(Luận văn thạc sĩ) Nghiên cứu nhân giống cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO
(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, tháng 12 - 2016


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

PHẠM THÙY DUNG

NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY HƯƠNG THẢO
(Rosmarinus officinalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

Thái Nguyên, tháng 12 - 2016

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng
dẫn của GS.TS. Chu Hoàng Mậu. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chưa được ai công bố.
Tác giả

Phạm Thùy Dung


ii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới GS.TS. Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên
cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của chị Trần Thị Hồng - Kỹ thuật
viên Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, Khoa Sinh học, Trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
Trong thời gian thực hiện luận văn thạc sĩ tại Trung tâm Thực nghiệm
thực hành và chuyển giao khoa học công nghệ - Đại học Tân Trào, tôi luôn
nhận được sự giúp đỡ của Ban lãnh đạo Trung tâm, các kỹ thuật viên tại phòng
Nuôi cấy mô đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện các thí nghiệm của
luận văn thạc sĩ.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy

cô giáo, cán bộ khoa Khoa học sự sống - Trường Đại học Khoa học - Đại học
Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành khoa học.

Tác giả

Phạm Thùy Dung


iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................... ii
MỤC LỤC................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT .................................. vi
DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................... viii
MỞ ĐẦU ................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề .............................................................................................. 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 2
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................ 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................... 4
1.1. Cây Hương thảo .................................................................................. 4
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo ........................ 4
1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo ...... 4
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo ................................. 7
1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam .............................. 7
1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in

vitro ........................................................................................................... 8
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật........... 8
1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ...................... 9
1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào ........................................... 10
1.3. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo..... 11
1.3.1. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật ở trong nước ............................................................................... 12


iv

1.3.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Hương thảo bằng phương pháp
nuôi cấy mô thực vật ................................................................................ 14
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 15
2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu ..................................... 15
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 15
2.1.2. Hoá chất, thiết bị ................................................................................... 15
2.1.3. Điạ điể m và thời gian nghiên cứu ......................................................... 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
2.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu ................................................................. 16
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro ................... 16
2.2.3. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ............................................................ 19
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm ...................................................................... 20
2.2.5. Phương pháp xử lí và tính toán số liệu ................................................. 21
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................. 22
3.1. Kết quả khử trùng hạt tạo mẫu sạch ................................................... 22
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh
trưởng đến hiệu quả phát sinh chồi và sự sinh trưởng của chồi Hương thảo
trong ống nghiệm ............................................................................................ 24
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh chồi và sự

sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên cây Hương thảo .... 24
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh
trưởng chồi từ nách lá mầm của cây Hương thảo...................................... 27
3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát
sinh và sinh trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo ..... 29
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ
của chồi Hương thảo in vitro ................................................................... 32


v

3.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trưởng của cây con in vitro ngoài vườn ươm ............................................ 34
3.5. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo .................................. 36
3.5.1. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân mang
mắt chồi bên ............................................................................................. 38
3.5.2. Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ nách lá mầm ........... 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 40
1. Kết luận ................................................................................................ 40
2. Đề nghị................................................................................................. 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 41
PHỤ LỤC


vi

DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CỤM TỪ VIẾT TẮT
BA:

6-Benzyladenine

BAP:

6-Benzylaminopurine

Cs:

Cộng sự

CT:

Công thức

DNA:

Deoxyribonucleic acid

ĐC:

Đối chứng

IAA:

Indole-3-acetic acid

IBA:

Indole-3-butyric acid

Kinetin: 6-furfurylaminopurine

MS:

Murashige và Skoog, 1962

NAA:

Naphthalene acetic acid

2,4-D:

2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

PLBs:

Protocorm like bodies (thể tiền củ)

SH:

