Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp có hoạt tính sinh học và bước đầu thử nghiệm trong bảo quản cá ngừ chù (auxis thazard) nguyên liệu (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

TRẦN VĂN VƯƠNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP
CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC VÀ BƯỚC ĐẦU THỬ NGHIỆM
TRONG BẢO QUẢN CÁ NGỪ CHÙ (AUXIS THAZARD)
NGUYÊN LIỆU

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 9540105

Khánh Hòa - 2020


Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang

Người hướng dẫn khoa học:

1. PGS.TS. VŨ NGỌC BỘI
Trường Đại Học Nha Trang

2. PGS.TS. NGUYỄN ANH TUẤN
Trường Đại Học Nha Trang

Phản biện 1: PGS.TS. NGÔ ĐẠI NGHIỆP
Trường đại học KHTN TP. HCM
Phản biện 2: PGS.TS. NGUYỄN VĂN MINH

Trường đại học Nha Trang
Phản biện 3: GS.TS. NGUYỄN THỊ HIỀN
Trường đại học Bách Khoa Hà Nội

Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án Trường Đại học Nha Trang
vào hồi ......... giờ, ngày ...... tháng ...... năm 2020.

Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia
- Thư viện Trường Đại học Nha Trang


TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN
Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp có hoạt tính sinh học
và bước đầu thử nghiệm trong bảo quản cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu.
Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản
Mã số: 9540105
Nghiên cứu sinh: Trần Văn Vương
Khóa: 2011
Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Vũ Ngọc Bội
2. PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn
Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang
Nội dung:
1. Cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về hiệu quả phân cắt chitin huyền phù trong
dung dịch axít HCl 10% thành oligochitin phân đoạn A (1÷3 kDa) bằng chiếu xạ γ
(nguồn Co-60) và so sánh hiệu quả phân cắt với axít HCl và chitinase.
2. Cung cấp các dẫn liệu mới về tối ưu hóa công đoạn sản xuất oligochitin phân đoạn
A bằng chiếu xạ γ (nguồn Co-60) chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10%. Kết quả nghiên cứu giúp bổ sung thêm dữ liệu, nhằm nâng cao hiệu quả sản
xuất thu hồi oligochitin phân đoạn A.
3. Cung cấp các dẫn liệu mới về hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của

oligochitin phân đoạn A trên nhóm vi khuẩn gây thối TPC, Pseudomonas spp và
Shewanella putrefaciens; nhóm vi khuẩn gây bệnh Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureus và Salmonella typhimurium.
4. Cung cấp các dẫn liệu và thông số chứng minh oligochitin phân đoạn A sản xuất
bằng chiếu xạ γ (nguồn Co-60) phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít
HCl 10% an toàn và không gây độc cho chuột thí nghiệm.
5. Đề xuất 01 quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng oligochitin phân
đoạn A với những thông số kỹ thuật cụ thể.
Người hướng dẫn

PGS.TS. Vũ Ngọc Bội PGS.TS. Nguyễn Anh Tuấn

Nghiên cứu sinh

Trần Văn Vương


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Nguyên liệu thủy sản, trong đó có cá ngừ chù sau đánh bắt thường hư hỏng rất
nhanh. Vì vậy ngư dân và các cơ sở thu mua, chế biến có xu hướng sử dụng các chất
bảo quản độc hại. Xu thế mới trong cải tiến công nghệ chế biến và bảo quản thủy sản
hiện nay theo hướng sử dụng các chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao không độc hại.
Do vậy "Nghiên cứu sản xuất chitin phân tử lượng thấp (dạng oligochitin) có hoạt tính
sinh học và bước đầu thử nghiệm trong bảo quản cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu”

là hướng nghiên cứu mới và có ý nghĩa thực tiễn hiện nay.
2. Mục tiêu của luận án
- Lựa chọn được tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin phù hợp.
- Xác định được các thông số tối ưu cho công đoạn phân cắt chitin thành oligochitin.

- Sản xuất được oligochitin có hoạt tính sinh học (kháng khuẩn và chống oxy hóa).
- Đánh giá được hiệu quả sử dụng oligochitin trong bảo quản cá ngừ chù (Auxis
thazard) nguyên liệu.
3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chitin sản xuất từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) theo quy
trình của đề tài KC07.02/11-15 và cá ngừ chù (Auxis thazard) nguyên liệu đánh bắt tại
Khánh Hòa.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
- Nghiên cứu lựa chọn tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin.
- Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn phân cắt chitin thành oligochitin bằng tác
nhân đã chọn.
- Đánh giá một số tính chất oligochitin đã sản xuất.
- Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của oligochitin.
- Đánh giá độc tính oligochitin thu nhận.
- Thử nghiệm sử dụng oligochitin trong bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu.
4. Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp hiện đại trong nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin.
Đặc trưng tính chất, đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính chống oxy hóa và độc
tính oligochitin thu nhận.
5. Kết cấu của luận án
Luận án gồm 148 trang nội dung, 134 tài liệu tham khảo và 32 trang phụ lục. Nội
dung luận án được trình bày trong 3 chương, với 30 bảng biểu, 64 hình ảnh, đồ thị và
sơ đồ nghiên cứu.

1


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN

Chitin là một polysaccharide có cấu trúc đa phân tử, mạch thẳng, đồng trùng
hợp từ hai tiểu đơn vị là 2-amino-2 deoxy-D glucopyranose (GlcN) và 2-acetamido-2deoxy-D-glucopyranose (GlcNAc) thông qua liên kết β-1-4-glucoside. Chitin được xem
như là một dẫn xuất của cellulose mà ở đó nhóm hydroxyl ở C2 được thay thế bằng
nhóm acetamide (-NH-CO-CH3).
Dựa vào trọng lượng phân tử trung bình (Mw), chitin có Mw ≤ 100 kDa được xem
là chitin có phân tử lượng thấp. Còn oligochitin hay chitin oligosaccharide là một
oligosaccharide có trọng lượng phân tử ≤ 10 kDa và có từ hai đến hàng chục gốc
monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Oligochitin có khả
năng kết tinh và tan trong nước cũng như hầu hết các loại dung môi và có nhiều hoạt
tính sinh học như kháng nấm, hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng các khối u, bướu, tăng
cường hiệu quả miễn dịch, và bảo vệ chống lại sự nhiễm trùng và oxy hóa.
1.2. PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT CHITIN VÀ OLIGOCHITIN
Ở Việt Nam cũng như trên thế giới, phương pháp sản xuất chitin và các dẫn xuất
của nó từ nguồn phế liệu thủy sản chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học để sản xuất
ở quy mô công nghiệp. Kỹ thuật sản xuất chitin theo phương pháp hóa học ở quy mô
công nghiệp có nhiều công đoạn nghiêm ngặt và thường thải ra một lượng lớn các
chất hóa học gây ô nhiễm môi trường. Sử dụng phương pháp sinh học trong sản xuất
chitin để khắc phục nhược điểm có thể gây ô nhiễm môi trường của phương pháp hóa
học trong sản xuất chitin và chitosan đã được một số nhà nghiên cứu đề cập.
1.3. ỨNG DỤNG OLIGOCHITIN
Oligochitin là polymer tự nhiên, an toàn và là sản phẩm thu được khi phân cắt

chitin. Oligochitin dễ tan trong nước và có đầy đủ tính chất của chitin, do có phân tử
lượng thấp nên oligochitin linh động và có hoạt tính sinh học mạnh hơn chitin, thể
hiện ở khả năng chống oxy hóa, hoạt tính kháng khuẩn nên có tiềm năng ứng dụng
trong nhiều trong lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm. Ngoài
ra theo một số nghiên cứu gần đây, ngoài hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa
cao thì oligochitin còn có một số đặc tính sinh học như chống phát triển của tế bào
ung thư nên có sử dụng để làm thực phẩm chức năng, kích thích hệ miễn dịch chống
nhiễm bệnh đối với vật nuôi và kháng nấm ở thực vật nên ứng dụng trong lĩnh vực

trồng trọt. Hiện nay các nghiên cứu về ứng dụng của oligochitin trong lĩnh vực bảo quản
thực phẩm, đặc biệt là trong bảo quản nguyên liệu thủy sản ở quy mô công nghiệp còn ít
và mới được nghiên cứu trong thời gian gần đây.
2


