Nghiên cứu tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu IN VITRO của cao giàu saponin sâm vũ diệp (panax bipinnatifidus seem) và tam thất hoang (panax stipuleanatus h t tsai et k m feng)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y – DƯỢC

LÊ THỊ THANH HOA

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG
CHỐNG NGƯNG TẬP TIỂU CẦU IN VITRO
CỦA CAO GIÀU SAPONIN SÂM VŨ DIỆP
(Panax bipinnatifidus Seem.) VÀ TAM THẤT HOANG
(Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược, ĐHQGHN, Bộ
môn Dược lý – Dược lâm sàng, Bộ môn Y Dược học cơ sở, các thầy cô giáo trong
khoa đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu cho em trong thời gian qua, giúp em hoàn
thành chương trình học.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS. Vũ Thị Thơm, PGS.TS.
Dương Thị Ly Hương, hai giảng viên mẫu mực dẫn dắt em từ những ngày đầu tiên
của đề tài, truyền cho em nhiều động lực và kiến thức quý báu giúp em hoàn thành
khoa luận một cách tốt nhất.
Em cũng xin cảm ơn đề tài thuộc chương trình Tây Bắc: “Ứng dụng các giải
pháp khoa học công nghệ để phát triển nguồn nguyên liệu và tạo sản phẩm từ hai
loài cây thuốc Sâm vũ diệp (Panaxbipinnatifidus Seem.) và tam thất hoang (Panax
stipuleanatus H.Tsaiet K.M. Feng) vùng Tây Bắc”, mã số KHCN-TB.07C/13-18 đã
tài trợ kinh phí giúp em hoàn thành nội dung nghiên cứu này. Cảm ơn Khoa xét
nghiệm Huyết Học, Bệnh viện Bạch Mai tạo điều kiện cho em thực hiện thí nghiệm.

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè, đặc biệt là
mẹ em đã luôn quan tâm, hỗ trợ, động viên giúp em hoàn thành khóa luận này.
Lần đầu viết khóa luận, mặc dù rất cố gắng nhưng khó tránh được sai sót.
Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô để khóa luận được hoàn thiện hơn.
Em xin chân thành c ảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2017
Sinh viên
Lê Thị Thanh Hoa


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Kí hiệu
AA
ADP
AMP
ATP
CADP
CEPI
COX-1
CT
EtOH
GP
IC 50
LC 50
MDA
MPA
FPA
NTTC
PPP

PRP
SVD
TTH
TXA2
vWF
AUC
HMWK
PDGF
CTAP

Giải nghĩa

Acid arachidonic
Adenosin diphosphat
Adenosin monophosphat
Adenosin triphotphat
Collagen Adenosin diphotphat (Collagen+ADP)
Collagen Epinephrin
Cyclooxygenase 1
Thời gian lấp kín (Closure time)
Alcol etylic
Glycoprotein
Liều ức chế 50 % đối tượng th ử (Inhibitory concentration
50%)
Liều gây chết 50% đối tượng thử (Lethal Dose 50%)
Malondialdehyde
Độ ngưng tập tiểu cầu tối đa (Maximum platelet
aggregation)
Phần trăm ngưng tập tiểu cầu điểm cuối (Final platelet
aggregation)

Ngưng tập tiểu cầu
Huyết tương nghèo tiểu cầu (Platelet Poor Plasma)
Huyết tương giàu tiểu cầu (Platelet Rich Plasma)
Sâm vũ diệp
Tam thất hoang
Thromboxan A2
Von-Willerbrand
Diện tích dưới đường cong
Kininogen cao phân tử (High molecular weight kininogen)
Yếu tố phát triển (platelet derived growth factor)
Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết (connective tissue
activating peptid)


STT
Bảng 3.1

Mức độ ngư

Bảng 3.2

của Sâm vũ
Phần trăm n

Bảng 3.3

Sâm vũ diệp
Tốc độ ngư

Bảng 3.4

Sâm vũ diệp
Mức độ ngư

Bảng 3.5

Tam thất ho
Phần trăm n

Bảng 3.6

Tam thất ho
Tốc độ ngư

Tam thất ho


STT
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 1.7
Hình 2.1
Hình 2.2
Hình 2.3
Hình 2.4.
Hình 2.5

Hình 2.6
Hình 3.1
Hình 3.2

Sâm vũ diệp
Tam thất hoa
Các glycopro
Cấu trúc của
Cơ chế gây n
Quá trình ng
Nguyên lí củ
Sơ đồ qui trì
Sơ đồ qui trì
Qui trình đo
Đồ thị ngưng
Chỉ số Slope
Chỉ số diện t
Đồ thị ngưng
Đồ thị ngưng


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ.......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN................................................................................... 3
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp.............................................. 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật............................................................................................ 3
1.1.2. Thực trạng và phân bố..................................................................................... 4
1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang..............4
1.1.4. Thành phần hóa học......................................................................................... 5
1.2. Sinh lý học tiểu cầu........................................................................................... 6

1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu.............................................................................................. 7
1.2.2. Chức năng tiểu cầu.......................................................................................... 9
1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiể u cầu.............................................. 13
1.3.1. Thời gian máu chảy....................................................................................... 13
1.3.2. Đo sức bền mao mạch................................................................................... 13
1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu................................................................................... 14
1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm Giêmsa 14
1.3.5. Co cục máu đông........................................................................................... 14
1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu....................................................................................... 15
1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu............................................................................... 15
1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu............................................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................18
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu............................................................ 18
2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................... 26
3.1. Kết quả............................................................................................................ 26
3.1.1 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Sâm vũ diệp..................................... 26
3.1.2 Tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của Tam thất hoang................................ 29


3.2. Bàn luận.......................................................................................................... 32
3.2.1. Mô hình nghiên cứu...................................................................................... 32
3.2.2. Kết quả nghiên cứu........................................................................................ 33
3.2.4. Hạn chế của nghiên cứu................................................................................ 35
Kết luận.................................................................................................................. 36
Đề xuất................................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO


ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, huyết khối là một trong ba nhóm bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất thế
giới, là nguyên nhân gây tắc mạch máu, nhồi máu cơ tim, đột quỵ do thiếu máu cục
bộ, hoại tử chi, thuyên tắc phổi, tăng huyết áp…[41]. Những nghiên cứu gần đây
cho thấy yếu tố có vai trò quan trọng bậc nhất đối quá trình hình thành huyết khối là
tiểu cầu. Sau khi được kích hoạt, tiểu cầu thực hiện quá trình bám dính, thay đổi
hình dạng, ngưng tập, phóng thích các chất làm tăng đáp ứng ngưng tập, tạo cục
máu đông, dẫn đến hình thành huyết khối [23]. Trên lâm sàng, các thuốc kháng tiểu
cầu là liệu pháp lý tưởng. Một số thuốc kháng tiểu cầu hiện có như: aspirin,
clopidogrel, prasugrel, và dipyridamol được sử dụng rộng rãi trong dự phòng và
điều trị huyết khối, bên cạnh những lợi ích, thuốc kháng tiểu cầu còn một số tác
dụng phụ như: gây chảy máu, loét dạ dày, giảm ti ể u cầu. Những hạn chế trên thúc
đẩy việc nghiên cứu, phát triển thuốc kháng tiểu c ầ u mới mạnh hơn và ít tác dụng
phụ hơn. Bên cạnh các thuốc tổng hợp, các thuốc có nguồn gốc tự nhiên cũng là đối
tượng được quan tâm nghiên cứu [41].
Việt Nam là vùng đất của nhiều loài thảo dược quý, trong đó có những cây
thuốc được dân gian sử dụng từ hàng ngàn năm nay như các loại nhân sâm, tam
thất... Tuy nhiên, các thảo dược này từ bao đời nay vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp
hoặc chế biến thành nguyên liệu thô, do vậy chưa phát huy được hết công dụng.
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus
H. T. Tsai et K. M. Feng) được xác định là loài cây quý hiếm và có nguy cơ tuyệt
chủng rất cao ở Việt Nam. Theo y học cổ truyền, Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
dùng làm thuốc bổ như các loại Sâm khác, có tác dụng tăng lực, chống mệt mỏi,
giảm cholesterol, tăng cường sinh dục, chống stress [15]. Một số loài thuộc chi
Panax được nghiên cứu khá đầy đủ về dược lý, hóa học và độc tính. Tuy nhiên ở
Việt Nam và trên thế giới, số lượng các nghiên cứu về tác dụng sinh học và thành
phần hóa học hai loài cây này còn hạn chế. Các nghiên cứu về thành phần hóa học
cho thấy trong rễ, lá của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có chứa saponin (chất có
khả năng chống ngưng tập tiểu cầu) với hàm lượng cao [13, 15, 36]. Giai đoạn trước
của đề tài, đã chứng minh được Sâm vũ diệp có tác dụng ức chế ngưng tập tiểu cầu
(NTTC) trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn tổng, phân đoạn

n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL, phân
đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức chế ngưng tập
tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và mức liều: phân đoạn tổng ở mức liều 1-2-5

1


mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn n-hexan các mức liều
0,5-1-2-5 mg/mL [19]. Saponin cũng là thành phần chính của phân đoạn n-butanol,
tuy nhiên butanol là một dung môi hữu cơ, có ít nhiều độc tính nên trong sản xuất
công nghiệp, người ta hạn chế dùng butanol để chiết xuất. Để khắc phục hạn chế
này, nhóm nghiên cứu của PGS. Đỗ Thị Hà (Viện Dược liệu) và Nguyễn Hữu Tùng
(Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội) đã đưa ra một quy trình chiết cao giàu
saponin mà không dùng butanol, với hiệu suất chiết cao Tam thất hoang là
20,59±0,27 %, Sâm vũ diệp là 14,44±0,14 % [8, 27]. Liệu cao này có còn hoạt tính
chống ngưng tập tiểu cầu không? Và tác dụng của nó so với phân đoạn n-butanol
như thế nào? Để trả lời những câu hỏi này, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu
tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu in vitro của cao giàu saponin của Sâm vũ diệp
(Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et
K. M. Feng)”, với mục tiêu:
1. Đánh giá tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu của cao giàu saponin Sâm vũ

diệp và Tam thất hoang trên in vitro.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về Tam thất hoang và Sâm vũ diệp
1.1.1. Đặc điểm thực vật

Sâm vũ diệp, còn gọi là Trúc tiết nhân Sâm, Tam thất lá xẻ, Sâm hai lần xẻ,
Hoàng liên thất, Vũ diệp tam thất. Tên khoa học: Panax bipinnatifidus Seem., thuộc
họ Nhân Sâm - Araliaceae [4, 20].
Sâm vũ diệp là cây thảo sống nhiều năm; rễ dài có nhiều đốt và những vết
sẹo do thân rụng hằng năm để lại. Thân mảnh cao 10–20 cm, tới 50 cm, thường lụi
vào mùa khô. Lá kép chân vịt, mọc vòng ba cái một, mang 3-7 lá chét mỏng, không
lông, mép có răng đôi cạn hay sâu dạng thùy. Hoa màu trắng lục, xếp 20-30 cái
thành tán đơn trên một trục dài 15-20 cm ở ngọn thân, cuống hoa cỡ 1 cm. Qủa
mọng, khi chín màu đỏ, chứa 1-2 hạt [4].
Tam thất hoang được gọi với các tên khác là Tam thất rừng, Dã tam thất,
Bình biên tam thất, Thổ tam thất. Tên khoa h ọc: Panax stipuleanatus H. T. Tsai et
K. M. Feng, họ Nhân Sâm (Araliaceae) [4, 20], cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ

mập, nằm ngang, có nhiều vết lõm do vết thân để lại, ít phân nhánh. Mỗi khóm
thường có một thân mang lá. Lá kép chân vịt, gần 1-3 cái, mọc vòng ở ngọn; cuống
dài 5-10 cm. Lá chét 5, có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, dài 5-13 cm,
rộng 2-4 cm, nhọn hai đầu, mép cuống hoa dài 1-1,5 cm. Hoa màu vàng xanh với
năm lá đài nhỏ, 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 2 ô. Qủa mọng, gần hình cầu dẹt, đường
kính 0,6-1,2cm, khi chín màu đỏ. Hạt 1 hoặc 2, màu xám trắng [4, 25].
Hai loài Sâm vũ diệp và Tam thất hoang có hình thái tương đối giống nhau.
Điểm khác biệt nhất là Sâm vũ diệp có lá xẻ thùy, còn Tam thất hoang thì không [20].

Hình 1.1. Sâm vũ diệp

Hình 1.2. Tam thất hoang

3


1.1.2. Thực trạng và phân bố

Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) được Seemann phát hiện lần đầu
tiên tại vùng núi Hymalaya của Ấn Độ và được công bố năm 1868 trên tạp chí J.
Botany. Trên thế giới, Sâm vũ diệp được tìm thấy ở Trung Quốc, bắc Myanma, đông
bắc Ấn Độ và Nepal. Ở nước ta, Sâm vũ diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên
Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai) và huyện Than Uyên (Lai Châu). Sapa
chính là điểm cực nam của bản đồ phân bố Sâm vũ diệp trên th ế giới ( khoảng 23
độ vĩ Bắc) [21, 53].
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H. T. Tsai et K. M. Feng) được hai nhà
khoa học người Trung Quốc công bố năm 1975 trên tạp chí Acta Phytotaxonomica
Sinica. Loài này được tìm thấy đầu tiên tại khu rừng Mã Quan, Trung Quốc (phía
bắc Việt Nam) ở độ cao 1100-1700 m so với mặt nước biển. Cho đến nay, trên toàn
thế giới, loài này mới chỉ tìm thấy ở tỉnh Vân Nam (Trung Quốc) và một vài điểm ở
Vườn Quốc gia Hoàng Liên Sơn thuộc tỉnh Lào Cai, Việt Nam [20].
Tại Việt Nam cho đến nay, các kết qu ả nghiên cứu cho thấy hai loài Sâm vũ
diệp và Tam thất hoang phân bố tự nhiên ở sườn tây bắc dãy Hoàng Liên Sơn và
một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa
của tỉnh Lào Cai [10, 20, 21]. Phạm vi phân bố của hai loài này rất hạn chế, các
quẩn thể của chúng được tìm thấy trong tự nhiên với kích thước rất nhỏ. Tuy nhiên
gần đây Sâm vũ diệp đã được thuần hóa và bước đầu được trồng thử nghiệm ở một
số địa phương ở Hà Giang và Lào Cai [10].
1.1.3. Công dụng và tác d ụng dược lý của Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Theo Đông y, Tam thất hoang có vị ngọt, hơi đắng, tính ấm. Có tác dụng tư
bổ cường tráng, tiêu viêm giảm đau, khử ứ sinh tân và cầm máu. Sách đỏ Việt Nam
năm 2007 ghi “Tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc. Thân rễ
thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh dục, chống stress. Lá,
nụ, hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hóa, an thần” [4].
Sâm vũ diệp vị đắng, nhạt, tính hàn, có tác dụng tư bổ cường tráng, tiêu
viêm, giảm đau, khư ứ sinh tân và cầm máu. Dược liệu từ Sâm vũ diệp là thân rễ, rễ
củ dùng cầm máu các loại vết thương và xuất huyết. Làm thuốc bổ chữa thiếu máu,
xanh xao gầy còm nhất là đối với phụ nữ sau sinh đẻ; còn có tác dụng kích thích