Schenk và Hildebrandt, 1972


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo sau 20 ngày..............22
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang
mắt chồi bên của cây Hương thảo ..........................................................................25
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ nách lá
mầm của cây Hương thảo .......................................................................................28
Bảng 3.4. Ảnh hưởng kết hợp giữa BAP và IBA đến sự phát sinh và sinh trưởng

chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo .................................................30
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi Hương
thảo sau 4 tuần ..........................................................................................................32
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của giá thể đến tỉ lệ sống, sinh trưởng và phát triển của cây
con in vitro ngoài vườn ươm sau 60 ngày ..............................................................34


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên .................................................................... 5
Hình 2.1. Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga.......... 15
Hình 3.1. Kết quả khử trùng hạt Hương thảo bằng khí clo trong 5 giờ .................... 23
Hình 3.2. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng khí clo đến khả năng nảy mầm
hạt Hương thảo.............................................................................................................. 24
Hình 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến sự sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt
chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần..................................................................... 26
Hình 3.4. Ảnh hưởng của BAP 1,5 mg/l đến sự phát sinh và sinh trưởng chồi từ
nách lá mầm của cây Hương thảo ............................................................................... 29
Hình 3.5. Ảnh hưởng của hàm lượng BAP kết hợp với IBA đến sự phát sinh và sinh
trưởng chồi tái sinh từ mắt chồi bên của cây Hương thảo sau 8 tuần. ...................... 31
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng ra rễ của chồi
Hương thảo. ................................................................................................................ 33
Hình 3.7. Cây Hương thảo in vitro trồng trong các giá thể khác nhau sau 60 ngày36
Hình 3.8: Sơ đồ Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo từ đoạn thân và từ
nách lá mầm .................................................................................................................. 37
Hình 3.9. Hình ảnh quy trình nhân giống in vitro cây Hương Thảo ......................... 39
từ đoạn thân mang mắt chồi bên .................................................................................. 39

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây Hương thảo có tên khoa học là Rosmarinus officinalis L., là một
loài thực vật có hoa thuô ̣c họ Hoa môi. Hương thảo là cây bản địa vùng Địa
Trung Hải, được trồng nhiều ở Nam Âu, Tây Á và Bắc Phi. Tại Việt Nam cây
được nhập trồng ở một số tỉnh miền Trung và miền Nam [26]. Hương thảo
được sử dụng để làm gia vị, đuổi muỗi, trị liệu bằng xoa bóp, sản xuất mỹ
phẩm và dược phẩm. Các hợp chất trong cây Hương thảo được bổ sung vào
kem dưỡng da, xà phòng thơm…[25].
Hương thảo tỏa mùi hương nồng ngào ngạt, lá tươi hay lá khô đều
thơm. Lá và ngọn cây Hương thảo được sử dụng là chủ yếu. Lá tươi hay lá
khô đều được dùng làm gia vị trong ẩm thực và chiết xuất tinh dầu, ứng dụng
trong y tế, mỹ phẩm. Hương thảo có vị chát, nóng, mùi thơm nồng, giúp loại
bỏ căng thẳng, tăng cường trí nhớ, giúp tinh thần sảng khoái [26]. Tinh dầu
Hương thảo hỗ trợ việc tuần hoàn máu, giúp máu lưu thông tốt hơn, giúp cải
thiện trí nhớ, giúp tinh thầ n thư giañ , giảm stress... Mặc dù tinh dầu Hương
thảo có nhiều công dụng tốt, nhưng hiện nay nước ta chưa cung cấp đủ
nguyên liệu nên phải nhập hoàn toàn từ nước ngoài [25].
Các thành phần quan trọng nhất của Hương thảo là axit caffeic và các
dẫn xuất như axit rosmarinic và axit carnosic. Những hợp chất này có tác
dụng kháng nấm và kháng khuẩn, làm trẻ hóa làn da bằng cách cải thiện lưu
thông máu, chống viêm và kích ứng da và rất hữu ích trong điều trị mụn trứng
cá, viêm da, eczema và các bệnh ngoài da khác…[23],[25].
Hiện nay, cây Hương thảo đã được nhập trồng ở Việt Nam, cây sinh
trưởng phát triển tốt, thích hợp được với điều kiện khí hậu nhiệt đới, cây
thường được nhân giống bằng cách gieo hạt hoặc giâm cành [25]. Tuy nhiên

