Lai Tế bào Soma

157
Chương 8
Lai Tế bào Soma

I. Vấn đề lai ghép ở thực vật
Lai ghép hay là lai dinh dưỡng từ lâu đã được thực hiện ở thực vật và
có ý nghĩa trong thực tiễn trồng trọt các cây ăn trái, cây cảnh …Lai dinh
dưỡng bằng ghép là lai soma, nhưng thực chất thì cây lai dinh dưỡng là
một loại cơ thể khảm vừa mang các tế bào và mô của gốc ghép và cành
ghép. Giữa các tế bào của mô gốc ghép và cành ghép có thể có sự trao đổi
thông tin điều chỉnh sự trao đổi chất tạo cho cành ghép có một số tính chất
của gốc ghép, nhưng không xảy ra sự hợp nhân. Vì vậy các tính trạng
trung gian chỉ có ở thế hệ cành ghép, khi đem gieo các hạt của cành ghép
thì thế hệ sau không còn có tính trạng trung gian vì hạt được hình thành từ
hệ gene của cành ghép.
Khác với tế bào động vật, tế bào thực vật có thành tế bào là lớp bao
ngoài cùng. Thành tế bào gồm cellulose, hemicellulose và pectin. Nếu
thành tế bào bị tách bỏ, tế bào thực vật chỉ còn lớp màng sinh chất bọc
ngoài gọi là tế bào trần hay protoplast. Khi các protoplast tiếp xúc nhau thì
chúng có thể hợp nhất lại làm một.
Vì tế bào thực vật có thành tế bào, nên trước đây trong môt thời gian
dài,người ta cho rằng kỹ thuật dung hợp protoplast chỉ giới hạn ở các tế
bào động vật. Mãi cho đến năm 1960, sau những nghiên cứu thành công
của Cocking với việc dung một hỗn hợp các enzyme để tách bỏ thành tế
bào thực vật, thì kỹ thuật dung hợp protoplast mới được áp dụng ở thực
vật. Tuy nhiên, nó chỉ thực sự phát triển mạnh mẽ và có xu hướng được
ứng dụng trong chọn giống chỉ sau khi các kết quả nghiên cứu về việc tái
sinh hoàn chỉnh cây thuốc lá từ protoplast của Takebe (1971) và việc tái
sinh cây thuốc lá lai do dung hợp protoplast giữa 2 loài N. tabacum và N.
langsdorffi của Carlson (1972).

II. Đại cương về lai tế bào soma và công nghệ tế bào thực vật
Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong
đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall)
sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào
thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành
có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh
cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid
nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các

158
protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung
hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các
giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào
soma.
Sự ra đời của kỹ thuật protoplast cho phép tạo ra những tái tổ hợp di
truyền giữa các đơn vị phân loại xa (loài hay chi) mà mà bằng phương
pháp lai hữu tính khó hoặc không thể đạt được. Trong quá trình dung hợp,
bên cạnh sự kết hợp của các genome nhân, còn có thể xảy ra sự hợp nhất
tế bào chất giữa các protoplast. Nhờ vậy, một số tính trạng do các gene
trong tế bào chất kiểm soát như tính bất thu, có thể chuyển từ cây này sang
cây khác nhờ kỹ thuật này.
III. Phương pháp tạo tế bào trần
Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây:
1. Phương pháp cơ học
Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng
màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích
để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha
loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành
các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập
protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker

tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập
từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs)
và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa
chuột và rễ củ cải đường.
2. Phương pháp sử dụng enzyme
Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp
cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast.
Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử
dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế
bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ
enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên
có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá,
rễ, hạt phấn …), callus, tế bào đơn,…
Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải
bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm
thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài.


159


Hình 8.1.
Protoplast thuốc lá
IV. Liên kết và dung hợp tế bào trần
1. Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật
1.1. Xử lý bằng NaNO
3
Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO
3
(0,25 M) kích thích dung

hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để
sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên
phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO
3
không thích hợp với tế bào
bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá.
1.2. Xử lý bằng PEG
Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ
và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm
dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một
sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu
quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca
2+
có hiệu quả tăng tần
số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng:
hoặc cung cấp cầu nối để Ca
2+
có thể liên kết các bề mặt màng với nhau
hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa
giải.
1.3. Dung hợp bằng điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp
bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây
độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các protoplast hoặc các thể dị
nhân được xử lý bằng PEG.
Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng
dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich

160
(1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện

trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp
bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung
hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện
cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích
thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực. Phương
pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút.
Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực
hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao
tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc
của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý.
Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển
chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc
ít hơn.
Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia
trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma.



Hình 8.2
Dung hợp protoplast và cytoplast


161

Hình 8.3
Dung hợp tế bào
V. Nuôi cấy tế bào lai và tái sinh cây
1. Nuôi cấy protoplast
1.1. Thành phần dinh dưỡng
Môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch

huyền phù và callus. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và ammonium dùng
trong môi trường nuôi cấy mô ở thực vật có thể là quá cao đối với nuôi
cấy protoplast. Hầu hết muối của môi trường B5 (Gamborg và cs, 1968)
và MS (Murashige và Skoog, 1962) cải biến một ít là thích hợp. Tăng
nồng độ Ca trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2-4 lần so với bình
thường là có lợi cho việc duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào (Torres
1989). Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3-5%, ở một số loài như
thuốc lá, sucrose được sử dụng ở nồng độ thấp hơn chỉ khoảng 1,5%.
Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống như trong môi
trường nuôi cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp
nồng độ khác nhau để cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia các
protoplast phân lập. Protoplast ngũ cốc đòi hỏi cung cấp 2,4-D riêng rẽ
hoặc tốt hơn là phải phối hợp với cytokinin. Tuy nhiên 2,4-D cũng như
các auxin khác (NAAA, IAA) được sử dụng riêng rẽ thường làm mất tiềm
năng phát sinh hình thái ở các callus có nguồn gốc protoplast. Các
cytokinin thường được sử dụng là BAP, kinetin, 2-iP hoặc zeatin. Mặc dù
tổ hợp hai loại hormone trên thay đổi tùy từng loài, nhưng nói chung trong
nuôi cấy protoplast thì tỷ lệ auxin/cytokinin cao thích hợp cho phân chia tế
bào, trong khi các protoplast có nguồn gốc từ những tế bào phân hóa cao