HÃY TRÌNH bày NHỮNG HIỂU BIẾT của bạn về TÍNH CHẤT, các CÔNG NGHỆ CHẾ tạo PHỔ BIẾN (PHƯƠNG PHÁP hóa học) và ỨNG DỤNG của các hạt NANO OXXIT sắt (fe3o4) từ TÍNH

Bộ Giáo dục và Đào tạo
Trường Đại học Quy Nhơn

TIỂU LUẬN
BÀI THI CUỐI KỲ 1

Môn: Vật lý vật liệu nano

Đề tài: HÃY TRÌNH BÀY NHỮNG HIỂU BIẾT CỦA

BẠN VỀ TÍNH CHẤT, CÁC CÔNG NGHỆ CHẾ
TẠO PHỔ BIẾN (PHƯƠNG PHÁP HÓA HỌC) VÀ
ỨNG DỤNG CỦA CÁC HẠT NANO OXXIT SẮT
(Fe3O4) TỪ TÍNH?

Tên người làm: Lê Thị Diễm Hằng
Lớp: Cao học Vật Lý-K20
Giáo viên: PGS.TS.Phạm Thành Huy
Quy Nhơn, Năm 2018


MỤC LỤC
Trang
1. Một số tính chất của hạt nano từ tính Fe3O4 :........................................................1
1.1. Kết quả đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4....................................................1
1.2. Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe3O4:........................................................2
2. Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học):........................................4
3. Ứng dụng của các hạt nano ô xít sắt(Fe3O4) từ tính.................................................4
3.1. Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào:...........4
3.1.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4:...........................................4
3.1.2 Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào.............................................................7

3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4........7
3.1.2.2. Gắn kết với tế bào bạch cầu:..................................................................9


1. Một số tính chất của hạt nano từ tính Fe3O4 :
1.1. Kết quả đo phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4
Mục đích chính của phép đo này là xác định được cấu trúc và kích thước hạt
của mẫu Fe3O4. Mẫu Fe3O4 sau khi được chế tạo thì được rửa bằng nước cất vài
lần, tiếp theo được tiến hành sấy khô thành dạng bột. Sau đó mẫu được đem đi ghi
phổ nhiễu xạ tia X(XRD). Hình 1 là kết quả đo XRD của mẫu hạt Fe 3O4. Phổ nhiễu
xạ được so sánh với PDF 790418 với bước sóng Cu Kα1.
Kết quả này cho thấy các đỉnh nhiễu xạ thuộc về Fe 3O4 chứng tỏ các mẫu
chứa phần lớn là Fe3O4. Đồng thời các đỉnh nhiễu xạ cực đại, do đó mẫu được tạo
thành ở dạng tinh thể. Các đỉnh nhiễu xạ cực đại tương ứng với các đỉnh chuẩn của
cấu trúc oxit sắt từ dạng nano. Trong kết quả đo nhiễu xạ tia X không thấy có xuất
hiện đỉnh nhiễu xạ cực đại nào lạ, chứng tỏ rằng chỉ có pha ôxit sắt từ cấu trúc tinh
thể. Sự mở rộng của các đỉnh nhiễu xạ nguyên nhân chính là do trạng thái cấu trúc
của bản thân hạt từ gây nên.
Kích thước trung bình của hạt được tính từ đỉnh nhiễu xạ có cường độ mạnh
nhất trong phổ nhiễu xạ tia X, vị trí 2θ vào cỡ 35o sử dụng công thức Scherrer (1):
D= (1)
với D là đường kính hạt trung bình, λ là bước sóng tia X tới (λ = 1,54056 Ǻ) ,
B là độ rộng phổ (B=0,62 o), θ là vị trí đỉnh nhiễu xạ (17,5 o). Kết quả tính toán thu
được:
D=13,51 nm
Từ đây có thể khẳng định được rằng, chúng tôi đã chế tạo được hạt nano từ
tính Fe3O4 với đường kính vào khoảng cỡ vào khoảng 10-16 nm.

