Nghiên cứu một số đặc tính của Enzym Lipase từ mủ đu đủ và ứng dụng vào quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN ĐÌNH HẢI NAM

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH
CỦA ENZYM LIPASE TỪ MỦ ĐU ĐỦ VÀ
ỨNG DỤNG VÀO QUÁ TRÌNH LÀM GIÀU
DHA, EPA TRONG DẦU CÁ HỒI

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số : 60.42.02.01

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đà Nẵng - Năm 2018


Công trình được hoàn thành tại
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Minh Nhật

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Thị Xô

Phản biện 2: PGS.TS. Trương Thị Minh Hạnh

Luận văn được bảo vệ tại Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp
Thạc sĩ Công nghệ sinh học họp tại Trường Đại học Bách khoa vào
ngày 13 tháng 10 năm 2018

* Có thể tìm hiểu luận văn tại:
- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng
- Thư viện Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng


1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Năm 1848, một trong số những loại enzym vô cùng quan trọng
lần đầu tiên được khám phá bởi nhà sinh lý học người Pháp Claude
Bernard, đó là enzym lipase [1]. Trên thực tế, từ trước mốc thời gian
này, nhân loại đã biết đến một số cách ứng dụng lipase thông qua việc
sử dụng dịch chiết từ tuyến tụy của một số loại động vật. Kể từ đó, nhiều
nhà khoa học trên thế giới đã bắt đầu quá trình tìm hiểu và nghiên cứu
về loại enzym này, mở ra một kỉ nguyên mới với sự ứng dụng rộng rãi
và toàn diện của enzym lipase như ngày nay.
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases EC 3.1.1.3) là enzym
thuộc lớp các enzym xúc tác cho phản ứng thủy phân (hydrolase) chất
béo (triglycerides) thành glycerol và các axit béo tự do. Lipase có hoạt
tính xúc tác chọn lọc rất cao, nhờ đặc tính này mà lipase ngày càng được
ứng dụng phổ biến trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, hóa chất tẩy rửa,
mỹ phẩm, tổng hợp các chất hữu cơ, dược phẩm,… [2].
Lipase được tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau: thực vật, động
vật, côn trùng hoặc các vi sinh vật. Ở động vật, lipase được tìm thấy ở
tụy và niêm mạc dạ dày. Ở côn trùng, lipase được tìm thấy trong huyết
thanh và nước bọt. Ở thực vật, lipase hiện diện phần lớn trong các mô
của thực vật hạt kín [3]. Phần lớn lipase hiện nay được nghiên cứu và
ứng dụng chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật [2].
Lipase từ thực vật tuy chỉ chiếm một phần nhỏ trong nền công
nghiệp sản xuất enzym nhưng với nhiều ưu điểm như giá thành thấp, là

enzym cố định tự nhiên, dễ dàng chấp nhận và được sử dụng trực tiếp
như chất xúc tác sinh học ở dạng chế phẩm thô nên gần đây loại enzym
này đã được quan tâm và nghiên cứu khá phổ biến [4].
Đu đủ thường được biết đến với enzym papain – một loại
protease đã được thương mại hóa từ lâu và có nhiều ứng dụng trên thực
tế. Tuy vậy, lipase từ đu đủ hiện nay cũng đã được nghiên cứu ở nhiều


2
nơi trên thế giới và được sử dụng khá phổ biến trong các ngành công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp tẩy rửa, hóa học và y học. Trong khi đó,
cây đu đủ được trồng phổ biến ở nhiều vùng của nước ta nhưng chủ yếu
chỉ để thu nhận papain từ phần protein có khả năng tan trong nước, rất
nhiều các enzym khác có trong mủ đu đủ, mà tiêu biểu là lipase vẫn
chưa được tận dụng triệt để [5].
Trong thời gian gần đây, một trong những ứng dụng quan trọng
và nổi trội của enzym lipase với ngành công nghệ thực phẩm là biến đổi
cấu trúc chất béo theo hướng mong muốn hoặc làm giàu, tách chiết các
axit béo thiết yếu – axit béo không no đa nối đôi.
Khoa học hiện đại đã chứng minh các axit béo không no chứa
nhiều nối đôi (PUFAs) đóng một vai trò hết sức quan trọng đối với sức
khỏe con người. Dầu cá từ lâu lại được biết đến như một nguồn không
thể thiếu cung cấp các axit béo không no chứa nhiều nối đôi (PUFA).
Trong các loại dầu cá biển như cá hồi, cá thu, cá mòi, cá ngừ.... thường
có chứa một lượng n-3PUFA lớn, trong đó có hai loại đặc biệt được
quan tâm là DHA (acid docosahexaenoic) và EPA (acid
eicosapentaenoic). Các nghiên cứu gần đây đã khẳng định rằng hai loại
axit béo này có vai trò điều hòa ổn định mức độ cholesterol và LDL
(Low Density Lipoprotein) trong máu. Vì vậy, việc bổ sung các axít béo
trên một cách thích hợp giúp duy trì mức độ bình thường của cholesterol

