(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20 và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NCS. Nguyễn Thu Thuỷ

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ
CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ
THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội – Năm 2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NCS. Nguyễn Thu Thuỷ

NGHIÊN CỨU VAI TRÒ ĐIỀU HOÀ
CỦA GEN MÃ HOÁ PROTEIN A20 VÀ CƠ CHẾ PHÂN TỬ

THAM GIA KIỂM SOÁT QUÁ TRÌNH SINH LÝ TẾ BÀO TUA

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. Nguyễn Thị Xuân - Viện nghiên cứu hệ gen
2. TS. Hoàng Văn Tổng - Học viện quân y

Hà Nội – Năm 2020


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:
Luận án là công trình nghiên cứu của tôi là chủ yếu. Nghiên cứu được thực
hiện trong khuôn khổ đề tài Nafosted mã số 108.06-2017.16, “Nghiên cứu vai trò
điều hòa của gen mã hóa cho protein A20 với bệnh bạch cầu cấp tính và các cơ chế
phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào”, thời gian thực hiện 2017-2019
do TS. Nguyễn Thị Xuân làm chủ nhiệm đề tài.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế với sự
đồng ý và cho phép của đồng tác giả. Những kết quả còn lại trong luận án chưa
được tác giả nào công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2020
Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thu Thuỷ


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Xuân,
Phòng Hệ gen học miễn dịch, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam là người đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình
tôi thực hiện luận án. Đó là nền tảng, hành trang giúp tôi tự tin vững bước trên con
đường khoa học sau này.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn TS Hoàng Văn Tổng, Phòng An toàn sinh
học, Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, thầy không chỉ truyền
thụ cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn mà còn giúp tôi bồi đắp lòng say mê, sự
nghiêm túc, tính cẩn thận trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS. TS Nguyễn Huy Hoàng, Viện trưởng Viện
Nghiên cứu hệ gen và các thầy cô, các anh chị ở Viện đã luôn hướng dẫn tận tình
cho tôi trong các môn học cũng như phương pháp thực nghiệm và trình bày kết quả.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, đã luôn động viên và dành
cho tôi nhiều lời khuyên quý báu trong trong suốt thời gian qua. Nhân đây, tôi xin
gửi lời cảm ơn chân thành đến các bạn trong Phòng Hệ gen học miễn dịch đã luôn
bên cạnh giúp đỡ và cổ vũ nhiệt tình để tôi hoàn thành tốt các thí nghiệm của mình.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các anh chị ở phòng Đào tạo nói riêng và
Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam nói chung, đã luôn hỗ trợ và tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi học tập và thực hiện luận án.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến lãnh đạo các cấp và đồng
nghiệp ở Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y, đã tạo điều kiện
và động viên giúp đỡ để tôi hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập, nghiên cứu của mình.
Với tất cả lòng biết ơn, tôi xin dành cho gia đình, người thân, bạn bè đã luôn
tin tưởng, thông cảm, động viên, tạo điều kiện và chia sẻ khó khăn trong suốt thời
gian qua, giúp tôi hoàn thành tốt luận án này.
Nghiên cứu sinh

DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt

Viết đầy đủ

APC

Antigen-presenting cell – tế bào trình diện kháng nguyên

bp

Base pairs – cặp Nucleotide

DISC

Death-inducing signaling complex – phức hợp tín hiệu gây chết

ELISA

Enzym - Linked Immunosorbent Assay

FLT3

Fms-related tyrosine kinase 3 ligand

GM-CSF

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

IL

Interleukin

IFN

Interferon

IκB-α

Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in Bcells inhibitor, alpha

LPS

Lipopolysaccharide

MHC

Major histocompatipility complex – phức hệ phù hợp tổ chức
chính

NF-κB

Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NK cell

Natural killer cell – tế bào giết tự nhiên

pDC

Plasmacytoid DC – tế bào tua dòng lympho

STAT

Signal transducer and activator of transcription - yếu tố truyền
tín hiệu và hoạt hoá phiên mã

TBT

Tế bào tua


TgPRF

Profilin từ Toxoplasma gondii

T. gondii

Toxoplasma gondii

Th1

T helper cell type 1 - tế bào T hỗ trợ loại 1

T-reg

T regular - tế bào T điều hoà

TLR

Toll-like receptor

TNFAIP3

Tumor necrosis factor α-induced protein 3 – Protein kích thích
yếu tố hoại tử khối u 3

TNF

Tumor necrosis factor – yếu tố hoại tử u


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1

Các bộ kit tách chiết, các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu

34

Bảng 2.2

Các thiết bị chính được sử dụng cho nghiên cứu

36

Bảng 2.3

Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn

45

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin

52

Bảng 3.2

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào CD11b+DC khi phơi nhiễm profilin

54

Bảng 3.3

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào pDC khi phơi nhiễm profilin

56

Bảng 3.4

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào CD8+DC sau khi phơi nhiễm profilin

59

Bảng 3.5

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm profilin

61

Bảng 3.6

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào pDC sau khi phơi nhiễm profilin

62

Bảng 3.7

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS

65

Bảng 3.8

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của các nhóm tế
bào tua sau khi phơi nhiễm profilin

