Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dưỡng schizochytrium mangrovei PQ6 định hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN CẨM HÀ

NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG
SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM
NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE,
MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC

Hà Nội - Năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN CẨM HÀ

NGHIÊN CỨU SQUALENE TỪ VI TẢO BIỂN DỊ DƢỠNG

SCHIZOCHYTRIUM MANGROVEI PQ6 ĐỊNH HƢỚNG LÀM
NGUYÊN LIỆU CHO THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE,
MỸ PHẨM VÀ DƢỢC PHẨM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN S SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS. TS Đặng Diễm Hồng

Hà Nội – Năm 2020


i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.
TS. Đặng Diễm Hồng, nguyên Trưởng phòng Công nghệ tảo, Viện Công nghệ sinh
học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - người thầy đã định hướng,
truyền dạy những kiến thức khoa học và giúp đỡ tôi vượt qua những trở ngại và khó
khăn trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Tôi trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phòng thí
nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, bộ phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban
Lãnh đạo và bộ phận đào tạo của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất và
giúp tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu.
Trong quá trình viết luận án tôi đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình
của TS. Hoàng Thị Lan Anh. Ngoài ra tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của các đồng
nghiệp làm việc tại phòng Công nghệ Tảo: TS. Hoàng Thị Minh Hiền, TS. Ngô Thị
Hoài Thu, TS. Lưu Thị Tâm, ThS. NCS. Lê Thị Thơm. Nhân dịp này, tôi xin chân

thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Nguyễn Hoàng Ngân- Học
viện Quân Y, đã giúp đỡ tôi trong một số thử nghiệm trên động vật thực nghiệm,
phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý của squalene.
Luận án được thực hiện trong khuôn khổ các đề tài Quỹ Phát triển Khoa học và
Công nghệ Quốc gia - Nafosted, Bộ Khoa học và Công nghệ “Nghiên cứu đánh giá và
khai thác chất squalene làm dược phẩm từ vi tảo biển của Việt Nam” (2013-2016) do
PGS. TS. Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm, đề tài “Cơ chế điều hòa trao đổi lipid của
các hợp chất từ thực vật biển Việt Nam trong phòng và điều trị bệnh gan nhiễm mỡ
không do rượu” (2014-2016) và đề tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nuôi trồng lượng lớn sinh khối tảo
Schizochytrium mangrovei PQ6 và tách chiết qualene đủ tiêu chuẩn nguyên liệu làm
thực phẩm chức năng” (2014-2016) do TS. Hoàng Thị Minh Hiền làm chủ nhiệm.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ở bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập,
nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình.
Hà Nội, ngày tháng
năm 2020
Tác giả

Nguyễn Cẩm Hà


ii
Lời cam đoan
Tôi xin cam Ďoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần Ďã
Ďược công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự Ďồng ý và cho phép

của các Ďồng tác giả;
Phần còn lại chưa Ďược ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày tháng 10 năm 2020
Tác giả

Nguyễn Cẩm Hà


iii

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn……………………………………………………………………...

i

Lời cam Ďoan…………………………………………………………………...

ii

Mục lục…………………………………………………………………………

iii

Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt…………………………………………..

viii

Danh mục các bảng…………………………………………………….............

xi

Danh mục các hình vẽ, Ďồ thị…………………………………………………..

xii

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………….

1

Chƣơng 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………....

4

1.1.

Giới thiệu chung về squalene…………………………………..

4

1.1.1.

Tính chất hóa lý của squalene…………………………………...

4

1.1.2.

Nguồn gốc và cấu trúc của squalene…………………………….

4

1.1.3

Các con Ďường sinh tổng hợp của squalene ở Ďộng vật, thực vật
và vi sinh vật……………………………………………………..

6

1.1.4

Ứng dụng của squalene………………………………………….

11

1.1.5.

Các nguồn cung cấp squalene…………………………………...

18

1.2.

Công nghệ tách chiết và tinh sạch squalene……………..……

21

1.2.1.

Công nghệ tách chiết squalene………………………………….

21

1.2.2.

Các phương pháp Ďịnh lượng và tinh sạch squalene………….....

27

1.3.

Giới thiệu công nghệ nuôi trồng vi tảo biển dị dƣỡng………

29

1.4.

Giới thiệu về chi vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium……….

33

1.4.1

Đặc Ďiểm chung của chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium….

33

1.4.2.

Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
cho sản xuất squalene……………………………………………

1.4.2.1.

Tình hình nuôi trồng chi vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium
cho sản xuất squalene trên thế giới……………………………......

1.4.2.2.
Chƣơng 2.

37
37

Tình hình nghiên cứu và nuôi trồng Schizochytrium cho sản xuất
squalene ở Việt Nam………………………………………………..............

39

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………...

43


iv
2.1.

Vật liệu………………………………………………………….

43

2.1.1.

Mẫu vật…………………………………………………………..

43

2.1.2.

Các bộ kít sinh phẩm…………………………………………….

44

2.1.3.

Động vật thí nghiệm……………………………………………..

45

2.1.4.

Các dòng tế bào………………………………………………….

46

2.1.5.

Hoá chất………………………………………………………….

46

2.1.6.

Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm…………………………………..

46

2.1.7.

Môi trường nuôi cấy……………………………………………..

47

2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu………………………………………

48

2.2.1.

Nhóm phương pháp xác Ďịnh chủng/loài; Ďặc Ďiểm sinh học;
Ďiều kiện nuôi trồng tối ưu của chủng/loài tiềm năng cho sản
xuất squalene cao ………………..................................................

2.2.1.1.

48

Phương pháp xác định sinh trưởng qua mật độ tế bào và sinh
khối khô…………………………………………………………………

48

2.2.1.2.

Phương pháp chụp ảnh hình thái……………………………….......

49

2.2.1.3.

Phương pháp xác định hàm lượng lipid tổng số trong sinh khối
tảo………………………………………………………………………..

49

2.2.1.4.

Phương pháp nhuộm lipid bằng Nile Red…………………………..

49

2.2.1.5.

Phương pháp xác định đường khử bằng DNSA……………………

49

2.2.1.6.

Phương pháp xác định sơ bộ hàm lượng squalene………………..

50

2.2.1.7.

Bố trí thí nghiệm nghiên cứu điều kiện nuôi trồng tối ưu của
chủng/loài tiềm năng thuộc chi Schizochytrium cho sản xuất
squalene cao …………………………………………………………...

2.2.2.

Nhóm phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch
squalene từ S. mangrovei PQ6……………………………………….

2.2.2.1.

53

Phương pháp xác định điều kiện tách chiết và tinh sạch lượng
nhỏ

squalene

từ

sinh

khối

S.

mangrovei

PQ6………………………………………………………………………
2.2.2.2.