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
2.1.1. Chitin
Chitin được sản xuất tại Trung tâm thí nghiệm thực hành - trường Đại học Nha
Trang theo quy trình của đề tài KC07.02/11-15 từ nguyên liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng
(Litopenaeus vannamei), lô 50 kg. Sau đó, tiếp tục được tinh sạch theo phương pháp
được giới thiệu bởi Nguyễn Công Minh và cs và sấy khô bằng kỹ thuật sấy lạnh, xay
nhỏ tới kích thước ≤ 1mm
2.1.2. Enzyme
Chitinase (EC 3.2.1.14), loại endochitinase tinh khiết dạng bột, nguồn gốc từ
Streptomyces griseus (C6137-25UN), pHop 6,0, top 370C, hoạt độ ≥ 0,2 units/mg theo
công bố, xuất xứ Sigma–Aldrich Mỹ được bảo quản và sử dụng theo đúng hướng dẫn
của nhà sản xuất.
Hemicellulase (EC 232.799.9) nguồn gốc từ Aspergillus niger, dạng bột màu
trắng pHop 4,5, top 400C, hoạt độ 3,0 units/mg, xuất xứ Sigma-Aldrich Mỹ được bảo
quản và sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Cellulase (EC 232.734.4) nguồn gốc từ Aspergillus niger, dạng bột màu trắng
pHop 5,0, top 370C, hoạt độ 3,0 units/mg, xuất xứ Sigma-Aldrich Mỹ được bảo quản và
sử dụng theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.1.3. Hóa chất
Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu, phân tích là loại dùng cho thí nghiệm có xuất
xứ Merck Đức và Trung Quốc. Các loại hóa chất đều được bảo quản theo đúng yêu
cầu của nhà sản xuất ghi trên bao bì. Các loại hóa chất cơ bản sử dụng HCl, H3PO4,
HNO3, NaOH, Methanol, Ethanol, Aceton.

2.1.4. Chủng vi sinh vật thử nghiệm
+ Nhóm vi khuẩn gây thối: Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC), Shewanella
putrefaciens và Pseudomonas spp. Được phân lập trên cá ngừ chù nguyên liệu gây thối ở
điều kiện tương tự như mẫu cá ngừ chù bảo quản

+ Nhóm vi khuẩn gây bệnh: Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus. Sử
dụng chủng gốc được lưu tại phân viện Thú y Miền Trung Nha Trang.

2.1.5. Cá ngừ chù nguyên liệu
Cá ngừ chù nguyên liệu (Auxis thazard) loại tươi, thu mua từ tàu cá, được đánh
bắt tại vùng biển Khánh Hòa, chiều dài 40±5 cm, trọng lượng 1000±50 gr/con. Phù
hợp với TCVN 2646-78: Cá biển ướp nước đá yêu cầu kỹ thuật.
2.1.6. Nước đá
Nước đá được sản xuất tại phòng thí nghiệm, nước làm đá đảm bảo chất lượng
theo QCVN 02:2009/BYT: Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về chất lượng nước sinh hoạt.
2.1.7. Chuột thí nghiệm
Sử dụng chuột lang (Cavia porcellus) làm chuột thí nghiệm trong đánh giá độc chất
học. Chuột được sử dụng có khối lượng trung bình 300-350 g/con, số lượng 80 con.
3


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Để hoàn thành nội dung nghiên cứu, luận án tiến hành các bước thí nghiệm được
trình bày trên Hình 2.1.
Chitin rắn, kích thước ≤ 1mm
Chitin huyền phù

Chitin dung dịch

Phân cắt bằng chiếu xạ γ (nguồn 60Co)

Xử lý huyền phù

Đánh giá hiệu quả phân cắt chitin dựa vào
độ giảm phân tử lượng trung bình (Mv)
Lựa chọn chitin dạng phù hợp
Phân cắt bằng axít:
HCl 36%

H3PO4 85%

Phân cắt bằng enzyme:
Chitinase

HNO3 70%

Cellulase

Hemicellulase

Đánh giá hiệu quả phân cắt thông qua
xác định hàm lượng GlcNAc tạo thành

Đánh giá hiệu phân quả cắt thông qua xác
định hàm lượng GlcNAc tạo thành

Lựa chọn loại axít phù hợp, Phân cắt chitin thành oligochitin Lựa chọn loại enzyme phù hợp,
phân cắt chitin thành oligochitin
phân cắt chitin thành oligochitin bằng chiếu xạ γ (nguồn 60Co)

Đánh giá hiệu quả phân cắt chitin thành oligochitin thông qua đánh giá: lượng
oligochitin thu hồi, hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa, chi phí sản xuất
Lựa chọn tác nhân phân cắt chitin thành oligochitin phù hợp
Tối ưu hóa công đoạn sản xuất oligochitin bằng tác nhân đã lựa chọn
Sản xuất thu nhận oligochitin từ quy trình đã tối ưu
1
Đánh giá oligochitin thu nhận.
Cụ thể:
Đánh giá hoạt tính kháng
khuẩn và chống oxy hóa

Đánh giá
độc tính

2

Đặc trưng
tính chất
Thử nghiệm trong bảo quản cá ngừ chù nguyên
liệu trong nước đá lạnh

Đánh giá chất lượng
cảm quan

Đánh giá một số chỉ
tiêu hóa học

Đánh giá một số chỉ
tiêu vi sinh vật

Đề xuất quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu
bằng oligochitin trong nước đá lạnh

Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
4


2.2.2. Phương pháp sử dụng trong phân tích
2.2.2.1. Xác định tính chất của chitin
• Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy tới khối lượng không đổi, theo AOAC (1990).
• Xác định độ deacetyl chitin, oligochitin dựa vào đo độ hấp phụ quang học sau
khi phân cắt mẫu với H3PO4 theo phương pháp được giới thiệu bởi Hein và cs (2008).
• Xác định phân tử lượng trung bình độ nhớt, bằng nhớt kế Ubbelohde theo phương
pháp của Einbu và cs (2004).
• Xác định hàm lượng tro tổng bằng phương pháp nung, theo AOAC (1990).
• Xác định hàm lượng protein hòa tan, theo phương pháp theo phương pháp
microbiuret (Hein và cộng sự, 2004).
• Đánh giá màu sắc bằng phương pháp cảm quan.
2.2.2.2. Xác định hoạt độ enzyme
• Xác hoạt độ chitinase bằng phương pháp Miller, thông qua phản ứng giữa axít
3,5-dinitrosalicylic với N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) tạo thành từ quá trình phân
cắt chitin.
• Xác định hoạt độ cellulase, hemicellulas bằng phương pháp Miller, thông qua
phản ứng giữa D-glucose tạo thành từ quá trình phân cắt CMC với axít 3,5dinitrosalicylic.
2.2.2.3. Đánh giá khả năng phân cắt chitin
Đánh giá khả năng phân cắt chitin thông qua xác định lượng đường khử Nacetyl-D-glucosamine (GlcNAc) tạo thành (mg/g chitin), dựa vào phản ứng của N-acetylD-glucosamine (GlcNAc) với axít 3,5-dinitrosalicylic (DNS).
2.2.2.4. Thu nhận oligochitin phân đoạn A và B và đánh giá hiệu suất thu hồi
• Sử dụng màng lọc theo phương pháp của Yeon & Kim (2000) có một chút hiệu chỉnh.
• Sử dụng hóa chất theo phương pháp của E. Muraki và cs (1993) có một chút
hiệu chỉnh.

• Đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin = Khối lượng oligochitin thu hồi (gr)/Khối
lượng mẫu chitin ban đầu (gr)*100 (%).
2.2.2.5. Đánh giá chất lượng cá ngừ chù nguyên liệu
• Lấy mẫu, bảo quản mẫu, theo TCVN 6507:2005, TCVN 6404: 2008, TCVN
5287:2008.
• Đánh giá chất lượng cảm quan, theo No.103/76 OJ No.L20 EEC (28-01-1976).
• Xác định pH, theo TCVN 4835-2002.
• Xác định hàm lượng tổng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N), theo TCVN 9215:2012.
• Xác định hàm lượng nitơ ammoniac (NH3), theo TCVN 3706-90.
• Xác định định lượng hàm lượng malonaldehyde (MAD) bằng TBARS.
• Xác định hàm lượng histamin bằng phương pháp HPLC, theo AOAC Số 977.13.
• Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC), theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999)
có một chút hiệu chỉnh.
5


• Xác định vi khuẩn sinh H2S (Shewanella putrefaciens) theo phương pháp của
Gram L. (1992) có một chút hiệu chỉnh.
• Xác định Pseudomonas spp theo phương pháp của Gram L. (1992) có một chút
hiệu chỉnh.
• Xác định Clostridium perfringens, theo tiêu chuẩn ISO 7251 (7/2005).
• Xác định Staphylococcus aureus, theo tiêu chuẩn ISO 6888-1 (1/2004).
• Xác định Salmonella typhimurium, theo tiêu chuẩn ISO 6579 (2/2006).
• Tham chiếu chất lượng cảm quan và một số chỉ tiêu hóa học theo TCVN 2646-78.
• Tham chiếu giới hạn vi sinh vật gây bệnh theo QĐ 46/2007/BYT.
2.3. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÍ SỐ LIỆU
Sử dụng phân tích ANOVA kết hợp với Tukey Test để so sánh giá trị trung bình
của các mẫu nghiên cứu.
Sử dụng phần mềm DX 8.0.3, Microsoft Office Excel 2013 để thiết kế thí nghiệm,
phân tích tối ưu và xử lý thống kê.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. SẢN XUẤT VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CHITIN
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng chitin thu nhận
Đặc tính
Chitin của
STT
Tên chỉ tiêu
sản phẩm AxioGen [28]
1 Màu sắc
Trắng ngà
Ngà vàng
2 Độ ẩm (%)
8±0,21
<10
3 Hàm lượng protein (%)
0,32±0,03
4 Tro (%)
0,15±0,04
<1
5 Độ deacetyl
22±2,0
≤50
6 Độ mịn (mm)
≤1,0
7 Phân tử lượng trung bình độ nhớt (Mv, kDa) 1015±5,5
Kết quả phân tích ở Bảng 3.1 cho thấy chitin sản xuất từ đầu vỏ tôm thẻ chân
trắng có chất lượng cao hơn chitin chitin thương mại do Công ty AxioGen công bố. Cụ
thể màu sắc trắng ngà, độ ẩm 8%, hàm lượng tro 0,15% và độ deacetyl 22%.
Kết quả nghiên cứu cho thấy chitin, luận án sản xuất hoàn toàn đáp ứng yêu cầu

chất lượng phục vụ cho nghiên cứu và luận án sẽ sử dụng loại chitin này trong các thí
nghiệm của luận án.
3.2. NGHIÊN CỨU LỰA CHỌN TÁC NHÂN PHÂN CẮT CHITIN THÀNH
OLIGOCHITIN
3.2.1. Nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin bằng axít
3.2.1.1. Xác định loại axít
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng axít HCl 36% để phân cắt chitin thành
GlcNAc ở nhiệt độ 400C, trong thời gian 6 giờ thì hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện
qua hàm lượng GlcNAc tạo thành lớn nhất.
6


3.2.1.2. Nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin bằng axít HCl
3.2.1.2.1. Xác định nồng độ chitin
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng axít HCl 36% để phân cắt chitin thành
GlcNAc ở nồng độ chitin 10%, trong thời gian 6 giờ có hiệu quả phân cắt cao thể hiện
qua hàm lượng GlcNAc tạo thành đạt 71,7% kém 1,1 lần so với mức cao nhất ở nồng độ
chitin 2%, tuy nhiên lại tăng được nồng độ chitin lên 5,0 lần.
3.2.1.2.2. Xác định nồng độ HCl
Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ axít HCl thích hợp cho quá trình phân cắt chitin
thành GlcNAc ở nhiệt độ 400C trong thời gian 6 giờ là 12M. Do vậy, luận án quyết định chọn
nồng độ axít HCl 12M để nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.1.2.3. Xác định nhiệt độ thủy phân
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy khi phân cắt chitin bằng axít HCl 12M ở nhiệt
0
độ 40 C trong thời gian 6 giờ thì hàm lượng GlcNAc tạo thành trong phản ứng cao nhất
đạt hiệu suất 80,1%. Do vậy, luận án quyết định lựa chọn nhiệt độ nghiên cứu phản ứng
phân cắt chitin thành oligochitin là 400C.
3.2.1.2.4. Xác định thời gian thủy phân
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy quá trình phân cắt chitin bằng axít HCl trong

thời gian 6 giờ ở nhiệt độ 400C tạo thành GlcNAc với hàm lượng cao nhất. Do vậy, luận
án sẽ chọn mốc thời gian cực đại 6 giờ để nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin trong
các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.2.5. Phân cắt chitin thành oligochitin bằng axít HCl
Kết quả nghiên cứu phân cắt chitin nồng độ 10% bằng axít HCl 12M, ở nhiệt độ
400C trong thời gian 5 giờ thì hàm lượng oligochitin phân đoạn A và B thu nhận được
cao nhất, tương ứng 5,85% và 6,50%.
3.2.1.3. Đề xuất quy trình phân cắt chitin thành oligochitin bằng axít HCl
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất quy trình phân cắt chitin
thành oligochitin bằng axít HCl được trình bày ở Hình 3.1.
Chitin rắn
Phân cắt bằng axít HCl ở chế độ:
nồng độ 12M (w/w), nhiệt độ 400C, thời
gian 5 giờ và nồng độ chitin 10% (w/w)

Hỗn hợp oligochitin
Tách phân đoạn oligochitin
Oligochitin phân đoạn A

Oligochitin phân đoạn B

Hình 3.1. Sơ đồ quy trình phân cắt chitin thành oligochitin bằng axít HCl
7


3.2.1.4. Sản xuất thu nhận oligochitin
Bảng 3.2. Hiệu suất thu nhận oligochitin theo quy trình Hình 3.1
STT Thông số
Kết quả
1