sinh dục và được dùng trong điều trị vô sinh. Ở Vân Nam (Trung Quốc), người ta
dùng rễ củ chữa thổ huyết, chảy máu mũi, đòn ngã tổn thương, thương tổn bên trong
gây đau lưng [4].

4


Nghiên cứu của Trần Công Luận năm 2002 công bố cao Tam thất hoang và
Sâm vũ diệp có tác dụng phục hồi thời gian ngủ bị rút ngắn bởi stress, đưa về trạng
thái bình thường ở các liều thử nghiệm 44, 88, 176 mg/kg. Cao saponin toàn phần
của Tam thất hoang có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành MDA ở nồng
độ 25, 50, 100 µg/mL [13]. Năm 2009, nghiên cứu của Viện Dược liệu chỉ ra rằng
phân đoạn saponin của Tam thất hoang có hoạt tính chống oxy hóa – lipid
peroxidation, dịch chiết tổng ethanol có tác dụng chống trầm cả m ở liều 44-176
mg/kg trên chuột [14].
Năm 2017, nghiên cứu của Lê Thị Tâm cho thấy Sâm vũ diệp có tác dụng ức
chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạn và các mức liều: phân đoạn
tổng, phân đoạn n-butanol, phân đoạn etylacetat có tác dụng ở các mức liều 0,5-1-25 mg/mL, phân đoạn ete các mức liều 1-2-5 mg/mL. Tam thất hoang có tác dụng ức

chế ngưng tập tiểu cầu trên in vitro ở các phân đoạ n và mức liều: phân đoạn tổng ở
mức liều 1-2-5 mg/mL, phân đoạn n-butanol ở mức liều 5 mg/mL, phân đoạn nhexan các mức liều 0,5-1-2-5 mg/mL) [19].
1.1.4. Thành phần hóa học
1.1.4.1. Sâm vũ diệp
Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân rễ Sâm vũ diệp cho thấy có nhiều
saponin khung dammaran và oleanan. Năm 1989, Trung Quốc đã phân lập 13 saponin
khung dammaran. Hai saponin mới đã được phân lập là bipinnatifidusoside F1 và F2, cùng
với 11 saponin đã biết từ lá khô của Sâm vũ diệp thu thập ở dãy núi Qinling Trung Quốc.
Saponin đã biết được xác định là ginsenosid F1, F2, F3, Rg2, Re, Rd, Rb1, Rb3, 24(S)pseudoginsenosid F11, panasenosid và majorosid F1 [44]. Năm 2011, nhóm nghiên cứu
Việt Nam- Hàn Quốc phân lập và xác định cấu trúc 10 saponin khung oleanan từ thân rễ
Sâm vũ diệp, được thu hái ở Hoàng Liên Sơn, Việt Nam, trong đó có 3 chất mới là

bifinosid A-C (1-3) và 7 hợp chất đã biết, bao gồm: narcissiflorine methyl ester (4),
chikusetsusaponin IVa (5), pseudoginsenoside RP1 methyl ester (6), stipuleanoside R1 (7),
pseudoginsenoside RT1 methyl ester (8), momordinIIe (9), và stipuleanoside R2 methyl
ester (10) [40]. Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu bước đầu nghiên cứu thành phần
hoá học của Sâm vũ diệp, kết quả là đã phân lập được một hỗn hợp saponin (11) bao gồm:
stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid

(11A)

và

β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid

(11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N-(1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl)
heptacosanamid

(12),

dichaccarid:

saccharose

(13),

saponin:

28-

desglucosylchikusetsusapnin IV (14) từ phân đoạn chiết ethyl acetat thân rễ Sâm vũ diệp.
Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên được công

5


bố phân lập từ cây này [9]. Năm 2017, rễ Sâm vũ diệp thu hái ở Sa Pa, Lào Cai đã
được nhóm nghiên cứu Khoa Y Dược xác định được 3 cấu trúc hóa học trên cơ sở
phân tích quang phổ và so sánh với chất tham khảo, bao gồm: Stigmast-5-en-3-ol
hay còn gọi là β-sitosterol (1), acid oleanolic (2) và daucosterol (3) từ phân đoạn
cao chiết etyl acetate của cao chiết tổng ethanol Sâm vũ diệp [11]. Trong ba chất
phân lập được thì oleanolic acid là sapogenin của các saponin khung olean có ý
nghĩa trong đánh giá hàm lượng tổng saponin có trong Sâm vũ diệp [10].
1.1.4.2. Tam thất hoang
Cho đến nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Tam thất
hoang được công bố. Một số nghiên cứu tập trung vào phần thân rễ của loài này chỉ
ra rằng phần thân rễ Tam thất hoang chứa nhiều saponin khung oleanan (hầu hết đều
là saponin dẫn chất acid oleanolic) với hàm lượng tương đối cao cùng một số
saponin khung dammaran với hàm lượng thấp. Năm 1985, nhóm các nhà nghiên
cứu ở Trung Quốc phân lập 2 saponin loại dẫn chất acid oleanolic và đặt tên là
stipuleanosid R1 và stipuleanosid R2 từ thân rễ Tam thất hoang [43]. Năm 2002,
trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama
(Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran gồm các
ginsenosid Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lượng nhỏ từ dich chiết ethanol của Tam
thất hoang được thu hái ở Trung Quốc [36]. Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Chun
Liang đã phân lập được 11 hợp chất saponin từ mẫu Tam thất hoang thu hái ở Việt
Nam trong đó có 1 chất mới là spinasaponin A methyl ester (1) [33]. Năm 2013,
nhóm tiếp tục phân lập được 4 hợp chất saponin nữa đều là các saponin khung
oleanan [38]. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu cũng đã phân lập được một số hợp chất
khác từ Tam thất hoang gồm 2 polyacetylen mới (stipudiol và stipuol), 1
polyacetylen đã biết (3R,9R,10R)- panaxytriol và các hợp chất khác: spathulenol
(serquiterpen) và 9- docosenoic acid methyl ester (acid béo) [48]. Ở Việt Nam,