2

trồng bằng hạt tỉ lệ nảy mầm thấp, hạt giống phải nhập khẩ u nên giá thành
cao. Nhân giống bằng giâm cành cho hệ số nhân thấp, tỉ lệ thành công cũng
không cao.
Xuất phát từ giá trị to lớn của cây Hương thảo và thực trạng nhu cầu về
giống cây Hương thảo ở nước ta, việc ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào
thực vật nhằm tạo ra được một số lượng lớn giống cây sạch bệnh, đáp ứng nhu
cầu phát triển sản xuấ t ở nước ta là hết sức cần thiết, do vậy chúng tôi xây
dựng đề tài luâ ̣n văn tha ̣c si ̃ là: “Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo
(Rosmarinus officinalis L.) bằng phương pháp nuôi cấy mô thực vật”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng đươ ̣c quy trình tái sinh in vitro cây Hương thảo bằng kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Nghiên cứu điề u kiêṇ khử trùng hạt để ta ̣o mẫu sạch trong ống nghiệm;
3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và sự kết hợp giữa BAP và IBA đến sự
phát sinh chồi và sinh trưởng của chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên và từ
nách lá mầm;
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro;
3.4. Nghiên cứu giá thể thích hơ ̣p đưa cây ra môi trường tự nhiên.
3.5. Đề xuất được quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu xác định được môi trường thích hợp cho nhân
giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, đánh
giá được ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng, thành phần môi
trường nuôi cấy và thời gian khử trùng mẫu cấy, đánh giá được tác động
của các giá thể đến sinh trưởng của cây con trong giai đoạn vườn ươm, là

3

cơ sở bổ sung thêm dữ liệu cho việc nghiên cứu các loại cây dược liệu
khác.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tạo ra được các cây con có chất lượng cao, đồng đều và sạch bệnh
không phụ thuộc vào mùa vụ, là cơ sở cung cấp nguồn cây giống theo nhu cầu
thực tiễn.
Quy trình nhân giống in vitro cây Hương thảo có thể sử dụng cho các
phòng thí nghiệm công nghệ tế bào để nhân giống phục vụ phát triển Hương
thảo đáp ứng nhu cầu thực tiễn.


4

Chương 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cây Hương thảo
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Hương thảo
Cây Hương thảo còn có tên gọi khác là cây Mê điệt, tên tiếng Anh là
Rosemary. Cây Hương thảo thuộc chi Rosmarinus, họ Hoa môi (Lamiaceae),
bộ Hoa môi (Lamiales), lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida), ngành Hạt kín
(Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae) [26].
Hương thảo da ̣ng cây bụi nhỏ, thẳng cứng, cao từ 80 đến 150 cm, lá và
hoa có mùi thơm. Thân cây thẳng đứng có nhiều nhánh dài. Hương thảo có lá
đơn, mọc đối, lá dày, có mép gập xuống, không cuống, mặt trên lá có màu
xanh đậm và bóng, mặt dưới lá có màu trắng và có lông tơ. Những bông hoa
mọc ra từ nách lá. Hoa hình môi, có màu xanh dương dài dưới 1 cm, đài hoa

hình chuông, có lông mịn, tràng hoa 2 môi, môi dưới chẻ sâu như môi của
một số hoa lan. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 5. Quả Hương thảo giống như
hầu hết quả thuộc họ Lamiaceae, quả là một chùm gồm 4 quả khô hợp lại,
màu nâu. Toàn cây có mùi rất thơm. Bộ phận sử dụng được là ngọn cây có
hoa và lá [26].
1.1.2. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây Hương thảo
Cây Hương thảo có chứa một số hoạt chất sinh học bao gồm chất chống
oxy hóa như axit carnosic và axit rosmarinic. Các hợp chất hoạt tính sinh học
khác bao gồm long não (lên đến 20% trong lá Hương thảo khô), axit caffeic,
axit ursolic, axit betulinic, rosmaridiphenol, và rosmanol [25],[26],[23].
Axit

rosmarinic

là

este

của

axit

caffeic

và

axit

3,4-

dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực vật khác
nhau. Axit rosmarinic là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng


5

kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm
khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng
trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong công nghiệp thực phẩm, axit rosmarinic
là thành phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là
chất bảo quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản
hải sản tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều
món ăn [12], [23]. Hoạt động chống oxy hóa của axit rosmarinic mạnh hơn so
với vitamin E.

Hình 1.1. Cây Hương thảo ngoài tự nhiên
Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng rộng
rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ phẩm...
Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá cây.
Lipton S. A. và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham
cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo - axit


6

carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến võng
mạc, bao gồm thoái hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt. Axit
carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thoái hóa và tổn thương ánh sáng gây ra trong
nuôi cấy tế bào và trong các mô hình động vật gặm nhấm. Trong vài năm,
nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc tự do

trong não. Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong một
mô hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt
chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật. Nghiên cứu
cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã lưu giữ
lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh sáng đã
được bảo vệ [28].
Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và rau
quả khác nhau. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có tác
động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong một số
tế bào ung thư ở người. Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung thư vú
bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của protein
quan trọng trong con đường truyền tín hiệu [20].
Hương thảo có thể sử dụng theo các bài thuốc dân gian ở nước ta [29].
Bài thuốc số 1: Dùng 200g lá Hương thảo khô ngâm với 1 lít rượu trắng
trên 40 độ, bảo quản trong chai thủy tinh đã được khử trùng, cất nơi khô ráo.
tránh ánh nắng. Ngày uống 2 lần, mỗi lần 2ml rượu thuốc pha với nước sôi để
nguội, giúp tăng cường sức khỏe, chữa căng thẳng thần kinh, tiêu hóa kém.
Bài thuốc số 2: Dùng 2-3 lá Hương thảo khô hãm trong một tách nước
sôi làm một liều. Ngày uống 4-5 liều. Hoặc dùng 20g lá khô (30g lá tươi) hãm
với 500ml nước sôi, chia 4-5 lần để uống trong ngày. Xoa nhẹ nước hãm
thuốc này lên da đầu để tăng cường sự mọc tóc, hoặc dùng để rửa các vết


7

thương nhiễm trùng và lâu khô, rửa mắt 3-4 ngày lần trong ngày khi bị viêm
giác mạc nhẹ.
Bài thuốc số 3: Tinh dầu Hương thảo pha vào nước tắm 3-4 giọt giúp
tinh thần sảng khoái, thư giãn cơ thể, giảm stress.
1.1.3. Đặc điểm sinh thái, trồng trọt cây Hương thảo

Cây Hương thảo phát triển tốt nhất ở Địa Trung Hải hay ở những nơi
có khí hậu tương tự. Hương thảo chịu hạn tốt, thích hợp với đất mùn bở ẩm,
không thích hợp với đất sét. Cây Hương thảo cũng cần thoát nước tốt, nên
trồng ở môi trường không có sương giá có ánh nắng mặt trời chiếu 6-8 giờ để
cây phát triển tốt. Nếu trồng bằng hạt nên trồng vào mùa xuân. Các hạt giống
sẽ bắt đầu nảy mầm khoảng 14-21 ngày sau khi trồng. Đối với nhân giống
bằng giâm hom, chọn những nhánh khỏe mạnh trên cây mẹ, cắt mỗi hom dài
5-10cm, tỉa lá sát gốc. Có một số loài sâu bệnh có thể ảnh hưởng đến cây
Hương thảo. Nó là rất dễ bị bệnh phấn trắng. Cây dễ mắc bệnh khi được trồng
ở trong môi trường có không khí ẩm. Nhện, ruồi trắng và một số loài côn
trùng có thể sử dụng Hương thảo làm thức ăn [27].
1.1.4. Tình hình sử dụng cây Hương thảo tại Việt Nam
Hương thảo mới được du nhập về Việt Nam thời gian ngắn nhưng đã
nhận được sự quan tâm của nhiều người. Đặc biệt là những người yêu thiên
nhiên, thích khám phá. Do cây Hương thảo có mùi thơm nên những người
ngửi qua mùi hương của nó khó có thể quên được, chỉ cần chạm nhẹ tay vào
cây là có thể cảm nhận được mùi hương này. Cây được ưu chuộng và tìm mua
rất nhiều, người ta mua về làm cảnh, trang trí trong nhà, giúp xua đuổi muỗi.
Gần đây, Hương thảo còn trở thành một gia vị mới mẻ đối với người nội trợ.
Nó không hề bị mất đi hương thơm trong khi nấu nướng. Trong nấu ăn, lá
Hương thảo thường được sử dụng tươi, nhưng cũng có thể được sấy khô, nó
có vị đắng nhẹ rất quyến rũ, mùi của Hương thảo có thế át mùi tanh của thịt