67

Bảng 3.9

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào
CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS

69

Bảng 3.10

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào
CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine,
khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Annexin
V, âm tính với 7-AAD

72

Bảng 3.11

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự apoptosis của tế bào
CD11b+DC sau khi phơi nhiễm LPS và một số cytokine,
khảo sát bằng tỉ lệ phần trăm tế bào dương tính với Caspase-3

74

Bảng 3.12

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm
profilin

84

Bảng 3.13

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm
profilin

86

Bảng 3.14

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào pDC
thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin

89

Bảng 3.15

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1

90

Bảng 3.16

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di cư của tế bào
CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1

92


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Cấu trúc gen A20 và protein A20

4

Hình 1.2

Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch

5

Hình 1.3

Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong con đường tín hiệu
TNFR1

10

Hình 1.4

Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong các đường hiệu IL1R/TLR4

11

Hình 1.5

Tế bào tua chuột phân lập từ lách

17

Hình 1.6

Vòng đời của các tế bào tua

18

Hình 1.7

Tế bào tua và chức năng điều hòa miễn dịch

20

Hình 1.8

Sự biệt hóa đa dạng của tế bào tua

23

Hình 1.9

TLR điều hoà hoạt động hệ thống miễn dịch

29

Hình 2.1

Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ nhất - các tế bào tua biệt hóa bằng
FLT3 và phơi nhiễm với profilin

38

Hình 2.2

Sơ đồ nhóm thí nghiệm thứ hai - các tế bào tua biệt hóa bằng
GM-CSF và phơi nhiễm với LPS

39

Hình 2.3

Pha loãng protein chuẩn theo dải nồng độ chuẩn

46

Hình 3.1

Kết quả biểu hiện protein A20 sau khi đưa A20-siRNA vào tế
bào tua

50

Hình 3.2

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào CD8+DC khi phơi nhiễm profilin

53

Hình 3.3

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của
CD11bDC khi phơi nhiễm profilin

55

Hình 3.4

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế
bào pDC khi phơi nhiễm profilin

57

Hình 3.5

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào
CD8+DC khi phơi nhiễm profilin

60


Hình 3.6

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào
CD11bDC khi phơi nhiễm profilin

61

Hình 3.7

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào
pDC khi phơi nhiễm profilin

64

Hình 3.8

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào
CD11b+DC khi phơi nhiễm với LPS

66

Hình 3.9

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của các nhóm tế
bào tua khi biệt hoá bởi FLT3 và phơi nhiễm profilin

68

Hình 3.10

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển của nhóm tế bào
CD11b+DC khi biệt hoá bởi GM-CSF và phơi nhiễm LPS

70

Hình 3.11

Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua số
lượng tế bào CD11b+DC dương tính với marker Annexin V
và âm tính với 7-AAD

73

Hình 3.12

Ảnh hưởng của protein A20 đối với apoptosis thông qua tỷ lệ
tế bào CD11b+DC dương tính với marker Caspase-3

75

Hình 3.13

Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α,
STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm
profilin

77

Hình 3.14

Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α,
STAT1 và STAT3 ở tế bào pDC khi phơi nhiễm profilin

79

Hình 3.15

Ảnh hưởng của protein A20 lên con đường tín hiệu IκB-α,
STAT1 và STAT3 ở tế bào CD11b+DC khi phơi nhiễm LPS

82

Hình 3.16

Ảnh hưởng của protein A20 lên biểu hiện của marker trưởng
thành của tế bào pDC thông qua con đường tín hiệu IκB-α và
STAT1

84

Hình 3.17

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự tiết cytokine của tế bào
pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1

87

Hình 3.18

Ảnh hưởng của protein A20 lên sự di chuyển tế bào pDC
thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1

89

Hình 3.19

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế
bào CD11b+DC thông qua con đường tín hiệu STAT1

91


Hình 3.20

Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào
CD11bDC thông qua con đường tín hiệu STAT1

92

Hình 4.1

Hình dot blot của những tế bào tua được nhuộm cùng kháng
thể FITC-Annexin V và PE-CD11c

124

Hình 4.2

Hình ảnh tế bào tua nhuộm màu huỳnh quang

125

Hình 4.3

Hình dot blot của những TBT được nhuộm cùng kháng thể
FITC-CD11c và PE-CD86/ MHC II/ CD40

126

Hình 4.4

Nồng độ TNF-α trong dịch huyền phù CD11bDC xác định
bằng ELISA

128

Hình 4.5

Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động
của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ

130

Hình 4.6

Tỷ lệ TBT dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động
của cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ

131

Hình 4.7

Phân tích tín hiệu hoạt động STAT1 trong tế bào CD11b+DC
khi phơi nhiễm với IL-10

132

Hình 4.8

Phân tích tín hiệu hoạt động STAT3 trong CD11b+DC khi
phơi nhiễm với IL-10

133


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .......................................... 3
1.1. Protein A20....................................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20 ........................................ 3