50

53

Phương pháp xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch
squalene ở quy mô pilot từ sinh khối tảo S. mangrovei
PQ6………………………………………………………………………

2.2.2.3.

55

Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của
squalene.. .....................................................................................

56


v

2.2.2.4.

Phương pháp xác định cấu trúc của squalene..............................

2.2.3.

Nhóm phương pháp xác Ďịnh các chỉ tiêu chất lượng của
squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6………………………..

2.2.4.

57
57

Nhóm phương pháp Ďánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý
của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên Ďộng vật thực
nghiệm (in vivo) và mô hình tế bào (in vitro)…………………...

2.2.4.1

58

Nhóm phương pháp đánh giá tính an toàn và tác dụng dược lý
của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in
vivo………………………………………………………………………

2.2.4.2.

58

Nhóm phương pháp đánh giá bước đầu nghiên cứu cơ chế tác
dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6
trên mô hình in vitro…………………………………………………..

59

2.2.5.

Thống kê phân tích số liệu………………………………………

63

2.2.6.

Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu……………

63

Chƣơng 3.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN….…………….

65

3.1.

Sàng lọc chủng vi tảo biển dị dƣỡng có tiềm năng sản xuất
squalene…………………………………………………………

3.2.

Ảnh hƣởng của điều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 lên
sinh trƣởng và hàm lƣợng squalene…………………………..

3.2.1.

72

Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp vitamin lên sinh trưởng và
hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………….…………...

3.2.2

70

Ảnh hưởng của nồng độ tebinafine lên sinh trưởng và hàm
lượng squalene ở cấp độ bình tam giác ……………………………

3.2.1.5.

69

Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu lên sinh trưởng và
hàm lượng squalene ở cấp độ bình tam giác………………………

3.2.1.4.

67

Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên sinh trưởng và hàm

lượng squalene ở cấp độ bình tam giác ……………………………

3.2.1.3

67

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng và hàm lượng squalene
ở cấp độ bình tam giác………………………………………………..

3.2.1.2.

67

Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng S. mangrovei PQ6 cho sản xuất
squalene ở cấp Ďộ bình tam giác…………………………………

3.2.1.1.

65

73

Tối ưu Ďiều kiện nuôi trồng chủng S. mangrovei PQ6 ở bình lên
men 30 lít Ďể thu sinh khối tảo giàu squalene…………………...

75


vi
3.2.2.1.

Ảnh hưởng của nồng độ glucose lên sinh trưởng và tích lũy
squalene của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong
hệ thống bình lên men 30 lít………………………………………….

3.2.2.2.

75

Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên sinh trưởng và tích lũy squalene
của chủng S. mangrovei PQ6 nuôi trồng theo mẻ trong hệ thống
lên men 30 lít…………………………………………………………...

3.2.2.3

Ảnh hưởng của lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất lên sinh
trưởng và tích lũy squalene của chủng S. mangrovei PQ6……...

3.2.2.4

81

Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………….

3.3.1.

79

Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên sinh trưởng và tích lũy

squalene của chủng S. mangrovei PQ6………………………….

3.3.

77

86

Tối ưu Ďiều kiện tách chiết và tinh sạch lượng nhỏ squalene từ
S. mangrovei PQ6………………………………………………..

86

3.3.1.1.

Tách chiết lipid tổng số từ sinh khối S. mangrovei PQ6………....

86

3.3.1.2

Tách chiết lipid không xà phòng hóa từ lipid tổng số…………….

90

3.3.1.3.

Tinh sạch và định lượng squalene bằng sắc ký lớp mỏng và sắc
ký lỏng cao áp………………………………………………………….

3.3.1.4.

Tách chiết, tinh sạch và làm giàu squalene bằng phương pháp
dung môi………………………………………………………………...

3.3.2.

94

Ảnh hưởng của các tác nhân lên hiệu quả tách chiết squalene từ
sinh khối khô S. mangrovei PQ6…………………………………….

3.3.2.2.

92

Xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch squalene ở quy mô
pilot từ S. mangrovei PQ6……………………………………….

3.3.2.1.

91

95

Tách chiết squalene từ dịch tế bào chủng S. mangrovei PQ6 sau
quá trình nuôi cấy lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất …………

97

3.3.2.3.

Điều kiện tinh chế squalene bằng phương pháp sắc ký cột……...

98

3.3.2.4.

Xây dựng quy trình tách chiết và làm sạch nguyên liệu squalene
từ sinh khối tảo S. mangrovei PQ6………………………………

101

3.3.3.

Tách chiết và tinh chế lượng lớn squalene từ S.mangrovei PQ6...

103

3.3.4.

Phân tích các chỉ tiêu về cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim
loại của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6……………….

3.4.

Tính an toàn và tác dụng dƣợc lý của squalene tách chiết từ

105

vii
S. mangrovei PQ6 trên mô hình động vật thực nghiệm (in
vivo) và mô hình tế bào (in vitro)………………………………
3.4.1.

Độc tính cấp của squalene trên mô hình Ďộng vật thực
nghiệm…………………………………………………………...

3.4.2.

112

Tác dụng dược lý của squalene trên chuột nhắt trắng thí
nghiệm…………………………………………………………...

3.5.

109

Đánh giá mức độ tổn thương chức năng gan, thận chuột khi
dùng squalene dài ngày……………………………………………….

3.4.3.

108

Ảnh hưởng của squalene đối với một số chỉ tiêu huyết học và
sinh hóa của chuột……………………………………………………..

3.4.2.3.

108

Ảnh hưởng của squalene lên tình trạng chung và sự thay đổi thể
trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày…………………….

3.4.2.2.

107

Độc tính bán trường diễn của squalene trên mô hình Ďộng vật
thực nghiệm……………………………………………………...

3.4.2.1.

107

114

Bƣớc đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm lipid của
squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 trên mô hình in
vitro……………………………………………………………...

117

3.5.1.

Đánh giá Ďộc tính của squalene trên các dòng tế bào……………

117

3.5.2.

Tác dụng giảm lipit của squalene lên tế bào gan và tế bào Ďại
thụ thể……………………………………………………………

3.5.2.1.

Tối ưu hóa thời gian và nồng độ ủ squalene lên sự thay đổi hàm
lượng lipid trong tế bào gan HepG2………………………………..

3.5.2.2.

119

Cơ chế phân tử tác dụng giảm cholesterol của squalene tách
chiết từ S. mangrovei PQ6……………………………………….

3.5.4.

118

Tác dụng của squalene lên sự thay đổi hàm lượng lipid nội bào
trong tế bào gan HepG2 và RAW264.7……………………………..

