(Luận án tiến sĩ) Nghiên cứu sản xuất Huyết thanh kháng nọc rắn cạp nia đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa; đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo WHO ước tính, mỗi năm Việt Nam cần khoảng 1,7 triệu đơn vị
máu phục vụ cấp cứu điều trị (≈ 2% dân số) [40]; ngoài máu và các chế phẩm
máu, chế phẩm huyết tương, còn phải kể đến các chế phẩm huyết thanh như:
gamma globulin, anti-HBs globulin, anti-T lymphocyte globulin, anti-D
globulin, antivenom [141],[147],[152]...trong đó, huyết thanh kháng nọc rắn
(antivenom) là loại chế phẩm rất quan trọng, đặc biệt trong điều trị rối loạn
đông cầm máu do nhiễm độc nọc rắn họ Vipridae.
Là nước nhiệt đới, với ¾ diện tích rừng núi và đất nông nghiệp, bờ biển
dài hơn 3000 km, Việt Nam có môi trường rất thuận lợi cho rắn độc phát triển.
Phần lớn cư dân sinh sống, làm việc trong môi trường nông nghiệp, rừng núi,
hải đảo...nguy cơ bị rắn độc cắn rất cao (> 30.000 người /năm [21]); ngoài tổn
thất nhân mạng, chi phí điều trị rất tốn kém: nhiều nạn nhân phải thở máy
hàng tháng hoặc phải truyền hàng chục lít máu và huyết tương để cứu tính
mạng; kỷ lục, đầu tháng 6/2013, bệnh viện Bạch Mai đã phải truyền ≈ 46 lít
máu và chế phẩm để cứu một người bệnh [174].
Nhằm giảm thiểu tỷ lệ tử vong, giảm số lượng máu và huyết tương phải
sử dụng trong điều trị rắn độc cắn, Bộ y tế đã quan tâm chỉ đạo việc nghiên
cứu, ứng dụng sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn (HTKNR) [6],[8]. Đến
nay, đã có một số nghiên cứu rất thành công, góp phần cứu sống hàng ngàn
bệnh nhân, giảm mạnh lượng máu và chế phẩm phải sử dụng [6],[21],[23]...
Tuy vậy, sau nhiều năm nỗ lực, đến nay chúng ta vẫn đang thiếu trầm
trọng nhiều loại HTKNR; hầu như ta chỉ có duy nhất hai loại HTKNR cho rắn
hổ đất và rắn lục tre [8],[165],[166],[171]. Do tính đặc hiệu kháng nguyên nọc
rắn theo vùng địa lý, mỗi quốc gia phải tự chế tạo HTKNR cho chính quốc
gia mình (khuyến cáo của WHO) [141],[20],[6]. Để đáp ứng nhu cầu cấp cứu,


2

điều trị rắn độc cắn, chúng ta rất cần đẩy mạnh nghiên cứu, sản xuất HTKNR;
đặc biệt là các HTKNR cho các loài rắn độc nguy hiểm, thường gặp; trong
các loài đó, hàng đầu phải kể đến rắn cạp nia, chiếm 35,8% các loài rắn độc
họ rắn hổ (Elapidae) tại Việt Nam, là loài rắn độc có độc tính cực mạnh, gây
tử vong rất cao (> 80% nếu không được cấp cứu điều trị kịp thời) [14].
Thực tế điều trị rắn cạp nia cắn ở Việt Nam từ trước đến nay cho thấy:
nước ta có hai loài rắn cạp nia thường gặp chủ yếu là rắn cạp nia nam
(Bungrarus candidus) và rắn cạp nia bắc (Bungarus multicinctus). Đây là hai
loài rắn có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” rất giống nhau, thoáng nhìn rất
khó phân biệt. Hai loài rắn này khác nhau cả về độc tính nọc và biểu hiện lâm
sàng, chẩn đoán rất dễ nhầm lẫn, HTKNR đơn đặc hiệu không có tác dụng
chéo và cũng chưa có VDK để chẩn đoán xác định [15].
Nghiên cứu sản xuất HTKNR đa giá cho cả hai loài rắn độc nguy hiểm
nói trên là giải pháp đem lại thuận lợi cho cấp cứu điều trị bệnh nhân rắn cạp
nia cắn trong cả nước. Để tăng tính an toàn của chế phẩm, dạng F(ab’)2 là tối
ưu, đồng thời phải áp dụng các giải pháp kỹ thuật và kiểm soát chất lượng
toàn diện để chế phẩm có thể đạt Tiêu chuẩn Quốc gia về HTKNR dùng cho
người, theo Dược điển Việt Nam [9].
Với các lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá
F(ab’)2 từ huyết tƣơng ngựa; đánh giá chất lƣợng chế phẩm trong phòng
thí nghiệm” được thực hiện, nhằm các mục tiêu sau:
1. Nghiên cứu sản xuất HTKN-RCN đa giá F(ab’)2 từ huyết tương ngựa,
đạt Tiêu chuẩn Quốc gia.
2. Đánh giá chất lượng chế phẩm trong phòng thí nghiệm.


3

Chƣơng 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. MỘT SỐ ĐIỂM CẦN CHÚ Ý VỀ MÁU VÀ HUYẾT TƢƠNG
1.1.1. Máu:
Máu là mô lỏng màu đỏ lưu thông trong hệ thống tuần hoàn; tạo thành từ
các tế bào hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một lượng nhỏ tế bào gốc sinh máu
và phần huyết tương chứa protein, muối khoáng, nước....Máu chiếm 1/13
trọng lượng cơ thể (60-70 ml/kg); thể tích ở nam khoảng 5-6 lít, nữ 4,5-5 lít;
tỷ trọng: 1.055-1.063, pH 7,33-7,43 [31].
Máu động vật có vú cũng gồm HC, BC, TC, huyết tương,.. với chức năng
cung cấp oxi, dinh dưỡng, đông cầm máu, bảo vệ cơ thể,...tương tự ở người.
1.1.2. Huyết tƣơng:
Là phần dịch lỏng thu được sau ly tâm hoặc để lắng tự nhiên máu đã
chống đông. Thành phần chủ yếu của huyết tương là nước (92%), các protein
hòa tan (albumin, globulin, fibrinogen...), đường, các yếu tố đông máu, các
chất điện giải, vitamin, hormon, carbon dioxide... [31],[167].
Protein huyết tương gồm: globulin miễn dịch, bổ thể, các yếu tố đông
máu, các yếu tố enzyme, các protein liên kết với lipid, các protein vận
chuyển...các thành phần này thay đổi trong bệnh lý.
Điện di protein, điện di miễn dịch sẽ tách được các thành phần protein.
Mỗi protein huyết tương đều có điểm đẳng điện tương ứng với pH.
Tính hòa tan của protein chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và tính tan trong
dung dịch muối.
Khi cấu trúc protein thay đổi, độ hòa tan cũng thay đổi, tính chất sinh học
có thể mất đi; các yếu tố gây biến tính protein là: nhiệt độ, acid, base, tia cực
tím (làm đứt gãy liên kết peptid), sóng siêu âm (gây oxy hóa) [31],[163].