1

(4 2 2 )
(3 3 3 )

(4 0 0 )

(2 2 2 )
30

40

(4 4 0 )

(3 1 1 )
(2 2 0 )

In tensity
20

50

60

70

2 (degree)

Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X của mẫu Fe3O4
1.2. Ảnh TEM của mẫu hạt nano từ tính Fe3O4:
Sau khi mẫu Fe3O4 được tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X để có thể khẳng định

rằng đã chế tạo được hạt nano từ tính Fe 3O4 và xác định được cấu trúc và kích
thước hạt dựa trên các tính toán lý thuyết thì chúng tôi tiếp tục tiến hành chụp ảnh
TEM cho mẫu Fe3O4 với mong muốn có thể xác định rõ hơn về kích thước cũng
như cấu trúc hạt nano từ tính Fe 3O4. Trước khi đem đi chụp ảnh TEM thì mẫu
Fe3O4 được rửa nhiều lần bằng nước cất và được đánh siêu âm trong vòng 15-30
phút để cho các hạt phân tán đều trong nước. Bằng cảm quan chúng tôi có thể thấy
rằng khi các hạt nano từ tính Fe3O4 được phân tán đều trong nước thì dung dịch đó
có màu đen, và các hạt là có từ tính bởi theo một cách đơn giản là dùng một miếng
nam châm nhỏ đặt ở đáy cốc thì sau chừng 10-15 phút các hạt sẽ bị lắng xuống
phía dưới đáy cốc, sau một thời gian để ở ngoài không khí thì dung dịch có chuyển
sang màu hơi nâu.
1.3. Tính chất từ:
2


Tiến hành đo đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4 dạng bột sấy khô ở nhiệt độ
phòng sử dụng hệ đo là thiết bị từ kế mẫu rung. Mục đích của phép đo là xác định
tính chất từ và từ độ bão hòa của mẫu Fe3O4. Kết quả thu được thể hiện trên hình 2:
100
80

B

60
40

M(H)

20
0

-20
-40
-60
-80
-100
-15000 -10000

-5000

0

5000

10000

15000

H (Oe)

Hình 2: Đường cong từ hóa của mẫu Fe3O4
Kết quả này cho ta thấy rằng lực kháng từ H c=0, mặt khác có thể thấy rằng từ
độ dư Mr=0, tức là không có hiệu ứng trễ hầu như không đáng kể, vậy có thể nhận
xét được rằng các hạt nano từ tính Fe 3O4 có tính chất siêu thuận từ. Đường cong là
một đường đối xứng, từ độ bão hòa (tính theo emu/g) là tương đối cao, cụ thể trên
đồ thị ta có thể thấy M S=80 emu/g, trong khi đó từ độ bão hòa của mẫu khối là 90
emu/g, như vậy có thể thấy từ độ bão hòa của hạt nano từ tính Fe 3O4 là tương đối
cao, tuy nhiên vẫn thấp hơn giá trị từ độ bão hòa của mẫu khối.

3

2. Các công nghệ chế tạo phổ biến ( phương pháp hóa học):
Phương pháp này dựa trên phản ứng thủy phân muối FeSO 4 để tạo ra hạt nano
sắt từ. Quy trình thực hiện tiến hành theo các bước cụ thể sau. Sau khi rửa sạch các
dụng cụ thí nghiệm thì dung dịch muối FeSO 4 được pha chế bằng cách cho 17,71 g
muối FeSO4 hòa với 200 ml nước cất, tương tự 10,11 KNO 3 hòa vào 100 ml nước
cất, và 13,81 g KOH pha với 50 ml nước cất, ba dung dịch trên được pha chế ở ba
cốc thí nghiệm khác nhau, sau khi pha xong các dung dịch trên được lọc bằng giấy
lọc định lượng trước khi được đưa vào tiến hành thí nghiệm.
Các dung dịch đã được chuẩn bị như trên được đổ vào một bình thủy tinh 1L
theo thứ tự ở trên và được khuấy bằng máy khuấy từ gia nhiệt. Hỗn hợp phản ứng
được gia nhiệt tới 90oC và được giữ trong vòng 2h, toàn bộ thí nghiệm được tiến
hành trong môi trường khí nitơ.
Sau 2h, khí nitơ được tắt và bình thủy tinh chứa hỗn hợp sau phản ứng được
đưa ra khỏi máy khuấy từ và để ở nhiệt độ phòng trong một giờ.
Tiếp theo, hỗn hợp này được rửa 2 lần bằng nước cất (2L), 1 lần với axit nitric
1M (1L), và cuối cùng là rửa với 2 lần nữa với nước cất (2L). Phần chất rắn màu
đen được tách xuống dưới bằng cách sử dụng một miếng nam châm, sau đó loại bỏ
đi phần dung dịch ở trên, tiếp tục quá trình rửa bằng nước cất nếu thấy cần thiết
cho tới khi dung dịch ở phía trên đã trở nên sạch. Cuối cùng, toàn bộ sản phẩm
được giữ trong 1L nước, thông thường phương pháp này cho ta 10 g sản phẩm.
Theo phân tích thì các hạt được tạo ra là Fe 3O4 nhưng với kích thước lớn hơn
so với phương pháp đồng kết tủa và các hạt nano Fe 3O4 sau khi được tạo thành rất
dễ bị kết đám lại với nhau chỉ sau thời gian ngắn.
3. Ứng dụng của các hạt nano ô xít sắt(Fe3O4) từ tính
3.1. Ứng dụng hạt nano từ tính Fe3O4 trong đánh dấu và tách chiết tế bào:
3.1.1. Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4:
Để có thể ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải được chức năng hóa
bề mặt để gắn kết với các đối tượng sinh học như DNA, kháng thể, enzyme. Các
4

nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, cacbonxyl, thiol. Để có
được các nhóm chức trên bề mặt hạt nano, người ta sử dụng nguyên tắc thủy phân
organosilane để tạo ra môt lớp polymer trên bề mặt hạt nano.
Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là: X(CH2)n-SiRn(OR’)3-n. Trong đó thì X là nhóm chức cần thiết để có thể gắn kết với
các đối tượng sinh học, (CH2)n là nhóm đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm
này có thể dày hay mỏng. SiRn là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt
nano.
Alkoxysilane với rất nhiều nhóm chức X khác nhau đã được thương mại hóa.
Trong các ứng dụng về sinh học thì nhóm chức amino được sử dụng nhiều nhất.
Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản
ứng đồng thời, đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm
silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm OH tự do trên bề
mặt của hạt nano từ tính Fe3O4 để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững.
Trong quá trình tiến hành chức năng hóa bề mặt thì điều kiện của môi trường
phản ứng có ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chức năng hóa bề mặt. Ví dụ như
cồn thì thường làm gia tăng quá trình thủy phân và động học hóa rắn do đó làm
tăng cường quá trình chức năng hóa bề mặt, tuy nhiên cồn cũng cạnh tranh với
nhóm silane trên bề mặt bằng liên kết hydro.
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 3-aminopropyl triethoxysilane
(APTS, n=2) để tạo ra nhóm chức amino trên bề mặt hạt nano. Quy trình chức
năng hóa bề mặt gồm các bước như sau: Lấy 400 mg hạt nano từ tính cho vào 100
ml nước cất hai lần. Dùng máy siêu âm để phân tán hạt và dụng dịch để được một
thể huyền phù ổn định. Nhỏ 1 ml dung dịch APTS vào trong dung dịch huyền phù
nói trên và dùng máy khuấy từ để khuấy trong vòng 8 giờ cho quá trình chức năng
hóa bề mặt xảy ra hoàn toàn. Kết thúc quá trình này ta thu được sản phẩm, đem lọc
rửa 5 lần bằng lần bằng nước cất và lọc từ sẽ thu được hạt nano từ tính Fe3O4 có bề
mặt là các nhóm amino. Lúc này hạt ta có thể gắn hạt nano với kháng thể antiCD4
phát huỳnh quang và không phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu T. Kháng thể

anCD4 là kháng thể có khả năng đối ứng với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào
5


bạch cầu CD4+ T, nhờ khả năng phát huỳnh quang của kháng thể giúp cho việc
đếm tế bào bạch cầu được dễ dàng hơn với độ chính xác cao

Hình 3: Chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính Fe3O4 bằng nhóm amino sử dụng
APTS (Hạt nano sau khi được chức năng hóa bề mặt được gọi tắt là Amino-NP).
Nguyên tắc của phép xác định này là dùng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3)
cho phản ứng với các hạt nano Fe3O4 có nhóm chức NH2 trên bề mặt, sau đó đo
dung dịch sau phản ứng bằng phép đo phổ hấp thụ (UV Vis), phép đo sẽ xác định
số lượng 4-Nitrobenzaldehyde (C7H5NO3) ở trong dung dịch, từ đó có thể xác định
được số nhóm amino trên bề mặt hạt nano. Trong cấu tạo phân tử của 4Nitrobenzaldehyde có tồn tại cấu trúc vòng benzen 6 cạnh, vì vậy khi đo phổ hấp
thụ UV-Vis sẽ cho các đỉnh hấp thụ tương ứng với các nồng độ khác nhau. Phổ hấp
thụ cho thấy ở bước sóng 270 nm thì có các đỉnh hấp thụ như hình 3:

6


sample 30 microgram/ml
sample 27 microgram/ml
sample 24 microgram/ml
sample 18 microgram/ml
sample 15 microgram/ml
sample 12 microgram/ml

2.5

Intensity

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
150

200

250

300

350

400

-1

wave number (cm )

Hình 4: Phổ hấp thụ của dung dịch chứa 4-Nitrobenzaldehyde với các nồng độ
khác nhau.

Sau khi tiến hành đo phổ hấp thụ xong có thể xây dựng một đường miêu tả sự

phụ thuộc của nồng độ 4-Nitrobenzaldehyde có trong dung dịch với cường độ phổ
hấp thụ và đem so sánh với một đường chuẩn của 4-Nitrobenzaldehyde với các
nồng độ tương ứng. Hình dưới là đồ thị miêu tả sự so sánh đó.
3.1.2 Đánh dấu tế bào và tách chiết tế bào
3.1.2.1 Quá trình gắn kết hạt nano từ tính Fe3O4 với kháng thể antiCD4
Quá trình gắn với kháng thể antiCD4 được thực hiện như sau: Lấy 0,4g hạt
nano từ tính đã được chức năng hóa bề mặt bằng nhóm amino sử dụng APTS
(amino-NP) đem rửa và tách từ hai lần bằng 1ml dung dịch đệm 2-(NMorpholino) ethanesulfonic acid (MES) có pH bằng 6 và nồng độ là 0,1M. Sau đó
7


amino-NP được phân tán trong 0,25 ml dung dịch đệm chứa MES và 2mg 1-ethyl3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ở dạng bột bằng cách khuấy đều
tại nhiệt độ phòng trong vòng 15 phút. Tách rửa bằng từ trường hai lần trước khi
nhỏ 1 µg–100 µg kháng thể đơn dòng antiCD4 (antiCD4, Invitrogen). Tách rửa từ
bốn lần bằng nước cất ta thu được hạt nano gắn kháng thể antiCD4, gọi tắt là
antiCD4-NP.
Trong một số mẫu, chúng tôi có sử dụng 20 µl kháng thể antiCD4 phát huỳnh
quang (gọi tắt là *antiCD4, bước sóng kích thích là 480 nm, bước sóng phát xạ 520
nm của hãng Exiobio) trộn với antiCD4 có các nồng độ khác nhau. Sau hai giờ các
hạt nano được bọc bởi các kháng thế đơn dòng antiCD4 và *antiCD4 được tách rửa
từ 3 lần bằng 1ml dung dịch đệm phosphate saline (PBS).
Kết quả cuối cùng ta thu được hạt nano từ bọc bởi 2 loại kháng thể đơn dòng
antiCD4: một loại thường (gọi tắt là antiCD4-NP) và loại kia phát huỳnh quang
(gọi tắt là *antiCD4-NP) và chúng được bảo quản trong PBS bổ sung thêm
albumin huyết thanh bò (BSA).

8


Hình 5: Quy trình gắn kết hạt nano được chức năng hóa với kháng thể antiCD4.

Phản ứng (A) Hạt nano từ tính được chức năng hóa EDC. Phản ứng (B) Gắn kết
kháng thể antiCD4 với hạt nano từ tính được bao phủ bởi EDC.
3.1.2.2. Gắn kết với tế bào bạch cầu:
Lấy 200 µl máu người bình thường được li tâm trong ống nghiệm Eppendorf
1,5 ml với tốc độ 1000 vòng / phút trong vòng 10 phút để loại bỏ huyết thanh rồi
hòa vào 200 µl PBS bổ sung 1% BSA. Sau đó được ủ với 0,2 mg antiCD4-NP và
*antiCD4-NP trong vòng 20 phút ở nhiệt độ phòng. Bổ sung 1,3 ml dung dịch đệm
nhược trương (5 mM Tris pH 7.0, 10% glycerol) để đột ngột phá tung màng tế bào
9


