Phát triển sinh khối vi rút nhân đa diện (NPV) trên tế bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

LÊ THANH HẢI HÀ

PH¸T TRIÓN SINH KhèI Virus NH¢N §A DIÖN (NPV)
TR£N TÕ BµO S¢U KHOANG PHôC Vô S¶N XUÊT
THUèC TRõ S¢U SINH HäC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2020


MỤC LỤC
Diễn giải

Trang

LỜI CAM ĐOAN

i

LỜI CẢM ƠN

ii

MỤC LỤC

iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

v

DANH MỤC BẢNG

vi

DANH MỤC HÌNH

ix

MỞ ĐẦU
1.Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu

1

2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài

3

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3

4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

4

5. Những đóng góp mới của luận án

4

CHƯƠNG 1. CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu

5

1.2. Tổng quan tài liệu

6

1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

6

1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

6

1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

8

1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng

12

1.2.1.4. Nghiên cứu điều kiện phát triển sinh khối của tế bào côn trùng

18

1.2.1.5. Nghiên cứu lây nhiễm NPV trên tế bào nhân nuôi

28

1.2.1.6. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo dạng sử dụng chế phẩm NPV

32

1.2.2. Tình hình nghiên cứu ở trong nước

35

1.2.2.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng

35

1.2.2.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại

36

1.2.2.3. Nghiên cứu nuôi nhân tế bào côn trùng

37

ii


1.2.2.4. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV

38

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

43

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu

43

2.1.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

43

2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

44

2.2.1. Địa điểm nghiên cứu

44

2.2.2. Thời gian nghiên cứu

44

2.3. Nội dung nghiên cứu

44

2.4. Phương pháp nghiên cứu

44

2.4.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn NPV sâu khoang

44

2.4.2. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây
nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân
48
2.4.2. 1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp để nhân sinh khối tế bào sâu khoang

50

2.4.2.2. Nghiên cứu lây nhiễm NPV sâu khoang trên tế bào nhân nuôi

54

2.4.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi và tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

60

2.4.3.1. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sau lây nhiễm trên tế bào

60

2.4.3.2. Nghiên cứu phát triển chế phẩm NPV dạng bột thấm nước

61

2.4.3.3. Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được
2.4.4. Phương pháp tính toán, xử lý số liệu

65

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Điều tra, đánh giá và thu thập, tuyển chọn virus nhân đa diện (NPV) trên sâu
khoang
66
3.1.1. Mức độ phổ biến và khả năng gây chết sâu khoang của virus nhân đa diện
(NPV) ngoài đồng ruộng
66
3.1.2. Phân lập, tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao

70

3.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm NPV trên tế
bào nhân nuôi
77
3.2.1. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

iii

78


3.2.1.1. Nghiên cứu điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang

78

3.2.1.2. Phát triển sinh khối tế bào sâu khoang qui mô phòng thí nghiệm

88

3.2.2. Nghiên cứu phát triển sinh khối NPV sâu khoang trên tế bào nuôi nhân

92

3.2.2.1. Xác định điều kiện thích hợp cho lây nhiễm virus nhân đa diện ( NPV)

93

3.2.2.2. Mức độ phát triển sinh khối tế bào và hình thành thể vùi trong quá trình lây
nhiễm virus nhân đa diện (NPV)
101
3.2.2.3. Mức độ gây chết sâu khoang và hình thành thể vùi của NPV nhân trên tế
bào và trên sâu
105
3.2.2.4. Hiệu lực trừ sâu khoang của chủng virus TL.1a nhân trên tế bào

107

3.3. Nghiên cứu tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang và tạo chế phẩm dạng bột thấm
nước
109
3.3.1. Tinh sạch thể vùi NPV sâu khoang

109

3.3.2. Thử nghiệm tạo chế phẩm NPV sâu khoang dạng bột thấm nước

114

3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang của chế phẩm tạo được

117

3.3.3.1. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trong điều kiện phòng thí nghiệm

117

3.3.3.2. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang trên bắp cải ngoài nhà lưới

117

3.3.3.3. Đánh giá hiệu lưc phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng

120

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận

126

2. Đề nghị

127

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128
TÀI LIỆU THAM KHẢO

129

PHỤ LỤC

iv


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu,

Diễn giải

chữ viết tắt
ADN

Axit Deroxyribo Nucleic

CT

Công thức

CV

Coefficient of Variation (Hệ số biến động)

FBS

Fetal Bovin Serum (Huyết thanh)

et al.

Những người khác

MOI

Multiplicity of Infection (Chỉ số lây nhiễm)

nnk.

Những người khác

NSNN

Ngày sau nuôi nhân

NSLN

Ngày sau lây nhiễm

NPV

Nuclear Polyhedrosis Virus (Virus nhân đa diện)

OB

Occlusion Bodies (Thể vùi)

PBS

Photphatse Buffer Saline

PIB

Polyhedral shaped inclusion Bodies (Thể vùi nhân đa diện)

QCVN

Qui chuẩn Việt Nam

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TB

Trung bình

v


DANH MỤC BẢNG
Diễn giải

Trang

Bảng 3.1. Mật độ sâu khoang phát sinh và tỷ lệ sâu chết do NPV trên các cây trồng
ngoài đồng ruộng (2014- 2015)

68

Bảng 3.2. Mức độ phổ biến của NPV ký sinh sâu khoang trên các cây trồng ngoài
đồng ruộng (2014- 2105)

69

Bảng 3.3. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang ở các ngày sau lây
nhiễm của các chủng NPV sau phân lập lần 1

72

Bảng 3.4. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang sau lây nhiễm của
các chủng NPV sau phân lập lần 2

74

Bảng 3.5. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng
NPV điển hình sau phân lập lần thứ 4

75

Bảng 3.6. Số thể vùi hình thành và hiệu quả gây chết sâu khoang của các chủng
NPV đã được lựa chọn

76

Bảng 3.7. Mật độ tế bào sâu khoang ở các ngày sau nuôi nhân trên các môi trường
khác nhau

79

Bảng 3.8. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau 81
Bảng 3.9. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân ở các mức pH môi trường khác
nhau

83

Bảng 3.10. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân trên môi trường có bổ sung
huyết thanh FBS với tỷ lệ khác nhau

85

Bảng 3.11. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân in vitro ở điều kiện thích hợp 86
Bảng 3.12. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân theo phương pháp tĩnh và lắc
trên bình lọc khuẩn 250ml

89

Bảng 3.13. Mật độ tế bào sâu khoang khi nuôi nhân với lượng 750ml môi trường
trên bình lọc khuẩn 1000ml theo phương pháp tĩnh và lắc

91

Bảng 3.14. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào có mật độ khác
nhau

94

vi


Bảng 3.15. Số lượng thể vùi hình thành khi nhiễm NPV trên tế bào theo chỉ số MOI
khác nhau

95

Bảng 3.16. Số lượng thể vùi hình thành sau thời gian ủ lây nhiễm NPV khác nhau
97
Bảng 3.17. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang
với các loại môi trường khác nhau

98

Bảng 3.18. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang
ở nhiệt độ khác nhau