trong cơ thể, góp phần ngăn ngừa các bệnh về tim mạch cũng như nguy
cơ gây xơ vữa động mạch. Ngoài ra, những axit béo không no này cũng
là thành phần không thể thiếu trong khẩu phần ăn của trẻ em bởi chúng
có khả năng tăng cường thị giác và sự phát triển của trí não [6].
Trong số các loại cá được con người sử dụng làm thực phẩm, cá
hồi (Salmon salar) đã được biết đến là một trong những thực phẩm giàu
chất dinh dưỡng nhất. Đặc biệt, trong dầu cá hồi có chứa hàm lượng lớn
các loại axit béo chưa bão hòa, tiêu biểu là DHA và EPA [7]. Thịt cá hồi
có giá trị dinh dưỡng cao nên được rất nhiều quốc gia quan tâm khai
thác và đánh bắt, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sau khi chế biến để


3
sử dụng phần thịt cá, rất nhiều phụ phẩm như đầu cá, xương, vây bụng
và thịt thừa vẫn chưa được tận dụng phục vụ cho con người đúng cách
(chủ yếu được chế biến làm thức ăn chăn nuôi). Điều này gây nên một
sự lãng phí lớn bởi giá trị dinh dưỡng ở các bộ phận khác của cá không
hề thua kém phần thịt cá. Chính vì vậy, nếu biết cách tận dụng được
nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ quá trình chế biến thủy sản này để tạo ra các
chế phẩm giàu DHA và EPA phục vụ cho nhu cầu dinh dưỡng của con
người, thì đó sẽ là một định hướng mang lại nhiều ý nghĩa tích cực. Đây
chắc chắn sẽ là một vấn đề được chú trọng trong tương lai gần.
Điều đáng chú ý là trong dầu cá tự nhiên, phần lớn các axit béo
nói chung và hai axit béo thiết yếu nói riêng là DHA và EPA nằm dưới
dạng các gốc acyl trong triacylglycerol (triglycerid). DHA và EPA vốn
là những axit béo thiết yếu, nhưng bên cạnh đó, vẫn có rất nhiều axit béo
no hoặc không no một nối đôi khác không có tác dụng tốt đối với sức
khỏe con người. Ý tưởng tìm cách loại bỏ các loại axit béo không cần
thiết đó để làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong dầu cá tự nhiên đã
được biết đến từ khá lâu và hiện tại có rất nhiều phương pháp khác nhau

để thực hiện quá trình này. Trong số đó, phương pháp sử dụng enzym
lipase đã thể hiện được nhiều ưu điểm nổi trội so với các phương pháp
hóa học truyền thống trước đây.
Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm hiện đang là một
trong những định hướng ứng dụng quan trọng của lipase, đặc biệt trong
công nghệ sản xuất các sản phẩm có chứa hàm lượng cao các axit béo
thiết yếu. Tầm quan trọng của các axit béo chưa bão hòa (PUFA) đối với
chế độ dinh dưỡng thể hiện ở việc giúp ngăn ngừa rất nhiều bệnh tật.
Điều này đã được khoa học chứng minh từ ba thập kỷ trước. Đặc biệt,
omega-3 (trong đó có DHA và EPA) tham gia vào quá trình hình thành
các hoocmon - đóng một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình phát
triển của cơ thể người. Các axit béo thiết yếu này được xem là không thể
thiếu cho sự phát triển của trẻ em.