3.5.3.

118

121

Tác dụng giảm triglyceride của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6…………………………………………………..

125

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………...

127

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ………………………………

129

TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………

131

PHỤ LỤC


viii

Q111`DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên đầy đủ

Từ viết tắt

Tên tiếng Việt

ABCA1

ATP-binding cassette protein A1

Protein A1 liên kết với ATP

ABCG1

ATP-binding cassette protein G1

Protein G1 liên kết với ATP

ALT

Alanine aminotransferase

Alanine aminotransferase

ApoE

Apolipoprotein E

Apolipoprotein E

AST

Aspartate aminotransferase

Aspartate aminotransferase

ATP

Adenosine triphosphate

Adenosine triphosphate

CCT

Chuột cống trắng

Chuột cống trắng

CNT

Chuột nhắt trắng

Chuột nhắt trắng

CYP7A1

Cholesterol 7a- hydroxylase

Cholesterol 7a- hydroxylase

DHA

Docosahexaenoic acid

Axít docosahexaenoic

DMAPP

Dimethylallyl diphosphate

Dimethylallyl diphosphate

DMEM

Dulbecco's

modified

eagle Môi trường DMEM

medium
DNA

Deoxyribonucleic acid

Axít deoxyribonucleic

DO

Dissolved oxygen

Oxy hòa tan

DXP

1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate

1- deoxy-D-xylulose-5-phosphate

EN

Ectoplasmic net

Mang lưới ngoại chất

ER

Endoplasmic reticulum

Màng lưới nội chất

EPA

Eicosapentaenoic acid

Acid eicosapentaenoic

FAS

Fatty acid synthase

Fatty acid synthase


ix

ESFA

Este steryl fatty acid

Acid béo este steryl

FBS

Fetal bovine serum

Huyết thanh phôi bò

FPP

Farnesyl diphosphate

Farnesyl diphosphate

GAPDH

Glyceraldehyde-3-phosphate

GAPDH

dehydrogenase
GC

Gas chromatography

Sắc ký khí

GPP

Geranyl diphosphate

Geranyl diphosphate

HDL-C

high

density

lipoprotein- cholesterol gắn với lipooprotein tỷ

cholesterol

trọng cao

HMG-CoA 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA
HMGR

3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl 3 - hydroxyl - 3 - methylglutaryl
coenzyme A reductase

HPLC

3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA

High

performance

coenzyme A reductase
liquid Sắc ký lỏng cao áp

chromatography
IPP

Isopentenyl diphosphate

Isopentenyl diphosphate

KLCT

Khối lượng cơ thể

Khối lượng cơ thể

KXPH

Không xà phòng hóa

Không xà phòng hóa

LD50

Lethal dose 50%

Liều gây chết 50% số Ďộng vật

thực nghiệm

LDL-C

Low density liporotein-cholesterol

Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ
trọng thấp

LDL-R

Low density lipoprotein - receptor

Thụ thể lipoprotein có tỷ trọng
thấp

LXR

Liver X receptor

Thụ thể gan X

MĐTB

Mật Ďộ tế bào

Mật Ďộ tế bào


x

MEP

Methylerythritol phosphate

Methylerythritol phosphate

MJA

Methyl jasmonate

Methyl jasmonate

MVA

Mevalonate

Mevalonat

NMR

Nuclear magnetic resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

OA

Oleic acid

Acid oleic

ORO

Oil Red O

Oil red O

PA

Palmitic acid

Palmitic acid

PBS

Phosphate buffered salina

Muối Ďệm phosphate

PCR

Polymerase chain reaction

Phản ứng chuỗi trùng hợp

PUFA

Polyunsaturated fatty acid

Axít béo không bão hòa Ďa nối Ďôi

RNA

Ribonucleic acid

Acid ribonucleic

SCF

Super critical fluid

Chất lỏng siêu tới hạn

SKK

Sinh khối khô

Sinh khối khô

SKT

Sinh khối tươi

Sinh khối tươi

TB

Tế bào

Tế bào

TG

Triglycerid

Triglycerit

TBNF

Terbinafine

Terbinafine

TBS

Tris-buffered saline

Tris-buffered saline

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

VLDL-C

Very low density-cholesterol

Cholesterol gắn với lipoprotein tỷ
trọng rất thấp

VTBDD

Vi tảo biển dị dưỡng

Vi tảo biển dị dưỡng


xi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1.

Các thông số lý hóa của squalene…………………………………..…

4

Bảng 1.2

Một số tiêu chuẩn của squalene thương mại………………………….

17

Bảng 1.3.

Tính chất vật lý của một số chất lỏng siêu tới hạn (SCF)…………….

23

Bảng 1.4.

Các phương pháp tách chiết squalene từ nguồn tự nhiên……………..

24

Bảng 1.5.

Sự phân loại của lớp Labyrinthulea Ďược Ďiều chỉnh từ các nghiên của
Anderson và Cavalier-Smith (2012), Gomaa và cộng sự (2013),
Beakes và cộng sự, (2014)…………….................................................

35

Bảng 2.1.

Danh sách các chủng thuộc chi Schizochytrium và Thraustochytrium..

44

Bảng 2.2.

Trình tự các cặp mồi Ďược sử dụng trong phản ứng qPCR…………..

45

Bảng 2.3.

Địa Ďiểm tiến hành các thí nghiệm trong nghiên cứu…………………

63

Bảng 3.1.

Sinh trưởng, hàm lượng lipid tổng số và squalene của các chủng
thuộc chi Schizochytrium, Thraustochytrium Ďã phân lập………….....

Bảng 3.2

65

Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên hàm lượng và sản lượng squalene
trong quá trình lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất của tế bào S.
mangrovei PQ6………………………………………………………...

Bảng 3.3.

84

Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên
hàm lượng và hiệu suất tách chiết lipid KXPH từ lipid tổng số của
chủng PQ6……………………………………………………………..

Bảng 3.4.

91

Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp dung môi n-hexane: chloroform lên
hiệu suất tách chiết lipid KXPH và hàm lượng squalene từ lipid tổng
số của chủng PQ6……………………………………………………...

Bảng 3.5.

91

Các chỉ tiêu cảm quan, hóa lý, vi sinh vật và kim loại của squalene
tách chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6……………………………..

106

Bảng 3.6.

Độc tính cấp theo Ďường uống của squalene trên chuột nhắt trắng…...

107

Bảng 3.7.

Ảnh hưởng của squalene lên thể trọng chuột cống trắng……………...

109

Bảng 3.8.

Ảnh hưởng của squalene lên một số chỉ tiêu huyết học và sinh hóa
trong máu chuột………………………………………………………..

109

Bảng 3.9.