máu làm tế bào trở thành dạng ko có bào quan và bào tương hay còn gọi là tế bào
ma.
Lúc này các antiCD4-NP và *antiCD4-NP sẽ gắn đặc hiệu lên các tế bào
bạch cầu CD4+ T thông qua tương tác kháng nguyên -kháng thể và được tách lọc
bằng từ trường, giúp loại bớt các tế bào ma. Trong thí nghiệm được tiến hành để
đối chứng, chúng tôi tiến hành gắn trực tiếp 20 µl kháng thể đơn dòng antiCD4
phát huỳnh quang với 200 µl máu để nhuộm tế bào bạch cầu CD4 + T, quá trình xử
lí tiếp theo cũng được tiến hành tương tự như trên chỉ khác là không có tuyển từ.
Các tế bào sau khi phản ứng gắn đặc hiệu với kháng thể được bảo quản trong
50 µl PBS lạnh, bổ sung 1% ABS và 10% glycerol. 5 µl dung dịch chứa tế bào
được nhỏ lên một tấm kính (slide glass) rồi được phủ lên bằng một phiến kính
mỏng (cover glass) để tiến hành quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang Carl Zeiss
Axio. Cường độ phát huỳnh quang được xử lý bằng phần mềm Scion Image.
Một số hình ảnh về các tế bào được chụp từ kính hiển vi huỳnh quang
Hình 6 là ảnh chụp các tế bào trong máu từ kính hiển vi dưới ánh sáng thường
(6A, 6C) và dưới chế độ phát huỳnh quang với ánh sáng kích thích là 480nm và
ánh sáng huỳnh quang 520nm (6B, 6D). Đối với các mẫu được chụp trên hình 3.8
chưa được tuyển từ nên dưới ánh sáng thường (6A, 6C) có thể nhìn thấy tế bào
hồng cầu và nhiều loại tế bào bạch cầu. Có thể nhận biết được loại tế bào dựa vào

hình dạng của chúng. Khi chụp dưới chế độ phát huỳnh quang (6B, 6D) thì chỉ
quan sát thấy tế bào bạch cầu CD4 + T mà không quan sát thấy các tế bào hồng cầu
và các tế bào bạch cầu dạng khác. Lý do là vì các kháng thể đơn dòng antiCD4
phát huỳnh quang rất đặc hiệu, chỉ gắn với kháng nguyên CD4 trên bề mặt tế bào
bạch cầu CD4+ T và làm cho các tế bào này phát sáng.

10


Hình 6: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T riêng lẻ được chụp bằng kính
hiển vi dưới ánh sáng thường (A, C ) và dưới ánh sáng kích thích (480 nm) (B, D)
sau khi chúng được gắn kết với kháng thể đơn dòng phát huỳnh quang
antiCD4.Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T.
Còn trong hình 7 cũng là hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4 + T được chụp
bằng kính hiển vi dưới ánh sáng thường (7A, 7C) và dưới chế độ phát huỳnh quang
với ánh sáng kích thích là 480nm (7B, 7D) nhưng khác so với mẫu ở hình 6 là các
tế bào này được được gắn kết với các hạt nano từ tính được chức năng hóa bề mặt
bởi kháng thể phát huỳnh quang antiCD4 (*antiCD4-NP) và đã được tuyển từ.
Không giống như hình 6 trong hình 7 không thấy xuất hiện nhiều các tế bào hồng
11


cầu hay tế bào bạch cầu loại khác. Hơn nữa tín hiệu thu được dưới chế độ ảnh chụp
huỳnh quang (7B, 7D) cho thấy cường độ phát huỳnh quang của tế bào bạch cầu
CD4+ T mạnh hơn cường độ phát huỳnh quang của tế bào được gắn kết với kháng
thể huỳnh quang mà không có hạt nano.

Hình 7: Hình ảnh các tế bào bạch cầu CD4+ T được chụp bằng kính hiển vi dưới
ánh sáng thường (A, C) và dưới ánh sáng kích thích (480nm) (B, D) sau khi được

12


gắn kết với hạt nano đã được chức năng hóa bề mặt bởi kháng thể antiCD4 phát
huỳnh quang. Mũi tên chỉ các tế bào bạch cầu CD4+ T

13