4
Trong công nghiệp chế biến chất béo trước đây, thông thường
người ta sử dụng các phương pháp hóa học để thủy phân dầu mỡ thành
glycerol và các axit béo, sau đó sử dụng phương pháp vật lý để tinh
sạch. Những năm gần đây, phương pháp làm giàu axit béo bằng xúc tác
enzym thường được lựa chọn để thu nhận và tinh sạch các axit béo
không no nhiều nối đôi, do chúng dễ bị oxy hóa và phân hủy ở nhiệt độ
cao trong các quá trình chưng cất truyền thống. Chính vì vậy, enzym
lipase đóng một vai trò hết sức quan trọng đối với nhóm phương pháp
này.
Các phương pháp làm giàu DHA và EPA bằng lipase có những
ưu điểm vượt trội so với các phương pháp vật lý và hóa học truyền
thống. Bản chất của phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá
bằng lipase dựa trên đặc điểm chọn lọc axit béo và sự phân biệt của
lipase đối với các PUPA ω-3 có nối đôi gần nhóm carboxyl. Đặc biệt,

các lipase cố định có thể tái sử dụng mà không làm giảm đáng kể khả
năng xúc tác. Điều này giúp ta thấy được hướng ứng dụng tiềm năng của
loại enzym này trong lĩnh vực xử lý dầu cá nhằm mục đích làm giàu các
axit béo thiết yếu.
Phần lớn lipase được sử dụng trong các nghiên cứu tính đến
thời điểm này có nguồn gốc chủ yếu từ vi sinh vật. Cho đến nay, ở Việt
Nam chưa có công trình nghiên cứu nào ứng dụng enzym lipase từ thực
vật để làm giàu DHA và EPA trong dầu cá. Vì vậy, sử dụng enzym
lipase từ thực vật (đu đủ) để thủy phân dầu cá hồi nhằm tạo nên sản
phẩm giàu DHA và EPA có thể nói là một định hướng mới và hứa hẹn
cho kết quả khả quan, bởi các enzym từ thực vật có những ưu thế riêng
so với enzym từ các nguồn khác. Bên cạnh đó, Việt Nam là một đất
nước có bờ biển dài với nguồn hải sản phong phú cũng như sở hữu diện
tích đất nông nghiệp rộng lớn – rất phù hợp với mục tiêu mà đề tài đang
hướng đến là tận dụng những nguồn nguyên liệu sẵn có nhằm giảm giá
thành sản phẩm.


5
Nhận thấy được tiềm năng phát triển rất lớn của nguồn lipase
thực vật nói chung và từ đu đủ nói riêng, với mục đích làm sáng tỏ
những đặc tính của enzym lipase từ mủ quả đu đủ cũng như khả năng
ứng dụng của loại enzym này trong công nghiệp thực phẩm, chúng tôi
đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính của enzym lipase từ
mủ đu đủ và ứng dụng vào quá trình làm giàu DHA, EPA trong dầu
cá hồi”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Xác định một số đặc tính của enzym lipase từ mủ quả đu đủ, bao gồm:
+ Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym trên cơ chất là dầu cá
hồi.

+ Tính đặc hiệu của enzym với axit béo no/không no.
- Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bởi lipase từ mủ đu đủ nhằm
mục đích làm giàu hàm lượng axit béo DHA và EPA thông qua các
phương pháp khác nhau.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mủ đu đủ: được thu từ một số vườn đu đủ trồng tại huyện Đại Lộc,
tỉnh Quảng Nam.
- Dầu cá hồi: dầu cá được tách chiết từ lường cá hồi được mua tại Công
ty TNHH chế biến thực phẩm D&N, tại 01 Nguyễn Phục, Thọ Quang,
Sơn Trà, Đà Nẵng.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu sử dụng các phương pháp cơ bản và phù hợp với quy mô
phòng thí nghiệm.
- Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa chính xác trên các đối tượng là enzym
lipase được thu nhận từ đu đủ trồng tại các nhà vườn ở huyện Đại Lộc,
tỉnh Quảng Nam và cá hồi có nguồn gốc tại thành phố Đà Nẵng.