GlcNAc (%)
80,09±1,91
2
Hàm lượng oligochitin phân đoạn A (%)
6,95±0,12
3
Hàm lượng oligochitin phân đoạn B (%)
5,86±0,17
4
Phần khác (%)
7,10±0,14
Kết quả nghiên cứu cho thấy axít HCl có khả năng phân cắt chitin mạnh, tuy
nhiên sản phẩm thu được chủ yếu ở dạng monomer là GlcNAc (80,09%). Sản phẩm ở
dạng oligomer là khá ít. Cụ thể lượng oligochitin phân đoạn A chỉ đạt 5,86% và
oligochitin phân đoạn B chỉ đạt 6,95%.
3.2.2. Nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin bằng chiếu xạ gamma (γ)
3.2.2.1. Xác định trạng thái của chitin sử dụng trong chiếu xạ
Kết quả nghiên cứu cho thấy, chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% khi
chiếu xạ γ bị phân cắt thành oligochitin mạnh nhất, thông qua độ giảm phân tử lượng
trung bình độ nhớt mạnh nhất. Do vậy luận án quyết định chọn mẫu chitin huyền phù
trong dung dịch axít HCl 10% để tiếp tục nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.2.2. Nghiên cứu phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl thành
oligochitin bằng chiếu xạ gamma (γ)
3.2.2.2.1. Xác định nồng độ dung dịch axít HCl
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiếu xạ γ ở suất liều hấp thụ 3,0 kGy/giờ, liều hấp thụ
200 kGy và nồng độ chitin huyền phù 10% với mẫu chitin huyền phù ở nồng độ axít HCl
5% thì phân tử lượng trung bình (Mv) sau chiếu xạ lớn, nghĩa là chitin vẫn chưa ở dạng
oligochitin. Nhưng nếu tăng nồng độ axít lên 15% thì phân tử lượng trung bình (Mv) của
mẫu chitin sau chiếu xạ γ lại thấp, sản phẩm thu được chủ yếu ở dạng monomer, ứng
83,2% nên không đáp ứng được mục tiêu sản xuất thu nhận oligochitin của luận án. Chỉ ở

nồng độ axít HCl 10% mẫu chitin thu nhận sau chiếu xạ đáp ứng được yêu cầu về khả
năng phân cắt cũng như hiệu quả thu nhận oiligochitin sau chiếu xạ. Do vậy luận án sẽ
chọn chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% để phân cắt thành oligochitin.
3.2.2.2.2. Xác định nồng độ chitin huyền phù
Kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng chiếu xạ γ để phân cắt chitin thành
oligochitin ở liều hấp thụ 200 kGy, suất liều hấp thụ 3,0 kGy/giờ với chitin huyền phù
nồng độ 10% có hiệu quả cao thể hiện qua hàm lượng GlcNAc tạo thành bằng 0,95 lần
so mức cao nhất, nhưng lại tăng được nồng độ chitin huyền phù lên 5,0 lần. Điều này sẽ
giúp tiết kiệm thời gian, chi phí cũng như lượng hóa chất sử dụng. Do vậy luận án quyết
định chọn chitin huyền phù nồng độ 10% để nghiên cứu phân cắt thành oligochitin.
3.2.2.2.3. Xác định liều hấp thụ
Kết quả nghiên cứu cho thấy khi chiếu xạ γ chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10% ở nồng độ chitin 10% (w/v), suất liều hấp thụ 3,0 kGy/giờ với liều hấp thụ là 200
kGy thì hiệu quả phân cắt cao thể hiện qua hàm lượng GlcNAc tạo thành lớn. Do vậy, để
bảo đảm hiệu quả phân cắt chitin thành oligochitin luận án quyết định lựa chọn liều hấp
thụ là 200 kGy để nghiên cứu quá trình phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10% thành oligochitin.
8


3.2.2.2.4. Xác định suất liều hấp thụ
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiếu xạ γ chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10%
ở nồng độ chitin 10% (w/v), liều hấp thụ 200 kGy với suất liều hấp thụ 2,5 kGy/giờ thì
hiệu quả phân cắt cao thể hiện qua hàm lượng GlcNAc tạo thành lớn. Do vậy, luận án
quyết định lựa chọn suất liều hấp thụ 2,5 kGy/giờ để nghiên cứu phân cắt chitin huyền phù
trong dung dịch axít HCl 10% thành oligochitin.
3.2.2.2.5. Phân cắt chitin thành oligochitin bằng chiếu xạ γ
Kết quả nghiên cứu cho thấy, phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10%, nồng độ chitin 10%, suất liều hấp thụ 2,5 kGy/giờ ở liều hấp thụ 200 kGy thu nhận
oligochitin phân đoạn A và B hiệu quả nhất, tương ứng 59,42 và 29,89%.

3.2.2.3. Đề xuất quy trình phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10% thành oligochitin bằng chiếu xạ γ
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất quy trình phân cắt chitin
thành oligochitin bằng chiếu xạ γ được trình bày ở Hình Hình 3.2.
Chitin huyền phù trong dung dịch HCl 10%

Phân cắt bằng chiếu xạ γ ở chế độ:
suất liều hấp thụ 2,5 kGy/giờ, liều hấp thụ
200 kGy và nồng độ chitin 10% (w/w)

Hỗn hợp oligochitin

Tách phân đoạn oligochitin

Oligochitin phân đoạn A

Oligochitin phân đoạn B

Hình 3.2. Sơ đồ quy trình phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl
10% thành oligochitin bằng chiếu xạ γ
3.2.2.4. Sản xuất thu nhận oligochitin
Bảng 3.3. Hiệu suất thu nhận oligochitin theo quy trình ở Hình 3.2
STT
Thông số
Kết quả
1
GlcNAc (%)
7,0±0,81
2
Hàm lượng oligochitin phân đoạn A (%)

60,3±1,46
3
Hàm lượng oligochitin phân đoạn B (%)
30,8±1,23
4
Phần khác (%)
1,9±0,13
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiếu xạ γ chitin huyền phù trong dung dich axít
HCl 10% ở suất liều hấp thụ 2,5 kGy/giờ, liều hấp thụ 200 kGy và nồng độ chitin 10%
tạo thành oligochitin tương đối cao. Đặc biệt là oligochitin phân đoạn A thu nhận được
tới 60,3% và nhiều hơn oligochitin phân đoạn B (30,8%) 1,96 lần.
9


3.2.3. Nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin bằng enzyme
3.2.3.1. Xác định loại enzyme
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy khả năng phân cắt chitin bằng chitinase ở hoạt
độ 0,1 U/mg, tỷ lệ bổ sung 0,1% (w/v), nồng độ chitin huyền phù 10%, nhiệt độ 370C,
pHmt 5,0, trong thời gian 5,5 có hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện qua hàm lượng
GlcNAc tạo thành lớn nhất. Do vậy luận án quyết định lựa chọn chitinase để tiếp tục
nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.3.2. Nghiên cứu phân cắt chitin thành oligochitin bằng chitinase
3.2.3.2.1. Xác định nhiệt độ thủy phân
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy phân cắt chitin bằng chitinase ở hoạt độ 0,1
U/mg, tỷ lệ bổ sung 0,1% (w/v), nồng độ chitin huyền phù 10%, pH 6,0, thời gian 5,5
ngày, ở nhiệt độ 400C có hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện qua hàm lượng GlcNAc
tạo thành lớn nhất. Do vậy luận án quyết định lựa chọn nhiệt độ 400C để nghiên cứu quá
trình phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.3.2.2. Xác định pHmt thủy phân
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy phân cắt chitin bằng chitinase ở hoạt độ 0,1