4

1.2. CÁC LOẠI CHẾ PHẨM MÁU VÀ CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG
1.2.1. Máu toàn phần:
Máu toàn phần là máu lấy từ mạch máu người cho (hoặc động vật cho
máu), bảo quản trong túi (hoặc chai, bình chuyên dụng) có chất chống đông
và bảo quản máu (thông thường là CPDA gồm citrate, phosphat, đường
dextrose, adenin). Mỗi đơn vị máu người cho khỏe mạnh (250 ml) có 30 - 40
gam hemoglobin [31],[170]. Bảo quản máu toàn phần ở nhiệt độ 2 - 6oC, thời
gian bảo quản tối đa 42 ngày với dung dịch CPDA. Máu toàn phần lưu trữ
chứa thành phần chính là hồng cầu, máu mới thu nhận còn có tiểu cầu và một
số yếu tố đông máu; bạch cầu đoạn nhanh chóng bị huỷ và giải phóng ra các
chất trung gian; ngoài ra máu toàn phần còn chứa các bạch cầu lympho và các
yếu tố huyết tương.
1.2.2. Khối hồng cầu [31],[170]:
Khối hồng cầu là máu toàn phần đã được ly tâm và tách phần huyết tương
ở trên; tuỳ cách sản xuất mà có 5 loại khối hồng cầu sau:
+ Khối hồng cầu đậm đặc: là khối hồng cầu có hematocrit (Hct) khoảng 75%,
gồm có: hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, một ít huyết tương; bảo quản ở nhiệt độ
2 - 6°C; là chế phẩm có tính đậm đặc nên phải truyền chậm.
+ Khối hồng cầu có dung dịch bảo quản: là khối hồng cầu sau khi tách huyết
tương được trả lại dung dịch bảo quản; thành phần gồm có hồng cầu và dung
dịch bảo quản, một ít bạch cầu, lượng huyết sắc tố tương tự máu toàn phần;
bảo quản ở nhiệt độ 2 - 6°C, thời gian tối đa 42 ngày.
+ Khối hồng cầu nghèo bạch cầu: là chế phẩm máu được sản xuất từ máu
toàn phần tách huyết tương và phần buffy coast; thành phần gồm có hồng cầu
và khoảng 10% bạch cầu so với khối hồng cầu thông thường; có ưu điểm làm


5

giảm các phản ứng do bạch cầu, giảm các nguy cơ lây bệnh do tác nhân cư trú

trong bạch cầu.
+ Khối hồng cầu rửa: là máu toàn phần hoặc khối hồng cầu được ly tâm bỏ
hết huyết tương, sau đó thay thế bằng nước muối sinh lý NaCl 0,9% trộn đều,
ly tâm tiếp để rửa ba lần; thành phần gồm có: hồng cầu + nước muối sinh lý;
bảo quản ở nhiệt độ 2oC - 6°C dưới 24 giờ, ở nhiệt độ 22°C dưới 6 giờ.
+ Khối hồng cầu lọc bạch cầu và khối hồng cầu chiếu xạ: là khối hồng cầu đã
được dùng màng lọc bạch cầu hay tia xạ hoặc cả hai, bảo quản ở 2 - 6°C dưới
hai tuần từ khi chiếu xạ. Nếu dùng màng lọc rời thì sau lọc không để quá 24
giờ. Thành phần chủ yếu là hồng cầu, còn rất ít bạch cầu, bạch cầu bị bất hoạt.
Như vậy: sau khi tách huyết tương, tùy điều kiện và nhu cầu truyền trả
khối hồng cầu cho ngựa sớm hay muộn để quyết định sử dụng chống đông,
dung dịch nuôi dưỡng hồng cầu và phương pháp bảo quản, vận chuyển trên
đường đến nơi truyền trả khối hồng cầu ngựa. Nếu lấy máu ngựa vào các túi
đôi, túi ba, dung tích 450ml, việc tách huyết tương và truyền trả khối hồng
cầu ngựa sẽ đơn giản hơn lấy vào bình nhựa số lượng lớn (10 lít).
1.2.3. Khối tiểu cầu:
Tuỳ cách sản xuất, có hai loại khối tiểu cầu sau:
+ Khối tiểu cầu pool: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng cách ly tâm các túi
máu toàn phần, gạn lấy lớp buffy coast rồi ly tâm tách lấy tiểu cầu; thông
thường từ 3 - 4 đơn vị máu toàn phần cùng nhóm ABO có thể sản xuất được
một đơn vị pool tiểu cầu; khối tiểu cầu nếu chưa pool, được bảo quản ở 22°C,
lắc liên tục, thời gian từ 3 - 5 ngày; nếu đã pool qua hệ thống hở: để ≤ 24 giờ;
số lượng tiểu cầu/pool khoảng 1,5 x 1011.
+ Khối tiểu cầu máy: là khối tiểu cầu được sản xuất bằng máy tách tế bào lấy
tiểu cầu từ một người cho, thành phần có ≥ 3,0 x 1011 tiểu cầu/đơn vị, có ít
bạch cầu; bảo quản ở 22°C trong máy lắc liên tục, tối đa được 5 ngày.


6

1.2.4. Huyết tƣơng tƣơi đông lạnh:
Huyết tương tươi đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần trong
6 giờ kể từ lúc lấy máu, bảo quản đông lạnh; thành phần có albumin, globulin
miễn dịch, các yếu tố đông máu bền vững và yếu tố VIII còn khoảng 70%;
lượng huyết tương tách từ một đơn vị máu (250 ml) thường ≈ 125 - 150 ml.
Thường pool lượng huyết tương tươi của hai đơn vị máu toàn phần cùng
nhóm, dung tích khoảng 250 - 300ml. Bảo quản ở nhiệt độ - 25°C/năm, bảo
quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].
Khi sản xuất HTKNR, phải bảo quản huyết tương của nhiều đợt, được
lấy trong nhiều thời điểm khác nhau, bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 25°C để tránh
các biến tính của protein theo thời gian do nhiều yếu tố tác động bất lợi.
1.2.5. Tủa VIII (cryo):
Để huyết tương tươi đông lạnh ở 4°C, huyết tương tan ra có một phần
tủa, ly tâm thu nhận các tủa này đó là tủa lạnh yếu tố VIII (cryo); thành phần:
cryo có khoảng 2 - 3 đơn vị yếu tố VIII /ml và yếu tố V, fibrinogen; trọng
lượng phân tử yếu tố VIII khoảng 300 kD [164], lớn hơn trọng lượng phân tử
IgG (150 kD) [16] và được tách ta trong phương pháp tủa Cohn ở Fraction I,
loại bỏ phần này khi tách γ-globulin vì không cần thiết sử dụng.
1.2.6. Huyết tƣơng tƣơi đã tách tủa:
Huyết tương tươi đã tách tủa là phần huyết tương tách ra sau khi lấy tủa
ở huyết tương tươi đông lạnh, bảo quản ở - 25°C; thành phần gồm có:
albumin, globulin, một số yếu tố đông máu. Nếu sản xuất HTKNR theo
phương pháp Cohn, đây là phần cần thiết giữ lại để sản xuất do có γ -globulin.
Sản phẩm này cần bảo quản như huyết tương tươi đông lạnh: ở nhiệt độ 25°C / năm, bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn - 25°C trong hai năm [31],[170].