6
4. Phương pháp nghiên cứu
4.1. Phương pháp thu nhận
- Phương pháp thu nhận mủ đu đủ
- Phương pháp thu nhận dầu cá hồi
4.2. Phương pháp hóa sinh
- Phương pháp xác định chỉ số acid
- Phương pháp xác định chỉ số xà phòng hóa
- Phương pháp xác định hoạt độ của lipase đối với cơ chất dầu cá hồi:
+ Phương pháp chuẩn độ
+ Phương pháp đo quang

- Phương pháp xác định tính đặc hiệu của lipase với các loại axit béo
- Phương pháp làm giàu DHA và EPA trong dầu cá hồi xúc tác bởi
enzym lipase thô từ mủ đu đủ
- Phương pháp xác định hàm lượng axit béo trong dầu cá.
Và một số phương pháp thực nghiệm khác.
4.3. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu
5.

ngh a h a học và th c ti n của đề tài nghiên cứu

5.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Xác định một số đặc tính của enzym lipase thu được từ mủ quả đu đủ ở
Đại Lộc, Quảng Nam, trong đó có tính đặc hiệu của loại enzym này đối
với axit béo no hoặc không no (là kết quả chưa từng được công bố trước
đó).
- Xác định được một số đặc tính cơ bản của dầu cá hồi.
- Đánh giá hiệu quả của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng lipase từ
mủ quả đu đủ nhằm mục đích làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong
dầu cá.


7
5.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Tận dụng được nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền.
- Làm giàu hàm lượng DHA và EPA trong dầu cá hồi để sản xuất ra
những sản phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng và chăm sóc sức khỏe của
người tiêu dùng với giá trị cao.
- Tạo công ăn việc làm cho người nông dân và ngư dân.
- Nguồn gốc enzym từ tự nhiên sẽ đảm bảo an toàn cho người sử dụng,
rất thích hợp để ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm.

6. Kết cấu luận văn
Luận văn có bố cục cụ thể như sau:
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Tài liệu tham khảo
Phụ lục


8
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYM LIPASE
1.1.1. Giới thiệu chung
1.1.2. Cấu trúc enzym
1.1.3. Đặc tính xúc tác
1.1.4. Cơ chế xúc tác
1.1.5. Tính chất
1.1.5.1. Tính đặc hiệu
1.1.5.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xúc tác bởi enzym
1.1.6. Ứng dụng của enzym lipase
1.1.7. Ưu thế của phản ứng được xúc tác bởi lipase
1.1.8. Nguồn gốc của lipase
1.1.9. Lipase từ mủ đu đủ
1.1.9.1. Sơ lược về lipase thực vật
1.1.9.2. Vài đặc điểm của cây đu đủ
1.1.9.3. Mủ đu đủ và lipase từ mủ đu đủ

1.2. DẦU CÁ VÀ NGUỒN DINH DƯỠNG TỪ DẦU CÁ
1.2.1. Dầu cá
1.2.2. Nguồn dinh dưỡng từ dầu cá: Omega-3
1.2.3. Dầu cá hồi – nguồn cung cấp DHA, EPA
1.3. ỨNG DỤNG LIPASE LÀM GIÀU DHA, EPA TRONG DẦU
CÁ
Dựa trên hai phản ứng đặc trưng nhất của lipase là phản ứng
thủy phân (hydrolysis) và ester hóa (esterification), có hai phương pháp
làm giàu DHA, EPA tương ứng hiện vẫn được dùng phổ biến.


9
1.3.1. Phản ứng thủy phân dầu cá
1.3.2. Phản ứng ester hóa
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
1.4.1. Nghiên cứu trong nước
1.4.2. Nghiên cứu ngoài nước
Hiện trên thế giới vẫn chưa có công trình cụ thể nào về khả
năng ứng dụng sửa đổi cấu trúc – làm giàu DHA, EPA từ nguồn chất
béo là dầu cá hồi bởi enzym lipase từ một loại thực vật phổ biến là đu
đủ. Nghiên cứu của chúng tôi nhằm làm sáng tỏ thêm đặc tính của
enzym lipase khi hoạt động trên một cơ chất cụ thể là dầu cá hồi, cũng
như kiểm tra tính hiệu quả của việc làm giàu DHA, EPA trong dầu cá
nhờ enzym từ đu đủ nói riêng, thực vật nói chung.