nghiên cứu v ề thành phần hóa học của Tam thất hoang vẫn còn mới mẻ. Năm 2002,
Trần Công Luận đã phát hiện sự có mặt của hai nhóm chất chính là polyacetylen và
saponin cùng với acid béo, acid amin, tanin bằng phương pháp thử định tính hóa
học và phân tích sơ bộ sắc ký lớp mỏng [14]. Đồng thời bằng cách thủy phân
saponin rồi kết tinh sapogenin toàn phần thu được acid oleanolic [13].
1.2. Sinh lý học tiểu cầu
Tiểu cầu là tế bào máu nhỏ nhất, không có nhân, đường kính 3-4 µm, được
sản xuất từ mẫu tiểu cầu, nguyên mẫu tiểu cầu bắt đầu từ tế bào nguồn dòng tủy, do
tế bào gốc sinh máu tạo nên. Mỗi mẫu tiểu cầu có thể tạo được 3000 tiểu cầu. Số

6


9

lượng tiểu cầu lưu hành ở máu ngoại vi khoảng 150 - 450 × 10 /L [18, 29]. Tiểu cầu
có đời sống ngắn, khoảng từ 8-14 ngày. Hiện nay có thể giữ tiểu cầu trong 7 ngày
ngoài cơ thể ở nhiệt độ 20-22 °C, lắc liên tục [18].
1.2.1. Cấu trúc tiểu cầu.
Tiểu cầu có một cấu trúc phức tạp gồm 4 khu vực: khu ngoại vi, khu sol-gel,
khu bào quan và khu màng
Khu ngoại vi
Khu ngoại vi gồm lớp màng tiểu cầu kết nối với hệ thống các ống mở. Màng
tiểu cầu gồm hai lớp lipid bao quanh tiểu cầu. Màng tiểu cầu chứa các glycoprotein
quan trọng đóng vai trò như các receptor bề mặt liên quan đến quá trình đông máu
[52]. Glycoprotein Ib (GPIb): là protein xuyên màng có nhiệm vụ liên kết với yếu tố

wWF giúp cho tiểu cầu dính bám vào collagen. Đây là bước đầu tiên trong hoạt
động đông cầm máu của tiểu cầu [18, 29]. Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa): là
protein màng, hoạt động phụ thuộc vào ion canxi, có nhiệm vụ liên kết với

fibrinogen, giúp cho tiểu cầu ngưng tập tạo thành đinh cầm máu [18, 29]. Ngoài ra,
các phospholipid điện tích âm, đặc biệt phosphatidylserine (PS) có vai trò quan
trọng trong quá trình đông máu, là chất nền ban đầu cho các phản ứng enzym tiểu
cầu để tạo ra thromboxan A2 (TXA2), sản phẩm quan trọng trong quá trình hoạt hóa
tiểu cầu và là chất chủ vậ n mạnh gây nên quá trình ngưng tập tiểu cầu. Màng tiểu
cầu cũng có khả năng nhậ n và chuyển tín hiệu bề mặt thành tín hiệu hóa học bên
trong [17, 52].

Hình 1.3. Các glycoprotein màng tiểu cầu và chức năng của chúng [29]

7


Hệ thống các kênh mở gồm các kênh mở vào trong tiểu cầu như các không
bào làm tăng diện tích bề mặt tiểu cầu, các hạt tiểu cầu phóng thích các chất qua hệ
thống kênh này [18]. Hệ thống ống dẫn từ trong bào tương của tiểu cầu ra đến lớp
màng ngoài, tạo thành các lỗ nhỏ li ti trên bề mặt tiểu cầu. Hệ thống này đóng vai
trò như một đường dẫn cho các chất từ bên ngoài môi trường đi vào trong tế bào
chất của tiểu cầu và là nơi đưa các chất được giải phóng từ các hạt ra khỏi tiểu cầu
khi chúng bị hoạt hóa [7].
Khu sol-gel
Khu sol-gel nằm dưới khu ngoại vi gồm các vi ống và vi sợi. Vi ống nằm sát
màng tiểu cầu tạo nên khung đỡ và tham gia vào hoạt động co rút khi tiểu cầu bị
kích thích [52]. Vi sợi gồm các sợi actin có liên hệ chặt chẽ với các vi ống và tham
gia vào hoạt động tạo giả túc của tiểu cầu [52]. Ngoài ra khu sol-gel còn chứa
glycogen [28].
Khu bào quan
Khu bào quan gồm có các loại hạt và thành phần tế bào như các lysosom, ty
thể… Những bào quan này tham gia vào quá trình trao đổi chất, là nơi dự trữ enzym
và một lượng lớn các chất khác có vai trò quan trọng với chức năng tiểu cầu [18,

23]. Hạt đặc chứa một số chất như ADP, ATP, GDP, GTP, serotonin, histamin, canxi,
magie, pyrophosphat, nucleotid khác. Các chất này được giải phóng khi tiểu cầu bị
kích thích [18]. Hạt γ -gamma (Túi lysosome) chứa enzym như galactosidase,
fucosidase, hexosaminidase, glucuronidase. Hạt α chứa nhiều protein dính như
fibrin, fibronectin, vWF, thrombospondin, thromboglobulin, vitronectin; Yếu tố phát
triển (platelet derived growth factor - PDGF); Peptid hoạt hóa tổ chức liên kết
(CTAP: connective tissue activating peptid); Yếu tố 4 tiểu cầu; Yếu tố đông máu:
yếu tố V, kininogen, fibrinogen, yếu tố XI, protein S, chất ức chế yếu tố hoạt hóa
plasminogen. Hạt λ: làm tan cục máu đông trong giai đoạn sau của sự hồi phục
mạch [18, 37].
Khu vực màng
Khu vực màng gồm hệ thống ống dày đặc gắn với canxi một cách chọn lọc,
đóng vai trò là nơi dự trữ canxi của tiểu cầu. Đây cũng là nơi tổng hợp men
cyclooxygenase và prostaglandin của tiểu cầu [52].

8


Hình 1.4. Cấu trúc của tiểu cầu [29]
1.2.2. Chức năng tiểu cầu
Chức năng chính của tiểu cầu là làm v ững bền mạch máu, tạo nút cầm máu
ban đầu và tham gia vào quá trình đông máu huyết tương [17, 29].
1.2.2.1. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình cầm máu
Trong trạng thái sinh lý bình thường, tiểu cầu không dính vào nội mô mạch
máu còn nguyên vẹn, khi khi tế bào nội mô thành mạch bị tổn thương tiểu cầu
nhanh chóng trải qua các quá trình thông qua một loạt các phản ứng phối hợp tinh
xảo, mà kết quả cuối cùng là hình thành một nút tiểu cầu tại nơi mô tổn thương. Quá
trình chuyển đổi tiểu c ầ u bất hoạt thành tiểu cầu hoạt hóa xảy ra theo một chiều
dọc liên tục nhưng có thể được chia thành các bước: bám dính, kết tập, phóng thích
các chất [7, 18, 23, 35].