7

1.2.7. Huyết tƣơng đông lạnh:
Huyết tương đông lạnh là huyết tương tách từ máu toàn phần sau 6 giờ

kể từ khi lấy máu; thành phần gồm các yếu tố huyết tương,...các yếu tố đông
máu không bền vững còn lại ít; bảo quản ở nhiệt độ - 25°C, như huyết tương
tươi đông lạnh. Huyết tương để sản xuất HTKNR được sản xuất, tách chiết
theo dạng chế phẩm này.
1.2.8. Khối bạch cầu hạt:
Là chế phẩm huyết tương tách từ phần buffy-coast và pool của nhiều
người cho máu; thành phần chứa nhiều bạch cầu hạt, hồng cầu và một số tế
bào lympho và các chất do bạch cầu giải phóng; do sản xuất theo phương
pháp pool từ nhiều người cho nên nguy cơ nhiễm virus rất cao. Bảo quản: ở
nhiệt độ 22°C ≤ 24 giờ. Trong sản xuất HTKNR, chỉ cần tách huyết tương, vì
vậy cần để lại phần bạch cầu và tiểu cầu cùng với khối hồng cầu; cần truyền
lại máu ngựa sớm để ngựa đảm bảo sức khỏe, nhanh hồi phục.
1.2.9. Albumin:
Albumin là protein hình cầu, tính hòa tan cao, trọng lượng phân tử
66.500 Da, chiếm nhiều nhất trong huyết thanh; chức năng chính là duy trì 70
– 80% áp lực keo trong huyết tương và liên kết vận chuyển các chất có phân
tử nhỏ như bilirubin, hormon, steroid, acid béo, các phân tử thuốc.
Dung dịch albumin được điều chế từ huyết tương đậm đặc chứa 15 20% protein toàn phần, lượng Na+ ≤160 mmol/lít, albumin đẳng trương chứa
5% protein [163]; do trọng lượng phân tử albumin thấp, sản xuất chế phẩm
này theo phương pháp tủa Cohn sẽ thu được albumin ở Fraction V, phần tủa
Cohn cuối cùng; khi sản xuất HTKNR, cần tách chiết albumin để loại bỏ; theo
tiêu chuẩn tinh sạch protein của dược điển Việt Nam III-2002, albumin chỉ
được phép còn dạng vết, phát hiện được bằng điện di miễn dịch [7].


8

1.2.10. Gamma globulin:

Hình 1.1. Các thành phần protein khi điện di protein huyết thanh [176].

Gamma globulin (-globulin) là các lớp globulin xác định được khi điện
di protein huyết thanh; với 5 lớp -globulin là IgG, IgM, IgD, IgA, IgE; trong
đó chiếm tỷ lệ nhiều nhất là IgG, sau đó là IgM; IgD, IgA, IgE chiếm rất ít.
Năm 1940, -globulin đã được tách chiết lần đầu tiên trên thế giới.
Không lâu sau đó, globulin miễn dịch tiêm bắp (IGIM) được đưa vào sử dụng,
tạo miễn dịch thụ động dự phòng điều trị bệnh viêm gan A, bệnh vô globulin huyết (1950). Globulin miễn dịch tiêm tĩnh mạch (tức IGIV) được
sản xuất và đưa vào sử dụng năm 1970, ít đau, tác dụng nhanh hơn IGIM.
Năm 1981, Gamimune do Mile phân lập, là IGIV đầu tiên được đăng
ký ở Mỹ. Sandoglobulin của hãng Sandoz có ở thị trường năm 1984.
Gamimune được chuyển thành dạng không biến đổi năm 1986; sản phẩm này
được đổi tên thành Gamimuner N. Sau đó, một số IGIV khác được đăng ký ở
Mỹ như: Gammagard do Hyland, Polygam bởi hội chữ thập đỏ Mỹ, Iveegam
bởi Immuno, Venoglobulin - I bởi Alpha Therapeutic, Gammar-IV bởi Armor
và GammaRaas của tập đoàn RAAS (Mỹ) [167].
Năm 1991, IGIV sản phẩm dạng bột hoà tan lần đầu tiên được chấp
nhận (Venoglobulin-S). Năm 1994, sau một vụ dịch viêm gan C liên quan đến


9

Gammagard, sản phẩm điều chế dạng bột không hoà tan Gammagard và
Polygam bị đình chỉ.
Năm 1980, bệnh nhân dùng IGIV điều trị giảm -globulin huyết, xuất
huyết giảm tiểu cầu tự phát (ITP) thấy đa số gây tăng số lượng tiểu cầu. Tiếp
theo phát hiện ngẫu nhiên này, việc sử dụng IGIV cho ITP được nghiên cứu
và hiện nay nó chính thức được dùng cho chỉ định này. Kể từ khi IGIV có
hiệu quả đối với ITP, chúng tiếp tục được đánh giá trong điều trị những bệnh
khác với giả định cơ chế tự miễn. Hầu hết sử dụng IGIV đối với bệnh tự miễn
đều có hiệu quả; ví dụ bệnh Kawasaki, nhược cơ, bệnh đa thần kinh huỷ

myelin viêm mạn tính, hội chứng Guillain-Barre...
Các chỉ định -globulin được thừa nhận hiện nay gồm: suy giảm miễn
dịch tiên phát, xuất huyết do giảm tiểu cầu tự phát, bệnh Kawasaki, ngăn ngừa
nhiễm khuẩn thụ động, AIDS, bệnh nhân thực hiện ghép tuỷ xương.
Gamma globulin tiêm tĩnh mạch (IGIV) là chế phẩm có trên 95% IgG từ
huyết tương người hiến máu được tinh chế. IGIM chứa 15 - 18% protein,
trong đó IgG chiếm trên 90%. IGIM là dung dịch trong suốt hoặc hơi đục, có
thể có màu vàng nhạt hoặc nâu nhạt. Cả hai loại đều là dung dịch vô khuẩn,
không chứa chất gây sốt, gồm các -globulin chứa nhiều loại kháng thể có
mặt trong máu người bình thường.
Sau khi tiêm bắp IGIM, nồng độ IgG huyết thanh đạt đỉnh trong hai
ngày, được phân bổ nhanh và ngang nhau giữa các khu vực trong và ngoài
mạch máu. Ở những người có hàm lượng IgG bình thường, thời gian bán hủy
của IgG khoảng 23 ngày. Khi liều tiêm IGIM lớn hơn 10 ml thì phải chia ra
thành nhiều liều nhỏ để tiêm vào nhiều vị trí bắp thịt khác nhau nhằm làm
giảm đau tại chỗ và bớt khó chịu. Tổng liều một lần tiêm bắp thịt không được
vượt quá 20 ml - ngay cả đối với người lớn. Bảo quản ở nhiệt độ từ 2 - 8oC và


10

không được để đông băng. Thời hạn dùng của IGIM không được quá 3 năm
kể từ ngày xuất khỏi kho lạnh (5oC) của nhà sản xuất [31],[123].
Bảng 1.1. Các thành phần của protein huyết tương [31],[167],[176]

Globulins

Albumins

α1-antitrypsin, α2-antiplasmin, antithrombin

α1- transcortin, α2-ceruloplasmin, retinol
α-globulins
binding protein, orosomucoid, α2-macroglobulin,
haptoglobin
hormone, binding globulin, transferrin
β-globulins angiostatin, hemopexin, β-2 microglobulin, factor
H, plasminogen, properdin
-globulin

Immunoglobulins (IgG, IgM, IgA, IgD, IgE)

Loại khác

Fibronectin, macroglobulin/microglobulin,
Transcobalamin

Lòng trắng
Conalbumin, ovalbumin, avidin
trứng
Serum
Human serum albumin, bovine serum albumin,
albumin
prealbumin
Loại khác

C-reactive protein, α-lactalbumin, parvalbumin,
ricin

1.2.11. Kháng huyết thanh:
Kháng huyết thanh (KHT) là sinh phẩm chứa -globulin miễn dịch có khả

năng trung hòa kháng nguyên đặc hiệu, thu được từ huyết tương động vật
hoặc huyết tương người đã được mẫn cảm với kháng nguyên trước đó, được
tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết theo quy định và loại bỏ các
protein không cần thiết [7],[9]. Một số KHT đã được nghiên cứu, sử dụng
trong chuyên ngành Huyết học và Truyền máu:
- Anti-HBs globulin: dùng cho con của những bà mẹ có HBV (+), sản xuất từ
huyết tương người cho máu giàu anti-HBs globulin [30],[41],[173].