8

cá, tạo thêm vị đặc biệt khi làm các món nướng như pizza, gà nướng, tôm
nướng. Hương thảo chứa nhiều canxi, sắt ,vitamin A và C [23].
1.2. Ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân giống in vitro
1.2.1. Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả các
loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi
trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [9].
Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là tính
toàn năng (Totipotence) của tế bào. Trong tế bào chứa hệ gen, gồm tất cả
các gen mã hóa cho các protein liên quan đến các đặc tính, tính trạng và
chức năng sinh học của thực vật. Hiện nay, người ta đã hoàn toàn chứng
minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào
riêng rẽ [5].
Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9] tất cả các loại tế bào đó đều bắt
nguồn từ tế bào hợp tử. Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử sẽ phân chia hình
thành nhiều tế bào phôi sinh sau đó sẽ biến đổi thành các tế bào chuyên hóa.
Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô
chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau. Mặc dù các tế bào đã phân
hoá thành các tế bào có chức năng riêng nhưng chúng vẫn không mất đi khả
năng biến đổi của mình. Trong điều kiện thích hợp, các tế bào này lại có thể
trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó được gọi là
phản phân hoá tế bào.
phân hóa tế bào
tế bào phôi sinh

tế bào dãn
phản phân hóa tế bào

tế bào chuyên hóa


9

1.2.2. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố quyết định cho
sự phân hoá tế bào và cơ quan nuôi cấy.
Theo Nguyễn Quang Thạch và Cs [9], nuôi cấy in vitro là nuôi cấy
trong điều kiện vô trùng. Nếu không đảm bảo tốt điều kiện vô trùng mẫu nuôi
cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết. Điều kiện vô trùng
có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của của nuôi cấy mô in vitro.
Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là dùng các
chất hóa học, tia cực tím có khả năng diệt nấm và vi khuẩn. Vô trùng ban đầu
là một thao tác khó và là khâu đầu tiên có ý nghĩa quyết định. Tuy vậy, nếu
tìm được nồng độ và thời gian xử lý thích hợp sẽ cho tỷ lệ sống cao, thông
thường hay sử dụng một số hóa chất như HgCl2 0.1%, NaHCl 10%, cồn 70º,
clorox,…để khử trùng. Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy,
buồng và bàn cấy vô trùng, phòng nuôi cây [5].
Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quá
trình sinh trưởng của mô nuôi cấy. Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy
chịu ảnh hưởng từ các yếu tố như: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng
và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng tác động đến quá trình phát
triển của mô nuôi cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây
là 12 – 18 giờ/ngày. Cường độ ánh sáng tác động đến sự phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy [5].
Theo Dương Tấn Nhựt (2011) ánh sáng là một trong những yếu tố ảnh
hưởng lên quá trình tạo rễ của mẫu cấy. Quá trình tạo rễ chỉ cần cường độ
ánh sáng thấp, cường độ ánh sáng cao quá ngăn cản quá trình tạo rễ. Chất
lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự ra rễ, ánh sáng đỏ cam thích hợp cho
sự ra rễ hơn ánh sáng xanh da trời [2]. Hiện nay trong các phòng thí nghiệm
nuôi cấy mô để cung cấp nguồn ánh sáng có cường độ 2000 - 2500 lux người