10
CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
2.1.2. Hóa chất
2.1.3. Thiết bị
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ
2.2.1.1. Thu nhận mủ đu đủ
2.2.1.2. Thu nhận enzym thô từ mủ đu đủ
2.2.1.3. Hiệu suất thu nhận
2.2.2. Phương pháp thu nhận dầu cá hồi
2.2.3. Phương pháp vật lý và hóa lý
2.2.3.1. Xác định khối lượng mẫu
2.2.3.2. Xác định nhiệt độ
2.2.3.3. Xác định độ pH
2.2.3.4. Phương pháp sấy
2.2.4. Phương pháp hóa sinh
2.2.4.1. Phương pháp xác định chỉ số acid
2.2.4.2. Phương pháp xác định chỉ số xà phòng hóa
2.2.4.3. Phương pháp đo quang xác định hoạt độ của lipase thô
2.2.4.4. Phương pháp chuẩn độ xác định hoạt độ của lipase đối với cơ
chất dầu cá hồi
2.2.4.5. Phương pháp xác định tính đặc hiệu axit béo của lipase đối với
cơ chất
- Phương pháp đo hoạt độ bằng chuẩn độ.


11
- Phương pháp so sánh hoạt độ bằng đĩa thạch.
2.2.4.6. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt
độ lipase

2.2.4.7. Phương pháp thủy phân làm giàu DHA và EPA trong dầu cá hồi
bằng enzym lipase
- Hiệu suất thủy phân [23]: được tính theo công thức:
( )

2.2.4.8. Phương pháp ester hóa kết hợp phương pháp kết tinh với ure
làm giàu DHA, EPA trong dầu cá hồi bằng enzym lipase
- Dạng sản phẩm sau phản ứng: được đánh giá thông qua hiệu suất
ester hóa (%).

- Hiệu suất thu hồi DHA, EPA sau phản ứng (DHA/EPA rec very):

(

)

(

)

(

)

- Hiệu quả làm giàu DHA, EPA:
(

)

(

(

)
)

(

)
(

)

2.2.4.9. Phương pháp xác định hàm lượng axit béo trong dầu cá
2.2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
2.2.6. Phương pháp thống kê và xử lý số liệu


12
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA ENZYM LIPASE
TỪ MỦ ĐU ĐỦ
3.1.1. Đánh giá hiệu suất thu nhận
3.1.2. Đánh giá hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.2.1. Xác định thời gian đo hoạt độ
Trong phản ứng xúc tác với enzym, hoạt độ enzym sẽ tăng dần
theo thời gian, nhưng mức độ tăng khác nhau. Có một khoảng thời gian
xác định mà tại đó, mức độ thay đổi hoạt độ theo thời gian là lớn nhất.
Lúc này, vận tốc phản ứng là cao nhất, mức hoạt độ đo được tại thời
điểm này phản ánh chính xác hoạt lực của enzym.

Tiến hành thí nghiệm đo hoạt độ tại các mốc thời gian khác nhau.
Kết quả sự biến thiên của chỉ số acid theo thời gian được thể hiện đồ thị
hình 3.2.

Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn sự thay đổi vận tốc phản ứng (∆V/t) theo thời gian


13
Kết luận: thời gian tối ưu để xác định hoạt lực enzym lipase từ
mủ đu đủ trên cơ chất dầu cá hồi là 15 phút.
3.1.2.2. Hoạt độ của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.3. Nghiên cứu tính đặc hiệu của chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ
3.1.3.1. Xác định tính đặc hiệu bằng phương pháp chuẩn độ
Tiến hành xác định hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên
những cơ chất khác nhau. Kết quả thể hiện trên biểu đồ hình 3.3:

Dầu đậu nành

Loại cơ chất

Hình 3.3. Hoạt độ lipase mủ đu đủ trên các loại cơ chất khác nhau
Thứ tự hoạt độ enzym trên cơ chất khác nhau:
Triglycerid của axit bé bất bã hòa đa > Triglycerid của
axit bé bất bã hòa đơn > Triglycerid của axit bé n
Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu đối với các
triglycerid có thành phần là các axit béo không no nhiều nối đôi trong
phân tử.


14

3.1.3.2. Xác định tính đặc hiệu bằng phương pháp đĩa thạch
Phương pháp đĩa thạch: là phương pháp định tính, dễ quan sát, sử dụng
để kiểm chứng lại hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ.
- So với lipase khác: hoạt độ của lipase đu đủ thể hiện khá tốt (hình 3.4)

(a)

(b)

(c)

Hình 3.4. Hoạt độ trên cùng cơ chất dầu cá hồi của hai loại lipase khác
nhau; hình (a) lipase thương mại; hình (b) lipase thô; hình (c) không dùng
lipase

- Quan sát hoạt động của lipase trên hai cơ chất là triolein và dầu cá hồi:
hoạt độ của lipase đu đủ thể hiện cao hơn trên cơ chất dầu cá hồi.