U/mg, tỷ lệ bổ sung 0,1% (w/v), nồng độ chitin huyền phù 10%, nhiệt độ 400C, thời
gian 5,5 ngày, ở pHmt 6,0 có hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện qua hàm lượng
GlcNAc tạo thành lớn nhất. Do vậy luận án quyết định lựa chọn pHmt 6,0 để nghiên cứu quá
trình phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.3.2.3. Xác định thời gian phân cắt
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy phân cắt chitin bằng chitinase ở hoạt độ 0,1
U/mg, tỷ lệ bổ sung 0,1% (w/v), nồng độ chitin huyền phù 10%, nhiệt độ 400C, pHmt
6,0, trong thời gian 5,5 ngày có hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện qua hàm lượng
GlcNAc tạo thành lớn nhất. Do vậy luận án quyết định lựa chọn mốc thời gian cực đại ở
5,5 ngày để nghiên cứu quá trình phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.3.2.4. Xác định hoạt độ enzyme
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy phân cắt chitin bằng chitinase ở 5,5 ngày, tỷ
lệ bổ sung 0,1% (w/v), nồng độ chitin huyền phù 10%, nhiệt độ 400C, pHmt 6,0, ở hoạt
độ 0,3 U/mg ngày có hiệu quả phân cắt cao nhất thể hiện qua hàm lượng GlcNAc tạo
thành lớn nhất. Do vậy luận án quyết định lựa chọn hoạt độ 0,3 U/mg để nghiên cứu quá
trình phân cắt chitin thành oligochitin.
3.2.3.2.5. Phân cắt chitin thành oligochitin bằng chitinase
Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy, phân cắt chitin huyền phù bằng chitinase ở
nồng độ chitin 10%, nhiệt độ 400C, pHmt 6,0, hoạt độ enzyme 0,3 U/mg và thời gian phân cắt
4,5 ngày thu nhận oligochitin phân đoạn A và B hiệu quả nhất, tương ứng 22,42% và 25,02%.
10


3.2.3.3. Đề xuất quy trình phân cắt chitin thành oligochitin bằng chitinase
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất quy trình phân cắt chitin
thành oligochitin bằng chitinase được trình bày ở Hình Hình 3.3.
Chitin huyền phù, nồng độ 10%

Phân cắt bằng chitinase ở chế độ:
nhiệt độ 400C; pHmt 6,0; thời gian 4,5

ngày; hoạt độ 0,3 U/mg; tỷ lệ 0,1% (w/v)
Gia nhiệt 850C, thời gian 5 phút

Hỗn hợp oligochitin

Tách phân đoạn oligochitin

Oligochitin phân đoạn A

Oligochitin phân đoạn B

Hình 3.3 Sơ đồ quy trình phân cắt chitin thành oligochitin bằng chitinase
3.2.3.4. Sản xuất thử nghiệm và đánh giá hoạt tính oligochitin thu nhận
Bảng 3.4. Hàm lượng oligochitin thu nhận theo quy trình ở Hình 3.3
STT
1
2
3
4

Thông số
GlcNAc (%)
Hàm lượng oligochitin phân đoạn A (%)
Hàm lượng oligochitin phân đoạn B (%)
Phần khác (%)

Kết quả
53,0±1,87
21,6±1,16
24,9±1,73

0,5±0,10

Từ các kết quả phân tích ở trên cho thấy phân cắt chitin huyền phù thành
oligochitin bằng chitinase ở nhiệt độ 400C; pHmt 6,0; thời gian 4,5 ngày; hoạt độ 0,3
U/mg; tỷ lệ 0,1% (w/v) là tương đối cao. Tuy nhiên lượng oligochitin phân đoạn A thu
nhận chỉ 21,6%, trong đó oligochitin phân đoạn B chiếm 24,9%.
3.2.4. So sánh hiệu quả phân cắt chitin thành oligochitin của axít HCl, chiếu xạ γ
và chitinase và lựa chọn tác nhân thích hợp
3.2.4.1. So sánh lượng oligochitin phân đoạn A và B thu nhận
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiếu xạ γ cho phép phân cắt chitin thu hồi sản phẩm
chủ yếu là oligochitin phân đoạn A, chiếm 60,3% còn phân đoạn B thu hồi là 30,8%.
Trong khi nếu sử dụng axít HCl thì ngược lại, oligochitin phân đoạn A và B thu được rất
ít, chỉ 6,95% và 5,86%. Còn khi sử dụng chitinase thì lượng oligochitin phân đoạn A và B
thu được chiếm 21,6% và 24,9%.
3.2.4.2. So sánh hoạt tính chống oxy hóa của oligochitin phân đoạn A và B
Kết quả nghiên cứu cho thấy oligochitin phân đoạn A sản xuất bằng axít HCl,
chiếu xạ γ và chitinase không có sự khác biệt về hoạt tính chống oxy hóa, trong khi
11


oligochitin phân đoạn B thu nhận bằng chiếu xạ γ có hoạt tính chống oxy hóa mạnh
hơn từ axít HCl và chitinase. Oligochitin phân đoạn A có hoạt tính chống oxy hóa cao
hơn oligochitin phân đoạn B trung bình từ 2,12÷2,97 lần tùy theo tác nhân sản xuất.
3.2.4.3. So sánh hoạt tính kháng khuẩn
Kết quả nghiên cứu cho thấy oligochitin phân đoạn A và B sản xuất bằng axít
HCl, chiếu xạ γ và chitinase đều có hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm. Tuy
nhiên hoạt tính kháng của oligochitin phân đoạn A mạnh hơn oligochitin phân đoạn B
từ 1,5÷2,0 lần.
3.2.4.4. Chi phí sản xuất oligochitin bằng axít HCl, chiếu xạ γ và chitinase
Chi phí để sản xuất oligochitin phân đoạn A bằng chiếu xạ γ là thấp nhất, thấp hơn

axít HCl và chitinase tương ứng 11,33 và 12,48 lần.
Chi phí để sản xuất oligochitin phân đoạn B bằng chiếu xạ γ là thấp nhất, thấp
hơn bằng axít HCl 6,86 lần và chitinase 5,55 lần.
3.3. NGHIÊN CỨU TỐI ƯU HÓA CÔNG ĐOẠN PHÂN CẮT CHITIN THÀNH
OLIGOCHITIN PHÂN ĐOẠN A BẰNG CHIẾU XẠ GAMMA
3.3.1. Tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng tới công đoạn phân cắt chitin thành oligochitin
phân đoạn A
* Xác định mô hình hồi quy
Y = 55,26 + 2,47A + 22,13B - 1,64C + 0,95AB +1,15AC + 0,324BC - 0,26A2 16,2B2 + 0,39C2 (*)
Kết quả phân tích trình bày ở Hình 3.4÷3.7 về ảnh hưởng suất liều hấp thụ, liều
hấp thụ và nồng độ chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% tới lượng
oligochitin phân đoạn A thu hồi. Chọn được khoảng tối ưu của các thông số là: suất
liều hấp thụ 2,0÷3,0 kGy/giờ, liều hấp thụ 160÷240 kGy, nồng độ chitin huyền phù
trong dung dịch axít HCl 10% là 7,0÷10,0%.

Hình 3.4. Đường đồng mức biểu diễn ảnh
hưởng của liều hấp thụ và suất liều hấp thụ tới
hiệu quả thu hồi oligochitin phân đoạn A

Hình 3.5. Ảnh hưởng của liều hấp thụ và suất liều hấp
thụ tới hiệu quả thu hồi oligochitin phân đoạn A

Hình 3.6. Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng
của liều hấp thụ và nồng độ chitin tới hiệu quả
thu hồi oligochitin phân đoạn A

Hình 3.7. Ảnh hưởng của liều hấp thụ và nồng độ
chitin tới hiệu quả thu hồi oligochitin phân đoạn A

12

* Xác định thông số tối ưu cho công đoạn sản xuất oligochitin phân đoạn A
Kết quả nghiên cứu tối ưu hóa cho thấy thông số tối ưu cho công đoạn chiếu xạ γ
chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% thành oligochitin phân đoạn A là: suất
liều hấp thụ 2,97 kGy/giờ, liều hấp thụ 227,2 kGy và nồng độ chitin huyền phù trong
dung dịch HCl 10% là 9,84%.
3.3.2. Đề xuất quy trình sản xuất oligochitin phân đoạn A
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất quy trình sản xuất oligochitin
phân đoạn A bằng chiếu xạ γ được trình bày ở Hình 3.8.
Chitin rắn
Xử lý huyền phù 9,84 % (w/v)
trong dung dịch HCl 10%
Chiếu xạ γ với:
suất liều hấp thụ 2,97 kGy/giờ,
liều hấp thụ 227,2 kGy
Hỗn hợp oligochitin
Tách oligochitin phân đoạn A
Sấy khô chân không
Oligochitin phân đoạn A