10

ta sử dụng các dàn đèn huỳnh quang [7].
Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh
hưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây. Tùy thuộc
vào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp. Nhiệt độ
của buồng nuôi cây cần đảm bảo nhiệt độ ổn định trong khoảng 25ºC [7].
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật phải có đầy đủ các chất dinh
dưỡng, các chất cần thiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh
trưởng bình thường của cây. Thành phần hóa học của môi trường đóng vai
trò quyết định đến sự thành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực
vật. Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấy
thực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sử
dụng cho mục đích này, trong đó môi trường cơ bản được sử dụng rất phổ
biến như MS (Murashige & Skoog, 1962), là môi trường thích hợp cho cả
thực vật một lá mầm, hai lá mầm. Môi trường Gramborg (1965) còn gọi là
B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào
trần. Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưng đều
gồm một số thành phần cơ bản sau [3]: Các muối khoáng đa lượng và vi
lượng, nguồn cacbon, các vitamin và aminoaxit, chất bổ sung, chất làm thay
đổi trạng thái môi trường, các chất điều hòa sinh trưởng.
1.2.3. Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào
Theo Ngô Xuân Bình và Cs [7], nuôi cấy mô tế bào thực vật được
thực hiện theo 5 giai đoạn sau: (1) Giai đoạn chuẩn bị nhằm tạo được
nguyên liệu thực vật sạch để đưa vào nuôi cấy. (2) Tái sinh mẫu nuôi cấy
được điều khiển chủ yếu bằng các chất điều hòa sinh trưởng (tỷ lệ
auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy. (3) Giai đoạn nhân nhanh
chồi thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinh trưởng
(auxin, cytokinin …), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm


11

mem…, kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp. Tuỳ thuộc vào
đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sự hình
thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự phát triển của các
chồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính. (4) Tạo cây
hoàn chỉnh, khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang
môi trường ra rễ. Thường sau 2-3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở
thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoại này người ta bổ sung vào môi trường nuôi
cấy các chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hormon thực
vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy. Trong nhóm này các
chất IAA, IBA, NAA và 2,4D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo
rễ cho chồi. (5) Đưa cây ra đất là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó
quyết định khả năng ứng dụng của quá trình nhân giống in vitro trong thực
tiễn sản xuất. Đây là giai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi
trường tự dưỡng hoàn toàn. Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh
thích hợp để cây có thể đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong
ruộng sản xuất.
1.3. Nghiên cứu nhân giống in vitro cây dược liệu và cây Hương thảo
1.3.1. Tình hình nhân giống cây dược liệu bằng phương pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật ở trong nước
Trong những năm gần đây công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật ở
nước ta dần phát triển và được áp dụng thành công trên nhiều loại cây trồng
khác nhau như dứa, cà phê, các cây thuốc quý, các loài lan, cây cảnh, cây ăn
quả... Việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật vào bảo tồn
nguồn gen cây dược liệu đã được nhiều tác giả quan tâm có thể kể đến như:
Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Thanh và Cs đã tiến
hành nghiên cứu nhân giống thành công cây Lô hội bằng phương pháp nuôi
cấy in vitro. Nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng môi trường MS bổ sung