1.1.2. Cấu trúc gen A20 và protein A20 ............................................................... 3
1.1.3. Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch................... 5
1.1.2.1. Vai trò của protein A20 trong tế bào T .................................................... 6
1.1.2.2. Vai trò của protein A20 trong tế bào B.................................................... 6
1.1.2.3. Vai trò của protein A20 trong tế bào tua ................................................. 7
1.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis.......... 7
1.1.5. Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20 ............................................... 8
1.1.6. Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20 ......................... 9
1.1.6.1. Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB ...................................................... 9
1.1.6.2. Protein A20 điều hoà tín hiệu STATs.................................................... 11
1.1.7. Vai trò của protein A20 đối với một số bệnh tự miễn và ung thư ............. 13
1.1.8. Tình hình nghiên cứu về protein A20 trên thế giới và ở Việt Nam ........... 14
1.2. Tế bào tua ....................................................................................................... 16
1.2.1. Khái niệm và lịch sử phát hiện tế bào tua ................................................. 16
1.2.2. Đặc điểm sinh học của tế bào tua ............................................................. 16
1.2.3. Chức năng tế bào tua ............................................................................... 19
1.2.4. Phân loại tế bào tua .................................................................................. 20
1.2.5. Các quá trình sinh lý tế bào tua ................................................................ 22
1.2.5.1. Sự biệt hoá của tế bào tua ..................................................................... 22
1.2.5.2. Sự trưởng thành của tế bào tua .............................................................. 23
1.2.5.3. Sự di cư của tế bào tua .......................................................................... 24
1.2.5.4. Sự thực bào của tế bào tua .................................................................... 25
1.2.5.5. Sự tiết cytokine của tế bào tua............................................................... 26
1.2.5.6. Sự chết theo chương trình của tế bào tua ............................................... 26
1.2.6. Một số thụ thể Toll - like receptors kích hoạt hoạt động tế bào tua........... 29


Kháng nguyên Lipopolysaccharide .................................................................... 30
Kháng nguyên Profilin từ Toxoplasma gondii .................................................... 30
1.2.7. Một số nghiên cứu ứng dụng về tế bào tua trong điều trị ung thư ............. 31

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........................34
2.1. Vật liệu nguyên liệu ........................................................................................ 34
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................. 34
2.1.2. Các hoá chất ............................................................................................ 34
2.2. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 35
2.3. Sơ đồ thí nghiệm ............................................................................................. 36
2.4. Phương pháp nghiên cứu................................................................................. 40
2.4.1. Phương pháp nuôi cấy và biệt hoá tế bào tua............................................ 40
2.4.2. Phương pháp đưa phân tử siRNA vào trong các tế bào tua ....................... 41
2.4.3. Kỹ thuật Western blot đo mức độ biểu hiện protein ................................. 41
2.4.4. Kỹ thuật ELISA đo nồng độ các cytokine tiết ra bởi tế bào tua ................ 44
2.4.5. Phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry analysis) ........ 47
2.4.6. Phương pháp xác định sự di cư tế bào (transwell migration assay) ........... 48
2.4.7. Phương pháp phân tích số liệu ................................................................. 49
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN ...................................50
3.1. Vai trò của protein A20 điều hoà các chức năng sinh lý tế bào tua .................. 50
3.1.1. Kết quả bất hoạt gen A20 trong tế bào tua ................................................ 50
3.1.2. Vai trò của protein A20 điều hòa sự trưởng thành tế bào tua .................... 51
3.1.3. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua................. 59
3.1.3.1. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt
hóa tế bào tua bằng FLT3 .................................................................................. 59
3.1.3.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào tua khi biệt
hóa tế bào tua bằng GM-CSF............................................................................. 65
3.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua ............................ 67
3.1.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi biệt hóa tế
bào tua bằng FLT3 ............................................................................................ 67
3.1.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự di cư của tế bào tua khi phơi niễm
với GM-CSF và phơi nhiễm LPS ....................................................................... 69
3.1.5. Vai trò của protein A20 đối quá trình apoptosis của tế bào tua ................. 70

3.2. Nghiên cứu một số tín hiệu phân tử liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua
dưới vai trò điều hòa của protein A20 .................................................................... 76
3.2.1. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong
tế bào tua nhóm CD11b+DC khi phơi nhiễm với profilin ................................... 77
3.2.2. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa IκB-α, STAT1 và STAT3 trong
tế bào tua pDC khi phơi nhiễm với profilin........................................................ 79
3.2.3. Protein A20 điều hòa sự phosphoryl hóa STAT1 và STAT3 trong tế bào
tua nhóm CD11b+DC khi xử lý với LPS ............................................................ 81
3.2.4. Vai trò của protein A20 đối với một số chức năng sinh lý của tế bào
pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 .......................................................... 83
3.2.4.1. Vai trò của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào pDC thông
qua tín hiệu IκB-α và STAT1 ............................................................................ 84
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của protein A20 đối với sự trưởng thành của tế bào
pDC thông qua tín hiệu IκB-α và STAT1 khi phơi nhiễm profilin ..................... 84
3.2.4.2. Vai trò của protein A20 đối với sự tiết cytokine của tế bào pDC thông
qua tín hiệu IκB-α và STAT1 ............................................................................ 86
3.2.4.3.Vai trò của protein A20 đối với sự di chuyển của tế bào pDC thông qua
tín hiệu IκB-α và STAT1 ................................................................................... 89
3.2.5. Vai trò của protein A20 đối với chức năng của tế bào CD11b+DC thông
qua tín hiệu STAT1 ........................................................................................... 90
3.2.5.1. Vai trò của protein A20 đối với quá trình sản xuất cytokine của tế bào
CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 .............................................................. 90
3.2.5.2. Vai trò của protein A20 trong điều hoà sự di chuyển của tế bào
CD11b+DC thông qua tín hiệu STAT1 .............................................................. 92
BÀN LUẬN .......................................................................................................... 94
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................108
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ..................................................................................................110
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................111