11

- Anti-T lymphocyte globulin: điều trị suy tủy xương, điều trị bệnh tự miễn
(sản xuất từ huyết tương thỏ gây miễn dịch) [75],[86],[97],[109].
- Anti-hairy cell serum: điều trị leucemie tế bào tóc (sản xuất từ huyết tương
thỏ gây mẫn cảm) [132].
- Anti-D globulin: điều trị huyết tán do bất đồng nhóm máu mẹ con hệ Rh,
dùng cho người mẹ Rh (-) sau khi sinh con Rh (+) [57],[74],[138],[139] và
điều trị xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) [119].
- Anti-γG globulin: điều trị đái huyết sắc tố kịch phát lạnh PNH (Paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria) [99].
- Anti-neutrophil serum (ANS): gây giảm bạch cầu đoạn trung tính (sản xuất
từ huyết tương thỏ) [127].
- Anti-thymocyte globulin: sản xuất từ huyết thanh thỏ [111].
- Antivenom (SAV): điều trị các rối loạn đông máu, DIC, tan máu,... do rắn
độc họ Viperidae cắn [33] (sản xuất từ huyết tương ngựa, dê, bò, cừu,...).
- Antiglobulin người sử dụng trong chẩn đoán (Coombs test), sản xuất từ
huyết tương thỏ, ngựa...[22].
Hiện nay lượng KHT rất thiếu hụt ở các nước nghèo do các nhà sản xuất
chỉ sản xuất KHT từ huyết tương người hoặc từ động vật tinh chế hai
bước,...giá thành tăng lên gấp nhiều lần, kèm theo là nguy cơ phải đóng cửa

các trang trại nuôi ngựa sản xuất KHT vì không đem lại lợi nhuận, do giá đắt,
do thị trường eo hẹp, do những đạo luật bảo vệ động vật không cho lấy máu,...
đã khiến việc sản xuất KHT càng trở lên kém hấp dẫn; kết quả là sự khan
hiếm về số lượng và chủng loại trên thị trường, hậu quả tất cả đổ lên người
bệnh. Để duy trì sản xuất KHT phục vụ đa số như hiện nay, chính phủ một số
nước miễn thuế cho sản xuất KHT [77], tăng cường hỗ trợ sản xuất KHT
miễn phí cho người nghèo (Thái Lan) [96],[104],[119],[160],[148], tăng
cường hỗ trợ ngân sách từ các tổ chức quốc tế, các tổ chức từ thiện để duy trì
số lượng, chất lượng các sản phẩm [153],[67],[63],[68],[149].


12

1.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CHẾ PHẨM HUYẾT TƢƠNG:
1.3.1. Phƣơng pháp tủa lạnh bằng Ethanol:
+ Phương pháp tủa Cohn:
Là phương pháp tách các thành phần máu và huyết tương bằng thay đổi
nồng độ ethanol, pH, nhiệt độ, lực ion...quy trình này còn được gọi là: quy
trình tách "tủa protein" đã biết ra khỏi các protein chưa biết trong huyết
tương; được phát minh lần đầu tiên bởi Edwin Joseph Cohn (1892-1953),
người Mỹ [169]; phát minh lúc đó đã góp phần cứu sống hàng vạn người
trong Chiến tranh thế giới thứ II; đến nay vẫn là phương pháp cơ bản trong
tách chiết các chế phẩm máu và huyết tương tại các Trung tâm Huyết học Truyền máu trên thế giới [31].
Phân đoạn huyết tương theo phương pháp Cohn thu được albumin
huyết thanh, -globulin, fibrinogen, thrombin và một số yếu tố đông máu.
Fibrinogen và các phần phân đoạn của thrombin được nghiên cứu sâu hơn,
chế tạo thành các sản phẩm fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin.
Các -globulin tìm thấy trong Fraction Cohn II, III được chứng minh có
tác dụng rất tốt trong điều trị bệnh sởi, bệnh bại liệt, điều chỉnh và ngăn ngừa
bệnh viêm gan truyền nhiễm cho những người lính trong chiến tranh thế giới

thứ hai. Fibrin keo lỏng, fibrin bọt và màng fibrin đã được sử dụng điều trị
nạn nhân bỏng, trong đó có một số nạn nhân từ cuộc tấn công tại Trân Châu
Cảng, giúp tỷ lệ ghép da thành công tăng cao. Fibrinogen keo lỏng rất hữu ích
trong kết nối dây thần kinh bị cắt đứt. Fibrin bọt và thrombin được sử dụng để
kiểm soát chảy máu, đặc biệt là trong tổn thương gan và khối u, giảm thiểu
chảy máu từ tĩnh mạch lớn cũng như đối phó với dị tật mạch máu trong não.
Màng fibrin được sử dụng để cầm máu trong các ứng dụng phẫu thuật khác
nhau, bao gồm cả phẫu thuật thần kinh, tuy nhiên, không hữu ích trong việc
kiểm soát chảy máu động mạch.


13

Sau này Martin MacPhee (Hội chữ thập đỏ Mỹ) trong đầu những năm
90, đã thử nghiệm thành công sản phẩm "Băng keo fibrin” trong quân y Mỹ;
đây là loại fibrinogen có khả năng ngăn chặn xuất huyết động mạch.
+ Phương pháp Cohn cải tiến [31]:
Để sản xuất một lượng lớn albumin, -globulin miễn dịch; nhiều nơi sử
dụng phương pháp Cohn có bổ xung điều kiện pH, nhiệt độ, lực ion, nồng độ
ethanol của môi trường tủa cho phù hợp với từng thành phần của huyết tương,
như: các cải tiến của tác giả Gerlough (1955), Hink (1957), Van Aken (1996),
Mulford , Kistler và Nitschmann, William N. Drohan....
- Phương pháp Van Aken (1996):
Fraction I (F1): sử dụng ethanol 8%, pH 7,2, - 3oC, lực ion 0,14.
Thu được F-VIII, Von - Willebrand, fibrinogen (5,1% protein).
Fraction II (F2): xử lý nước mặt bước 1, ethanol 25%,- 5oC, pH 6,9.
Thu được F-II, V, VII, IX, X và IgG, IgA, ít IgM (3% protein)
Fraction III (F3): xử lý nước mặt bước 2 bằng ethanol 18%, pH 5,2.
Thu được AT-III, bổ thể, IgM, protease inhibitor.
Fraction IV (F4): xử lý nước mặt bước 3 (IV- 1) bằng ethanol 40%, pH 5,8.