(a)

(b)

Hình 3.5. Hoạt độ trên hai đĩa cơ chất khác nhau của lipase từ mủ đu đủ;
hình (a) cơ chất triolein; hình (b) cơ chất dầu cá hồi

Kết luận: enzym lipase mủ đu đủ có tính đặc hiệu đối với các
triglycerid có thành phần là các axit béo không no nhiều nối đôi trong
phân tử.

15
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt độ enzym lipase
thô trên cơ chất dầu cá hồi
3.1.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của enzym lipase thô từ mủ
đu đủ
Khảo sát hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu
cá hồi tại các mức nhiệt độ khác nhau để tìm ra mức nhiệt độ tối ưu của
enzym. Kết quả thể hiện qua đồ thị hình 3.6.
255,56a

198,89b
188,89

b

134,44c

134,45c

94,44c,d
81,11d

o

Nhiệt độ ( C)

Hình 3.6. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các mức nhiệt độ khác nhau
đến hoạt độ enzym
Kết luận: mức nhiệt độ tối ưu là 45oC.

16
3.1.4.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của enzym lipase thô từ mủ đu
đủ
Khảo sát hoạt độ của enzym lipase từ mủ đu đủ trên cơ chất dầu
cá hồi tại các mức pH khác nhau để tìm ra mức pH tối ưu cho enzym.
Kết quả thể hiện qua đồ thị hình 3.7.
262,22a

231,11b

226,67b

224,45b
213,33b,c
207,78b,c
204,44b,c
193,33c,d
187,78c,d

Hình 3.7. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của các mức pH khác nhau đến
hoạt độ enzym
Kết luận: mức pH tối ưu bằng 8.
3.2. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG LIPASE MỦ ĐU ĐỦ ĐỂ LÀM
GIÀU DHA VÀ EPA TRONG DẦU CÁ HỒI
3.2.1. Một số đặc điểm của dầu cá hồi thô
3.2.1.1. Xác định các chỉ số chất lượng của dầu cá hồi thô
Đã xác định được một số chỉ số chất lượng của dầu cá hồi thô.

17
3.2.1.2. Xác định thành phần axit béo có trong dầu cá hồi
Đã xác định được thành phần axit béo có trong dầu cá hồi, trong đó
DHA chiếm 4,11% và EPA chiếm 4,03%.
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ứng dụng enzym lipase từ mủ đu đủ để làm
giàu DHA, EPA
Một trong những xu hướng ứng dụng quan trọng của enzyme
lipase hiện nay là làm giàu các axit béo omega-3 có lợi có sức khỏe (đặc
biệt là DHA và EPA) từ nguồn nguyên liệu sẵn có (các loại dầu cá).
Trong đề tài nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn dầu cá hồi là nguồn
nguyên liệu chính để thực hiện quá trình làm giàu.
Trong phần trình bày dưới đây, chúng tôi sử dụng hai đặc tính
xúc tác của lipase để phục vụ cho nghiên cứu, bao gồm đặc tính xúc tác
cho phản ứng ester hóa giữa axit béo và ancol (3.2.2.1); và đặc tính xúc
tác cho phản ứng thủy phân chất béo (3.2.2.2). Đây là hai phản ứng có
chiều nghịch nhau [48], chính việc tận dụng được đặc điểm xúc tác cho
cả hai loại phản ứng này khiến ứng dụng của enzym lipase trở nên linh
hoạt và đa dạng.
3.2.2.1. Làm giàu theo phương pháp tạo kết tinh với ure kết hợp ester
hóa bằng lipase từ mủ đu đủ
Phương pháp d a trên tính xúc tác ch phản ứng ester hóa của
enzym lipase.
Quy trình của phương pháp:
Bước 1: Thực hiện xà phòng hóa dầu cá bằng dung dịch kiềm đặc nhằm
thủy phân toàn bộ các axit béo có trong dầu cá, tách hỗn hợp axit béo
này khỏi hỗn hợp, sau đó axit hóa trở lại để thu các axit béo này dưới
dạng tự do.
Bước 2: Tiến hành loại bỏ các axit béo no ra khỏi hỗn hợp bằng phương
pháp kết tinh với ure. Các axit béo không cần thiết này sẽ phản ứng với
ure tạo kết tủa. Lọc bỏ kết tủa, thu được hỗn hợp các axit béo bất bão

hòa (trong đó có DHA, EPA).