99

Bảng 3.19. Số lượng thể vùi hình thành khi lây nhiễm NPV trên tế bào sâu khoang
ở các mức pH môi trường khác nhau

101

Bảng 3.20. Mật độ tế bào sâu khoang và số thể vùi hình thành sau các ngày lây
nhiễm NPV theo chỉ số MOI khác nhau

104

Bảng 3.21. Hiệu lực trừ sâu khoang của các nguồn NPV được tạo ra từ lây nhiễm
trên tế bào và trên sâu khoang

105

Bảng 3.22. Số lượng thể vùi hình thành từ các nguồn NPV tạo ra từ lây nhiễm trên
tế bào và trên sâu khoang

106

Bảng 3.23. Hiệu lực trừ sâu khoang của các chủng NPV được nhân sinh khối trên tế
bào và trên sâu khoang

108

Bảng 3.24. Số lượng thể vùi sâu khoang và tỷ lệ thu hồi sau tinh sạch theo các
phương pháp khác nhau

111

Bảng 3.25. Các chủng NPV sâu khoang sử dụng trong phân tích phả hệ

113

Bảng 3.26. Thành phần phụ gia, chất lượng và liều lượng sử dụng chế phẩm NPV

dạng bột thấm nước

116

Bảng 3.27. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang của chế phẩm NPV sau 6 ngày phun
trong điều kiện phòng thí nghiệm

117

Bảng 3.28. Hiệu lực phòng trừ sâu khoang trên bắp cải của chế phẩm NPV trong
điều kiện nhà lưới

118

Bảng 3.29. Số lượng thể vùi hình thành trên sâu khoang trên bắp cải sau khi sử
dụng chế phẩm NPV ngoài nhà lưới

119

vii


Bảng 3.30. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên bắp cải ngoài
đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội)

121

Bảng 3.31. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều
lượng khác nhau trên bắp cải ngoài đồng ruộng tại Vân Nội (Hà Nội)

122

Bảng 3.32. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP khi phun với liều
lượng khác nhau trên đậu tương ngoài đồng ruộng tại Mỹ Thành (Hà Nội)

124

Bảng 3.33. Hiệu lực trừ sâu khoang của chế phẩm NPV-1 WP trên đậu tương tại
Mỹ Thành (Hà Nội)

124

viii


DANH MỤC HÌNH
Diễn giải

Trang

Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang

7

Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D)

8

Hình 2.3. Buồng đếm hồng cầu Neubauer

54

Hình 3.1. Triệu chứng sâu non sâu khoang chết do NPV trên lạc và bắp cải

67

Hình 3.2. Thể vùi NPV màu trắng đục hình thành và lắng đọng

69

Hình 3.3. Lây nhiễm NPV trên sâu non sâu khoang trong phòng thí nghiệm

72

Hình 3.4. Thể thể vùi (OB) và thể hoạt động (virion) của chủng TL.1a

77

Hình 3.5. Thí nghiệm xác định môi trường nuôi nhân tế bào thích hợp A: Ban đầu;
B: Sau nuôi nhân 3 ngày

80

Hình 3.6. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày nuôi nhân ở các mức nhiệt độ khác nhau.
A: 240C; B: 260C, C: 280C và D: 290C

81

Hình 3.7. Tế bào sâu khoang sau 6 ngày đã nuôi nhân đợt tháng 11/2016 quan sát
dưới kính với độ phóng đại 100X

86

Hình 3.8. Tế bào sâu khoang sau nuôi nhân 6 ngày khi quan sát dưới kính hiển vi có
độ phóng đại 600X và 200X

87

Hình 3.9. Nhân tế bào theo phương pháp lắc (A) và theo phương pháp tĩnh (B)

90

Hình 3.10. Thể vùi NPV sâu khoang sau khi tinh sạch khi quan sát dưới kính hiển vi
với độ phóng đại 200X và 600X

111

Hình 3.11. Kết quả phân tích PCR các mẫu NPV trên tế bào và trên sâu

112

Hình 3.12. Thể vùi sau tinh sạch (A), được đưa vào lọ bảo quản (B)

113

Hình 3.13. Cây phả hệ dựng theo phương pháp Neighbor-joining.

114

Hình 3.14. Đóng gói chế phẩm NPV sau khi tạo dạng sử dụng

116

ix


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu
Sâu khoang (Spodoptera litura Fabr.) là loài sâu ăn tạp thường gây hại trên
các đối tượng cây trồng cạn, phân bố rộng ở nhiều nước thuộc khu vực nhiệt đới và
á nhiệt đới. Theo Kumari và Singh (2009); Hong (2002), sâu khoang có thể sống và
gây hại trên 290 loài cây thuộc 90 họ thực vật khác nhau [1, 2]. Ở Việt Nam, sâu
khoang thường phát sinh phá hại nặng trên nhiều loại cây trồng, điển hình như các
loại rau họ Thập tự, nho, đậu đỗ, cà chua, dưa chuột, rau muống, khoai sọ, thuốc lá,
đậu tương, lạc, bông, đay, v.v. (Viện Bảo vệ thực vật, 2003, 2006) [3, 98].
Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực vật (2001), để bảo vệ cây trồng
khỏi tác hại do sâu khoang, nông dân thường phải sử dụng nhiều loại thuốc hóa học
bảo vệ thực vật với liều lượng cao [4]. Sự lệ thuộc vào thuốc bảo vệ thực vật hóa
học đã làm tăng mức độ kháng thuốc của sâu khoang, gây khó khăn cho công tác
phòng trừ và gây nhiễm bẩn thực phẩm, gây độc hại đáng kể đối với sức khỏe người
sản xuất và tiêu dùng sản phẩm, ô nhiễm môi trường và làm tổn hại đến quần thể
các loài sinh vật có ích trên đồng ruộng .
Trên đồng ruộng, cũng như các loài côn trùng thuộc bộ Cánh phấn khác, sâu
khoang thường bị chết do nhiễm NPV. Theo kết quả điều tra của Viện Bảo vệ thực
vật (2001), khi sâu khoang phát sinh ở mật độ cao, tỷ lệ sâu chết do bị nhiễm NPV
(Nuclear Polyhedrosis Virus) từ 0,2- 1,5% trên rau bắp cải, từ 0,9- 1,6% trên đậu
tương và 0,3- 1,9% trên lạc [4].
Rohrmann và George (2011), Kitajima (1989); Kamakoff và Ward (2007) đã
xác định NPV lây nhiễm, gây chết trên sâu khoang là loài vi rút nhân đa diện
(Nuclear Polyhedrosis Virus- NPV) thuộc họ Baculoviridae và thuộc nhóm vi rút

sinh thể vùi (Oclusion Bodies - OB), mỗi thể vùi có thể chứa tới 200 thể vi rút hoạt
động (virion) hình que có vỏ ngoài protein bao bọc phân tử ADN (nhân) dạng vòng
xoắn kép. Thể vùi của NPV côn trùng có hình khối đa diện với kích thước từ 0,1515µm. NPV sâu khoang rất chuyên tính và có hiệu quả gây chết cao đối với sâu
khoang, không lây nhiễm trên các loài không phải là ký chủ của nó [5, 6, 7].