Thu được tủa IV- 2 có haptoglobin transferrin, -globulin.
Fraction V (F5): xử lý nước mặt bước 4 (IV- 2) bằng ethanol 40%, pH 5,8.
Thu được tủa V chứa albumin và -globulin (1% protein).
Nước mặt V được tủa ethanol 40%, - 3oC, pH 5,2 thu được albumin sạch.
Quy trình này cho 5 sản phẩm (Fraction I, II + III, IV- 1; IV- 2, V) trong
đó, mỗi bước lại chiết tách các sản phẩm tinh khiết hơn.
Như vậy, Gamma globulin miễn dịch có mặt trong F-II.
Sản phẩm này có thể sử dụng với dung dịch lỏng tiêm bắp cơ IGIM; để
đảm bảo an toàn và hiệu quả cao, cần sản xuất dạng tiêm tĩnh mạch IGIV. Có
nhiều phương pháp sản xuất IGIV, nhưng phương pháp sử dụng F-II Cohn


14

loại bỏ Fc của IgG được nhiều nước sử dụng có kết quả. Có thể tóm tắt
phương pháp này như sau: F-II thu được bằng phương pháp Cohn cho tác
dụng với pepsin ở pH 5; sản phẩm thu được đem thẩm tích loại bỏ Fc và
pepsin, cho sản phẩm an toàn hơn, giảm phản ứng phụ, có thể tiêm tĩnh mạch.
- Phương pháp Gerlough (1955): sử dụng ethanol 20% thay vì 40%
trong Fraction II và III, làm giảm tiêu thụ ethanol; ngoài ra, tác giả kết hợp
hai Fraction IV vào một bước, giảm số fraction yêu cầu.
- Phương pháp Hink (1957): phương pháp này năng suất cao hơn do tái sử
dụng một số các protein huyết tương bị loại bỏ trong các Fraction IV.
- Phương pháp kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol của William N. Drohan:
Phương pháp này kết hợp tủa lạnh và tủa ethanol, tách được ba thành phần
huyết tương có giá trị: tủa lạnh yếu tố VIII, fibrinogen, yếu tố VonWillebrand; IgG (F-II); albumin. Phương pháp này được Mỹ, Đức, Pháp, Italy
và nhiều nước đang phát triển sử dụng có hiệu quả, trang bị đơn giản, các sản
phẩm đạt độ tinh khiết tốt, nhất là albumin đạt trên 85%, giảm được dịch tủa
ethanol.
- Phương pháp Mulford: sử dụng Fraction II và III là bước cuối trước khi

xử lý nhiệt, kết hợp Fraction IV và V (hạn chế là albumin không tinh khiết).
- Phương pháp Kistler và Nitschmann: cung cấp albumin tinh khiết hơn,
tương tự như phương pháp Gerlough, Fraction II, III thực hiện ở nồng độ
ethanol thấp hơn 19%, pH 5,8. Fraction IV được kết tủa ở điều kiện ethanol
40%, pH 5.8 và nhiệt độ - 8oC; albumin, bị thu hồi trong Fraction V, được
tinh chế bằng cách chiết xuất ở ethanol 10%, pH 4,6 và nhiệt độ - 3oC.
Sau phát minh của Cohn, việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm máu,
chế phẩm huyết tương và truyền máu từng phần đã phát triển nhanh ở các
nước tiên tiến. Tới nay, một số nước đã tách được trên 20 sản phẩm, tập trung


15

vào các nhóm sản phẩm có hiệu quả cao trong điều trị như albumin, globulin
miễn dịch, các yếu tố đông máu.
1.3.2. Phƣơng pháp tủa bằng muối:
Phương pháp này dùng trong tinh chế IgG, mảnh kháng thể Fab, F(ab’)2.
Để thu được một thành phần protein, cần phá vỡ lớp nước liên kết xung quanh
phân tử này bằng cách bổ sung vào dung dịch protein các dung môi hoặc các
hoá chất có ái lực với nước mạnh hơn để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein
đó, giúp cho protein kết tủa. Thường sử dụng dung môi (acetone, ethanol)
hoặc muối trung tính để kết tủa protein. Sự kết tủa có tính chọn lọc: các
protein khác nhau kết tủa ở nồng độ dung môi và muối khác nhau.
Để kết tủa protein huyết tương, thường dùng nhất là ammonium
sulphate (NH4)2SO4, do muối này có mức độ hoà tan rất cao trong nước, ít
làm mất hoạt tính enzyme, thậm chí còn có tác dụng làm bền enzyme; ưu
điểm nữa là khả năng kết tủa chọn lọc protein, loại bỏ được nhiều protein
không mong muốn trong huyết tương. Lưu ý, khi sử dụng, phải bổ sung vào
huyết tương một cách từ từ, kết hợp khuấy đều để tránh khả năng tăng quá
nhanh cục bộ của nồng độ muối, làm mất tính kết tủa chọn lọc của nó, thậm

chí có thể làm biến tính một số protein kém bền. Hạn chế của phương pháp là
mất nhiều thời gian, do nồng độ ammonium sulphate cao, tỷ trọng của dung
môi lớn, để kết tủa được các protein, phải ly tâm tốc độ cao và nhiệt độ thấp,
sau đó cần loại muối khỏi chế phẩm khi chuyển sang bước tinh sạch tiếp theo.
Để loại bỏ muối và các tạp chất có phân tử lượng thấp, thường dùng biện
pháp thẩm tích đối với nước hay đối với các dung dịch đệm loãng hoặc bằng
cách lọc qua gel sephadex.
Muối (NH4)2SO4 rẻ và phổ biến, độ hòa tan lại rất lớn (bão hòa 767g/l ở
25oC); thường được sử dụng ở dạng bột rắn, cho vào huyết tương tới nồng độ
bão hoà 40-50%, ủ ở nhiệt độ, pH nhất định, trong thời gian thích hợp tùy loại


16

huyết tương của người hay động vật để đạt kết quả cao nhất. Thu IgG qua ly
tâm hoặc lọc thu tủa, hòa lại kết tủa bằng một lượng đệm tối thiểu; thẩm tích
đối với đệm trước khi dùng.
Để loại bỏ những thành phần protein không cần thiết, có thể gây biến
tính chọn lọc bằng nhiệt độ, pH. Phương pháp này thích hợp với protein chịu
acid và bền nhiệt: đưa nhiệt độ của dung dịch protein lên 50 - 70oC và pH ≤ 5;
những protein không bền nhiệt và không chịu pH thấp sẽ bị biến tính, được
loại bỏ bằng ly tâm hoặc lọc.
Khi thu hoạch các mảnh kháng thể F(ab), F(ab’)2, phải cắt Fc bằng các
enzyme pepsin hoặc papain. Đây là các protease thủy phân protein, xúc tác
cho quá trình thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Nhiệt độ có tác
dụng làm tăng tốc độ của phản ứng enzyme đến tốc độ cực đại chừng nào
enzyme chưa bị biến tính; khi nhiệt độ tăng đến 60 - 70oC, enzyme mất hẳn
hoạt tính. Các bước tinh sạch protein thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp
dưới 40oC, để hạn chế sự biến tính enzyme. Để loại bỏ các protein tạp và các
tạp chất có phân tử lượng cao khác, thường kết hợp nhiều biện pháp khác

nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của
môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các
dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi
ion), điện di, phương pháp lọc gel.
1.3.3. Phƣơng pháp sắc ký (chromatography):
Dựa trên nguyên lý trao đổi ion dùng DEAE (Diethyl amino ethyl), CM
(Carboxyl methyl), hoặc lọc qua gel sử dụng Sephacryl S - 200,...bằng
phương pháp này, độ tinh khiết của sản phẩm đạt 99%. Tuy nhiên giá rất cao,
sử dụng một khối lượng lớn dung dịch đệm (buffer), trong khi so với phương
pháp Cohn chất lượng cũng không tốt hơn là bao. Mất mát trong quá trình sắc
ký nhiều hơn, hiệu suất thấp, làm số lượng lớn sẽ khó khăn, cho nên nhiều