PHỤ LỤC ............................................................................................................125
Phụ lục 1: Kết quả nuôi cấy tế bào tua ................................................................. 125


Phụ lục 1.1. Khả năng sống sót và biệt hóa của tế bào tua sau nuôi cấy ........... 125
Phụ lục 1.2. Hình ảnh tế bào tua sau nuôi cấy .................................................. 125
Phụ lục 1.3. Tế bào tua trưởng thành sau phơi nhiễm bởi Lipopolysaccharide . 127
Phụ lục 2: Sự tiết TNF-α của tế bào tua ............................................................... 129
Phụ lục 3: Ảnh hưởng của một số cytokine đối với quá trình apoptosis của tế bào
CD11b+DC .......................................................................................................... 131
Phụ lục 3.1. Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Annexin V dưới tác động của
cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và INF-γ............................................................. 131
Phụ lục 3.2. Tỷ lệ tế bào dương tính với marker Caspase-3 dưới tác động của
cytokine IL-10, IL-2, TNF-α và IFN-γ............................................................. 132
Phụ lục 4: Vai trò điều hòa của IL-10 đối với sự phosphoryl hóa STAT1 và
STAT3 trong tế bào tua ....................................................................................... 133
Phụ lục 4.1. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT1 ..... 133
Phụ lục 4.2. Vai trò điều hoà của IL-10 đối với sự phosphoryl hoá STAT3 ..... 134


1
MỞ ĐẦU

Protein A20 là protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3 (tumor necrosis
factor α-induced protein 3 - TNFAIP3) có đặc tính chống viêm và điều hòa ngược
hoạt động sinh lý của tế bào miễn dịch, thông qua việc ngăn chặn sự phosphoryl hóa
một số tín hiệu phân tử như: nhân tố phiên mã NF-κB và tín hiệu STAT (signal
transducer and activator of transcription). Các nghiên cứu di truyền cho thấy đột
biến gen A20 làm thay đổi chức năng sinh học của protein A20 và là một trong
những nguyên nhân gây ra các loại bệnh lý như bệnh tự miễn, viêm nhiễm và ung

thư. Chuột bị bất hoạt gen A20 thường biểu hiện tình trạng suy nhược, mắc các bệnh
tự miễn, viêm toàn bộ các cơ quan, bộ phận cơ thể và không sống sót được quá 2
tuần tuổi. Ở người, bất hoạt gen A20 đã được ghi nhận liên quan đến bệnh tự miễn
và ung thư như các loại bệnh ung thư máu. Tuy nhiên ảnh hưởng của protein A20
đến cơ chế bệnh sinh của các bệnh này vẫn chưa được tìm hiểu đầy đủ.
Tế bào tua (TBT) là tế bào trình diện kháng nguyên chuyên nghiệp cho các tế
bào lympho, có vai trò quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Chỉ có các TBT mới có
khả năng kích thích hình thành phản ứng miễn dịch ở tế bào lympho T trong trạng
thái không hoạt động. TBT cũng đóng góp vào các chức năng của các tế bào
lympho B và giúp duy trì trí nhớ miễn dịch của các tế bào này. TBT sản xuất các
cytokine và các yếu tố khác thúc đẩy hoạt hóa tế bào lympho B.
Các tế bào tua có mặt trong hầu hết các cơ quan lympho như lách và hạch
bạch huyết, biểu mô da, các ống tiêu hóa và ống hô hấp, chính vì thế chúng dễ dàng
tiếp xúc với nhiều loại kháng nguyên ngoại sinh. TBT được chia làm hai nhóm bao
gồm: TBT dòng lympho có nguồn gốc từ cơ quan lympho (DC plasmacytoid - pDC)
và TBT dòng tuỷ (classical DC - cDC). Tế bào dòng tủy cDC được phân chia thành
hai tập hợp con là CD8+DC và CD11b+DC có mức độ biểu hiện các loại thụ thể tolllike (toll-like receptor - TLR) khác nhau, do đó đóng vai trò khác nhau trong khả
năng tương tác với mầm bệnh.
Một số nghiên cứu trước đây trên tế bào tua đã chỉ ra rằng protein A20 có
khả năng ức chế khả năng sản xuất một số các cytokine. Tuy nhiên đến nay, chưa có
công bố khoa học nào về vai trò, cơ chế phân tử của gen A20 trong điều hòa các