Ảnh hưởng của squalene lên nồng Ďộ HDL-C máu chuột…………….

112

Bảng 3.10.

Ảnh hưởng của squalene lên cân nặng cơ thể và gan chuột nghiên cứu

115

Bảng 3.11.

Ảnh hưởng của squalene lên các chỉ số lipid máu chuột……………...

116


xii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Trang
Hình 1.1.

Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó……………………

Hình 1.2.

Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A).

5

Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA tại phần

bào tan và MEP ở lạp thể (B)………………………………………….
Hình 1.3

7

Sinh tổng hợp squalene thông qua con Ďường MEP ở vi khuẩn E. coli
(A). Sinh tổng hợp squalene ở nấm men Sacchacromyces cerevisae
(B)…………………………………………………………………

Hình 1.4.

Mối quan hệ giữa sinh tổng hợp terpenoid và DHA ở
Thraustochytrids……………………………………………………….

Hình 1.5.

76

Hình thái của S. mangrovei PQ6 khi nuôi trồng ở các nồng Ďộ glucose
ban Ďầu khác nhau dưới kính hiển vi quang học (Ďộ phóng Ďại x400).

Hình 3.9.

74

Ảnh hưởng của các nồng Ďộ glucose khác nhau lên sinh trưởng (A-B)
và hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6.............................

Hình 3.8.

73

Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô
(B), hàm lượng squalene (C) của S. mangrovei PQ6………………….

Hình 3.7.

71

Ảnh hưởng của nồng Ďộ terbinafine lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối
khô (B), hàm lượng lipid và squalene (C) của S. mangrovei PQ6........

Hình 3.6.

70

Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên hàm lượng squalene (A) và hiệu
suất squalene (B) của S. mangrovei PQ6...............................................

Hình 3.5.

69

Ảnh hưởng của nồng Ďộ glucose lên sinh trưởng (A) và hàm lượng
lipit (B) của S. mangrovei PQ6………………………………………..

Hình 3.4.

68

Ảnh hưởng của nồng Ďộ cao nấm men lên sinh trưởng (A) và hàm
lượng squalene (B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau ...............................

Hình 3.3.

64

Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ lên sinh trưởng (A) và hàm lượng squalene
(B) ở các ngày nuôi cấy khác nhau……………………………………

Hình 3.2.

41

Sơ Ďồ thí nghiệm nghiên cứu squalene tách chiết từ S. mangrovei
PQ6…………………………………………………………………….

Hình 3.1.

9

Các hệ thống bình lên men 5 lít, 10 lít, 30 lít và 150 lít cho nuôi trồng
vi tảo biển dị dưỡng S. mangrovei PQ6…..……………………………….

Hình 2.1.

8

Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên mật Ďộ tế bào (A), sinh khối

77


xiii
khô (B), sản lượng squalene (C), Ďường dư (D) của tế bào S.
mangrovei PQ6 .......................................................................................
Hình 3.10.

78

Ảnh hình thái của S. mangrovei PQ6 dưới kính hiển vi quang học ở
các thời Ďiểm khác nhau khi nuôi lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất
trong bình 30 Lít..................................................................................

Hình 3.11.

80

Mật Ďộ tế bào (A), sinh khối khô (B), sản lượng squalene (C) của S.
mangrovei PQ6 và hàm lượng Ďường dư (D) trong nuôi cấy theo mẻ
có bổ sung cơ chất..................................................................................

Hình 3.12.

81

Ảnh hưởng của tổ hợp vitamin B1, B6, B12 lên sinh khối (A), hàm
lượng squalene (B) và lượng Ďường dư (C) trong môi trường khi nuôi
cấy theo mẻ S. mangrovei PQ6.............................................................

Hình 3.13.

82

Hình thái tế bào chủng PQ6 ở các giai Ďoạn nuôi cấy của quá trình lên
men fed-batch. A- Trước thời Ďiểm bổ sung glucose; B- Sau khi bổ
sung glucose lên 22%.............................................................................

Hình 3.14.

85

Ảnh hưởng của các yếu tố dung môi (A), nhiệt Ďộ (B), thời gian (C),
số lần chiết (D) tỷ lệ sinh khối/dung môi (E), chế Ďộ khuấy trộn (G),
nhiệt Ďộ sấy sinh khối (H), Ďộ ẩm sinh khối (I) lên hiệu suất tách chiết
lipid .........................................................................................................

Hình 3.15.

Sắc ký lớp mỏng mẫu lipid không xà phòng hóa (A) và sắc ký Ďồ
squalene tinh sạch từ sinh khối chủng PQ6 (B) .....................................

Hình 3.16.

93

Phổ 1H (A) và 13C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.
mangrovei PQ6......................................................................................

Hình 3.19.

92

Ảnh chạy sắc ký lớp mỏng (A) và sắc ký Ďồ của squalene tinh sạch
sau quá trình làm giàu thông qua quy trình 6 bước (B) .........................

Hình 3.18.

92

Hàm lượng squalene qua các bước làm giàu và tách chiết từ sinh khối
S. mangrovei PQ6 ...................................................................................

Hình 3.17.

87

94

Ảnh hưởng của dung môi lên hàm lượng squalene tách chiết từ sinh
khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu squalene thô Ďược
tách chiết từ sinh khối tảo với các loại dung môi khác nhau .................

Hình 3.20.

Ảnh hưởng của Ďộ ẩm sinh khối tảo lên hàm lượng squalene tách
chiết từ sinh khối S. mangrovei PQ6. (A) Ảnh chạy TLC mẫu
squalene trong mẫu squalene thô Ďược tách chiết từ sinh khối tảo có

95

xiv
Ďộ ẩm khác nhau. (B) Hàm lượng squalene thô thu Ďược sau quá trình
chiết từ sinh khối có Ďộ ẩm 20 và 100%. (C) Hàm lượng squalene có
mặt trong squalene thô thu Ďược sau quá trình chiết từ sinh khối có Ďộ
ẩm 20 và 100%.......................................................................................
Hình 3.21.

Ảnh hình thái tế bào S. mangrovei PQ6 sau 0 h (A), 2 h (B), 4 h (C)
và 6 h (D) có bổ sung KOH 45% và duy trì pH=10...............................

Hình 3.22.

96

97

Hàm lượng squalene thô (A) và squalene có mặt trong squalene thô
(B) tách chiết từ sinh khối khô và dịch lên men tế bào S. mangrovei
PQ6.........................................................................................................

Hình 3.23.

Sắc ký lớp mỏng xác Ďịnh squalene từ mẫu chuẩn và mẫu squalene
thô của chủng PQ6 với các hệ dung môi chạy khác nhau......................

Hình 3.24.