18
Bước 3: Thực hiện phản ứng ester hóa giữa hỗn hợp các axit béo bất
bão hòa đa với glycerol dưới sự xúc tác của enzym lipase từ mủ đu đủ.
Đánh giá hiệu quả của phương pháp.
a) Xây dựng đường chuẩn xác định hàm lượng DHA, EPA dạng tự do
trong dầu cá
Đã xây dựng được đồ thị đường chuẩn DHA và EPA với hệ số
tương quan cao, thích hợp để đánh giá hàm lượng DHA, EPA tự do
trong mẫu bằng phương pháp HPLC.
b) Nghiên cứu xác định điều kiện kết tủa axit béo trong dầu cá bằng ure
Mô hình thực nghiệm bậc 2 tâm trực giao của Box-Wilson được
lựa chọn nhằm tìm kiếm các yếu tố ảnh hưởng phù hợp, sao cho khối
lượng kết tủa thu được là lớn nhất.
Hàm mục tiêu là: khối lượng kết tủa sau phản ứng với ure (để
loại bỏ được nhiều nhất các loại axit béo no và không no một nối đôi).
Hai yếu tố ảnh hưởng được lựa chọn là:
- Z1: Tỉ lệ ure : axit béo
- Z2: Thời gian phản ứng
Tiến hành các thí nghiệm theo quy hoạch đề ra, phân tích dữ
liệu và tìm ra phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố
đến mục tiêu như sau:
Y=2.1347 - 0.4667.x1 + 0.1332.
Phương trình hồi quy được đánh giá là phù hợp. Dựa vào
phương trình hồi quy, tìm được giá trị của hai biến ảnh hưởng sao cho
giá trị của hàm mục tiêu lớn nhất; đó là tỉ lệ ure : axit béo = 3:1 và thời
gian phản ứng là 8 giờ.
c) Đánh giá hiệu quả của phương pháp

- Thực hiện quy trình làm giàu với điều kiện tối ưu, xác định hàm lượng
DHA tại các thời điểm khác nhau để tính toán.


19
- Lúc đầu, 50 g dầu cá được đem đi tiến hành quá trình làm giàu, với
4,11% là DHA và 4,03% là EPA (phần 3.2.1.2), từ đó tính được khối
lượng DHA và EPA thực tế trong mẫu ban đầu lần lượt là 2,055 g và
2,015 g.
- Đến giai đoạn kết thúc quá trình ure loại bỏ các axit béo no (kết thúc
bước 2), thể tích mẫu thu được là 9,2 ml với khối lượng là 8,9 g. Lúc
này, tiến hành chạy HPLC đo được nồng độ DHA trong mẫu là 0,44M.
Dễ dàng tính được khối lượng DHA có trong mẫu là:
mDHA = nDHA. MDHA = CDHA. VddDHA. MDHA = 0,44. 9,2. 10-3. 328,5 = 1,33 g

Tương tự tính được:
mEPA = nEPA. MEPA = CEPA. VddEPA. MEPA = 0,176. 9,2. 10-3. 302,45 = 0,49 g

(Trong đó: m là khối lượng chất, n là số mol chất, M là khối lượng mol
chất (phân tử lượng), C là nồng độ chất và Vdd là thể tích dung dịch).
- Hiệu suất thu hồi DHA (DHA rec very) sau cả quá trình như sau:
( )

- Hiệu suất của quá trình ester hóa của mỗi l ại axit bé (hiệu suất
bước 3) căn cứ vào nồng độ DHA và EPA trước và sau phản ứng ester
hóa:
( )
( )

Tỉ lệ 75,5% và 65,34% là tỉ lệ chuyển hóa khá tốt đối với kiểu phản ứng

này.
- Tỉ lệ phần trăm của DHA tr ng hỗn hợp cuối cùng sau ester hóa:
( )

Tỉ lệ này có thể tăng cao đến 9,1%, tương ứng với mức làm giàu là 1,84
lần nếu loại bỏ glycerol dư sau phản ứng ester hóa.