Hình 3.8. Sơ đồ quy trình sản xuất oligochitin phân đoạn A bằng chiếu xạ γ
3.3.3. Sản xuất oligochitin phân đoạn A

Hình 3.9. Oligochitin phân đoạn A sản xuất, thu nhận theo quy trình Hình 3.8
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá hiệu suất và chất lượng oligochitin phân đoạn A
thu nhận từ quy trình trên Hình 3.8
TT
1
2

3
4

Thông số đánh giá
Hiệu suất thu hồi oligochitin phân đoạn A (%)
Màu sắc
Độ ẩm (%)
Tro tổng (%)

13

Kết quả
64,41%
Nâu vàng
9±0,12
1,01±0,05


3.3.4. Đặc trưng tính chất, đánh giá độc tính, đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và
kháng khuẩn oligochitin phân đoạn A
3.3.4.1. Đặc trưng tính chất
3.3.4.1.1. Xác định độ deacetyl
Kết quả nghiên cứu cho thấy độ deacetyl của mẫu oligochitin phân đoạn A thu nhận
bằng chiếu xạ γ chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% ở suất liều hấp thụ 2,97
kGy/giờ, liều hấp thụ 227,2 kGy tăng 10,9% so với mẫu chitin ban đầu. Tuy nhiên,
oligochitin phân đoạn A thu nhận vẫn ở dạng oligochitin do có độ deacetyl < 50%.
3.3.4.1.2. Xác định tính chất nhiệt (DSC)
M1

M2

Hình 3.10. Tính chất nhiệt của (M1) chitin và (M2) oligochitin phân đoạn A
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu chitin và mẫu oligochitin phân đoạn A thu
nhận có tính chất nhiệt tương đồng về mặt thời gian, trong khi mẫu oligochitin phân
đoạn A có đỉnh nhiệt phá vỡ tinh thể và nhiệt phân hủy nhỏ hơn mẫu chitin. Điều này
là do mẫu oligochitin phân đoạn A có chiều dài đoạn mạch giảm so với mẫu chitin.
3.3.4.1.3. Đánh giá độ rắn, độ kết tinh và cấu trúc bằng phổ XRD và 1H-NMR
* Đánh giá độ rắn, độ kết tinh và cấu trúc bằng phổ XRD

Hình 3.11. Phổ XRD của (M1) chitin và (M2) oligochitin phân đoạn A
14


Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu chitin và mẫu oligochitin phân đoạn A không
có sự khác nhau nhiều về cấu trúc (không có sự khác biệt nhiều về số vị trí peak). Tuy
nhiên mẫu oligochitin phân đoạn A có độ rắn và độ kết tinh giảm (diện tích và đỉnh
peak giảm) so với mẫu chitin ban đầu.
* Đánh giá cấu trúc phân tử bằng phổ 1H-NMR

Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của oligochitin phân đoạn A
Kết quả nghiên cứu cho thấy, mẫu oligochitin phân đoạn A thu nhận không bị
thay đổi cấu trúc. Điều đó chứng tỏ chiếu xạ γ mẫu chitin huyền phù trong dung dịch
HCl 10% tạo thành oligochitin phân đoạn A không làm thay đổi cấu trúc của
oligochitin thu nhận.
3.3.4.1.4. Phân tích nhóm chức bằng phổ hồng ngoại biến đổi chuỗi Fourier (FTIR)

Hình 3.13. Phổ FTIR của (M1) chitin và (M2) oligochitin phân đoạn A
Kết quả nghiên cứu cho thấy chiếu xạ γ ở suất liều hấp thụ 2,97 kGy/giờ, liều hấp
thụ 227,2 kGy mẫu chitin huyền phù trong dung dịch HCl 10% với liều hấp thụ 227,2
kGy thành oligochitin phân đoạn A chỉ xảy ra hiện tượng phân cắt, không có sự thay

đổi nhiều hay phá huỷ các nhóm chức trong phân tử.
15


3.3.4.1.5. Phân tích khối lượng phân tử bằng sắc ký lọc gel thấm qua (GPC)

Hình 3.14. Phổ GPC của oligochitin phân đoạn A
Kết quả phân tích trình bày ở Hình 3.14 và Bảng 3.6 cho thấy oligochitin phân
đoạn A có Mw = 2958 Da (< 3kDa), tương đương chiều dài đoạn mạch theo lý thuyết
<15 dp. Ngoài ra kết quả phân tích còn cho thấy, oligochitin phân đoạn A có chứa bốn
đoạn mạch có khối lượng phân tử tương ứng 1695, 2066, 2415 và 2986 Da và được
phân bố với tỷ lệ khác nhau.
3.3.4.1.6. Đánh giá độ tan
Kết quả nghiên cứu cho thấy oligochitin phân đoạn A hòa tan trong nước ngọt
với tỷ lệ khá cao tương ứng 98,1%, còn trong nước mặn chỉ là 81,2%.
3.3.4.2. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và kháng các chủng khuẩn thử nghiệm
3.3.4.2.1. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
* Khả năng quét gốc tự do DPPH
Oligochitin phân đoạn A có hoạt tính quét gốc tự do DPPH đạt 72,9 % ở nồng độ
4 mg/ml. Nồng độ càng tăng thì hiệu quả quét gốc tự do DPPH càng tăng.
* Hoạt tính kháng oxy hóa lipid màng
Oligochitin phân đoạn A có hoạt tính kháng oxy hóa màng lipid tốt, đạt 89,4% ở
nồng độ 4 mg/ml.
3.3.4.2.2. Đánh giá hoạt tính các chủng vi khuẩn thử nghiệm
Bảng 3.6. Khả năng ức chế các chủng vi khuẩn thử nghiệm của oligochitin
phân đoạn A bằng phương pháp đục lỗ thạch
STT
1
2
3

4
5
6

Chủng vi khuẩn
TPC
Pseudomonas spp
Shewanella putrefaciens
Clostridium perfringens*
Staphylococcus aureus*
Salmonella typhimurium**

Vùng ức chế (cm)
0,3
0,5
0,5
0,2
0,2
0,1

Ghi chú
Nhóm vi khuẩn
gây thối
Nhóm vi khuẩn
gây bệnh

* Ghi chú: *: vi khuẩn gram dương, **: vi khuẩn gram âm

Bảng 3.7. Hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm của oligochitin
phân đoạn A bằng phương pháp MIC

STT

Chủng vi khuẩn

Giá trị MIC (µg/ml)

16

Ghi chú


1
2
3
4
5
6

TPC
Pseudomonas spp
Shewanella putrefaciens
Clostridium perfringens*
Staphylococcus aureus*
Salmonella typhimurium**