17

nước kết hợp các phương pháp tủa lạnh ethanol với sắc ký. Theo phương
pháp này, sau ly tâm huyết tương tươi đông lạnh có ba nhóm nguyên liệu cần
tinh khiết và chiết tách bằng phương pháp sắc ký.
+ Nhóm 1 (tủa lạnh sau ly tâm): nếu sắc ký ta thu được bốn thành phần: FVIII, fibrinnogen, F.Von Willebrand, fibronectin.
+ Nhóm 2 (nước mặt sau ly tâm): Nếu sắc ký sẽ thu được sáu thành phần: FVII, IX, XI, AT III, pascal, protease inhibitor, IgG.
+ Nhóm 3: nhóm này có hàm lượng lớn nhất được tủa bằng ethanol 40%, pH
5,8 nhiệt độ 5oC sẽ thu được albumin và -globulin, có thể tủa thêm lần hai,
với ethanol 40%, pH 4,8. Phương pháp sắc ký tuy thu được các sản phẩm khá
tinh khiết, nhưng mất mát qua các bước của quy trình cũng khá nhiều.
1.3.4. Phƣơng pháp miễn dịch hấp thụ:
Sử dụng kháng thể đơn dòng, đặc hiệu kéo các sản phẩm cần thu hoạch
ra khỏi hỗn hợp chung. Tuy nhiên chi phí cho phương pháp này quá cao nên
chỉ dùng trong phòng thí nghiệm.
1.3.5. Phƣơng pháp lọc qua màng ma trận với các vật rắn:
Gần tương tự như phương pháp sắc ký trao đổi ion. Phương pháp này

sản xuất được lượng nhưng giá trị lọc không cao, nên vấn đề chất lượng, giá
thành đầu ra là một vấn đề cần bàn tới.
Tóm lại: sản xuất  - globulin miễn dịch đặc hiệu chống nọc rắn từ
huyết tương người không khó đối với các cơ sở sản xuất chế phẩm máu của
ngành Huyết học - Truyền máu, vấn đề là người cho huyết tương chứa KT
chống nọc rắn không đủ số lượng máu để cung cấp cho sản xuất với số
lượng lớn, hiệu giá KT thấp và nhiều phiền phức khác. Vậy nên, chỉ có thể
tạo nguồn huyết tương từ ngựa theo phương pháp miễn dịch chủ động.


18

1.4. HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN:
1.4.1. Khái niệm:
HTKNR là sinh phẩm chứa các γ-globulin miễn dịch kháng nọc rắn có
khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng, thu được từ động vật hoặc từ
người đã được miễn dịch, được tinh chế để lượng globulin đạt mức cần thiết
theo quy định và để loại bỏ các protein không cần thiết [7],[9].
Thuật ngữ “antivenin” xuất phát từ tiếng Pháp “venin”, nghĩa là nọc, từ
gốc chữ Latinh “venenum”, nghĩa là chất độc “poison”. Năm 1895, thuật ngữ
antivenin bắt đầu được sử dụng, đến nay đã phổ biến khắp toàn cầu. Từ 2003,
thuật ngữ “antivenin” tiếng Pháp đã được WHO chuyển thành tiếng Anh:
“antivenom”, cả hai danh pháp đều được công nhận và sử dụng như nhau.
1.4.2. Lịch sử phát minh:
Năm 1894, Calmette, Phisalix và Bertrand báo cáo tại hội nghị khoa
học tại Paris về kết quả xác định đặc tính kháng nọc rắn hổ của huyết thanh
thỏ. Năm 1895, Albert Calmette và Le’Pinay đã chế tạo thành công HTKNR
rắn hổ đất Việt Nam từ huyết tương ngựa và sử dụng HTKNR chế tạo điều trị
cứu sống nạn nhân, lần đầu tiên trên thế giới, HTKNR được sử dụng hiệu quả
trên người (Barbara J. Hawgood, 1999)[43]. Việc gây miễn dịch cho động

vật, lấy huyết thanh trị bệnh cứu người - kiểu miễn dịch thụ động (passive
immunity), do Emil Adolf Von Behring và Shibasaburo Kitasato phát minh
năm 1890 đã được A. Calmette ứng dụng trong thực tiễn, sản xuất thành công
HTKNR [64]. Nghiên cứu, chế tạo thành công HTKNR đã mở ra một thời kỳ
mới trong điều trị tai nạn rắn độc trên trái đất. Từ đó, các nghiên cứu về
HTKNR ngày càng phát triển, ứng dụng điều trị ngày càng hiệu quả, an toàn.
HTKNR có thể ngăn chặn hoặc đảo ngược hầu hết các triệu chứng nhiễm độc


19

nọc rắn và đóng một vai trò quan trọng trong việc giảm thiểu tử vong và tàn
phế (Chippaux J.P., Goiffon M., 1992 [54], Isbister G.K., 2010) [79]. Hàng
nhiều thập kỷ trôi qua, qua tác dụng thực tiễn của HTKNR, WHO đã khẳng
định: “HTKNR là thuốc đặc trị rắn độc cắn duy nhất phổ biến khắp toàn cầu,
giải quyết một trong những vấn đề y tế còn tồn tại của thế giới”[6].
1.4.3. Cơ sở miễn dịch học:
1.4.3.1. Kháng nguyên nọc rắn:
Các độc tố nọc rắn sau khi đã được khử độc tính, bảo đảm an toàn cho
động vật gây mẫn cảm mà vẫn giữ được tính sinh miễn dịch, tính kháng
nguyên gọi là KN nọc rắn. Nọc rắn trở thành kháng nguyên do có đủ các đặc
điểm của chất sinh miễn dịch đó là tính lạ, kích thước phân tử đủ lớn, có
thành phần và tính không thuần nhất về phương diện hoá học, có khả năng
giáng hoá. Khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể thì mức độ sinh miễn dịch
phụ thuộc vào mức độ lạ. Khác biệt về di truyền càng lớn, khác biệt về kháng
nguyên giữa hai cơ thể càng nhiều. Do đó, các độc tố nọc rắn có đặc điểm thứ
nhất là hoàn toàn “lạ” với cơ thể động vật gây mẫn cảm. Các kháng nguyên
có tính sinh miễn dịch tốt thường có trọng lượng phân tử trên 100 kDa.
Những phân tử có trọng lượng phân tử thấp từ 0,5-10 kDa, có tính sinh miễn
dịch yếu. Một số trường hợp có trọng lượng phân tử < 1 kDa có tính sinh

miễn dịch rất yếu [16],[34]. Độc tố nọc rắn họ Elapidae chủ yếu là dạng
neurotoxins, là các polypeptide có kích thước nhỏ, lan truyền, hấp thụ trong
cơ thể nạn nhân rất nhanh, nhưng khi chế tạo kháng nguyên lại khó khăn do
có tính sinh miễn dịch yếu. Các phân tử không hoà tan có tính sinh miễn dịch
lớn hơn các phân tử nhỏ và hoà tan do dễ bị đại thực bào nuốt và xử lý. Vì
vậy, có thể gây ngưng tập các toxins dạng polypeptid trọng lượng phân tử nhỏ
bằng nhiệt, làm tăng tính không hoà tan của các đại phân tử, tạo thuận lợi cho
đại thực bào nuốt chúng và làm tăng tính sinh miễn dịch.