1


Vì vậy, việc khai thác sử dụng và nghiên cứu khả năng phát triển sinh khối
NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học NPV là cần thiết, nhằm đáp ứng yêu cầu
phòng trừ sâu khoang hại trên các cây trồng nông nghiệp. Sử dụng chế phẩm sinh
học NPV còn góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản
xuất nông sản an toàn, chất lượng cao cho tiêu dùng và xuất khẩu, bảo tồn các loài
sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng. Đồng thời, thông qua việc sử
dụng chế phẩm sinh học này trong việc phòng trừ sâu khoang, sẽ góp phần bổ sung
nguồn vi sinh vật có ích NPV vào đồng ruộng.
Lâu nay, việc phát triển sinh khối NPV vẫn tiến hành theo phương pháp thủ
công với qui mô nhỏ hẹp. Bằng cách nuôi sâu sống số lượng lớn, sau đó nhiễm
NPV của loài sâu tương ứng, rồi nghiền lọc và đem ra sử dụng (Nguyễn Văn Cảm
et al., 1996) [8]. Theo cách này, việc sản xuất chế phẩm NPV phòng trừ sâu hại khó
thực hiện với qui mô công nghiệp, vì để nuôi được số lượng lớn cá thể của một loài
sâu hại phục vụ sản xuất chế phẩm là một vấn đề hết sức khó khăn, phải có đủ nhà
xưởng, trang thiết bị và việc nuôi sâu phải tiến hành trong điều kiện vô trùng.
Để có thể tạo được khối lượng lớn sinh khối NPV của các sâu hại với qui mô
công nghiệp, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng thành công
kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng để sản xuất các loại chế phẩm NPV
phục vụ phòng trừ sâu hại cây trồng nông, lâm nghiệp (Granados et al., 2007;
Goodman, 2008; Elanchezyan, 2009) [9, 10, 11]. Đến nay, nhiều nước như: Mỹ, Hà
Lan, Canada, Đức, Trung Quốc, Ấn Độ, v.v. đã và đang ứng dụng để sản xuất, cung
cấp cho thị trường nhiều loại chế phẩm NPV có hiệu lực cao trong phòng trừ sâu

hại cây trồng. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu phát triển sinh khối NPV trên cơ sở ứng
dụng kỹ thuật công nghệ nuôi nhân tế bào côn trùng là vấn đề còn rất mới, kết quả
thu được mới dừng lại ở bước khởi đầu và còn rất hạn chế.
Việc thực hiện đề tài: ”Phát triển sinh khối virus nhân đa diện (NPV) trên tế
bào sâu khoang phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học”được tiến hành nhằm đóng
góp tư liệu khoa học về tiềm năng của NPV và khả năng lây nhiễm, phát triển sinh
khối virus trên tế bào sâu khoang nhân nuôi, làm cơ sở cho việc phát triển chế phẩm
sinh học phục vụ phòng trừ sâu hại ở nước ta, góp phần hạn chế sử dụng thuốc trừ
2


sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất nông sản an toàn cho tiêu dùng và xuất khẩu,
bảo tồn các loài sinh vật có ích và bảo vệ môi trường đồng ruộng.
2. Mục đích, yêu cầu cần đạt của đề tài
2.1. Mục đích
- Trên cơ sở đánh giá tiềm năng ký sinh tự nhiên, tiến hành tuyển chọn chủng
vi rút nhân đa diện (NPV) có hoạt lực cao trong phòng chống sâu khoang.
- Xác định được kỹ thuật nuôi nhân tế bào sâu khoang và lây nhiễm phát
triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại.
2.2. Yêu cầu cần đạt
- Đánh giá được khả năng gây chết sâu khoang ngoài tự nhiên, thu thập và
tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang.
- Nghiên cứu xác định được điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào
sâu khoang và lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào nuôi nhân.
- Thử nghiệm phát triển chế phẩm virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang
dạng bột thấm nước có hiệu quả cao phòng trừ sâu khoang hại cây trồng.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Các dẫn liệu đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên đồng
ruộng và tuyển chọn chủng NPV có hoạt lực cao có ý nghĩa to lớn trong định hướng

khai thác, sử dụng NPV để quản lý sâu hại cây trồng nông nghiệp.
- Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân
đa diện (NPV) trên tế bào sẽ góp phần làm sáng tỏ tiềm năng ứng dụng trong phát
triển sinh khối NPV phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học.
- Kết quả nghiên cứu tinh sạch thể vùi (OB) của NPV sâu khoang, thử
nghiệm tạo chế phẩm sinh học NPV dạng bột thấm nước có hiệu quả cao trong
phòng trừ sâu khoang ngoài đồng ruộng làm cơ sở định hướng tiêu chuẩn hoá chất
lượng chế phẩm sinh học dựa trên số lượng thể vùi sau khi sản xuất.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả điều tra, thu thập và tuyển chọn 3 chủng NPV có tiềm năng cao trong
phát sinh thể vùi và gây chết sâu khoang phục vụ phát triển chế phẩm sinh học.
Với kết quả phát triển được 2 chế phẩm NPV có hiệu lực trừ sâu cao sẽ góp
phần định hướng xây dựng qui trình sản xuất và sử dụng chế phẩm để phòng trừ sâu
3


khoang, nhằm hạn chế sử dụng thuốc trừ sâu hóa học độc hại, phục vụ sản xuất
nông sản an toàn và bảo vệ môi trường đồng ruộng.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
- Virus nhân đa diện (NPV) sâu khoang: Được thu thập ngoài đồng ruộng và
được phân lập tại phòng thí nghiệm Sinh học (Viện Bảo vệ thực vật).
- Tế bào sâu khoang: Nguồn thực liệu tế bào sâu khoang sử dụng trong
nghiên cứu do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp, là dòng tế bào phát triển từ tế bào
gốc của mô phôi sâu khoang và đã được phân lập nuôi nhân, chọn lọc qua 135 chu
kỳ, hiện đang được lưu giữ bảo quản tại Viện Bảo vệ thực vật.
- Sâu non sâu khoang: Được nhân nuôi trong các lồng nuôi sâu chuyên dụng
với thức ăn bằng lá bắp cải thu hái hàng ngày và xử lý vô trùng bằng cồn 700.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
- Đánh giá tiềm năng gây chết sâu khoang của NPV trên bắp cải, lạc, đậu

tương và khoai sọ ngoài đồng ruộng. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng NPV
có hoạt lực cao trong gây chết sâu khoang.
- Xác định điều kiện thích hợp phát triển sinh khối tế bào sâu khoang
- Điều kiện lây nhiễm, phát triển sinh khối NPV trên tế bào sâu khoang.
- Kỹ thuật tinh sạch thể vùi, tạo chế phẩm NPV dạng bột thấm nước.
5. Những đóng góp mới của luận án
- Lần đầu tiên cung cấp các dẫn liệu khoa học có hệ thống về khả năng phát
triển sinh khối tế bào sâu khoang và lây nhiễm virus nhân đa diện (NPV) trên tế
bào, phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu sinh học tại Việt Nam.
- Bổ sung các dẫn liệu khoa học mới về mức độ phổ biến của NPV trên sâu
khoang hại bắp cải, lạc, đậu tương và khoai sọ. Phân lập, tuyển chọn được 3 chủng
NPV có tiềm năng (TL.1a; TL.2a; TL.3a), trong số đó TL.1a có hoạt lực gây chết
sâu khoang cao nhất (80%) và số thể vùi hình thành nhiều (2,6 x 108 OB/10 sâu).
- Bước đầu xác định được kỹ thuật tinh sạch thể vùi NPV phục vụ tạo dạng
sử dụng chế phẩm. Phát triển được 2 chế phẩm NPV dạng bột thấm nước (NPV-1
WP và NPV-2 WP) có hiệu quả cao trong phòng trừ sâu khoang hại trên cây bắp cải
(80,51- 82,29%) và đậu tương (96,92%).