Giai đoạ n bám dính
Tiểu cầu dính vào các bề mặt lạ những tổ chức dưới nội mạc bộc lộ khi mạch
máu bị tổn thương (in vivo) hoặc bề mặt ống nghiệm thủy tinh, lam kính (in vitro)
[17]. Trong thành mạch khỏe mạnh, tiểu cầu được duy trì ở trạng thái không hoạt
động bởi oxid nitric và prostacyclin từ tế bào nội mô các mạch máu. Tế bào nội mô
còn chứa ADPase (adenosin diphosphatase) có tác dụng kìm hãm quá trình kích
hoạt ADP. Khi thành mạch bị tổn thương, lớp tế bào nội mô bị mất đi và bộc lộ lớp
dưới nội mô, lớp này có bản chất là các protein dính như: collagen, yếu tố von
Willebrand, fibronectin, lamilin…[7, 41, 52]. Yếu tố vWF tạo điều kiện cho sự bám
dính ban đầu, thông qua liên kết với phức hợp GPIb/IX/V đóng vai trò thụ thể trên

9


màng tiểu cầu, vWF đóng vai trò quan trọng trong bám dính của tiểu cầu khi tốc độ
dòng máu cao. Trong điều kiện tốc độ dòng máu thấp hoặc tĩnh, bám dính ban đầu
của tiểu cầu chủ yếu thông qua liên kết collagen với GPIa/IIa. Những tương tác này
cho phép tiểu cầu lưu thông chậm lại đủ để có sự tương tác, ràng buộc hơn nữa của
các cặp thụ thể - phối tử dẫn đến sự bám dính tĩnh [7, 35]. Đặc biệt sự tương tác ban
đầu giữa collagen và GPVI gây ra sự kích hoạt GPIIb/IIIa và GPIa/IIa. vWF và
collagen hình thành liên kết mạnh mẽ tương ứng với GPIIb/IIIa và GPIa/IIa,
fibrinogen liên kết với GPIIb/IIIa giữ tiểu cầu tại chỗ [7, 12].
Giai đoạn ngưng tập
Là hiện tượng tiểu cầu tập trung thành nút qua hiện tượng dính. Hiện tượng
dính đã hoạt hóa tiểu cầu, tạo điều kiện cho tiểu cầu ngưng tập [18]. Ngưng tập tiểu
cầu được đặc trưng bởi sự tích tụ tiểu cầu vào m ột nút cầm máu. Các thụ thể tiểu
cầu trung tâm trong quá trình này là GPIIb/IIIa, liên kết các tiểu cầu kích hoạt thông
qua cầu fibrinogen. Một tiểu cầu không hoạ t hóa có khoảng 4.000-5.000 phức hợp
GPIIb/IIIa trên bề mặt của nó. Trong trạng thái không hoạt động, thụ thể này không
thể gắn với fibrinogen, vWF, TSP, fibronectin, vitronectin. Chỉ khi tiểu cầu được

hoạt hóa, phức hợp GPIIb/IIIa mới được hoạt hóa, hoạt động như một thụ thể dành
cho fibrinogen, chất này lại gắn với thụ thể trên các tiểu cầu khác tạo nên một cầu
nối làm cho các tiểu cầu ngưng tập lại với nhau và tiếp tục hoạt hóa. Hai giai đoạn
ngưng tập và hoạt hóa tác động qua lại, tương hỗ lẫn nhau diễn ra liên tục cho đến
khi tạo thành nút tiểu cầu [7, 29, 35].
Một số chất có khả năng gây ngưng tập tiểu cầu là: ADP, thrombin, adrenalin,
serotonin, acid arachidonic, thromboxan A2, collagen, ristocetin..., trong đó ADP đóng
vai trò quan trọng nhất vì chất này gây ngưng tập tiểu cầu một cách độc lập không phụ
thuộc các tác nhân khác và giúp cho phản ứng ngưng tập do các tác nhân khác xảy ra
đầy đủ hơn. Ngoài ra, ADP còn có nguồn gốc từ hồng cầu. Những hồng cầu tại vị trí
thành mạch bị tổn thương sẽ bài tiết ADP và nhờ vậy làm tăng nhanh nồng độ ADP khu
trú tại chỗ tổn thương, góp phần làm tăng quá trình ngưng tập tiểu cầu, nhanh chóng tạo
nút cầm máu ban đầu, làm ngừng chảy máu [17, 29].

Sự ngưng tập tiểu cầu gây ra bởi ADP: Bình thường các tiểu cầu không
ngưng tập vì có năng lượng được tạo ra do sự thoái hóa ATP thành ADP. Trong
trường hợp nồng độ ADP cao thì phản ứng này bị ức chế dẫn đến tiểu cầu bị ngưng
tập [23].

10


Hình 1.5. Cơ chế gây ngưng tập tiểu cầu của ADP [23]
Acid arachidonic hoạt hóa ngưng tập tiểu cầu làm hoạt hóa phospholipid, giải
phóng acid arachidonic. Acid arachidonic ho ạ t hóa men cyclooxygenase (có trong
hệ thống dày đặc) tạo prostaglandin và thromboxan A2 (thromboxan A2 có tác dụng
kích thích ngưng tập tiểu cầu). Thrombin gây ngưng tập tiểu cầu qua cơ chế tác
động lên yếu tố V có trên bề mặt tiể u cầu. Bởi vậy khi dùng men trypsin để thủy
phân yếu tố V thì tiểu cầu không còn ngưng tập được nữa [23]. Adrenalin và
noradrenalin gây ngưng tập tiểu cầu theo cơ chế gián tiếp thông qua việc phóng

thích ADP và trực tiếp kích thích sự ngưng tập qua vai trò của acid arachidonic
[23]. Sự ngưng tập do ristocetin xảy ra do sự kích thích yếu tố von-Willebrand gắn

với tiểu cầu tại vị trí của receptor GPIb. Vì vậy, nếu thiếu một trong hai yếu tố này
thì tiểu cầu không ngưng tậ p [18, 23]. Serotonin liên kết với thụ thể 5HT2A khuếch
đại cùng với ADP cho phản ứng của tiểu cầu, ngoài ra serotonin có thể
đóng vai trò gây đông máu, làm tăng việc lưu giữ protein đông máu như fibrinogen,
thrombospondin trên bề mặt tiểu cầu [7].
Sự ngưng tập tiểu cầu là một hiện tượng có thể phục hồi được tự nhiên. Qúa
trình phục hồi này là do sự có mặt của một hệ thống men ở trong huyết tương và
trong tiểu cầ u; trong đó adenylat kinase đóng vai trò quan trọng nhất [23].
Giai đoạn phóng thích các chất của tiểu cầu [23]
Dưới tác dụng của các yếu tố gây ngưng tập (ADP, thrombin), tiểu cầu sẽ bị
ngưng tập, tiếp theo sẽ xảy ra một loạt các biến đổi, đó là quá trình thay đổi hình
dạng và phóng thích của tiểu cầu. Đây là một hiện tượng rất phức tạp, bao gồm sự
biến đổi về hình thái và sinh hóa của tiểu cầu. Cụ thể là những thay đổi về hình thái:
tiểu cầu phồng to lên, trải rộng ra, kết dính, ngưng tập, hình thành chân giả, mất hạt,
co lại. Sau đó tiểu cầu co rút, giải phóng ra một loạt thành phần như ADP,