98

99

Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là nhexan/chloroform (9:1; v/v)...................................................................

Hình 3.25.

100

Sắc ký lớp mỏng TLC (A) và kết quả phân tích HPLC (B) xác Ďịnh
sự có mặt của squalene trong các phân Ďoạn thu Ďược sau khi tách và
tinh sạch squalene thô qua cột silica gel với dung môi rửa giải là nhexane...................................................................................................

100

Hình 3.26.

Quy trình tách chiết squalene từ S. mangrovei PQ6…………………..

102

Hình 3.27.

Ảnh minh họa sản phẩm squalene thô (A), squalene tinh sạch và hỗn
hợp acid béo (B) tách từ dịch lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất từ
sinh khối tảo chủng PQ6………………………………………………

Hình 3.28.

Sắc ký Ďồ HPLC của squalene chuẩn (A) và squalene tinh sạch từ
sinh khối S. mangrovei PQ6 (B)………………………………………

Hình 3.29.

Phổ 1H (A) và

13

104

C (B) NMR của squalene tinh sạch từ sinh khối S.

mangrovei PQ6……………………………………………………………….
Hình 3.30.

103

104

Hình ảnh Ďại thể và mô bệnh học vi thể - tương ứng (HE, x 400) của
gan, thận, lách chuột tương ứng sau 60 ngày uống thuốc lô Ďối chứng
(a, d, g, k), lô thí nghiệm 1 (b, e, h, l) và lô thí nghiệm 2 (c, f, i, m)….

Hình 3.31.

114

Tỷ lệ sống sót của tế bào HepG2 và RAW246.7 Ďược ủ với squalene

ở các nồng Ďộ khác nhau………………………………………………

117


xv
Hình 3.32.

Ảnh hưởng của thời gian ủ squalene sau 24 h (A), 48 h (B) và 72 h
(C) lên khả năng tích lũy lipid trong tế bào gan HepG2 Ďược gây rối
loạn chuyển hóa lipid………………………………………………….

Hình 3.33.

118

Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrvei PQ6 lên sự tích
lũy hàm lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm lipid bằng
Oil Red O (C) trong tế bào HepG2……………………………………

Hình 3.34.

120

Ảnh hưởng của squalene tách chiết từ S. mangrovei PQ6 lên hàm
lượng cholesterol (A); triglycerid (B) và nhuộm Oil Red O (C) trong
tế bào Ďại thực bào RAW264.7………………………………………..

Hình 3.35.

Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện mRNA của các gen
tham gia vào các quá trình trao Ďổi cholesterol trong tế bào HepG2 .....

Hình 3.36.

121

Ảnh hưởng của squalene lên mức Ďộ biểu hiện gen của LXR α (A) và
LXR β (B) trong tế bào Ďại thực bào RAW264.7……………………..

Hình 3.37.

120

122

Squalene Ďiều hòa quá trình vận chuyển ngược cholesterol và mức Ďộ
biểu hiện các gen Ďích của LXRs trong tế bào Ďại thực bào
RAW264.7…………………………………………………………….

Hình 3.38.

Ảnh hưởng của squalene trong quá trình sinh tổng hợp triglyceride
trong tế bào HepG2 ................................................................................

Hình 3.39.

124

125

Sơ Ďồ tóm tắt bước Ďầu nghiên cứu cơ chế phân tử tác dụng giảm
cholesterol và tác dụng giảm lipid của squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6………………………………………………………...

126


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của luận án
Việt Nam có trên 3.200 km bờ biển với một nguồn sinh vật biển nhiệt Ďới rất
Ďa dạng, phong phú về thành phần loài và giàu các hợp chất tự nhiên có thể ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, y dược.... Trong Ďó vi tảo với ưu
Ďiểm chính là giàu dinh dưỡng, có kích thước tế bào nhỏ (< 10 µm) phù hợp với
miệng của các ấu trùng thủy hải sản, dễ tiêu hóa, không Ďộc, có tốc Ďộ sinh trưởng
cao và sức chống chịu cao với những Ďiều kiện khắc nghiệt của môi trường, Ďược
coi là mắt xích Ďầu tiên, nguồn sinh khối sơ cấp quan trọng trong chuỗi thức ăn
biển. Ngoài ra, sinh khối vi tảo cũng chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quan
trọng cho người và Ďộng vật nuôi như: các loại sắc tố, vitamin, khoáng chất, protein,
các acid béo không bão hòa Ďa nối Ďôi (polyunsaturated fatty acid - PUFA)....Ďặc
biệt là squalene.
Squalene là một tripterpene tự nhiên, là tiền chất steroid của Ďộng, thực vật
thường Ďược sử dụng trong các sản phẩm dinh dưỡng, chăm sóc sức khỏe, mỹ phẩm
và y học. Squalene Ďược ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp mỹ phẩm, có tác
dụng chống khô da và làm mềm da, có vai trò bảo vệ da khỏi các tác hại do ánh
sáng, tia UV gây ra. Các nghiên cứu dịch tễ học Ďã cho thấy squalene ức chế hiệu
quả các tác nhân hóa học có khả năng gây ung thư ruột kết, phổi, da ở Ďộng vật thực
nghiệm. Squalene cần thiết cho cơ thể do nó là một chất chống oxy hoá tự nhiên có

vai trò bảo vệ các tế bào khỏi các gốc tự do và oxy phân tử có hoạt tính cao, có khả
năng tăng cường hoạt Ďộng của hệ miễn dịch. Việc cung cấp thực phẩm chức năng
có thành phần squalene cao (khoảng 500 mg/ngày) Ďã Ďược chứng minh là cần thiết
cho sức khỏe dinh dưỡng của con người, làm giảm Ďáng kể bệnh tim mạch và ung
thư vì vậy, chúng cũng Ďược dùng phổ biến trong dược phẩm.
Cho Ďến nay, các nguồn sản xuất squalene Ďược biết Ďến nhiều nhất là các
loại dầu Ďộng, thực vật. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức làm ảnh hưởng Ďến sự
bảo tồn nguồn lợi cá biển trong tự nhiên, cũng như sự phụ thuộc vào thổ nhưỡng,
mùa vụ của các loại cây trồng có dầu dẫn Ďến nguồn khai thác squalene Ďang dần
cạn kiệt. Trong khi Ďó, hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng, nhu
cầu về squalene làm nguyên liệu trong ngành công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm
Ďang ngày càng tăng.