12

2,5mg/l BAP là môi trường thích hợp để nhân nhanh chồi, môi trường MS bổ
sung than hoạt tính 1,5 - 2,0 g/l cho khả năng ra rễ đạt cao nhất. Giá thể ra cây
Lô hội in vitro thích hợp là cát mịn, tỉ lệ sống cao, cây sinh trưởng phát triển
tốt [10].
Nghiên cứu nhân giống in vitro cây Ba kích, tác giả Võ Châu Tuấn và
Cs (2010) đã cho thấy môi trường thích hợp cho nhân nhanh chồi in vitro cây
Ba kích là môi trường MS có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar, 3,5 mg/l BA
và 0,2 mg/l IBA, môi trường thích hợp cho tạo rễ in vitro là môi trường MS
có bổ sung 3% saccharose, 0,8% agar , IBA từ 0,2 - 0,25 mg/l. Cây in vitro có
khả năng sống sót cao và sinh trưởng tốt trên cơ chất đất cát pha [16].
Tác giả Hoàng Thị Kim Hồng (2011) đã đưa ra môi trường MS có bổ
sung BAP 4mg/l và NAA 0,1 mg/l kích thích đoạn thân của chồi in vitro cây
Hà thủ ô đỏ tái sinh cụm chồi tốt nhất và môi trường MS có bổ sung NAA 0,5
mg/l là môi trường có khả năng tạo rễ tốt nhất cho chồi in vitro [3].
Nhóm nghiên cứu của Mai Trường (2014) đã tiến hành tạo và nhân
phôi soma sâm Ngọc linh trong môi trường lỏng và thu được kết quả: từ mô
sẹo lá cây in vitro đã tạo và nuôi nhân huyền phù phôi soma dạng cầu trong
môi trường B5 có bổ sung IBA 3 mg/l, để tạo mô sẹo sinh phôi và phôi thứ
cấp đem nuôi cấy mảnh lá mầm và phôi soma con trên môi trường SH bổ
sung 10% nước dừa, có hoặc không có IBA 0,2 mg/l [5].
Trần Thị Hồng Thúy và Cs (2015) đã đề xuất môi trường thích hợp
nhất để cảm ứng tạo PLBs của lan Kim tuyến là môi trường Knudson +
Kinetin 0,5 mg/l + saccarose 10 g/l + nước dừa 10%. Môi trường tái sinh chồi
từ PLBs là môi trường Knudson + nước dừa 10% + dịch chiết khoai tây 10%
+ saccarose 30 g/l + BAP 0,5 mg/l + GA3 0,3 mg/l + Kinetin 0,3 mg/l +
NAA 0,1 mg/l + geltrite 2,7 g/l. Môi trường sinh trưởng và tạo rễ cho chồi tốt
nhất là môi trường Knudson + nước dừa 10% + dịch chiết khoai tây 10% +

13

saccarose 30 g/l + geltrite 2,7 g/l. Giá thể xơ dừa phù hợp cho giai đoạn thích
ứng cây trong vườn ươm [13].
Nghiên cứu tái sinh chồi in vitro cây Xáo tam phân tác giả Trương Thị
Bích Phượng và Cs (2015) cho thấy môi trường tốt nhất cho tạo chồi Xáo tam
phân là môi trường MS có bổ sung BAP 1,5 mg/l. Môi trường MS có bổ sung
TDZ 0,1 mg/l mẫu vật nuôi cấy tạo chồi cùng với tạo callus [15].
Bùi Đình Lãm và Cs (2015) đã tiến hành nghiên cứu khả năng nhân
giống cây Giảo cổ lam bằng phương pháp in vitro cho thấy môi trường MS bổ
sung kinetin 0,4mg/l và BA 0,5mg/l cho hệ số nhân nhanh chồi cao, chồi nhỏ,
xanh đậm. Ở giai đoạn ra rễ môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l cho tỷ
lệ ra rễ của cây Giảo cổ lam đạt 100% [1].
Nhóm nghiên cứu của Trương Thị Bích Phượng (2015) tiến hành nghiên
cứu nhân giống cây Đảng sâm thu được kết quả: môi trường thích hợp để tạo
callus là môi trường MS kết hợp 0,2 mg/l TDZ và 2,0 mg/l 2,4D. Môi trường tái
sinh chồi tối ưu là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l kinetin kết hợp với 0,2 mg/l
NAA. Môi trường thích hợp cho nhân chồi từ đoạn thân mang chồi nách in vitro
là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin kết hợp 0,2 mg/l NAA. Môi trường
tối ưu để ra rễ là môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l NAA [14].
Tác giả Ong Xuân Phong (2016) nghiên cứu trên đối tượng cây Xạ
đen thấy rằng môi trường thích hợp nhất cho nhân chồi Xạ đen là môi
trường MS có bổ sung BAP 0,6 mg/l hệ số nhân chồi đạt 3,84 lần sau 4 tuần.
Môi trường thích hợp để cảm ứng ra rễ là môi trường MS bổ sung 0,4 mg/l
α- NAA. Giá thể thích hợp để tiếp nhận cây in vitro là giá thể 50% tro trấu
và 50 % xơ dừa [11].