11


serotonin, adrenalin, histamin, yếu tố III tiểu cầu, 5-hydroxy tryptamin, nucleotid và
một số men khác. Các hiện tượng sinh hóa xảy ra như: kích thích chuyển hóa tiêu
đường, thoái hóa và tái tổng hợp từng phần ATP, ADP thành AMP, hoạt hóa
thrombosterin. Hiện tượng này xảy ra có sự tham gia của thrombin, collagen và có
tiêu tốn năng lượng của tiểu cầu. Đây là hiện tượng vô cùng ý nghĩa trong việc bảo
vệ mạch máu khi mạch máu bị tổn thương.
Trong thực tế, các khả năng kết dính, ngưng tập, phóng thích của tiểu cầu có
sự gắn bó rất chặt chẽ với nhau, khả năng này thúc đẩy, tạo điều kiện, mở rộng cho

khả năng khác xảy ra để đạt mục đích cuối cùng là thực hiện tốt các chức năng của
tiểu cầu.

Hình 1.6. Quá trình ngưng tập tiểu cầu [35]
Hiện tượng dính hoạt hóa tiểu cầu, thay đổi hình dạng từ hình đĩa thành dạng
quả cầu nhỏ gọ n, với phần mở rộng đuôi gai dài tạo điều kiện thuận lợi cho độ bám
dính. Tiểu c ầu ngưng tập, cùng lúc với quá trình này, bên trong tế bào chất của tiểu
cầu xảy ra hiện tượng giải phóng hạt, các chất chứa bên trong hạt sẽ được giải
phóng ra môi trường bên ngoài qua hệ thống kênh mở và thực hiện vai trò sinh học
của chúng [7, 18, 23].
1.2.2.2. Vai trò của tiểu cầu trong quá trình đông máu huyết tương
Ngay khi hiện tượng bám dính bắt đầu, tiểu cầu thay đổi hình dạng và chế
tiết chất tham gia quá trình khởi động đông máu HMWK, yếu tố này cùng với

12


kallikrein hoạt hóa yếu tố XII bước đầu của quá trình đông máu. Một lượng nhỏ
thrombin được hình thành trên bề mặt của một số tế bào mang TF (tissue factor) như:
nguyên bào sợi, bạch cầu đơn nhân hoạt hóa hoặc tế bào nội mô, lượng thrombin này
không có khả năng để tạo ra một cục máu đông fibrin ổn định, nhưng đủ để hoạt hóa
tiểu cầu. Sau đó, tiểu cầu hoạt hóa liên kết các yếu tố đông máu bởi các thụ thể chuyên
biệt. Tiểu cầu liên kết với các yếu tố V và VIII ch ống lại sự phân cắt bởi hoạt tính
protein C. Yếu tố XIa liên kết với thụ thể GPIb trên bề mặt tiểu cầu và hoạt hóa yếu tố
IX. Yếu tố Xa dễ dàng bị ức chế bởi TF. Sự phối hợp của các yếu tố đông máu trên bề
mặt tiểu cầu dẫn đến hình thành thrombin, vì vậy một cục máu đông ổn định fibrin
được hình thành. Ngoài ra tiểu cầu còn cung cấp khoảng
20 % yếu tố V và các yếu tố đông máu khác như fibrinogen, yếu tố IX, XIII [7].

1.3. Các xét nghiệm đánh giá chức năng tiểu cầu

Hiện nay, có rất nhiều phương pháp đánh giá chức năng tiểu cầu như: đo thời
gian máu chảy, đo sức bền mao mạch, đếm số lượng tiểu cầu, co cục máu đông, đo
độ dính tiểu cầu, đo độ ngưng tập tiểu cầu...
1.3.1. Thời gian máu chảy
Nguyên lý là khi mạch máu bị tổn thương, máu sẽ thoát ra ngoài, đồng thời
hệ thống cầm máu bắt đầu hoạt động. Hoạt động cầm máu gồm vai trò của thành
mạch và của tiểu cầu. Chất lượng của hoạt động này không tốt sẽ làm cho thời gian
để cầm được máu dài hơn. Xét nghiệm thời gian máu chảy là tạo ra tổn thương
mạch máu và đo thời gian t ừ lúc máu chảy đến khi máu ngừng chảy [16].
Nguyên lý của phương pháp Duke là dùng kim chủng tạo một vết thương
nằm ngang ở vùng giữa dái tai và đo thời gian máu chảy [12]. Trị số bình thường từ
2 – 4 phút [12, 23].
Nguyên lý của phương pháp Ivy là đo thời gian máu chảy của các vết thương ở
mặt duỗi cẳng tay, dưới 1 áp suất đã định [12]. Trị số bình thường: 4-8 phút [12, 23].

Phương pháp Borchgrevink có trị số bình thường từ 7-10 phút [23]
1.3.2. Đo sức bền mao mạch
Có 2 phương pháp, nhưng phương pháp giảm áp ít dùng hơn phương pháp
tăng áp: dùng huyết áp kế, duy trì lực bằng trung bình cộng giữa huyết áp tối đa và
tối thiểu trong vòng 10 phút sau đó tháo hơi nhanh. Đếm số nốt xuất huyết ngay
dưới vùng dưới da nếp khuỷu. Nếu trên 7 nốt xuất huyết là dương tính. Sức bền

13


mao mạch giảm gặp trong một số bệnh lý: Giảm tiểu cầu, viêm thành mạch dị ứng,
viêm thành mạch do độc tố. Trong bệnh von-Willebrand, bệnh rối loạn chức năng
tiểu cầu. Ngoài ra còn có thể gặp ở người già, thiếu vitamin C, do thể tạng hoặc có
tính gia đình [16, 23].
1.3.3. Đếm số lượng tiểu cầu

Có rất nhiều phương pháp đếm tiểu cầu, nhưng phổ biến nh ấ t hiện nay ở
các bệnh viện là đếm tiểu cầu bằng máy dựa trên nguyên lý trở kháng ho ặc laser.
3