2
chức năng sinh lý TBT khi phơi nhiễm với kháng nguyên có nguồn gốc ký sinh
trùng và ảnh hưởng của protein A20 đến hoạt động apoptosis của TBT khi bị kích
thích bởi một số cytokine. Do đó, các thí nghiệm được tiến hành để nghiên cứu vai
trò điều hoà của protein A20 đối với TBT khi được kích hoạt bởi một số kháng
nguyên như profilin từ Toxoplasma gondii hay lipopolysaccharide (LPS) và một số
cytokine, với tên đề tài: “Nghiên cứu vai trò điều hoà của gen mã hoá protein A20

và cơ chế phân tử tham gia kiểm soát quá trình sinh lý tế bào tua”.
Luận án được thực hiện với các mục tiêu như sau:
1. Đánh giá vai trò của gen A20 đối với việc điều hoà bốn chức năng sinh lý
gồm sự trưởng thành, tiết cytokine, di cư và quá trình apoptosis của tế bào tua.
2. Đánh giá ảnh hưởng của gen A20 đối với việc điều hòa ba tín hiệu phân tử
NF-κB, STAT1 và STAT3 liên quan đến quá trình sinh lý tế bào tua.


3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1. Protein A20
1.1.1. Khái niệm và lịch sử nghiên cứu về protein A20
Protein A20 (hay còn được gọi là TNFAIP3 - tumor necrosis factor alphainduced protein 3 - protein kích thích yếu tố hoại tử khối u 3) là protein ức chế phản
ứng viêm chống lại các tác nhân gây viêm. Protein A20 có chiều dài 790 axit amin
và khối lượng phân tử 89,6 kDa. Protein này đóng vai trò là chất điều hoà của phản
ứng miễn dịch trung gian thông qua kích hoạt yếu tố phiên mã kappa B (nuclear
factor kappa B - NF-κB) [1].
Các nghiên cứu ban đầu cho thấy, A20 là một protein bảo vệ các tế bào khỏi
quá trình apoptosis do TNF gây ra. Đến nay, A20 đã được công nhận rộng rãi là
một protein kháng viêm, nó không chỉ chất ức chế con đường tín hiệu NF-κB phụ
thuộc TNF, mà còn ức chế kích hoạt NF-κB để đáp ứng với Interleukin 1 (IL-1),
CD40 và tín hiệu thông qua các thụ thể nhận dạng mẫu (pattern recognition
receptors - PRRs) và kích hoạt thụ thể kháng nguyên tế bào T và tế bào B [2].
Nghiên cứu in vivo đầu tiên về vai trò của protein A20 trong sinh lý mô là
nghiên cứu trên mô hình chuột thiếu hụt A20 [3]. Chuột bị bất hoạt gen A20 biểu
hiện quá mẫn cảm với TNF, chết sớm do viêm đa cơ quan nghiêm trọng và suy
nhược cơ thể do tín hiệu thụ thể TLR phản ứng với vi khuẩn bội nhiễm [4]. Ngoài
ra, protein A20 đã được chứng minh là có vai trò điều hòa các dòng tín hiệu tế bào
khác, như con đường tín hiệu Wnt, con đường điều hòa interferon (interferon

regulatory factor - IRF) và phản ứng tự miễn [5-7].

1.1.2. Cấu trúc gen A20 và protein A20
Protein A20 được mã hóa bởi gen A20, gen này được đặt tên theo số bản sao
cDNA, và được xác định là gen cảm ứng với TNF trong các tế bào nội mô [8]. Gen
A20 nằm tại vị trí 6q23.3 trên vai dài của nhiễm sắc thể số 6 (forward strand) (Hình
1.1.A). Gen A20 chứa 15.869 bp bao gồm 9 exon và 8 intron (Hình 1.1.B). Trong
đó, exon 1, đầu 5’ của exon 2 và đầu 3’ của exon 9 không mã hoá protein. Độ dài


4
của mRNA là 4.446 bp, trình tự mã hóa (coding sequence - CDS) từ vị trí 67 đến
2439. mRNA của A20 được biểu hiện ở mức cao trong các hạch bạch huyết, ống
tiêu hoá, đường hô hấp, thanh quản, khí quản và thận [2].

Hình 1.1. Cấu trúc gen A20 và protein A20 [9]
A. Vị trí gen A20 trên vai dài của NST số 6
B. Cấu trúc gen A20 gồm 8 exon và 9 intron
C. Cấu trúc protein A20 gồm 1 miền OTU đầu N và 7 vùng ZnF đầu C
D. Cấu trúc 3D của protein A20
Protein A20 có chiều dài 790 acid amin và khối lượng phân tử là 89.614 Da.
A20 là protein zinc finger, cấu trúc của nó bao gồm 7 vùng E3 ubiquitin ligase
(ZnF) trong đầu C của nó và 1 termed ovarian tumor (OTU) domain trong đầu N
của nó (Hình 1.1.C). Protein A20 thuộc họ C64 peptidase và tồn tại trong tế bào
chất và nhân tế bào [9].


5
1.1.3. Vai trò của protein A20 điều hòa một số loại tế bào miễn dịch
Protein A20 có vai trò rất quan trọng trong điều hoà hệ thống miễn dịch

thông qua tác động đến các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào T và
các đại thực bào (Hình 1.2).