4


CHƯƠNG 1
CƠ SỞ KHOA HỌC VÀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học của đề tài nghiên cứu
NPV (Nuclear Polyhedrosis Virus) thuộc giống Alphabaculovirus, họ
Baculoviridae là một trong số ít vi rút có thể tồn tại ở dạng thể vùi (Occlusion
Bodies- OB) nên dễ dàng phân lập, lưu giữ và tạo dạng thành chế phẩm sinh học.
Trên đồng ruộng, NPV thường phát sinh gây chết sâu hại với tỷ lệ khá cao và luôn
tồn tại dưới dạng thể vùi, các thể vùi có thể tồn tại tới 30 năm ngoài tự nhiên và chỉ
bị tiêu diệt khi thể vùi gặp phải môi trường đất, nước có pH ≥ 9,0 hoặc dính bám

trên thân cây, lá cây, tàn dư cây trồng khi phơi nhiễm dưới ánh sáng trực xạ mạnh
hoặc tia cực tím (Kitajima, 1989; Grzywacz et al.,1996; Erayya, 2013) [6, 12, 13].
Sau khi các cá thể sâu non ăn phải thức ăn có mang thể vùi NPV, gặp pH cao
(> 9,0) của ruột giữa làm vỏ protein của thể vùi bị phá vỡ, giải phóng các thể hoạt
động (virion) và các thể vi rút hoạt động này sẽ xâm nhiễm vào nhu mô ruột giữa.
Sau đó xâm nhiễm sang các mô bào khác của cơ thể côn trùng. Sau 2-3 ngày, sâu
ngừng ăn và sau 5- 7 ngày thì sâu chết (Sajap et al., 2000) [14].
Khi sâu non chết, cơ thể căng mọng rất dễ bị vỡ khi có va chạm nhẹ và sau
khi vỡ, thân sâu dính bám vào lá hoặc thân cây và treo ngược cơ thể. Khi sâu chết,
các thể hoạt động của NPV tập hợp lại trong vỏ bọc protein thành thể vùi, thể vùi
được giải phóng ra môi trường đồng ruộng và tồn tại trong đất, trên tàn dư cây
trồng. Một sâu non chết bệnh NPV có thể chứa tới 24.553 thể vùi được giải phóng
ra môi trường đồng ruộng và có thể tồn tại từ 20-30 năm. Trong quá trình canh tác
cây trồng, làm đất hoặc do mưa gió, các thể vùi này dính bám lên lá cây và tiếp tục
chờ cơ hội tiếp tục xâm nhiễm gây chết cho sâu hại (Pourmirza, 2000) [15].
Như vậy, việc phun chế phẩm NPV vừa có ý nghĩa như một loại thuốc sinh
học để phòng trừ sâu hại một cách trực tiếp, vừa có tác dụng bổ sung nguồn virus
hữu ích, góp phần bảo vệ cân bằng sinh thái trên đồng ruộng.
Tuy nhiên, NPV chỉ có thể lây nhiễm và phát triển sinh khối trong các tế bào
sống của cơ thể côn trùng ở điều kiện môi trường thích hợp, như vậy việc phát triển

5


sinh khối NPV phải được thực hiện trên cơ thể sâu còn sống như phương pháp nuôi
sâu truyền thống hoặc lây nhiễm trên các mô, tế bào được nuôi nhân (Kalmakoff và
Ward, 2007; Elanchezhyan, 2009; Granados et al., 2007; Agathos et al., 2007,
Rohrmann và George, 2011) [6, 11, 9, 16].
Vì vậy, cần thiết phải nghiên cứu để có sự hiểu biết đầy đủ về điều kiện phát
triển sinh khối tế bào côn trùng, lây nhiễm NPV trên tế bào nuôi nhân trên cơ sở sử

dụng các chủng NPV có hoạt lực cao đã được tuyển chọn để phát triển sinh khối
NPV phục vụ phát triển thuốc trừ sâu sinh học phòng trừ sâu hại.
1.2. Tổng quan tài liệu
1.2.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
1.2.1.1. Nghiên cứu sâu khoang hại cây trồng
Các nhà khoa học trên thế giới đều xác định sâu khoang (Spodoptera litura
Fabricius; Noctuidae: Lepidoptera) là loài sâu đa thực, phá hại trên trên 290 loài cây
thuộc 90 họ thực vật khác nhau và được coi là đối tượng sâu hại quan trọng trong
sản xuất nông nghiệp ở nhiều nước trên thế giới (Kumari và Singh, 2009; Hong,
2002, Jadhav et al, 2015, Cherry et al.,2000) [1, 2, 20]. Theo tổng hợp của Kuldeep
et al. (2018) [17], sâu khoang phân bố rộng khắp ở khu vực Đông Nam châu Á, gây
hại trên 63 loại cây thuộc 22 họ, là sâu hại nguy hiểm gây thiệt hại nặng trên các
loại rau màu, đậu tương và bông, đay, v.v. Riêng tại Ấn độ, theo Alfred và
Samiayyan (2017) [18] đã thống kê và xác định sâu khoang phá hại trên 140 loài
cây thuộc 40 họ thực vật khác nhau, chủ yếu trên các cây trồng nông nghiệp.
Sâu khoang có thời gian qua các giai đoạn phát dục khá dài, nhất là giai đoạn
sâu non là thời gian sâu phá hại trên cây trồng, nên mức hại do sâu gây ra lớn.
Nghiên cứu sự phát triển của sâu khoang trên cà chua, Nagamandla và Shantanu
(2018) [19] xác định ở nhiệt độ 200C thời gian sâu non kéo dài tới 41,8 ± 3,56 ngày
và thời gian hoàn thành vòng đời là 60,4 ± 3,13 ngày; ở nhiệt độ 250C, thời gian
tương ứng là 25,8 ± 0,67 và 41,6 ± 1,08 ngày, nhưng ở nhiệt độ 300C thời gian phát
dục của sâu khoang rút ngắn, còn 16,3 ± 0,83 và 30,1 ± 1,29 ngày (tương ứng).
Kết quả nghiên cứu của Jadhav et al. (2015) chỉ rõ, khi sinh sống trên cây
nho ở điều kiện nhiệt đới, vòng đời của sâu từ 52- 56 ngày, trong đó thời gian phát
6