14

1.3.2. Nghiên cứu nhân giống cây Hương thảo bằng phương pháp nuôi cấy
mô thực vật
Năm 2012, Yumei và Cs đã nghiên cứu cảm ứng mô sẹo và tái sinh
chồi từ lá Hương thảo trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP, 0,5
mg/l NAA, và 50 g/l đường cho kết quả tốt nhất, với tỉ lệ cảm ứng là 88,8%.
Khi mô sẹo phát triển tái sinh thành chồi, môi trường MS có chứa 1,5 mg/l
BAP, 0,5 mg/l kinetin và 0,5 mg/l NAA cho kết quả tương đối tốt với 50% tỷ
lệ tái sinh và cho số lượng chồi tốt nhất. Môi trường MS có 0,1 mg/l NAA
cho thấy kết quả tốt trong việc tạo rễ với tỷ lệ ra rễ đạt 65%. Ngoài ra, nghiên
cứu cũng cho thấy, vô trùng các mẫu cấy bằng dung dịch chứa 75% ethanol
có thể dẫn đến sự chết hàng loạt mẫu cấy [21]. Theo Yesil-Celiktas và Cs
2007), khi nghiên cứu nuôi cấy chồi non trong môi trường MS có bổ sung 7
g/l agar, 30g/l đường, 1 và 3 mg/l NAA để tạo mô sẹo. Môi trường MS có bổ
sung 1mg/l NAA được chứng minh là môi trường tốt nhất cho việc tạo ra các
mô sẹo (65,0%) [19].
Cây Hương thảo là một loài cây mới được nhập khẩu vào nước ta, nên
hiện nay các tài liệu nghiên cứu còn rất hạn chế. Việc nghiên cứu phát triển
cây Hương thảo và các loại cây dược liệu đáp ứng nhu cầu thực tiễn là việc
rất cần thiết. Tuy nhiên hạt giống nhập từ nước ngoài về có khả năng nảy
mầm kém ở điều kiện Việt Nam, do vậy nghiên cứu nhân giống cây Hương
thảo – một loài cây dược liệu bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đáp
ứng nguồn cây giống cung cấp cho thực tiễn phát triển loại cây dược liệu này.


15

Chương 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu, hoá chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng hạt giống cây Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) mua tại
cửa hàng phân phối hạt giống, xuất xứ hạt giống tại Nga. Hạt Hương thảo có
kích thước nhỏ, có màu đen.

Hình 2.1. Hạt Hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) có nguồn gốc từ Nga
2.1.2. Hoá chất, thiết bị
Hoá chất
Các thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào được tiến hành trên nền môi trường MS
cơ bản gồm khoáng đa lượng, vi lượng và vitamin (Murashige và Skoog, 1962).
Hóa chất khử trùng gồm HCl và Javen; chất điều hòa sinh trưởng được sử
dụng BAP, NAA, IBA (Sigma, Đức); các hóa chất khác bao gồm đường
saccarose, agar…
Thiết bị
Thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào: Bình tam giác 250ml, pipet,
cốc thủy tinh định mức, đũa thủy tinh, bông, giấy làm nút, giấy thấm. Bộ đồ