Hình 1.2. Vai trò của protein A20 trong các tế bào miễn dịch [10]
Khi phơi nhiễm với một số tác nhân như LPS, Endotoxin, protein A20 tham
gia điều hoà ức chế chức năng các tế bào miễn dịch như tế bào tua, tế bào B, tế bào
T và các đại thực bào. Trong TBT, sau khi phơi nhiễm với LPS, protein A20 ức chế
sự tiết một số cytokine ví dụ như TNF-α, IL-6, IL-10, ức chế biểu hiện của marker
trưởng thành CD40, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα. Trong tế
bào B, sau khi kích thích bởi LPS, protein A20 làm tăng cường biểu hiện kháng thể
IgG1 và IgG3, ức chế biểu hiện kháng thể IgM và IgA, ức chế hiểu hiện của marker
bề mặt CD69 và CD80, ức chế sự phosphoryl hoá NF-кB và tăng cường IкBα.
Tương tự như vậy, đối với tế bào T và đại thực bào, khi phơi nhiễm với LPS,
protein A20 ức chế sự phosphoryl hoá phân tử tín hiệu NF-кB và tăng cường tín
hiệu IкBα.


6
1.1.2.1. Vai trò của protein A20 trong tế bào T
Ảnh hưởng của protein A20 đối với cân bằng nội môi tế bào T đã được kiểm
tra bằng cách sử dụng tế bào T trưởng thành maT-cre, để quan sát cả tế bào T CD8+
và T CD4+. Thí nghiệm đã thiết kế bất hoạt gen A20 ở hai dòng chuột A20maT và
A20CD4-KO. Ở chuột A20maT-KO, khoảng 80% tế bào T CD8+ và 30% của T CD4+ bị
ảnh hưởng, trong khi ở chuột A20CD4-KO, 100% tế bào T CD8+ và CD4+ đều bị ảnh
hưởng. Các tế bào T bị tác động từ cả hai dòng chuột đã cho thấy một kiểu hình
được kích hoạt, nhưng chỉ những con chuột A20maT-KO bị viêm gan và phổi với tỷ lệ
tế bào T CD8+ tăng. Các tế bào T CD8+ được kích thích TCR từ chuột A20maT-KO đã
tăng cường sản xuất IL-2 và IFN-γ in vitro có tương quan với tăng mức độ IFN-γ
huyết thanh in vivo. Mức độ TNF-α và IL-17 trong huyết thanh cũng tăng ở chuột
A20maT-KO. Vì cả IFN-γ và TNF-α đều là các yếu tố gây độc cho gan, các cytokine

này bị kiểm soát qua phản ứng viêm ở gan [11].
Sự khác biệt trong việc bất hoạt gen A20 ở tế bào T giữa hai dòng chuột có
thể chỉ ra rằng tế bào T CD8+ gây viêm ở chuột A20maT-KO trong khi tế bào T CD4+
tăng cường chức năng điều tiết ở chuột A20CD4-KO. Trong tế bào T CD4+, protein
A20 kiểm soát sự hoại tử và tự thực bào. Đối với các tế bào T CD8+, protein A20
điều hoà sự hoại tử, sự tiết IL-2 và IFN-γ, trong đó IFN-γ có thể đã góp phần vào
một kiểu hình viêm phổi và gan không xác định ở chuột A20maT-KO [11].

1.1.2.2. Vai trò của protein A20 trong tế bào B
Cân bằng nội môi tế bào B cần sự kết hợp tổng hợp các tín hiệu có nguồn
gốc thụ thể TLR, thụ thể tế bào B và CD40 để kích hoạt NF-κB bởi protein A20. Để
kiểm tra chức năng của protein A20 đối với tế bào B, phương pháp bất hoạt A20CD19-cre ở chuột đã được sử dụng. Các tế bào B bất hoạt gen A20 được kích hoạt
in vitro rồi đánh giá thông qua biểu hiện của marker CD80 và CD95 và sự tiết IL-6.
Kết quả cho thấy số lượng tế bào B ở chuột bất hoạt gen A20 được tăng lên. Ở chuột
A20CD19-KO 6 tuần tuổi, số lượng các tế bào B và tế bào plasma tăng lên ở lách và
các hạch bạch huyết ngoại vi. Chuột A20CD19-KO tăng cường các loại kháng thể tự
miễn, bao gồm kháng thể kháng dsDNA và immunoglobulin cầu thận. Tuy nhiên,
không có khối u ác tính nào phát triển trên chuột A20CD19-KO, vì vậy có thể A20 cũng


7
có chức năng như một gen ức chế khối u trong u lympho tế bào B [12]. Tóm lại,
protein A20 trong các tế bào B kiểm soát biểu hiện phân tử đồng kích thích sản xuất
IL-6 và biểu hiện protein sống sót Bcl-x.