dục của trứng, sâu non, nhộng và trưởng thành sâu khoang là 5- 7 ngày; 20- 23
ngày; 4- 6 ngày và 9- 12 ngày (tương ứng), một trưởng thành cái đẻ trung bình
499,2 trứng/con cái. Tác giả cũng xác định tỷ lệ trứng nở của sâu khoang và khả

năng sống sót của sâu non tuổi lớn khá cao, vì vậy tác hại do sâu khoang gây ra trên
cây trồng thường rất lớn [20]. Theo nghiên cứu của Patil et al., (2014), sâu khoang
có tiềm năng sinh sản rất cao, một trưởng thành cái có thể đẻ từ 500- 1.263 trứng và
khi trứng nở với thời gian sống của sâu non tới 24,5- 28,2 ngày thì mức gây hại của
chúng là rất lớn [21].
Nghiên cứu của Alfred và Samiayyan (2017) chỉ rõ sức ăn của sâu khoang
trên cây đậu triều ở mức cao nhất với chỉ số tiêu thụ thức ăn tới 3,889 trên đậu đỗ,
trong khi với các cây trồng khác ở mức từ 2,825- 3,343 [22]. Theo Liu et al. (1995)
xác định điều kiện thích hợp cho sâu khoang phát triển số lượng là 28- 300C và độ
ẩm không khí từ 85- 95% [23]. Kết quả nghiên cứu của Muniappan và Marutani
(1992) xác định số lượng quần thể sâu khoang phát triển mạnh ở nhiệt độ không khí
29- 300C và độ ẩm trên 90%. Các tác giả chỉ rõ sâu khoang phát triển nhanh với mật
độ cao trên bắp cải (185,7 con/10 cây), cải dưa và cải cuốn (169,0 con/10 cây) [24].

Trứng

Sâu non

Trưởng thành

Nhộng

Hình 1.1. Các giai đoạn phát dục của sâu khoang
7


Kết quả nghiên cứu Jat et al. (2017) [25] và Srivastava et al. (2018) [26] xác
định NPV là tác nhân vi sinh vật gây chết sâu khoang rất phổ biến, được coi là nhân
tố quan trọng và có hiệu quả cao trong điều hoà số lượng quần thể sâu hại trên đồng
ruộng. Hiện nay, các nhà bảo vệ thực vật rất quan tâm đến việc phát triển, ứng dụng

các chế phẩm NPV trong hệ thống quản lý tổng hợp (IPM) sâu hại nói chung và sâu
khoang nói riêng.
Tại Quảng Đông (Trung Quốc), Liu et al., (1995) xác định yếu tố hạn chế
đáng kể sự phát triển số lượng quần thể sâu khoang ngoài đồng ruộng là các tác
nhân ký sinh trên sâu non, đặc biệt NPV có thể làm sâu chết từ 7,2- 30,5%. Mặt
khác, do sâu hoá nhộng trong đất nên khi mưa kéo dài làm đất ngập nước thì nhộng
có thể chết tới 100% [23].
1.2.1.2. Nghiên cứu về NPV trên sâu hại
Theo Evans (1986), Summer và Smith (1987), Rohman và George (2011) chỉ
rõ vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus) thuộc họ Baculoviridae, lớp
Virus, bao gồm 2 giống: vi rút nhân đa diện (Nucleo Polyhedrosis Virus- NPV) và
vi rút hạt (Granulosis Virus – GV) [27, 28]. NPV là tác nhân gây chết cao đối với
các loài côn trùng thuộc các Bộ Lepidoptera, Hymenoptera, Diptera, Neuroptera,
Coleoptera, Trichoptera và nhện. Theo Arayya et al. (2013) NPV phát sinh và tồn
tại phổ biến trong tự nhiên, rất chuyên tính với ký chủ, không lây nhiễm trên động
vật máu nóng, an toàn với thiên địch và môi trường [29].

Hình 1.2. Các dạng Baculovirus (A), thể chồi (B) và thể vùi của NPV (C, D)
(Nguồn: Rohrmann và George, 2011)

8


Theo Arayya et al. (2013), NPV có dạng hình gậy, có kích thước 40- 70 x
250 - 400nm bao gồm lớp vỏ lipoprotein bao quanh nhân (capsid) chứa thể DNAprotein (core) và được gọi là nucleo- capsid. NPV tồn tại dưới dạng các hạt tinh thể
sáng, góc cạnh gọi là thể vùi (OB) hay còn gọi là polyhedra hoặc thể nhân đa diện
(PIB). Khi quan sát dưới kính hiển vi phản pha, thể vùi có kích thước 1-7µm. Tinh
thể này có nhiều cạnh và tạo thành 1 protein có khối lượng phân tử khoảng 25- 30
kDa. Các hạt virus có một lớp bọc bên ngoài gọi là nhân capsit (virion) và NPV có
một đặc tính hình thành các protein tinh thể trong nhân của tế bào vật chủ với kích

thước 0,5 - 15 nm [13].
Theo Hong et al. (2002), Rohrmann và George (2011) [2, 5], cấu tạo của
NPV gồm 3 phần: vỏ ngoài, vỏ capsid và lõi axit nucleic.
- Vỏ ngoài: là một lớp màng lipoprotein ngoài cùng còn gọi là protein ngoài.
Protein ngoài mang tính kháng nguyên và có tác dụng kích thích vào hệ thống miễn
dịch của cơ thể vật chủ.
- Vỏ capsid: Vỏ capsid nằm kế tiếp bên trong lớp vỏ ngoài và được ngăn
cách với lớp vỏ ngoài bởi một lớp dịch. Protein tạo nên vỏ capsid được gọi là
protein trong. Protein trong mang tính kháng nguyên, có tác dụng làm tăng khả
năng gây bệnh của virus.
- Genom: Genom của NPV là một phân tử ADN gồm 2 mạch xoắn kép. Khi
nhiễm vào tế bào vật chủ virus đưa lõi ADN vào tế bào vật chủ, ADN của virus sử
dụng năng lượng, nguyên liệu và riboxom của tế bào vật chủ để tổng hợp nên
protein và quá trình nhân lên của ADN. Mặt khác, khi tế bào bị nhiễm virus, ADN
của virus sinh ra men Azenaza ức chế ADN của tế bào vật chủ và phân giải tạo
thành các nucleotit tự do. Sau khi tổng hợp đủ các thành phần như vỏ, ADN thì
NPV tạo thành thể virus mới.
Theo Lynn (2002), vỏ của polyhedrin (thể vùi) được bao bọc là protein.
Polyhedrin dễ bị thủy phân trong môi trường kiềm. Do đó trong dịch ruột giữa của
sâu khoang với pH là 9-10 các thể đa diện bị phá vỡ, giải phóng các hạt virus tự do
(virion). Các hạt virus xâm nhập vào tế bào máu đến tế bào da, tế bào biểu mô khí
quản và tế bào mỡ để gây bệnh [30].
9


