Nghiên Cứu Thành Phần Hóa Học Trong Cao Petroleum Ether Của Cây Chỉ Thiên (Clerodendrum Indicum (L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA CÔNG NGHỆ
------------

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
TRONG CAO PETROLEUM ETHER
CỦA CÂY CHỈ THIÊN
(Clerodendrum indicum (L.) O. Ktze)

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. Lê Thanh Phước

Trần Thị Trà Mi
MSSV: 2063981
Ngành: Công Nghệ Hóa Học-Khóa 32

Tháng 11/2010


LỜI CẢM ƠN
------o0o-------

Sau gần 5 tháng làm luận văn vất vả và đầy thú vị, cuối cùng em đã đạt được những
thành công nhất định. Để đạt được những điều ấy, đầu tiên em xin gửi lời biết ơn sâu sắc
đến thầy Lê Thanh Phước, cán bộ hướng dẫn đề tài luận văn của em. Thầy đã tận tình

hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy đã giúp em có thêm
được những kiến thức mới về chuyên ngành Hóa Học Hợp Chất Thiên Nhiên, từ đó giúp
em thêm yêu nghề mình đã chọn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể quý thầy cô của bộ môn Hóa, khoa Công nghệ
đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt hơn bốn năm học tập tại trường và đã
tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp chúng em hoàn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin được gửi lời cám ơn đến cô Bùi Thị Bửu Huê và các thầy cô trong bộ
môn Hóa học, khoa Khoa học tự nhiên đã tạo điều kiện cho em được làm việc tốt nhất.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến anh Bành Nguyễn Anh Hào, học viên cao học
khóa 16 đã giúp đỡ tận tình, và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt
quá trình thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn các bạn Công nghệ hóa học và các bạn Cử nhân hóa học đã nhiệt
tình giúp đỡ em trong suốt thời gian em làm việc tại phòng thí nghiệm.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cả về
vật chất lẫn tinh thần giúp em vượt qua mọi khó khăn thử thách.
Xin chân thành cảm ơn!!!

Cần Thơ, tháng 11 năm 2010
Trần Thị Trà Mi

i


Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Khoa Công Nghệ
Bộ môn: Công nghệ hóa học

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lê Thanh Phước
2. Tên đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether của cây Chỉ thiên
(Clerodendrum indicum (L.) O. Ktze)”.
3. Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trà Mi

MSSV: 2063981

Lớp Công Nghệ Hóa Học – Khóa 32
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ..........................................................
................................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế: .......................................................................
................................................................................................................................
c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d. Kết luận, đề nghị và điểm:

................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

Cán bộ hướng dẫn

ii


Trường Đại Học Cần Thơ

Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam

Khoa Công Nghệ

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Bộ môn: Công nghệ hóa học

Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lê Thanh Phước
2. Tên đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học trong cao petroleum ether của cây Chỉ thiên
(Clerodendrum indicum (L.) O. Ktze)”.
3. Sinh viên thực hiện: Trần Thị Trà Mi

MSSV: 2063981

Lớp Công Nghệ Hóa Học – Khóa 32
4. Nội dung nhận xét:
a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp:
 Đánh giá nội dung thực hiện đề tài: ..........................................................
................................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế: .......................................................................
................................................................................................................................
c. Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
d. Kết luận, đề nghị và điểm:
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2010

Cán bộ phản biện
iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
----o0o---Cây Chỉ thiên có tên khoa hoc là Clerodendrum indicum (L.) O. Ktze. Ở Việt
Nam, cây Chỉ thiên mọc nhiều ở các tỉnh miền Tây, thường mọc hoang ở ven đường, đôi
khi được trồng làm cây cảnh trong gia đình. Các bộ phận của cây được dùng để chữa bệnh
viêm xoang mũi dị ứng, bệnh cảm sốt, hen suyễn, trừ giun,…Trong đề tài này, tôi xác
định thành phần hóa học của các hợp chất ít phân cực từ các bộ phận thân, lá và hoa của
cây Chỉ thiên.
Bằng phương pháp sắc ký cột KG 60 F254 (silica gel) kết hợp với sắc ký lớp mỏng,
chúng tôi phân lập ra được một chất sạch từ loài cây này.

iv


MỤC LỤC
----o0o----

LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN ............................................................................................. iv
MỤC LỤC ................................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. viii
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ix
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT ...................................................... x
LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................ xi
PHẦN I