375
250
250
300
300

400

Nhóm
khuẩn
thối

vi
gây

Nhóm
khuẩn
bệnh

vi
gây

* Ghi chú: *: vi khuẩn gram dương, **: vi khuẩn gram âm

3.3.4.3. Đánh giá độc tính
Kết quả đánh giá độc tính với tổng liều oligochitin là 20 ml/chuột cho nhóm 1; 10
ml/chuột cho nhóm 2 và 4 ml/chuột cho nhóm 3 được chia đều trong suốt 20 ngày cho
thấy chế phẩm oligochitin không gây độc cho chuột lang, được thể hiện:
- Toàn bộ cá thể chuột nghiên cứu đều còn sống, khỏe mạnh, tăng trọng tốt và
không khác biệt so với nhóm chuột đối chứng.
- Chuột có hiệu quả dung nạp oligochitin tốt, không có các phản ứng bất thường
xảy ra ngay sau khi uống sản phẩm nghiên cứu và trong suốt thời kỳ nghiên cứu.
- Các kết quả xét nghiệm huyết học, chỉ số men gan (SGOT và SGPT) và xét
nghiệm 10 chỉ số sinh hóa nước tiểu trên nhóm chuột thí nghiệm cho thấy các giá trị
không khác biệt so với nhóm chuột đối chứng.
- Kết quả giải phẫu bệnh cho thấy về đại thể tất cả các cơ quan hoàn toàn bình

thường, trọng lượng tươi của gan, lách, thận (2 bên) của chuột thí nghiệm không có sự
khác biệt so với nhóm chuột đối chứng. Quan sát vi thể của gan, lách, thận cho thấy
không có bất kỳ một tổn thương và sự khác biệt nào giữa chuột uống sản phẩm nghiên
cứu hay uống nước muối sinh lý (nhóm đối chứng).
Từ các kết quả nghiên cứu độc chất học trên chuột lang có thể kết luận sản phẩm
oligochitin phân đoạn A an toàn và không gây độc đối với chuột lang khi sử dụng bằng
đường uống.
3.4. NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM OLIGOCHITIN PHÂN ĐOẠN A TRONG
BẢO QUẢN CÁ NGỪ CHÙ NGUYÊN LIỆU
3.4.1. Nghiên cứu nồng độ dung dịch oligochitin phân đoạn A sử dụng
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu cá ngừ chù bảo quản bằng oligochitin phân đoạn
A ở nồng độ 1,0% có chất lượng cảm quan tương tự như mẫu cá ngừ chù bảo ở nồng độ
1,5% trong thời gian 22 ngày. Do vậy để tiết kiệm chi phí, luận án sẽ chọn dung dịch
oligochitin phân đoạn A ở nồng độ 1,0% để bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu.
3.4.2. Nghiên cứu bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng dung dịch oligochitin
phân đoạn A nồng độ 1,0%
3.4.2.1. Đánh giá chất lượng cảm quan cá ngừ chù nguyên liệu theo thời gian
Từ các phân tích ở trên về sự biến đổi chất lượng cảm quan của cá ngừ chù
nguyên liệu bảo quản bằng oligochitin phân đoạn A ở nồng độ 1,0% trong nước đá
lạnh (2±10C) ở trên cho thấy, mẫu TN đạt chất lượng cảm quan theo TCVN 2646-78
trong thời gian 21 ngày. Trong khi ở mẫu ĐC, không còn đạt chất lượng trong thời
gian 11 ngày. Như vậy mẫu cá ngừ chù nguyên liệu có sử dụng oligochitin phân đoạn
17


A ở nồng độ 1,0% đã giữ được chất lượng cảm quan trong thời gian gấp hai lần so với
mẫu không sử dụng oligochitin.
3.4.2.2. Đánh giá sự biến đổi một số chỉ tiêu hóa học cá ngừ chù nguyên liệu theo
thời gian
3.4.2.2.1. Biến đổi pH

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự thay đổi pH mẫu cá ngừ chù bảo quản bằng
oligochitin A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh diễn ra chậm hơn sơ mẫu ĐC, pH mẫu
TN vẫn đạt chất lượng theo TCVN 2646-78 trong thời gian 21 ngày. Trong khi đó mẫu
ĐC có sự biến đổi pH nhanh, trong thời gian 12 ngày đã không còn đạt chất lượng.
3.4.2.2.2. Biến đổi về hàm lượng nitơ ammoniac (NH3)
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản bằng
oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh đã giúp kìm hãm lượng NH3
so với mẫu ĐC. Ở mẫu TN sau 15 ngày, lượng NH3 vẫn đạt chất lượng theo TCVN
2646-78. Trong khi đó ở mẫu ĐC, sau 4 ngày mẫu đã không còn đạt chất lượng.
3.4.2.2.3. Biến đổi về tổng nitơ bazơ bay hơi (TVB-N)
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản bằng
oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh đã giúp kìm hãm sự gia tăng
lượng TBV-N, sau 22 ngày là 35,56 mg/100g. Trong khi đó ở mẫu ĐC hàm lượng
TBV-N tăng rất nhanh, sau 22 ngày tới 112,64 mg/100g.
3.4.2.2.4. Biến đổi hàm lượng malonaldehyde (MAD)
Kết quả nghiên cứu cho thấy mẫu cá ngừ chù nguyên liệu được bảo quản bằng
oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh đã giúp kìm hãm sự gia tăng
lượng MAD, sau 22 ngày là 0,1237 nmol MAD/g. Trong khi đó ở mẫu ĐC hàm lượng
MAD tăng rất nhanh, sau 22 ngày tới 0,5761 nmol MAD/g.
3.4.2.2.5. Biến đổi hàm lượng histamin
Kết quả nghiên cứu cho thấy bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng oligochitin
phân đoạn A nồng độ 1% trong nước đá lạnh đã giúp kìm hãm sự gia tăng hàm lượng
histamin, ở mẫu TN lượng histamin còn trong giới hạn tới hết thời gian bảo quản. Trong
khi ở mẫu ĐC, trong thời gian 11 ngày hàm lượng histamin đã vượt giới hạn cho phép
(100 mg/kg).
3.4.2.3. Đánh giá sự biến đổi một số chỉ tiêu vi sinh vật trên cá ngừ chù nguyên
liệu theo thời gian
3.4.2.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí (TPC)
Từ các phân tích ở trên về biến đổi TPC trên cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản
bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh cho thấy, ở mẫu TN

trong thời gian 15 ngày TPC vẫn trong giới hạn. Trong khi đó ở mẫu ĐC trong thời
gian 9 ngày TPC đã vượt giới hạn cho phép.
3.4.2.3.2. Pseudomonas spp
Từ những phân tích ở trên về Pseudomonas spp trên cá ngừ chù cho thấy, mẫu
bảo quản bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá (2±10C) đã có tác
dụng ức chế Pseudomonas spp nên lượng Pseudomonas spp thấp hơn 1,65 lần so với
mẫu ĐC trong thời gian 22 ngày.
18


3.4.2.3.3. Vi khuẩn sinh H2S (Shewanella putrefaciens)
Từ những phân tích ở trên về biến đổi của Shewanella putrefaciens trên cá ngừ chù
nguyên liệu cho thấy, mẫu bảo quản bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong
nước đá (2±10C) đã có tác dụng ức chế Shewanella putrefaciens nên lượng Shewanella
putrefaciens thấp hơn 1,59 lần so với mẫu ĐC trong thời gian 22 ngày.
3.4.2.3.4. Clostridium perfringens
Từ các phân tích ở trên về Clostridium perfringens trên cá ngừ chù nguyên liệu
bảo quản bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá lạnh cho thấy,
mẫu TN có thời gian bảo quản tới 17 ngày. Trong khi mẫu ĐC chỉ bảo quản được
không quá 9 ngày.
3.4.2.3.5. Salmonella typhimurium
Từ những phân tích về Salmonella typhimurium trên cá ngừ chù nguyên liệu
bảo quản bằng oligochitin phân đoạn A 1,0% trong nước đá (2±10C) cho thấy không
có sự xuất hiện Salmonella typhimurium trong thời gian bảo quản 22 ngày ở cả mẫu
TN và mẫu ĐC.
3.4.4.6. S.aureus
Từ những phân tích ở trên về S.aureus trên cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản
bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% cho thấy, mẫu TN có thời gian bảo quản
20 ngày. Trong khi mẫu ĐC thời gian bảo quản chỉ kéo dài 11 ngày.
3.4.3. Đề xuất quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng oligochitin phân