Quá trình nhân lên của NPV và sự hình thành thể đa diện được tiến hành
trong nhân tế bào, vỏ của thể đa diện được tổng hợp ở ngoài nhân sau đó vận
chuyển vào trong nhân để hình thành các thể đa diện. Số lượng virus và thể đa diện
ngày một tăng, kết quả phá vỡ tế bào vật chủ, giải phóng virus tự do và thể đa diện.
Virus tự do lại tiếp tục xâm nhập vào tế bào lân cận, bắt đầu chu trình phá vỡ tế bào

tiếp theo. Khi các tế bào vật chủ bị phá vỡ, quá trình phát bệnh của sâu hại sẽ biểu
hiện ra bên ngoài.
Phân tích trên kính hiển vi điện tử thấy các thể vùi đa diện nhân là những
tinh thể lớn, nhiều cạnh, có dạng như hình thoi, hình vuông, kích thước từ 1- 7m.
Các thể vùi này có cấu tạo vỏ bọc bởi các thể protein. Các lát cắt cực mỏng phóng
đại trên 60.000 lần cho thấy các khối đa diện chứa nhiều virion hình que (Rohrmann
và George, 2011; Khosaka et al., 1971) [5].
Theo Harrap (1972), các virion của NPV có một nucleocapsid trong một lớp
vỏ bao và nucleopsid này cũng có dạng hình que, chiều dài trung bình của các
virion là 200µm và đường kính 30 µm [31]. Rohrmann và George (2011) [5] còn
chỉ rõ các virion có 2 loại, gồm thể vùi (OB) và thể chồi (BV).
Theo Rohrmann và George (2011), thể vùi (Occlusion Bodies – OB) hay còn
gọi là thể vùi đa diện (Polyhedrosis Inclusion Bodies – PIB) có tính bền vững cao
và chống chịu tốt với điều kiện môi trường bình thường, chúng chứa thể đa diện
trong lớp vỏ protein gọi là polyhedrin. Các khối đa diện có đặc điểm dễ bị kiềm
hoá, dùng NaOH 0,1N có thể phá vỡ các vỏ đa diện giải phóng các virion. Vì vậy
trong ruột côn trùng, dịch ruột mang tính kiềm nên các polyhedra dễ bị phân huỷ để
lây nhiễm tiếp vào các nhân của các tế bào khác. Mỗi nucleocapsid chỉ chứa một sợi
đôi ADN dạng vòng. Khối lượng phân tử 75 - 10 x 106 Da.
Thể chồi (BV) được hình thành trong quá trình xâm nhiễm vào tế bào nhu
mô ruột giữa của vật chủ, sau đó các polyhedra của thể chồi xâm nhiễm vào các tế
bào của các cơ quan vật chủ. Đến cuối quá trình xâm nhiễm, các virion tập hợp lại
và hình thành lớp vỏ bọc protein trở thành thể vùi (OB) trong tế bào vật chủ và sau
đó giải phóng ra môi trường theo xác chết bị phân rã của cơ thể vật chủ [5].

10


Theo Farrar et al. (1999) thì NPV là nhóm virus lớn và có hiệu quả gây chết
cao đối với các loài côn trùng, mỗi loài virus thường rất chuyên tính. Đặc biệt, các

loài NPV hoàn toàn không lây nhiễm trên các loài động vật có xương sống. Vì thế,
chúng là những tác nhân sinh học rất hữu ích trong phòng trừ sâu hại cây trồng [32].
Kết quả thí nghiệm đồng ruộng trên cải bắp của Jat et al. (2017) xác định hiệu lực
trừ sâu khoang (Spodoptera litura) đạt từ 58,15- 72,13% khi phun với liều lượng
1,5 x1012 OB/ha [33]. Kết quả của Grzywacz et al. (2008) cho thấy hiệu quả trừ sâu
Spodoptera exempta trên đậu đỗ đạt tới 96% khi phun SpexNPV với liều lượng 5 x
1011 OB/ha [34]. Kết quả thí nghiệm của Bedjo (2017) trên đậu tương tại vùng
Đông Java (Indonesia) với các chủng khác nhau ở nồng độ từ 1 x 106 đến 1 x 1012
PIB/ml thì chủng có tỷ lệ sâu non sâu khoang tuổi 3 cao nhất đạt từ 51,11- 77,78%
sau 168 giờ xử lý [35]. Tại Malaysia, Sajap et al. (2000) đánh giá mức độ chuyên
tính của NPV sâu khoang (Spodoptera litura) đã xác định khi phun NPV sâu
khoang với liều lượng 6 x 107 PIB và 6 x 108 PIB/sâu non sâu khoang cho hiệu quả
gây chết tương ứng là 80,81 và 95,95%, nhưng hoàn toàn không gây chết sâu non
Spodoptera retorta Clerk (Noctuidae) và Preroma pendulla Joanis (Psychidae) [14].
Kết quả nghiên cứu của Jat et al.(2017) khi so sánh hiệu lực của các thuốc bảo vệ
thực vật dùng phòng trừ sâu khoang trên bắp cải, xác định hiệu lực của NPV đạt
76,11%, trong khi thuốc Spinosat đạt 85,99% và chế phẩm Bt đạt 52,93% sau 7
ngày phun [33].
Từ kết quả đánh giá hiệu quả của NPV trong phòng từ sâu khoang khi sử
dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với thuốc hoá học trên bắp cải tại Pakistan, nhóm tác
giả Maqsood et al. (2017) và Sumaira et al. (2017), đã khẳng định NPV là tác nhân
vi sinh vật có hiệu quả cao trong quản lý sâu khoang, chúng không chỉ gây chết sâu
non mà cả nhộng và trưởng thành mới vũ hoá [36, 37]. Arayya et al. (2013) cho
rằng NPV với nhiều đặc tính quí được coi là thuốc trừ sâu sinh học có tiềm năng
cần được khai thác sử dụng để phòng trừ sâu hại [13]. Theo tổng hợp của Devi et al.
(2016), hiện nay đã có 15 loại chế phẩm NPV đã được thương mại hoá, các sản
phẩm đóng vai trò quan trọng trong công tác bảo vệ cây trồng và thân thiện môi
trường. Tuy nhiên, theo tác giả, do NPV thuộc tác nhân ký sinh bắt buộc, chỉ có thể
11