1.1.2.3. Vai trò của protein A20 trong tế bào tua
Các tế bào tua bao gồm TBT dòng tủy (hay còn gọi là cDC bao gồm
CD8+DC và CD11bDC) và TBT dòng lympho (pDC) đóng vai trò quan trọng trong
cân bằng nội môi miễn dịch. Khi được kích hoạt, các TBT dòng tủy tạo ra các phản
ứng miễn dịch thích nghi đặc hiệu với các kháng nguyên và TBT dòng lympho

kiểm soát các phản ứng chống virus. Nghiên cứu tế bào trung gian CD11c-cre trên
mô hình chuột để tìm hiểu chức năng của protein A20 trong các TBT in vivo. Chuột
bất hoạt gen A20CD11c-KO bị rối loạn cân bằng nội môi khi các TBT dòng tủy và dòng
lympho đều giảm mạnh. Việc giảm số lượng các tế bào cDC và pDC in vivo trên
chuột A20CD11c-KO cho thấy protein A20 hỗ trợ sự sống sót của chúng [11].
Do vai trò rất quan trọng của gen A20 trong tế bào tua, bất hoạt gen A20 có
thể là một chiến lược để nâng cao hiệu quả phòng và điều trị bệnh dựa trên TBT đối
với bệnh ung thư và các bệnh truyền nhiễm. Trên thực tế, TBT thiếu hụt protein
A20 tạo ra đáp ứng miễn dịch kháng thể đặc biệt tốt hơn so với các TBT không
thiếu hụt A20 [13]. Ngoài ra, sự điều chỉnh làm giảm biểu hiện gen A20 trong TBT
thông qua siRNA đã cho thấy tăng cường khả năng kích thích tế bào T hiệu quả và
ức chế hoạt động của tế bào T điều hòa làm tăng cường phản ứng miễn dịch tế bào
chống lại các tác nhân gây bệnh.

1.1.4. Vai trò của protein A20 đối với sự chết theo chương trình apoptosis
Ngoài vai trò điều hòa tín hiệu NF-кB, protein A20 hoạt động như một
protein chống lại quá trình apotosis trong một số loại tế bào [14]. Chức năng này
phụ thuộc vào hoạt động của chuỗi ubiquitin. Đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về
chức năng của protein A20 trong quá trình apoptosis. Các thụ thể kích hoạt một
chuỗi các tín hiệu cho quá trình chết theo chương trình bằng cách thu hút các
adaptor tạo thành một chuỗi phản ứng báo hiệu gây chết (death-inducing signaling
complex - DISC). Protein A20 đã được xác định là một phần của DISC, là nơi


8
tương tác với Caspase-8 [15]. Quá trình apoptosis được kích hoạt bởi sự tương tác
của các thụ thể chết (death receptor) với các phối tử của nó như TRAIL (TNFrelated apoptosis-inducing ligand) và Caspase-8 [14].
Các nghiên cứu chỉ ra rằng protein A20 đảo ngược quá trình ubiquitin hóa
qua trung gian là protein cullin-3 của Caspase-8 và ngăn chặn sự gia tăng hoạt động
của Caspase-8. Điều này cho thấy, A20 ức chế tín hiệu apoptosis thông qua sự nhận

diện và ức chế Caspase-8 [15]. A20 làm tăng sự ubiquitin hóa liên kết với K63 của
RIP1 thông qua một cơ chế phụ thuộc vào ZnF4. Điều này cho phép RIP1 liên kết
với vùng protease của Caspase-8, ức chế sự dimer hóa, phân tách Caspase-8, và
ngăn chặn apoptosis gây ra bởi TRAIL [16]. Protein A20 ngăn cản apoptosis do
TNF gây ra thông qua quá trình bất hoạt c-Jun N-terminal kinase (JNK) trong tế
bào. Chứng tỏ tác động của protein A20 tới quá trình apotosis phụ thuộc rất lớn vào
loại tế bào như đại thực bào, tế bào B và TBT [14].

1.1.5. Cơ chế điều hoà hoạt động của protein A20
Biểu hiện và hoạt động của protein A20 tuân theo những quy luật chặt chẽ
trong các quá trình phiên mã, hậu phiên mã và hậu dịch mã [17]. Các yếu tố phiên
mã khác nhau phối hợp với nhau để điều hoà biểu hiện của protein A20 và cường
độ của tín hiệu NF-κB. Trong điều kiện bình thường, ở hầu hết các tế bào (ngoại trừ
tế bào lympho), protein A20 chỉ xuất hiện với lượng thấp vừa đủ. Khi kích hoạt tín
hiệu NF-κB thì biểu hiện protein A20 tăng lên nhanh chóng do có vị trí gắn kết với
NF-κB trong vùng promoter của gen A20. Tuy nhiên, trong tế bào lympho thì A20
được sinh ra ở mức cao. Kích thích thụ thể kháng nguyên dẫn đến giảm nhanh
chóng và protein A20 xuất hiện lại sau đó. Điều này cho thấy việc loại bỏ A20 dẫn
đến kích hoạt NF-κB [18, 19].
Vai trò điều hoà hoạt động của protein A20 thông qua microRNA (miRs)
nhắm đích vào mục tiêu là gen A20. Trong u lympho tế bào B lớn khuếch tán
(diffuse large B cell lymphoma - DLBCL), miR-125a và miR-125b được biểu hiện
quá mức dẫn đến ngăn chặn biểu hiện A20 và tăng cường tín hiệu NF-κB. Ngoài ra,
miR-125b là mục tiêu phiên mã trực tiếp của NF-κB. Sự mất chức năng của A20
gây ra bởi miR-125 dẫn đến củng cố và kéo dài hoạt động của NF-κB. miR-19b và


9
miR-29c cũng đã được chứng minh là nhắm vào mục tiêu gen A20, làm tăng cường
tín hiệu NF-κB và kích thích quá trình apoptosis [20].