Do vậy, việc tìm kiếm và phát triển các nguồn nguyên liệu mới thay thế
nguồn truyền thống Ďể tách chiết squalene là rất cần thiết và Ďang Ďược các nhà
khoa học trong và ngoài nước quan tâm nghiên cứu. Trong Ďó, vi sinh vật nói chung
và vi tảo biển nói riêng là một nguồn tiềm năng cho sản xuất squalene trên quy mô


2
lớn. Gần Ďây một số các loài vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) như thraustochytrids
Ďược xem như là các nhà máy tế bào tiềm năng cho sản xuất các chất có giá trị cao
trong Ďó có squalene. Tuy nhiên việc nghiên cứu squalene ở Việt Nam mới Ďược bắt
Ďầu từ 2012, kết quả nghiên cứu mới chỉ dừng ở việc cung cấp cơ sở khoa học ban
Ďầu về hàm lượng squalene từ một số chủng vi tảo, chưa có Ďược các phương pháp
tối ưu cho tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene; chưa có Ďược Ďiều kiện nuôi
trồng tối ưu vi tảo tiềm năng có sức sản xuất sinh khối có hàm lượng squalene cao;
chưa có Ďược quy trình công nghệ tạo chế phẩm squalene có hoạt tính sinh học bảo
Ďảm an toàn cho sử dụng theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ
sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện Ďề

tài “Nghiên cứu squalene từ vi tảo biển dị dƣỡng Schizochytrium mangrovei
PQ6 định hƣớng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và
dƣợc phẩm”.
2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án
- Sàng lọc và xác Ďịnh Ďược Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của chủng
Schizochytrium mangrovei PQ6 của Việt Nam, tiềm năng lựa chọn Ďược cho sản
xuất squalene.
- Xác Ďịnh Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết, làm sạch squalene từ sinh khối
chủng S. mangrovei PQ6 lựa chọn Ďược; Ďánh giá Ďộ an toàn và tác dụng sinh học,
dược lý của squalene tách chiết Ďược theo Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực
phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.
3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án
- Sàng lọc Ďược chủng/loài vi tảo biển của Việt Nam tiềm năng cho sản xuất
squalene từ một số chủng vi tảo biển Việt Nam
- Tối ưu Ďiều kiện nuôi cấy Ďể thu Ďược sinh khối tảo có hàm lượng squalene
cao ở chủng tiềm năng lựa chọn Ďược ở quy mô bình tam giác; bình lên men 30 Lít.
- Tối ưu Ďiều kiện tách chiết, làm giàu và tinh sạch squalene từ sinh khối
chủng vi tảo biển lựa chọn Ďược; xây dựng quy trình tách chiết và tinh sạch
squalene; xác Ďịnh Ďộ sạch và cấu trúc của squalene tách chiết Ďược.
- Đánh giá tính an toàn của squalene bao gồm Ďộc tính cấp và bán trường
diễn, tác dụng sinh dược trên mô hình in vivo (mô hình Ďộng vật thực nghiệm).
- Bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm cholesterol của squalene trên
mô hình in vitro (mô hình tế bào).
4. Những đóng góp mới của luận án
- Luận án là công trình Ďầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách bài bản, có
hệ thống về: sàng lọc; nuôi trồng chủng tiềm năng Schizochytrium mangrovei PQ6


3
có hàm lượng squalene cao (sản lượng squalene Ďạt Ďược sau quá trình lên men theo

mẻ có bổ sung cơ chất là 6,9 g/L); lựa chọn Ďược Ďiều kiện thích hợp cho tách chiết,
làm sạch squalene từ chủng PQ6 có Ďộ tinh sạch Ďạt 90- 95%; squalene tách chiết
Ďược là an toàn, có tác dụng làm giảm cholesterol tổng số và làm tăng hàm lượng
lipoptrotein có tỷ trọng cao gắn với cholesterol ở mô hình Ďộng vật thực nghiệm,
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm.

- Lần Ďầu tiên ở Việt Nam Ďã chứng minh Ďược squalene tách chiết từ S.
mangrovei PQ6 có tác dụng giảm cholesterol do tăng Ďiều hòa biểu hiện của các gen
tham gia vào quá trình hấp thu, vận chuyển, lưu thông cholesterol từ các mô ngoại
biên Ďến tế bào gan; bước Ďầu nghiên cứu cơ chế tác dụng giảm triglyceride của
squalene.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
- Có Ďược những dẫn liệu khoa học về Ďiều kiện nuôi trồng thích hợp của
chủng S. mangrovei PQ6 phân lập Ďược từ huyện Ďảo Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang
vào năm 2006-2008 (lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất glucose 22% vào môi
trường nuôi tại 36 h; bổ sung 0,4% hỗn hợp vitamin (vitamin B1- 45g/L; vitamin B6
- 45 g/L; và vitamin B12- 0,25g/L)) cho sinh trưởng Ďạt sinh khối khô (75,41±1,35)
g/L, hàm lượng squalene Ďạt (91,53±2,45) mg/g sinh khối khô, sản lượng squalene
Ďạt 6,9 g/L.
- Có Ďược quy trình tách chiết lượng lớn squalene từ chủng S. mangrovei
PQ6 có Ďộ tinh sạch cao 90- 95%, an toàn và Ďạt tiêu chuẩn Ďảm bảo chất lượng
Ďịnh hướng làm nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng, mỹ phẩm và dược
phẩm.

- Góp phần làm sáng tỏ squalene tách chiết từ chủng PQ6 có tác dụng giảm
cholesterol và tryglycerol nội bào, tăng hàm lượng cholesterol gắn với lipoprotein
có tỷ trọng cao, HDL-C và tỷ lệ HDL-C/cholesterol toàn phần trong máu; giảm
cholesterol gắn với LDL-C và VLDL-C trong máu mà không gây ảnh hưởng Ďến sự
phát triển cân nặng cơ thể và gan, cholesterol toàn phần và tryglyceride ở mô hình
tế bào và Ďộng vật thực nghiệm; bước Ďầu Ďã cung cấp cơ sở khoa học cho việc Ďịnh

hướng làm nguyên liệu cho thực phẩm bảo vệ sức khỏe, mỹ phẩm và dược phẩm có.
6. Bố cục của luận án
Luận án gồm 148 trang, trong Ďó phần mở Ďầu 3 trang; Tổng quan tài liệu 39
trang; Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 22 trang; Kết quả và thảo luận 62 trang; Kết
luận và kiến nghị 2 trang; Danh mục các công trình Ďã công bố 2 trang; Tài liệu tham
khảo 18 trang gồm 179 tài liệu. Trong luận án có 19 bảng, 45 hình và 28 trang phụ lục.