20

Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên mạnh hay yếu còn phụ thuộc tính
chất của hệ thống sinh học mà nó xâm nhập, kiểu hình di truyền của túc chủ
và cách gây mẫn cảm (liều lượng, đường vào của kháng nguyên, sử dụng các
tá chất miễn dịch hay không) [16],[19],[28]. Cấu trúc di truyền của túc chủ
ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh miễn dịch cũng như cường độ của đáp ứng.
Việc sử dụng động vật gây mẫn cảm cho hiệu quả cao cần phải lựa chọn.
Ngay cả chế độ ăn cũng cần phải đảm bảo, giúp cho sinh kháng thể tốt nhất.
Ngoài ra, bất kỳ kháng nguyên nào cũng cần sự kết hợp giữa liều lượng tối
ưu, đường vào của kháng nguyên và qui trình gây mẫn cảm, nhằm đạt đáp
ứng miễn dịch với cường độ cao nhất. Liều kháng nguyên quá thấp và liều
quá lớn kháng nguyên cũng không kích thích được đáp ứng miễn dịch vì
chúng làm cho các tế bào lympho rơi vào trạng thái không đáp ứng. Đưa
kháng nguyên vào cơ thể một lần, chỉ kích thích sinh miễn dịch với cường độ
thấp. Nếu kháng nguyên vào cơ thể lặp lại nhiều lần trong vòng thời gian vài
tuần sẽ gây đáp ứng miễn dịch với cường độ cao [16],[25].
Tá dược (adjuvant): là những chất khi được trộn với kháng nguyên, tiêm
gây mẫn cảm sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên. Sử dụng tá
dược làm tăng đáp ứng miễn dịch khi kháng nguyên có tính sinh miễn dịch

thấp hoặc khi chỉ có được một lượng nhỏ kháng nguyên. Tá dược kéo dài sự
tồn tại của kháng nguyên trong cơ thể túc chủ gây mẫn cảm. Khi tiêm kháng
nguyên + tá dược, kháng nguyên được giải phóng chậm hơn từ nơi tiêm vào
cơ thể túc chủ, thời gian tiếp xúc với kháng nguyên sẽ tăng lên [1],[2],[16].
Sự tăng kích thước của tá chất + kháng nguyên làm tăng hiệu quả đáp ứng
miễn dịch vì các đại phân tử dễ được đại thực bào nuốt hơn. Tá dược Freund
là một tá dược hay được sử dụng. Tá dược Freund hoàn toàn (Freund’s
complete adjuvant) có thêm Mycobarterium chết, hoà trong nhũ tương dầu, có
hiệu lực cao hơn tá dược Freund không hoàn toàn (Freund’s incomplete


21

adjuvant). Các dipeptide của Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào, làm
tăng hoạt động thực bào, tăng biểu lộ các phân tử MHC lớp II trên màng tế
bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1, cytokine do đại thực bào tiết
ra, là đồng kích thích tố hoạt hoá các tế bào lympho TH. Cả hoạt động trình
diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào lympho TH đều tăng
lên khi có tá chất. Một số tá dược kích thích phản ứng viêm tại chỗ và mạn
tính, thu hút các tế bào làm nhiệm vụ thực bào và lympho đến nơi có kháng
nguyên. Sự thâm nhiễm các tế bào này tại nơi tiêm tá chất dẫn đến hình thành
các u hạt. Đại thực bào tại u hạt là đại thực bào hoạt hoá, làm tăng hoạt hoá
lympho TH. Tùy từng trường hợp, khi gây mẫn cảm cho túc chủ, kháng
nguyên nọc rắn được phối hợp với các tá dược khác nhau, theo nhiều phương
pháp khác nhau, theo từng tác giả,... miễn sao hiệu quả nhất [16],[25].
1.4.3.2. Kháng thể chống nọc rắn:
Bản chất kháng thể chống nọc rắn là gamma globulin miễn dịch IgG,
đặc hiệu với kháng nguyên nọc rắn, lưu hành trong máu và bạch huyết, hoạt
động đáp ứng miễn dịch bằng cách trung hoà, loại bỏ các kháng nguyên nọc,
được tạo ra sau khi gây mẫn cảm cho động vật với kháng nguyên nọc rắn

tương ứng, đặc hiệu.
Kháng thể chống nọc rắn nhận diện và gắn một cách đặc hiệu với một
kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên. Trong phản ứng chống
độc tố nọc rắn (toxins), kháng thể chống nọc rắn gắn với độc tố, trung hòa,
làm giảm mất độc tính của độc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các độc tố trên
lên các thụ thể tế bào, giúp các tế bào của cơ thể tránh được các rối loạn do
các độc tố đó gây ra. Một cơ chế khác là hoạt hóa bổ thể. Khi hệ thống bổ thể
được hoạt hóa bởi kháng thể chống nọc rắn IgG, hiện tượng thực bào, thanh
lọc phức hợp miễn dịch và phóng thích các phân tử hóa hướng động được
diễn ra. Sau khi gắn vào kháng nguyên ở đầu biến thiên (Fab), kháng thể có


22

thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở đầu hằng định (Fc). Các tế bào NK có
thể thực hiện chức năng độc tế bào và ly giải các độc tố bị opsonine hóa bởi
các kháng thể. Tiếp xúc lặp đi lặp lại với cùng một kháng nguyên, sẽ dẫn đến
việc tạo ra kháng thể có ái lực cao hơn với kháng nguyên (thuần thục ái lực),
tạo ra các kháng thể có khả năng bám và trung hoà độc tố hiệu quả hơn
[16],[25]. Khi lượng IgG được tạo ra đã đạt số lượng cần thiết, các tế bào
lymphocyte B sử dụng một cơ chế đặc biệt gọi là phản hồi kháng thể
(antibody feedback), dập tắt các đáp ứng miễn dịch dịch thể. Tế bào plasma
chế tiết kháng thể sẽ di chuyển đến tuỷ xương, tại đây chúng tiếp tục sản sinh
ra các kháng thể ngay cả khi kháng nguyên đã được loại bỏ. Các tế bào
lymphocyte B mang trí nhớ miễn dịch không chế tiết kháng thể nhưng lưu
hành trong máu, tồn tại hàng tháng hoặc hàng năm, khi kháng nguyên tái xuất
hiện thì chúng sẽ nhanh chóng đáp ứng. Kháng thể chống nọc rắn cạp nia đa
giá là tập hợp nhiều kháng thể đặc hiệu chống rất nhiều thành phần độc tố
khác nhau; hiện nay không thể sản xuất HTKNR theo dạng sản xuất kháng
thể đơn dòng (Jose’ Maria Gutierrez, Guillermo Leon, 2003) [82],[125],[32].

1.4.4. Các giai đoạn của quy trình sản xuất HTKNR:
1.4.4.1. Chế tạo kháng nguyên nọc rắn:
Mục đích nhằm khử độc tính nọc, đảm bảo an toàn cho ngựa gây mẫn
cảm, kháng nguyên có tính sinh miễn dịch mạnh. Để chế tạo được kháng
nguyên, phải có nọc rắn chuẩn, chất lượng tốt, đại diện cho quần thể rắn độc
cần sản xuất HTKNR. Phải tuyển chọn chính xác, nhận diện đúng, phân loại
đúng loài rắn cần nghiên cứu. Tuyển chọn rắn không đại diện, HTKNR sẽ
không có tác dụng. Nọc để tạo HTKNR phụ thuộc theo mùa, vùng địa lý, đặc
tính di truyền từng loài rắn. Một số cơ sở sản xuất HTKNR dùng nọc rắn thu
được từ các quốc gia khác nhau để sản xuất HTKNR, kết quả không cao. Thí