Trị số bình thường của tiểu cầu là 150.000 - 300.000/mm . Số lượng tiểu cầu giảm
gặp trong: xuất huyết do giảm tiểu cầu có nguyên nhân miễn dịch, suy tuỷ xương,
leucemie cấp, sốt xuất huyết. Số lượng tiểu cầu tăng gặp trong: tăng tiểu cầu tiên
phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát [16, 23].
1.3.4. Quan sát hình thái và độ tập trung của tiểu cầu trên tiêu bản nhuộm
Giêmsa
Rất cần thiết phải làm đặc biệt ở các trường hợp nghi ngờ bệnh lý tiểu cầu.
Bình thường tiểu cầu bắt màu đỏ tím, không có nhân nhưng có các hạt màu đỏ và
đứng thành cụm nếu máu chưa qua chống đông. Độ tập trung tiểu cầu tăng trong:
tăng tiểu cầu tiên phát, leucemie kinh dòng hạt, đa hồng cầu tiên phát. Độ tập trung
tiểu cầu giảm gặp trong: Suy tuỷ xương, leucemie cấp [16, 23].
1.3.5. Co cục máu đông
Có nhiều phương pháp khác nhau, tuy nhiên trong lâm sàng thường dùng kỹ
thuật của Budtz-Olzen. Đây là xét nghiệm đơn giản nhưng khá đặc hiệu. Đánh giá
sự co cục máu bằng cách quan sát cục máu đông sau 2 giờ. Nguyên lý của phương
pháp: máu ra khỏi thành mạch sẽ bị đông, máu đông là máu chuyển thành dạng rắn
nhờ hình thành các sợi fibrin. Mạng lưới sợi fibrin ôm lấy các thành phần hữu hình
rồi co rút lạ i tạ o nên cục máu đông tách rời khỏi phần huyết thanh. Cục máu đông
co được là nh ờ vai trò của tiểu cầu và của fibrin [16, 23]. Cục máu co hoàn toàn:
phản ảnh tình trạng bình thường của fibrrinogen và tiểu cầu (cả số lượng và chất
lượng). Cục máu không co (không tạo thành cục máu tách riêng rõ ràng với huyết
thanh) hay cục máu co không hoàn toàn (phần huyết thanh tách ra ít dưới 30% máu)
hoặc co cục máu nhưng còn nhiều hồng cầu tự do trong huyết thanh) là thể hiện bất
thường của tiểu cầu (số lượng hoặc chất lượng) và/hoặc các fibrrinogen. Mức độ bất
thường càng nặng thì cục máu càng không co.

14


Xét nghiệm co cục máu phụ thuộc vào số lượng và chất lượng tiểu cầu,
lượng fibrinogen, yếu tố VIII và hematocrit [16, 23].
1.3.6. Đo độ dính tiểu cầu
Trên in vivo sử dụng phương pháp Borchrevink. Nguyên lý là đo độ dính tiểu
cầu qua việc lấy máu để đếm tiểu cầu trực tiếp tại vết thương vào các thời điểm cách
đều nhau. Trị số bình thường: 20-40 %. Trên in vitro có 3 phương pháp (phương
pháp Salzman, Bowie, Hellem). Nguyên lý là đo độ dính ti ểu cầu sau khi cho máu
hoặc huyết tương qua cột bi thủy tinh [23]. Độ dính tiểu cầu giảm trong: bệnh Von –
Willebrand, trong một số bệnh lý rối loạn chức năng tiểu cầu, dùng một số thuốc
giảm đau, sau truyền Dextran. Độ dính tiểu cầu tăng trong: bệnh lý huyết khối, tiểu
đường, hút thuốc lá, cũng có thể gặp trong những trường hợp sau mỗ, sau sinh, sau
một sang chấn nào đó (đặc biệt sau cắt lách, …) [23].
1.3.7. Đo độ ngưng tập tiểu cầu
Có rất nhiều kỹ thuật để đo độ ngưng tập tiểu cầu nhưng chủ yếu dựa trên
nguyên lý sau: Mật độ quang của huyết tương giàu tiểu cầu tỷ lệ thuận với nồng độ
của tiểu cầu có trong huyết tương đó. Bởi vậy khi cho thêm một chất gây ngưng tập
tiểu cầu nào đó (ADP, adrenalin) vào dung dịch huyết tương giàu tiểu cầu, hiện
tượng ngưng tập tiểu cầu sẽ xãy ra. Nồng độ tiểu cầu dưới dạng những phân tử riêng
biệt sẽ giảm dẫn đến mật độ quang học tăng. Ghi nhận một số hình ảnh của quá
trình thay đổi của mật độ quang sẽ biết được đặc điểm của quá trình ngưng tập tiểu
cầu [2, 3, 23, 50].

Hình 1.7. Nguyên lí của xét nghiệm đo độ ngưng tập tiểu cầu
(PPP: huyết tương nghèo tiểu cầu, PRP: huyết tương giàu tiểu cầu)

15

Nguyên lý của phương pháp đo quang: thiết bị đo độ ngưng tập tiểu cầu bằng
phương pháp quang học là một quang phổ kế có bước sóng thích hợp cố định. Một
chùm tia ánh sáng đỏ chiếu qua một ống chứa huyết tương giàu tiểu cầu và một
chùm tia khác chiếu qua một ống chứa huyết tương nghèo tiểu cầu. Khi đo, sử dụng
một mẫu huyết tương giàu tiểu cầu của mẫu máu cần đo để thiết lập điểm chuẩn ở
đó ánh sáng bị cản hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 0 %. Đồ ng thời sử dụng
huyết tương nghèo tiểu cầu của cùng mẫu máu để thiết lập điểm chuẩn ở đó ánh
sáng đi qua hoàn toàn và độ dẫn truyền ánh sáng là 100 %. Khi cho chất kết tập như
ADP, collagen, thrombin, epinephrin, acid arachidonic, ristocetin...vào huyết tương
giầu tiểu cầu sẽ xẩy ra hiện tượng các tiểu cầu ngưng tập với nhau tạo thành đám vì
vậy độ dẫn truyền ánh sáng sẽ tăng lên. Độ dẫn truyền ánh sáng phản ánh mức độ
ngưng tập tiểu cầu. Kết quả được thể hiện bằng % độ dẫn truyền ánh sáng của huyết
tương giàu tiểu cầu trong đó tiểu cầu đã ngưng tập tối đa [24, 37, 50, 51].
1.4. Các thuốc kháng tiểu cầu
Tiểu cầu có vai trò quan trọng trong cơ chế bệnh sinh huyết khối. Trong
nhiều bệnh lý, sự hoạt hóa tiểu cầu bao gồ m: hiện tượng dính, ngưng tập, phóng
thích ra các yếu tố/thành phần nội tiểu cầu… đó là những cơ sở sinh lý, sinh hóa và
cơ học quyết định cho sự hình thành huyết khối. Bởi vậy, hiện nay liệu pháp kháng
tiểu cầu ngày càng được quan tâm đúng mức hơn trong việc điều trị dự phòng và
chống sự hình thành huyết kh ối [23]. Thuốc kháng tiểu cầu là thuốc ức chế quá
trình kết dính, hoạt hóa, ngưng tập, nhằm ngăn ngừa, hạn chế tắc mạch [18]. Điều
trị chống ngưng tập tiểu c ầ u có thể tấn công lên các mục tiêu trên con đường của
quá trình ngưng tập tiểu c ầ u [26]. Hiện nay có nhiều thuốc kháng tiểu cầu với cơ
chế khác nhau được sử dụng như: Aspirin, Ticlopidin, Clopidogrel, Prasugrel…
1.4.1. Nhóm ức chế men Cyclo-oxygenase: Aspirin
Aspirin được coi là thuốc kháng tiểu cầu hàng đầu và được sử dụng rộng rãi.
Cơ chế tác dụng: Aspirin ức chế men cyclooxygenase 1 (COX-1) dẫn đến ngăn cản
sự tạo thành Thromboxan A2 (TXA2), nhờ đó mà ức chế ngưng tập tiểu cầu. Sự ức
chế này là rất mạnh và tồn tại suốt đời sống tiểu cầu đó, vì tiểu cầu không thể tổng