Hoạt động của protein A20 còn được điều hòa bởi quá trình phosphoryl hóa.
Sau khi kích thích bằng TNF hoặc LPS, A20 bị phosphoryl hóa, làm tăng thêm khả
năng ức chế tín hiệu của NF-κB [21]. Tế bào cơ trơn được nuôi cấy trong điều kiện
glucose cao, nồng độ A20 phụ thuộc vào quá trình O-glycosylate hậu dịch mã [22].
Protein A20 còn có vai trò kháng viêm bởi chính khả năng kết hợp của chất
ức chế liên kết A20 của NF-κB (A20-binding inhibitor of NF-κB - ABIN). Tax1
(Tax1-binding protein 1 - TAX1BP1) là protein kết hợp với polyubiquitin nhằm liên
kết A20 với cơ chất của nó, từ đó thực hiện chức năng điều chỉnh hoạt động của
protein A20 [23].

1.1.6. Một số dòng tín hiệu phân tử hoạt động điều hoà bởi A20
Có rất nhiều tín hiệu phân tử tham gia kích hoạt tế bào tua như: PI3K,
MAPK, NF-кB và STAT. Trong đó, NF-кB và STAT có liên quan chặt chẽ đến
hoạt động viêm trong bệnh tự miễn và ung thư. Hiện nay, trong y học người ta đã
nghiên cứu và ứng dụng các loại thuốc ức chế NF-кB và STAT để phục vụ điều trị
các loại bệnh mạn tính và ác tính, vì gen A20 tham gia điều hòa hoạt động, mức độ
thuần thục và sự biệt hóa của tế bào thông qua hoạt động của các tín hiệu phân tử
như NF-кB và STAT.
1.1.6.1. Protein A20 điều hoà tín hiệu NF-кB
Yếu tố phiên mã NF-кB gồm một họ các nhân tố phiên mã quan trọng đối
với tín hiệu viêm, miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thứ cấp. NF-кB có vai trò quan
trọng trong kiểm soát sự biểu hiện của các gen chống apoptosis đối với sự tồn tại
của tế bào. Ngoài ra, NF-кB còn có vai trò đa dạng trong sự phát triển, tăng sinh,
biệt hoá và trao đổi chất. Hoạt động của NF-кB có ảnh hưởng đến nhiều quá trình
trong tế bào. Do đó, sự điều hòa các con đường tín hiệu NF-кB là một yếu tố rất
quan trọng giúp duy trì sự cân bằng nội môi [24]. Một số cơ chế điều hoà tín hiệu
NF-κB để duy trì cân bằng nội mô đã được nghiên cứu tìm hiểu. Trong đó, A20 được
biết đến là một protein đóng vai trò chính trong việc chấm dứt tín hiệu NF-κB [24].

10
Việc điều hòa tín hiệu NF-κB là một bước quan trọng trong việc kiểm soát
và chấm dứt phản ứng miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thích ứng. Các dòng tín
hiệu NF-κB được kiểm soát chặt chẽ bởi quá trình ubiquitin hóa, ngoài ra có một số
protein khác gồm protein A20 gây trở ngại cho các quá trình này [25]. Protein A20
thực hiện vai trò là một enzyme chỉnh sửa quá trình ubiquitin hóa có hoạt tính loại
bỏ chuỗi ubiquitin ở đầu amino [26]. Cơ chất đầu tiên xác định cho hoạt động
deubiquitinase của A20 là protein tương tác với thụ thể RIP1 (kinases receptorinteracting protein 1). Khi thụ thể của TNF được kích hoạt thì RIP1 được
polyubiquitin hóa ở vị trí lysine 63 (K63) bởi ubiquitin E3 kết nối protein ức chế tế
bào apoptosis (cIAP) 1 và 2 (cellular inhibitor apoptosis protein) [27]. Protein A20
loại bỏ các chuỗi polyubiquitin liên kết với K63, ngăn chặn sự tương tác của RIP1
với yếu tố điều hoà NF-κB. Sau đó, A20 thêm chuỗi polyubiquitin liên kết với
K48 vào RIP1, dẫn đến quá trình thoái hóa [26]. Bằng cách này, A20 ức chế tín
hiệu NF-κB do TNF gây ra bởi sự phân giải tuần tự và sự thoái hóa RIP1 qua
trung gian ubiquitin.
Protein A20 ức chế hoạt động của NF-κB khi được kích hoạt bởi các
cytokine như TNF (Hình 1.3) hoặc IL-1 hoặc LPS (thụ thể của TLR4) (Hình 1.4)
bằng cách loại bỏ ubiquitin của các yếu tố liên quan đến thụ thể của TNF, thụ thể
của IL-1 hay thụ thể của TLR4 [28].

Hình 1.3. Cơ chế protein A20 ức chế NF-κB trong con đường tín hiệu TNFR1 [28]