23

dụ, Viện Nghiên cứu y học Nam Phi dùng nọc rắn Đông Phi chế tạo HTKNR
cho Tây Phi, kết quả hiệu lực kháng nọc rất hạn chế (Daltry J.C, Wuster W.,
Thorpe R.S, 1996) [20],[60]. Tuyển chọn rắn khỏe, tiến hành nuôi dưỡng cẩn
thận, giúp cho việc lấy nọc nhiều lần. Nọc rắn thu được phải sạch, không lẫn
máu, làm khô tự nhiên sau đó đông khô và bảo quản ở - 20oC. Chế tạo kháng
nguyên có nhiều phương pháp, hiện nay nhiều cơ sở thường dùng phương
pháp của Theakston RDG, sử dụng glutaraldehyde để bất hoạt độc tính nọc.
Khử độc bằng chiếu xạ hoặc nhiệt độ... có thể gây hủy hoại hoàn toàn những
kháng nguyên quan trọng, thậm chí phá vỡ cả cấu trúc protein nọc, tạo ra
những kháng thể không cần thiết, làm ra các HTKNR hiệu lực thấp.
Sau khi chế tạo được kháng nguyên, phải kiểm tra tính an toàn cho động
vật trước khi sử dụng)[13]: kiểm tra tính an toàn trên chuột lang (Safety test),
kiểm tra chí nhiệt tố trên thỏ (Pyrogen test), cấy khuẩn để xác định kháng
nguyên vô khuẩn (Sterility test). Để đánh giá được tính sinh miễn dịch,
thường phải sau hai, ba lần gây mẫn cảm. Có thể kiểm tra bằng gây mẫn cảm
trên thỏ trước khi làm chính thức.

Theo dõi đáp ứng miễn dịch sau mẫn cảm bằng thử nghiệm Ouchterlony,
ELISA, điện di miễn dịch huyết thanh đã có kháng thể và hiệu giá kháng thể
[12],[15],[22],[26][73].
1.4.4.2. Gây mẫn cảm, tạo nguồn huyết tương giàu kháng thể:
- Lựa chọn động vật: có thể chọn ngựa, lừa, dê, thỏ, chó, phôi trứng gà
[126],[129]...Dùng ngựa gây mẫn cảm, cung cấp huyết thanh đã có từ thế kỷ
trước, nhưng đến nay, nhiều trung tâm sản xuất HTKNR vẫn chọn ngựa, do
ngựa cho số lượng lớn huyết tương với giá rẻ và dễ làm, máu được lấy đều
đặn một khối lượng lớn mà không ảnh hưởng đến sức khỏe của ngựa, mang
đến hiệu quả kinh doanh cho nhà sản xuất, nhất là đối với các nước đang phát
triển, nạn nhân rắn độc nhiều, khả năng chi trả của bệnh nhân thấp. Thường


24

dùng ngựa đực trưởng thành, từ 3 - 4 tuổi, khỏe mạnh, trọng lượng 300 - 350
kg. Cứ một lít máu ngựa có thể cho 100 ml HTKNR, một con ngựa cho khai
thác huyết tương khoảng sáu năm (Lê Văn Hiệp, 2010) [159]. Cừu có đáp ứng
miễn dịch khác với ngựa, không gây phản ứng tại chỗ như ở ngựa khi dùng tá
dược Freund’s (Karlson-Stiber C., Persson H., Heath A. et al., 1997) [84].
Tuy gây mẫn cảm chỉ cần một lượng nhỏ nọc đã đạt mức kháng thể đặc hiệu
tối đa, nhưng số máu lấy chỉ được 500ml/lần với cừu lớn trưởng thành.
- Gây mẫn cảm: hiệu lực của HTKNR phụ thuộc vào hiệu giá kháng thể, tính
đặc hiệu và mức cô đặc. Vì vậy, huyết tương sản xuất cần có hiệu giá kháng
thể cao, đây là một yêu cầu quan trọng và là một vấn đề thường xuyên đặt ra
cho tất cả các nhà sản xuất. Thông thường, phải miễn dịch ngựa theo lịch
trình tăng dần lượng nọc tiêm vào cơ thể ngựa, hiệu giá kháng thể sẽ tăng theo
mỗi lần miễn dịch. Liều kháng nguyên và khoảng cách thời gian giữa các lần
tiêm kháng nguyên được xác định trước khi gây mẫn cảm, thường từ 2-4 tuần.
Tùy theo mức độ độc của nọc rắn (LD50) và kỹ thuật chế tạo kháng nguyên để

qui định liều kháng nguyên mỗi lần gây mẫn cảm cho phù hợp. Tá dược tạo
sự thuận lợi cho sự tiếp xúc giữa tế bào macrophages và tế bào lympho, hỗ trợ
hiệu quả quá trình sinh kháng thể. Huyền dịch kháng nguyên nọc rắn trong tá
dược Freund’s cũng làm giảm độc tính nọc vì nọc được giải phóng từ từ vào
cơ thể động vật mẫn cảm (Christensen, Latifi, Sawai, 1972) [20].
- Theo dõi hình thành kháng thể: trong suốt lịch trình gây mẫn cảm, theo dõi
sự hình thành kháng thể đặc hiệu, sử dụng kỹ thuật Ouchteclony, khuếch tán
hai chiều trong gel agarose1%, nếu xuất hiện các đường vòng cung tủa KN KT đặc hiệu, cho thấy đã hình thành kháng thể trong máu ngựa. Điện di miễn
dịch huyết thanh ngựa sau khi gây mẫn cảm với kháng nguyên nọc rắn để xác
định tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên.


25

1.4.4.3. Thu hoạch huyết tương giàu kháng thể:
Sau khi ngựa đã có kháng thể đặc hiệu chống nọc rắn với hiệu giá cao sẽ
lấy máu, thu huyết tương hoặc huyết thanh để sản xuất HTKNR. Theo Warrell
D.A, Theakston R.D.G (1971) tuy một số nhà sản xuất vẫn dùng huyết thanh
để sản xuất, song ngày nay đa số nhà sản xuất dùng huyết tương thu được từ
máu chống đông [20].
Dùng huyết tương có lợi điểm sớm hoàn trả được khối hồng cầu cho
ngựa, đảm bảo sức khỏe ngựa hồi phục sớm, giúp cho đáp ứng sinh kháng thể
chống nọc rắn được mạnh hơn. Ly tâm hoặc để lắng, tách khối hồng cầu để
truyền trả cho ngựa càng sớm càng tốt. Thường lấy máu vào bình thủy tinh
hoặc bình nhựa vô khuẩn chuyên dùng với thể tích lớn trên 10 lít. Hệ thống
lấy máu được thiết kế theo vòng kín để đảm bảo vô trùng, dễ khử khuẩn. Máu
lấy không được để vỡ hồng cầu, ảnh hưởng đến chất lượng huyết thanh.
Lượng máu lấy cần tính toán cân nhắc trước, tùy theo trọng lượng, sức khỏe
ngựa. Theo Lê Văn Hiệp (2010) thường lấy số lượng máu không quá 1,5%
trọng lượng cơ thể ngựa, trung bình một tháng/lần; cứ 1 lít máu ngựa cho

được ≈ 100ml HTKNR [159].
Cần chú ý an toàn cho người lấy máu khi làm việc với ngựa. Phải có các
dụng cụ chuyên dùng cố định thân mình và cổ ngựa, vừa dễ lấy máu, an toàn
cho người lấy máu.
1.4.4.4. Tinh chế huyết thanh kháng nọc rắn:
Đến nay, việc tinh chế HTKNR có thể thực hiện theo một trong ba kỹ
thuật chế tạo là IgG, F(ab’)2 và Fab [136]. Tùy điều kiện và kinh nghiệm của
nhà sản xuất, nhu cầu điều trị của từng quốc gia, từng địa phương và từng loại
nọc rắn; có thể sản xuất HTKNR ở một trong ba dạng sản phẩm trên, sau đó
tinh chế loại bỏ các thành phần khác, chỉ để lại phần đặc hiệu tác dụng với