4

CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về squalene
1.1.1. Tính chất hóa lý của squalene
Squalene có cấu tạo (2,6,10,15,19,23-hexanmethyltetracosa-2,6,10,14,18,22hexane) - là một chất trao Ďổi trung gian quan trọng trong sinh tổng hợp sterol và
triterpenes ở Ďộng vật và thực vật.
Squalene là một chất lỏng dạng dầu, trong suốt với trọng lượng phân tử là
410,7 g/mol, tỷ trọng 0,858 g /mL, nhiệt Ďộ nóng chảy 20°C, hợp chất này có thể
hòa tan trong dung môi hữu cơ nhưng không hòa tan trong nước [1, 2]. Bảng 1.1
Ďưa ra một số tính chất của squalene như Ďộ nhớt, tỷ trọng, Ďộ hòa tan và những
thông số này khẳng Ďịnh bản chất kị nước mạnh mẽ của phân tử này.
Bảng 1.1. Các thông số lý hóa của squalene [3]
Tính chất
Trọng lượng phân tử
Điểm nóng chảy
Chi số khúc xạ
Độ nhớt ở 25oC
Tỷ trọng
Điểm sôi ở 25oC
Điểm chớp cháy

Chỉ số Iod
Các Ďỉnh hồng ngoại
Sức căng bề mặt
Khả năng hòa tan của squalene trong nước

Giá trị
410,7 g/mol
-75oC
1,499
12 cP
0,858 g/mL
285oC
110oC
381 g/100g
2728, 1668, 1446, 1380, 1150, 1180,
964, 835 cm-1
~ 32 mN/m
0,124 mg/L

1.1.2. Nguồn gốc và cấu trúc của squalene
Squalene Ďược phát hiện vào năm 1096 bởi nhà nghiên cứu người Nhật, TS.
Mitsumaru Tsujimoto, một chuyên gia về dầu và chất béo tại trạm kiểm Ďịnh Công
nghiệp Tokyo. Ông Ďã phân tách phần không xà phòng hóa từ dầu gan cá mập
“kuroko - zame” và khám phá ra sự tồn tại một lượng lớn hydrocacbon không bão
hòa. Tại thời Ďiểm Ďó, TS. Mitsumaru Tsujimoto không phân tách Ďược hợp chất
này. Tuy nhiên, ông Ďã thu Ďược thành phần bromine dưới dạng bột màu trắng,
phân hủy ở 155oC, trong Ďó chứa 26,93% C, 3,94% H và 69,28% Br. Ông Ďưa ra


5

công thức cho hợp chất này là C10H18Br4. Mười năm sau, TS. Tsujimoto M. Ďã
thành công trong việc chưng cất chân không một phân Ďoạn của dầu từ gan của hai
con cá mập biển sâu, một hydrocacbon không bão hòa với công thức C30H50, Ông
gọi nó là “squalene”, từ gốc Latin là “Squalus” (cá mập) [4, 5].
Năm 1934, Robinson Ďã công bố cấu trúc vòng của squalene với phân tử
steroit. Năm 1936, cấu trúc sinh học của squalene Ďược mô tả lần Ďầu tiên bởi nhà
nghiên cứu Paul Karrer - người cũng Ďã khám phá ra cấu trúc hóa học của vitamin
A và E [6].
Theo công bố của Kohno và cộng sự (1995) thì squalene là một hydrocarbon
hợp chất béo không bão hòa (C30H50), với 6 liên kết Ďôi, chứa 6 Ďơn vị isoprene Ďể
cung cấp bộ khung cho tổng hợp cholesterol, acid mật và steroit. Do cấu trúc của liên
kết Ďôi trong sáu nhóm CH3, các isoprenoid có tác dụng chống oxy hóa tự nhiên một
cách mạnh mẽ [7].
E

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của squalene và tiền chất của nó [8]
A - Cấu trúc hóa học của isoprene. Các cấu trúc khác nhau của squalene: B - Dạng
kéo dài, C - Dạng cuộn, D - Dạng giống như sterol E - Cấu trúc hóa học của squalene

Do cấu trúc hóa học của squalene, Ďặc biệt là mức Ďộ không bão hòa cao nên
squalene không có tính ổn Ďịnh cao mà lại rất dễ bị oxy hóa. Hình 1.1 Ďã cho thấy
các liên kết Ďôi Ďã cho phép hình thành nên cấu trúc squalene ở dạng giống sterol,
dạng kéo dài hoặc cuộn. Thật thú vị khi cấu trúc squalene cũng có thể Ďược tổ chức
ở cả dạng giống với sterol. Hauss và cs (2002) Ďã chỉ ra squalane - một dạng hydro


6
hóa của squalene, Ďược gắn theo chiều ngang trong màng kép phospholipid. Các tác
giả nêu trên Ďã chỉ ra rằng cấu trúc liên kết như vậy có thể giúp bảo vệ việc chống
lại sự mất proton và ảnh hưởng tới protein màng [9]. Lohner và cs (1993) cũng Ďã

chứng minh squalene ở nồng Ďộ 6 % Ďã làm thay Ďổi cấu trúc lục giác bằng cách
tăng kích thước của các ống lục giác ngược. Trong trường hợp này cấu trúc
squalene Ďược cuộn lại và tích lũy trong lớp màng lipid kép (là màng hay một vùng
của màng chứa các phân tử lipid) [10]. Các thí nghiệm này cho thấy squalene trong
màng lưới nội chất có thể thích ứng với một dạng cấu trúc gần giống với ergosterol
trong khi cấu trúc cuộn trong màng huyết tương có thể chiếm ưu thế.
1.1.3. Các con đường sinh tổng hợp của squalene ở động vật, thực vật và vi sinh vật

Squalene là một hợp chất trung gian trong tổng hợp các hopanoid,
phytosterol và hơn 200 triterpenes quan trọng cho màng tế bào [11]. Squalene Ďược
tổng hợp từ các Ďơn vị isopentenyl, iso pentenyl di-phosphate (IPP) thông qua con
Ďường mevalonate (MVA) và dimethyl-allyl-diphosphate (DMAPP) thông qua con
Ďường methylerytritol phosphate (MEP) [12, 8]. Sự tổng hợp squalene thông qua
con Ďường MVA bắt Ďầu với sự kết hợp của một acetyl-CoA với một acetyl-CoA
khác bởi acetoacetyl-CoA synthase. Enzyme này Ďược gọi là transferyl acetyl-CoA
hoạt Ďộng từ sự hình thành của acetoacetyl-CoA. Chuỗi phản ứng từ acetoacetyl
CoA Ďến mevalonate tiếp tục tạo thành 3-hydroxy-3 methylglutaryl-CoA (HMGCoA) với sự có mặt của adenosine triphosphate (ATP) Ďể tạo thành mevalonate 5phosphate [13]. Sau Ďó, tiếp tục phosphoryl hóa bởi phosphomevalonate kinase với
sự hiện diện của ATP Ďể tạo thành mevalonate 5-diphosphate. Tiếp theo,
decacboxyl hóa bằng decarboxylase 5-diphosphate mevalonate Ďể tạo thành IPP, từ
Ďây nó là chất cơ bản Ďể xây dựng các hợp chất polyprenyl. DMAPP sau Ďó Ďược
tạo thành bằng cách Ďồng phân hóa IPP thông qua isopentanyl diphosphate
isomerase. Phản ứng ngưng tụ của IPP với DMAPP khi có mặt của farnesyl
diphosphate synthase Ďã tạo thành geranyl diphosphate (GPP) và sau Ďó có quá trình
ngưng tụ tiếp tục với một IPP khác Ďể tạo thành farnesyl diphosphate (FPP). Cuối
cùng, squalene synthase Ďược xác Ďịnh là enzyme xúc tác cho sự hình thành gián
tiếp NADPH của squalene với FPP là cơ chất [14, 15, 11]. Sinh tổng hợp squalene
thông qua con Ďường MEP do sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình sinh tổng
hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-D-xylulose-5-