20
3.2.2.2. Làm giàu theo hương pháp thủy phân bằng xúc tác lipase từ mủ
đu đủ
Phương pháp d a trên tính xúc tác ch phản ứng thủy phân của
enzym lipase.
- Hiệu suất của quá trình thủy phân (DH – degree of hydrolysis) được
dùng để đánh giá quá trình thủy phân.
- Khi thực hiện phản ứng thủy phân dầu cá bằng enzym lipase, chỉ cần
mức độ thủy phân (DH) của phản ứng đạt khoảng 50% là đạt yêu cầu.
a) Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ enzym/cơ chất đến hiệu suất thủy
phân
Tiến hành các phản ứng thủy phân với tỉ lệ enzym/cơ chất khác nhau,
lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%. Đo hiệu suất thủy phân tương
ứng. Kết quả thu được ở hình 3.18.

54,11f
52,50e
51,98e
50,71d
49,26c

46,05b

42,33a

Tỉ lệ enzym/cơ chất (%)

Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của các mức tỉ lệ enzym/cơ chất
đến hiệu suất thủy phân


21
Kết luận: tỉ lệ enzym/cơ chất phù hợp là 4% với mức hiệu suất thủy
phân tương ứng là 50,71%.
b) Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thủy phân
Tiến hành phản ứng thủy phân tại các mốc thời gian khác nhau; lần lượt
là 4 giờ, 8 giờ, 12 giờ, 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ, 28 giờ, 32 giờ. Đo hiệu
suất thủy phân tương ứng. Kết quả thu được ở hình 3.20.

f
54,53f 54,50

51,42e
50,21
47,82

e

d

45,24c
43,08b

38,24a

Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu
suất thủy phân
Kết luận: 20 giờ là khoảng thời gian tối ưu để thực hiện phản ứng thủy
phân dầu cá hồi dưới xúc tác của enzym lipase từ mủ đu đủ, với mức
hiệu suất thủy phân tương ứng là 50,21%.


22
c) Đánh giá hiệu quả của phương pháp
- Dựa trên hàm lượng DHA, EPA trước và sau phản ứng thủy phân, có
thể kết luận enzym lipase từ mủ đu đủ là một enzym đặc hiệu với DHA.
- Hiệu suất thủy phân đối với DHA:
3.2.2.3. Đánh giá hai phương pháp làm giàu
Trình bày, so sánh một số ưu, nhược điểm của hai phương pháp làm
giàu.


23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận:
1. Đã nghiên cứu được một số đặc tính của enzym lipase từ mủ đu đủ:
- Hiệu suất thu nhận enzym lipase từ mủ đu đủ là 19,31%.
- Thời gian tối ưu để xác định hoạt độ là 15 phút, với mức hoạt độ tương
ứng trên cơ chất dầu cá hồi là 232,41U/g.
- Enzym có tính đặc hiệu đối với chất béo của các axit béo không no,
nhiều nối đôi.
- Xác định được mức nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu cho enzym lipase

trên cơ chất dầu cá hồi lần lượt là 45oC và 8.
2. Đã nghiên cứu ứng dụng lipase từ mủ đu đủ để làm giàu DHA, EPA
trong dầu cá hồi:
- Xác định được một số đặc điểm của dầu cá hồi, bao gồm các chỉ số
chất lượng và thành phần axit béo trong dầu cá.
- Làm giàu bằng phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa: xác
định được tỉ lệ ure : axit béo và thời gian tối ưu trong phản ứng kết tinh
với ure lần lượt là 3/1 và 8 giờ. Mức độ làm giàu DHA trong sản phẩm
là 1,84 lần so với dầu cá ban đầu, hiệu suất thu hồi axit béo 64,88%. Tỉ
lệ DHA, EPA chuyển thành dạng glycerid lần lượt đạt 75,50% và
65,34%.
- Làm giàu bằng phương pháp thủy phân: xác định được mức tỉ lệ
enzym/cơ chất và thời gian để hiệu suất phản ứng đạt 50% lần lượt là
4% và 20 giờ. Hiệu suất thủy phân DHA đạt 63,30%.
Kiến nghị:
1. Nghiên cứu bổ sung thêm một số đặc tính khác của enzym lipase từ
mủ đu đủ, hoàn thiện các kết quả hiện có.
2. Nghiên cứu phương pháp tối ưu loại bỏ glycerol trong cách làm giàu
theo phương pháp kết tinh với ure kết hợp ester hóa.