phát triển sinh khối trên sâu, mô hoặc tế bào sống, điều này được xác định là khó
khăn lớn nhất cho việc phát triển sinh khối NPV để phòng chống sâu hại [38]. Mặt
khác, NPV phát sinh rất phổ biến trên đồng ruộng nhưng hoạt lực diệt sâu hại của
chúng cũng rất khác nhau, nên khi phát triển thành chế phẩm có hiệu quả cần thiết
phải qua quá trình tuyển chọn (Escribano,1999) [39]. Kết quả nghiên cứu của Bedjo
(2017) xác định chỉ có 1 trong 6 chủng phân lập NPV sâu khoang hại đậu tương là
SlNPV-JTM 97c có hiệu lực gây chết sâu đạt 77,9% [35].
Hơn nữa, kết quả nghiên cứu của Salama et al. (2017) chỉ ra rằng virus còn
chịu tác động của tia UV (Ultra violet), nhất là khi sử dụng chế phẩm trong mùa hè,
do tia UV sẽ làm giảm số lượng thể vùi của chế phẩm từ 25,2- 34,5% khi phơi
nhiễm UV từ 2- 4 giờ, dẫn tới làm giảm hiệu quả trừ sâu của thuốc còn 67,3% và
kéo dài thời gian trước khi chết của sâu ngoài đồng ruộng từ 2- 3 ngày. Vì vậy, việc
chọn thời điểm sử dụng chế phẩm NPV cũng là vấn đề cần thiết [40].
1.2.1.3. Nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng
Cũng như tế bào động vật nói chung, các dòng tế bào của các loài côn trùng
cũng thuộc nhóm Eukaryote, là tế bào của sinh vật có nhân chuẩn, có màng nhân
ngăn cách nhân với tế bào chất và trong nhân tế bào phân tử DNA kết hợp với các
protein tạo thành các sợi nhiễm sắc thể (Sills, 2005) [41].
Theo tổng kết của Granados et al. (2007), Elanchezyan (2009), Lynn (2002)
và Sudeep et al. (2005) thì trong những năm đầu của thế kỷ 20 khoa học nghiên cứu
về côn trùng trong một số lĩnh vực đã có những ý tưởng đầu tiên về việc sử dụng tế
bào côn trùng trong nuôi cấy in vitro như là một công cụ thí nghiệm cho các nghiên
cứu cơ bản về sinh học tế bào, bệnh lý côn trùng, v.v. [9, 11, 30, 42]
Dẫn theo tài liệu tổng hợp của Granados et al. (2007) [9], thí nghiệm nhân
nuôi tế bào côn trùng in vitro đầu tiên do Goldsmidt tiến hành vào năm 1915, ông
đã nuôi cấy các phần mô tách ra từ loài tằm Hyalophora cecropia. Sau đó, vào cuối
những năm 1930, Trager thực hiện một bước đột phá lớn bởi đã phát triển được một
môi trường nuôi cấy dựa trên những hiểu biết về tính chất vật lý và hóa học của tế
bào máu côn trùng. Đến năm 1956, Wyatt đã phát triển một môi trường dựa trên

phân tích sinh hóa chi tiết của tế bào máu tằm và chứng minh môi trường này gây ra
12


sự tăng trưởng của tế bào từ mô buồng trứng của loài tằm Bombyx mori, đóng góp
vào sự tăng trưởng và duy trì sự sống sót của tế bào trong phòng thí nghiệm trong
thời gian dài đến ba tuần.
Gần 50 năm sau kết quả nghiên cứu đầu tiên của Goldschmidt (1915), Grace
(1962) đã nghiên cứu ra môi trường nuôi cấy cùng với việc phân lập, nhân nuôi
thành công dòng tế bào đầu tiên từ bộ Lepidoptera, kể từ đó có tới hơn 500 dòng tế
bào khác nhau đã được phát triển, chủ yếu là ở các bộ Diptera, Lepidoptera,
Hemiptera và Orthoptera (Dẫn theo Granados et al. 2007 và Lynn, 1998) [9, 43].
Khi bắt đầu nuôi cấy tế bào côn trùng, một phương pháp chung giống như
phương pháp duy trì nuôi cấy tế bào động vật đã được áp dụng cho nuôi cấy tế bào
côn trùng. Tuy nhiên, điều kiện cụ thể cần phải được thay đổi và có tiêu chuẩn riêng
đối với từng loài tùy thuộc vào mô chọn để nuôi cấy ban đầu, môi trường nuôi cấy,
chất dinh dưỡng bổ sung, pH, nhiệt độ nuôi, v.v. (Freshney, 1987) [44].
Theo Grace (1982) và Granados et al. (2007), trong phát triển sinh khối tế
bào từ các tế bào gốc thì tế bào sẽ phân chia liên tục trong thời gian dài ở môi
trường thích hợp. Nếu mô tế bào phân lập không chứa tế bào gốc thì tế bào sẽ phát
triển chậm hoặc phát triển với tốc độ giảm dần và cuối cùng chúng không phân chia
tiếp mà sẽ tự chết dần [45, 9].
Theo Elanchezyan (2009), việc nhân nuôi phát triển sinh khối tế bào côn
trùng có ý nghĩa to lớn để phục vụ cho nghiên cứu cơ bản cũng như nghiên cứu ứng
dụng và thương mại. Chúng được sử dụng để sản xuất chế phẩm vi rút cho từng loài
thuộc bộ Lepidoptera, tạo ra thuốc trừ sâu sinh học hoặc sử dụng cho protein tái tổ
hợp. Vì vậy, việc nghiên cứu và sử dụng tế bào côn trùng ngày càng được quan tâm
tại nhiều nước trên thế giới. Sản phẩm tế bào nhân nuôi còn phục vụ việc sản xuất
protein tái tổ hợp, nghiên cứu sinh học và hoá sinh học tế bào; hiển thị các gen lạ
trong công nghệ tái tổ hợp gen; phát hiện tác nhân gây bệnh và tương tác giữa tế

bào và vi rút; sản xuất qui mô thương mại các vacxin chữa bệnh [11].
Theo đánh giá của Guy and Goodman (2008), hiện nay các nghiên cứu tập
trung nhiều vào việc phát triển các chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật sử dụng vi rút
côn trùng, coi đó như một công cụ mới trong quản lý sâu hại cây trồng nông lâm
13


nghiệp [46]. Còn Granados et al. (2007) và Weiss et al. (1981) cho rằng định hướng
thời gian tới sẽ là thời kỳ nghiên cứu phát triển sinh khối tế bào côn trùng với qui
mô lớn và thúc đẩy sản xuất cũng như thương mại sản phẩm từ nhân nuôi tế bào
trên thị trường, nhất là các thuốc trừ sâu sinh học virus [9, 47]. Sudeep et al. (2005)
chỉ rõ có tới 15 dòng tế bào của bộ Lepidoptera đã được xác định tại Ấn Độ đang và
sẽ sử dụng để nhân sinh khối virus với qui mô lớn phục vụ sản xuất thuốc trừ sâu
sinh học [42].
Qua 25 năm nghiên cứu, Lynn (2002) [30] đã tổng kết thành qui trình chung
cho việc nhân sinh khối tế bào côn trùng qua 11 công đoạn với các yêu cầu cụ thể
khác nhau cho từng công đoạn nhân nuôi. Đồng thời, chỉ rõ các loại vật liệu và thiết
bị cần có để nuôi nhân tế bào, đồng thời mô tả chi tiết các bước thực hiện của
phương pháp có hiệu quả để nhân nuôi đối với các dòng tế bào côn trùng khác nhau,
cụ thể như:
- Bốn bước thực hiện chung cho các dòng tế bào côn trùng;
- Bốn bước thực hiện đối với tế bào không bám dính hoặc bám dính lỏng lẻo,
như các dòng tế bào của loài Spodoptera litura và Mamestra brassica v.v...
- Sáu bước thực hiện với các dòng tế bào bám dính chặt, như các dòng tế bào
của loài Spodoptera frugipera, Anticarsa gemmatalis và Plutella xylostella, v.v.
- Đối với các dòng tế bào bám dính rất chặt như loài Heliothis armigera và
Diabrotica undecimpuncta phải thực hiện 7 bước bằng phương pháp Tripsin hoá.
Lynn (2002) cũng chỉ rõ vấn đề cần lưu ý trong nuôi cấy tế bào động vật nói
chung cũng như nuôi cấy tế bào côn trùng nói riêng đó là việc kiểm soát lây nhiễm
trong quá trình nhân nuôi in vitro tạo vật liệu tế bào [30].