7
phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia Ďể hình thành
IPP và DMAPP. Các bước còn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con Ďường MVA.

Con đường sinh tổng hợp squalene ở động vật có vú [8]
Ở các tế bào Ďộng vật, sự tổng hợp cholesterol (Hình 1.2A) xảy ra thông qua
con Ďường MVA/isoprenoid. Con Ďường này bắt Ďầu với acetyl-CoA, Ďược chuyển
thành HMG-CoA và sau Ďó Ďược khử bằng 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA
reductase (HMGR) thành MVA. Sự Ďiều hòa Ďược duy trì bằng cách kích hoạt hoặc
làm giảm HMGR. HMGR là một loại protein không thể tách rời của mạng lưới nội
chất chứa vùng cảm ứng sterol xuyên màng, Ďóng vai trò quan trọng trong sự thoái
hóa của enzyme bởi proteasome. Các nghiên cứu gần Ďây cho thấy có sự kích thích
trực tiếp và gián tiếp của sự thoái hóa bởi cholesterol, lanosterol và oxapseol.

A

B

Hình 1.2. Tổng hợp squalene thông qua con Ďường MVA ở Ďộng vật có vú (A) [8].
AACT - acetoacetyl-CoA thiolase; FPS - FPP synthase; HMGS - HMG-CoA synthase; HMGR HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphate isomerase; SQS - squalene synthase; SQE squalene epoxidase. Tổng hợp squalene ở thực vật thông qua con Ďường MVA ở phần

bào tan (cytosol) và MEP ở lạp thể (plastid) (B). AACT-acetoacetyl-CoA thiolase; DMAPP dimethylallyl diphosphate; DXP - 1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate; DXR - DXP reductoisomerase;
DXS - DXP synthase; FPP - farnesyl diphosphate; FPS - FPP synthase; G-3-P - glycerol-3phosphate; GPP - geranyl diphosphate; GGPP - geranylgeranyl diphosphate; HMBPP - (E)-4hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate; HMG-CoA - 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA; HMGS HMG-CoA synthase; HMGR-HMG-CoA reductase; IDI - isopentenyl diphosphateisomerase;IPPisopentenyldiphosphate; MEP - 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate; MVA - mevalonate; SQSsqualene synthase; ER - endoplasmic reticulum.


8
Con đường sinh tổng hợp squalene ở thực vật [8]
Ở thực vật, con Ďường sinh tổng hợp của sterol hơi khác so với tế bào Ďộng
vật và nấm. Phản ứng sinh tổng hợp từ squalene Ďến phytosterol dẫn Ďến sự hình
thành các sterol khác nhau, chẳng hạn như sitosterol, stigmasterol, campesterol và

isofucosterol. Trong thực vật, squalene bị oxy hóa thành 2,3-oxidosqualene và sau
Ďó Ďược chuyển Ďổi thành cycloartenol (9b, 19-cyclo-24-lanosten-3b-ol) thay vì
lanosterol Ďược biết ở Ďộng vật và nấm. Isoprenoid của thực vật có thể Ďược tổng
hợp thông qua con Ďường MVA trong phần bào tan (cytosol) dẫn Ďến sự hình thành
của sterol và brassinosteroids hoặc trong ty thể - nơi chuỗi ubiquinone Ďược hình
thành [16]. Ngoài ra, con Ďường MEP, trước Ďây Ďược gọi là con Ďường không
mevalonate hoặc DXP, Ďược xảy ra ở lạp thể (plastid) dẫn Ďến sự tổng hợp
carotenoids, chuỗi bên của chlorophyll, plastoquinone và phytohormone dạng
isoprenoid (Hình 1.2B).
Con đường sinh tổng hợp squalene ở vi sinh vật [8]
Sự tổng hợp squalene ở vi sinh vật khác nhau là khác nhau và tùy theo loài.
Các vi sinh vật nhân sơ (như E. coli) hay sinh vật nhân chuẩn (như Saccharomyces
cerevisea, Torulaspora delbrueckii và Chlamydomonas reinhardtii) sản xuất
squalene thông qua con Ďường MEP bởi sự kết hợp của hai phân tử FPP. Quá trình
sinh tổng hợp ở các vi sinh vật này bắt Ďầu bằng sự hình thành 1- deoxy-Dxylulose-5-phosphate (DXP) trong Ďó DXP-synthase và các enzyme khác tham gia
Ďể hình thành IPP và DMAPP. Các bước còn lại từ IPP Ďến FPP giống hệt với con
Ďường MVA. Không giống như con Ďường MVA, con Ďường MEP thường là không
tạo ra squalene, nhưng với những tiến bộ Ďạt Ďược về kỹ thuật trao Ďổi chất và sinh
tổng hợp Ďã cho phép tạo ra một gen mã hóa cho squalene synthase dị hợp có thể
mở rộng con Ďường MEP Ďể tạo ra squalene.
Như vậy, con Ďường MEP xảy ra chủ yếu ở vi khuẩn có nhân thật
(eubacteria) và vi khuẩn lam (cyanobacteria), trong khi MVA Ďược tìm thấy trong
vi khuẩn cổ (archaea) và một số ít eubacteria. Nhiều nghiên cứu Ďã xác Ďịnh vai trò
của sterol trong các tế bào nhân chuẩn Ďã Ďược thực hiện với nấm men như một hệ
thống mô hình nhân chuẩn. Ảnh hưởng của sterol Ďến Ďộ bền màng, tính thấm của
màng, sử dụng nguồn năng lượng và hoạt Ďộng của ATPase gắn màng Ďã Ďược
nghiên cứu bằng cách sử dụng các nấm men Ďột biến có khiếm khuyết ở con Ďường