hợp thêm men mới được nữa. Bên cạnh đó, Aspirin cũng ức chế sự tổng hợp chất
prostaglandin kháng đông, là PGI2 của tế bào nội mạc mạc thông qua việc ức chế
men prostacyclin synthetase, do đó gián tiếp kích thích NTTC. Tuy nhiên tác dụng
này không mạnh bằng tác dụng ức chế men cyclooxygenase và tác dụng này cũng
không kéo dài vì tế bào nội mạc có thể tổng hợp ra men mới [22, 23]. Aspirin có thể
ức chế ngưng tập tiểu cầu với các chất kết tập như collagen, ADP, epinephrin.

16


1.4.2. Nhóm ức chế ADP Receptor (nhóm Thienopyridin)
Ticlopidin: cơ chế tác dụng ức chế NTTC của Ticlopidin là do Ticlopidin
tưong tác với glycoprtein IIb/IIIa receptor của fibrinogen làm ức chế sự gắn
fibrinogen vào tiểu cầu hoạt hóa, ngăn cản sự kết dính tiểu cầu. Ngoài ra, thuốc còn
làm tăng prostaglandin D2 và E2 góp phần chống đông vón tiểu cầu và tăng thời
gian chảy máu [1, 22]. Ngày nay Ticlopidine ít sử dụng hơn vì có một số tác dungg̣
phu g̣quan trọng như giảm bacḥ cầu haṭ(cóthểgây tử vong), suy tủy v àtắc mâṭ.
Clopidogrel: bản thân Clopidogrel là tiền thuốc không có hoaṭtinhh kháng tiểu
cầu. Sau khi đươcg̣ hấp thu ở ruôt,g̣ khoảng 85 % lươngg̣ thuốc hấp thu đươcg̣ chuyển
hóa bởi các enzym esterase thành những chất không cóhoaṭtinhh và15% đươcg̣ chuyển
hóa bởi hê g̣ enzym cytochrome P-450 (hai bước) ở gan thành chất có hoaṭtinhh ức
chếthu g̣ thểP2Y12 trên bềmăṭtiểu cầu, làm ADP không gắn đươcg̣ vào thu g̣ thểcủa
nódẫn tới không hoaṭhoáđươcg̣ tiểu [1, 22, 39].
Prasugrel: làthuốc mới nhất thuôcg̣ nhóm Thienopyridin. Sau khi vào ống tiêu
hóa, prasugrel bi g̣ thủy phân nhanh chóng bởi esterase trong ruôṭvàmáu thành chất
chuyển hóa trung gian. Chất này laịđươ cg̣ biến thành chất chuyển hóa cóhoaṭ tinhh bởi
enzym cytochrome P450 (môṭ bước), chất chuyển hóa có hoaṭ tinhh của prasugrel ức
chếkhông hồi phucg̣ thu g̣ thểP2Y12 của tiểu cầu. Như vậy Prasugrel khắc phục được
nhược điểm của Clopidogrel nên Prasugrel cótác dungg̣ ức chếkết tâpg̣ tiểu cầu manḥ
hơn, nhanh hơn vàổn đinḥ hơn so với clopidogrel [1].

Thuốc ức chếP2Y12 không thuôcc̣ nhóm thienopyridin
Ức chếtrưcg̣ tiếp có hồi phucg̣ thu g̣ thểP2Y12 của tiểu cầu. Đây là thuốc đầy
triển vọng qua nghiên cứu PLATO (Study of Platelet Inhibition and Patient
Outcomes) [1].
1.4.3. Các thuốc ức chếthụ thể Glycoprotein IIb/IIIa của tiểu cầu
Abciximab, Eptifibati và Tirofiban. Các thuốc này ức chế glycoprotein
IIb/IIIa se ̃ức chếnhững liên kết chéo bằng fibrin giữa các tiểu cầu do đóức chế hinhh
thành huyết khối [1, 22].
1.4.4. Thuốc làm tăng AMP vòng tiểu cầu
Dipyridamol: Ức chế sự vỡ ra của AMP vòng do phosphodiesterase do đó là
tăng nồng độ APM vòng, ngăn cản sự ngưng tập, phóng xuất và kết dính tiểu cầu[1,
22]. Thuốc có tác dụng chống ngưng tập tiểu cầu nhưng không làm kéo dài thời gian
chảy máu [23].

17


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu
Đối tượng
Mẫu Sâm vũ diệp toàn cây tươi thu hái ở Sa Pa – Lào Cai vào tháng 3 năm
2016 được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp - Panax bipinnatifidus Seem. bởi
chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dược liệu, Viện Dược liệu. Phần dưới
mặt đất được rửa sạch, thái lát mỏng, sấy khô ở 40-50 °C đạt độ ẩm dưới 10 %, xay
nhỏ và bảo quản trong túi nilon. Mẫu được giám định tên khoa học là Sâm vũ diệp
sau khi được sơ chế, làm khô, xay nhỏ được chiết bằng EtOH 50 % với tỷ lệ dung
môi : dược liệu là 7:1, ở nhiệt độ 90 °C. Chiết 2h/lần, 3 lần/mẻ. Dịch chiết cồn 50 %
thu được cô dưới áp suất giảm đến khi tạo thành cao lỏng (1:1).
Cao chiết toàn phần của Sâm vũ diệp còn nhiều tạp chất bao gồm các hợp
chất ít phân cực, dầu béo và các thành phần saccarid tan trong nước. Loại bỏ các tạp

chất ít phân cực, thân dầu: dùng phương pháp chiết phân bố lỏng-lỏng với n-hexan
theo tỷ lệ 1:1 qua 3 lần. Cất loại thu hồi dung môi n-hexan để tái sử dụng. Lớp nước
sau chiết lỏng-lỏng chứa toàn lượng saponin đã được loại dầu béo và tạp chất thân
dầu. Loại bỏ các thành phần saccarid tan trong nước: sử dụng sắc ký hấp phụ bằng
resin diaion HP-20, rửa giải bằng EtOH 96 %.
Dịch sau loại tạp được c ất thu hồi dung môi dưới áp xuất giảm đến cao đặc,
đem sấy chân không tại 55-60 °C trong 24 giờ, sử dụng máy xay dược liệu, nghiền
cao thành dạng bột, rây qua rây 355, thu được cao khô định chuẩn giàu saponin của
Sâm vũ diệp, bảo quản trong túi nilon kín tại nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Các
phân đoạn chiết cao khô định chuẩn giàu saponin của Sâm vũ diệp được tiến hành
tại bộ môn Hóa Dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y Dược, do TS. Nguyễn Hữu
Tùng cung cấp (Hình 2.1) [27].

18