Theo Hurton et al. (2005), có 5 yếu tố liên quan đến việc không nhận biết và
khắc phục được tế bào nuôi cấy bị lây nhiễm, bao gồm: Một là: do kỹ thuật thao tác
không đúng và nhiễm từ nguồn thực liệu ban đầu; Hai là: nhận biết nhiễm qua kiểm
tra cảm quan (độ đục, màu sắc của môi trường nuôi cấy chuyển sang màu vàng,
v.v.); Ba là: có khoảng 6% các mẻ nuôi cấy tế bào bị nhiễm mà không thể nhận biết
ngay nên không kịp khắc phục; Bốn là: không nhận biết được do có chất kháng sinh
trong môi trường nuôi cấy đã ức chế tạm thời vi khuẩn; Năm là: không có cách khắc
14


phục dẫn đến tế bào bị phá hủy. Theo đó nguồn nhiễm có thể là từ mô ban đầu chưa
sạch, nhiễm chéo trong quá trình nuôi cấy, do các dụng cụ phòng thí nghiệm, môi
trường, thuốc thử chưa vô trùng và do thao tác của các kỹ thuật viên [48].
Theo Lynn (1996) cách đơn giản để tránh nhiễm khuẩn là không sử dụng
kháng sinh trong nuôi cấy duy trì dòng tế bào. Trong khi điều này nghe có vẻ mâu
thuẫn thì lí do thật đơn giản. Nếu không có kháng sinh trong môi trường, nếu nuôi
cấy bị nhiễm khuẩn thì sự nhiễm vi khuẩn đó sẽ nhận biết ngay trong môi trường
nuôi cấy giàu dinh dưỡng chỉ trong ít ngày nuôi cấy. Điều này giúp kĩ thuật viên
phát hiện sớm nhất có thể và nuôi cấy trở lại để phục hồi tế bào bị nhiễm [49].
Ngược lại, nếu nuôi cấy duy trì tế bào có kháng sinh có thể cấy chuyền tế
bào trong nhiều tuần hoặc nhiều tháng với mật độ nhiễm thấp mà không phát hiện
được. Điều đó có thể giải thích là do chất kháng sinh được sử dụng liên tục sẽ làm
chậm sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào bị nhiễm mà mắt thường không nhận
biết được nhưng thực tế nuôi cấy đó đã bị nhiễm khuẩn. Bằng cách đó, tất cả các tế
bào nuôi cấy sẽ bị nhiễm khuẩn lan rộng và khi đó cũng sẽ có ít hy vọng phục hồi.
Vì lý do nêu trên, Lynn (1996) cho rằng chỉ nên sử dụng kháng sinh trong
những thí nghiệm trong thời gian ngắn hoặc nuôi cấy sơ cấp. Trong trường hợp nuôi
cấy sơ cấp, sau mỗi lần nhân sinh khối tế bào môi trường nuôi cấy cũ được thay thế
bằng môi trường mới phải bổ sung chất kháng sinh (thường sau cấy chuyển lần thứ
5). Như thế tránh được hầu hết mọi sự nhiễm khuẩn [49].

Theo tác giả này, mối lo ngại chính khi nuôi cấy tế bào côn trùng lại là việc
tế bào bị nhiễm vi rút và mycoplasma. Để tránh nhiễm vi rút và mycoplasma thì giải
pháp tốt nhất đó là không bao giờ được sử dụng pipet hút bằng miệng và môi
trường, huyết thanh không chính hãng. Bên cạnh đó, tác giả cũng khẳng định một
lợi thế khi nuôi nhân tế bào côn trùng, trong khi rất nhiều các tác nhận và chất gây
nhiễm khi nuôi cấy tế bào động vật có xương sống phải đối mặt thì lại không phải là
một vấn đề với các tế bào côn trùng .
Để loại bỏ tất cả các nguồn gây nhiễm trong nuôi cấy tế bào côn trùng cần
phải kiểm tra vô trùng ở tất cả các giai đoạn nuôi cấy, cần tiến hành định kỳ hàng
tháng cho nuôi cấy các dòng tế bào liên tục, định kỳ hàng tuần trong trường hợp
15


phòng thí nghiệm bị nhiễm, trước mỗi lần bảo quản và trong trường hợp gặp cùng
một vấn đề với những kết quả bị lặp đi lặp lại. Khi phát hiện nhiễm cần loại bỏ ngay
tế bào đang nuôi cấy và kiểm tra tế bào đang bảo quản. Đồng thời, cô lập tất cả các
mẫu bảo quản liên quan đến mẫu nhiễm, khử trùng phòng thí nghiệm theo qui trình
tiêu chuẩn và loại bỏ ngay lập tức những tế bào không thể phục hồi thay thế.
Các nhà khoa học của Invitrogen Life Technologies (2002a) đã nêu khá chi
tiết về qui trình nuôi nhân, môi trường nhân sinh khối cần phải sử dụng và các
phương pháp nhận biết, xử lý khi sinh khối tế bào nuôi nhân bị nhiễm tạp. Qui trình
cũng chỉ rõ từ khâu chuẩn bị các trang thiết bị cần thiết, chuẩn bị môi trường nhân
nuôi, hệ thống điều khiển điều kiện môi trường nuôi cấy (nhiệt độ, pH và không
khí, v.v.) và kỹ thuật bảo quản tế bào trong thời gian chờ sử dụng, v.v. Các tác giả
này cũng nêu rõ 2 chỉ tiêu đánh giá chất lượng nuôi nhân dựa trên kết quả tính tổng
số tế bào có trong dịch thể, hình thái của tế bào và mức độ biến động số lượng tế
bào dựa trên xác định tổng số tế bào sống có được [50].
Như vậy, khi phát triển sinh khối đối với mỗi dòng tế bào của 1 loài côn
trùng cần thiết phải có sự nghiên cứu chi tiết để xác định rõ các yếu tố thích hợp
cho sự phát triển của tế bào, gồm: chủng loại môi trường, huyết thanh bổ sung,

nhiệt độ và pH môi trường nhân nuôi, v.v.
Theo Murhammer (2007) [51], quá trình nuôi nhân tế bào của loài côn trùng
nào đó cũng đều phải trải qua 3 công đoạn khác nhau, gồm: nhân sơ cấp, nhân thứ
cấp và nhân sản xuất. Các bước thực hiện cũng tương tự như nuôi nhân một tác
nhân vi sinh vật hữu ích để phát triển chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật, bao gồm:
- Nhân giống thực liệu từ giống gốc hay còn gọi là nhân sơ cấp hoặc nhân sơ
khởi (Initiation culture): nguồn thực liệu tế bào hay còn gọi là giống gốc thường
được bảo quản trong điều kiện lạnh sâu, như tủ lạnh sâu (-1980C) hoặc trong bình ni
tơ lỏng. Khi đưa vào nhân nuôi phải thực hiện giai đoạn nhân phục hồi, loại bỏ hoạt
chất duy trì, thay bằng môi trường nuôi nhân nhằm giúp tế bào phục hồi trở lại các
hoạt động sống của mình.

16