đoạn A
Từ các kết quả nghiên cứu ở trên, cho phép đề xuất quy trình bảo quản cá ngừ chù
nguyên liệu bằng oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% được trình bày ở Hình 3.15.
Cá ngừ chù nguyên liệu

Phân loại, xử lý sơ bộ

Nhúng vào dung dịch oligochitin phân
đoạn A nồng độ 1,0%, thời gian 5 phút

Xếp vào thùng cách nhiệt

Bảo quản lạnh (2±10C)
Hình 3.15. Sơ đồ quy trình bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng oligochitin phân
đoạn A nồng độ 1,0% trong nước đá

19


KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Đã tiến hành đánh giá hiệu quả phân cắt chitin thành oligochitin bằng tác nhân
axít HCl, chiếu xạ γ (Co-60) và enzyme chitinase cho thấy: Sử dụng kỹ thuật chiếu xạ γ
(Co-60) trực tiếp huyền phù chitin trong dung dịch axít HCl 10% cho hiệu quả phân cắt
chitin thành oligochitin cao nhất. Do vậy, kỹ thuật chiếu xạ γ (Co-60) trực tiếp huyền
phù chitin trong dung dịch axít HCl 10% được lựa chọn để phân cắt chitin thành
oligochitin, cụ thể:
• Chiếu xạ γ có hiệu suất thu hồi oligochitin phân đoạn A cao nhất, đạt 60,3%.
Cao hơn so với axít HCl và chitinase, tương ứng 8,7 và 2,8 lần.

• Oligochitin phân đoạn A có hoạt tính chống oxy hóa và và hoạt tính kháng các
chủng vi khuẩn thử nghiệm mạnh hơn oligochitin phân đoạn B, tương ứng là 1,2÷2,0
và 1,5÷2,0 lần.
• Oligochitin phân đoạn A thu nhận bằng chiếu xạ γ có chi phí sản xuất 5.850.912
đồng/kg. Thấp hơn so với axít HCl và chitinase, tương ứng 11,33 và 12,48 lần.
2) Đã tiến hành nghiên cứu và thu được các thông số tối ưu cho công đoạn phân
cắt chitin thành oligochitin bằng chiếu xạ γ (Co-60), cụ thể: Suất liều hấp thụ 2,97
kGy/giờ, liều hấp thụ 227,2 kGy và nồng độ chitin huyền phù 9,8%.
3) Đã tiến hành đánh giá một số tính chất oligochitin sản xuất và nhận thấy:
Oligochitin phân đoạn A có phân tử lượng (Mw) 2958 Da (<3kDa), chứa bốn phân
đoạn có phân tử lượng tương ứng: 1695, 2066, 2415 và 2986 Da. Không phát hiện sự
thay đổi nhóm chức đặc trưng, cấu trúc phân tử so với chitin ban đầu. Oligochitin
phân đoạn A có độ deacetyl 35,2% và độ hòa tan trong nước ngọt 98,1%.
4) Đã tiến hành đánh giá hoạt tính chống oxy hóa và kháng khuẩn của oligochitin
và nhận thấy:
• Về hoạt tính chống oxy hóa, thông qua đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH
và hoạt tính kháng oxy hóa lipid màng: Oligochitin phân đoạn A có khả năng quét gốc
tự do DPPH đạt 72,9% và hoạt tính kháng oxy hóa màng lipid đạt 89,4% (4 mg/ml).
• Về hoạt tính kháng khuẩn, đánh giá trên nhóm vi khuẩn gây thối: TPC,
Pseudomonas spp và Shewanella putrefaciens và nhóm vi khuẩn gây bệnh: Clostridium
perfringens, Staphylococcus aureus và Salmonella typhimurium: Oligochitin phân đoạn A
có hoạt tính kháng trên cả hai nhóm vi khuẩn thử nghiệm. Hoạt tính kháng nhóm vi khuẩn
gây thối (250 µg/ml) mạnh hơn nhóm vi khuẩn gây bệnh (300 µg/ml). Trong nhóm gây
bệnh, hoạt tính kháng chủng vi khuẩn gram dương (300 µg/ml) mạnh hơn chủng vi khuẩn
gram âm (400 µg/ml).
5) Đã tiến hành đánh giá độc tính oligochitin trên chuột, thông qua quan sát lâm
sàng, đánh giá trọng lượng, xét nhiệm máu, xét nhiệm nước tiểu, giải phẫu bệnh, quan
sát giải phẫu dạ dày và nhận thấy: Oligochitin phân đoạn A sản xuất bằng chiếu xạ γ
(Co-60) phân cắt chitin huyền phù trong dung dịch axít HCl 10% an toàn và không
gây độc cho chuột qua con đường tiêu hóa cũng như không có ảnh hưởng nào tới

trạng thái sinh lý của chuột thí nghiệm.

20


6) Đã tiến hành xây dựng quy trình và thử nghiệm sử dụng oligochitin trong bảo
quản cá ngừ chù nguyên liệu cho thấy: Cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản bằng
oligochitin phân đoạn A nồng độ 1,0% kết hợp với nước đá, duy trì được chất lượng cảm
quan trong thời gian 21 ngày, đáp ứng yêu cầu nguyên liệu trong chế biến.
4.2. KHUYẾN NGHỊ
Trên cơ sở của các nghiên cứu đã thực hiện, cần tiếp tục:
1) Nghiên cứu hoàn thiện quy trình và thiết bị sản xuất oligochitin phân đoạn A ở
quy mô công nghiệp, mục đích tăng công suất và giảm giá thành sản phẩm.
2) Triển khai bảo quản cá ngừ chù nguyên liệu bằng oligochitin ở quy mô lớn,
giúp hoàn thiện quy trình bảo quản, tiến tới chuyển giao quy trình bảo cá ngừ chù
nguyên liệu bằng oligochitin cho doanh nghiệp, cơ sở thu mua và người dân.
3) Nghiên cứu mở rộng ứng dụng oligochitin trên các đối tượng nguyên liệu thủy
sản khác nói riêng và thực phẩm nói chung, nhằm thay thế hóa chất độc hại giúp nâng
cao chất lượng và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
1. Tran Van Vuong, Nguyen Thi Van, Vu Ngoc Boi (2015), “Changes in chemical
components of frigate tuna (Auxis thazard) during storage by ice and low molecular
weight chitin”, VBFoodNet conference 22÷26 November, Nha Trang University, pp.
218÷225.
2. Trần Văn Vương, Nguyễn Thị Vân, Vũ Ngọc Bội (2016), “Nghiên cứu sự biến đổi
một số thành phần hóa học của cá ngừ chù (Auxis thazard) trong quá trình bảo quản
bằng nước đá kết hợp với chitin phân tử lượng thấp”, Tạp chí Nông nghiệp & Phát
triển Nông thôn, 16, Bộ NN&PTNT, tr.56÷62.
3. Trần Văn Vương, Nguyễn Anh Tuấn, Vũ Ngọc Bội (2018), “Depolymer chitin thu

nhận phân đoạn oligochitin bằng axít clohydric, chiếu xạ gamma và chitinase”, Tạp
chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, 03, Trường Đại học Nha Trang, tr.75÷81.
4. Trần Văn Vương, Vũ Ngọc Bội (2019), “Nghiên cứu tối ưu hóa công đoạn sản xuất
oligochitin bằng chiếu xạ gamma”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, 02,
Trường Đại học Nha Trang, tr.86÷92.
5. Trần Văn Vương, Vũ Ngọc Bội (2020), “Đánh giá chất lượng cảm quan và một số
chủng vi khuẩn gây thối cá ngừ chù nguyên liệu bảo quản bằng oligochitin kết hợp với
nước đá”, Tạp chí Khoa học Công nghệ Thủy sản, 01, Trường Đại học Nha Trang,
tr.46÷53.

21