TỔNG QUAN ............................................................................................ 1

1. KHÁI QUÁT VỀ NGUYÊN LIỆU .......................................................................... 2
1.1 Khái niệm về cây Chỉ thiên5,18 ............................................................................ 2
1.1.1 Đặc điểm cây Chỉ thiên ................................................................................ 2
1.1.2 Vùng phân bố .............................................................................................. 3
1.1.3 Bộ phận dùng ............................................................................................... 3
1.2 Một số bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng cây Chỉ thiên 12-17,19,20 ................... 3
1.3 Thành phần hóa học2 .......................................................................................... 4
2. CÁC KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH THÔNG DỤNG7 ................................................ 6
2.1 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng .................................................................................. 6
2.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng .................................................................................... 8
2.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt .............................................................................. 8
2.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm ............................................................................. 8

v


3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ4,9-11 ..................................... 8
3.1 Phương pháp sắc ký cột hở ................................. Error! Bookmark not defined.
3.1.1 Chọn chất hấp thu để nhồi cột ...................... Error! Bookmark not defined.
3.1.2 Chọn hệ dung môi giải ly cột ....................... Error! Bookmark not defined.
3.1.3 Kích thước cột và lượng chất hấp thu ........... Error! Bookmark not defined.
3.1.4 Nạp chất hấp thu vào cột .............................. Error! Bookmark not defined.
3.1.5 Nạp mẫu vào đầu cột.................................... Error! Bookmark not defined.
3.1.6 Theo dõi quá trình giải ly cột ....................... Error! Bookmark not defined.
3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) ................. Error! Bookmark not defined.
3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng .... Error! Bookmark not
defined.
3.2.2 Ưu điểm của sắc ký lớp mỏng ...................... Error! Bookmark not defined.
3.2.3 Công dụng của sắc ký lớp mỏng .................. Error! Bookmark not defined.

PHẦN II

THỰC NGHIỆM .................................................................................... 16

1. CÁC PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU, PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN ............... 17
1.1 Phương tiện nghiên cứu - thiết bị hóa chất ....................................................... 17
1.2 Các bước tiến hành ........................................................................................... 18
1.3 Quá trình thu hái và xử lý nguyên liệu .............................................................. 18
1.4 Định danh nguyên liệu...................................................................................... 19
2. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT CÓ TRONG CÂY ................................... 19
2.1. Alkaloid .......................................................................................................... 19
2.2 Flavonoid ......................................................................................................... 21
2.3 Glycoside ......................................................................................................... 21
2.4 Saponin ............................................................................................................ 22
vi


2.5 Steroid .............................................................................................................. 23
2.6 Tanin ................................................................................................................ 24
3. QUÁ TRÌNH TRÍCH LY, PHÂN LẬP, TINH CHẾ MẪU CHẤT TRÊN CAO
CHIẾT ....................................................................................................................... 27
3.1 Quá trình điều chế thu cao ................................................................................ 27
3.1.1 Điều chế cao EtOH .................................................................................... 27
3.1.2. Điều chế cao PE, cao EtOAc, cao Bu,… ................................................... 27
3.2 Tiến hành phân lập và tinh chế các chất trên cao PE ......................................... 30
3.3 Xác định cấu trúc của hợp chất vừa phân lập được ........................................... 34
PHẦN III

KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 36

1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 37
2. ĐỀ NGHỊ............................................................................................................... 37
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………………….38

vii


DANH MỤC HÌNH
----o0o---Hình 1

Thân, lá và hoa của cây Chỉ thiên ................................................................. 2

Hình 2

Minh họa sự phân bố của chất tan vào các pha dung môi .............................. 7

Hình 3

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng ............................................................................... 7

Hình 4

Minh họa phương pháp sắc ký cột hở ........................................................... 9

Hình 5

Mẫu cây sau phơi khô................................................................................. 18

Hình 6

Chiết ngâm dầm mẫu cây Chỉ thiên ............................................................ 19

Hình 7

Định tính alkaloid ....................................................................................... 20

Hình 8

Định tính flavonoid .................................................................................... 21

Hình 9

Định tính glycoside .................................................................................... 22

Hình 10 Định tính saponin ....................................................................................... 23
Hình 11 Định tính steroid......................................................................................... 24
Hình 12 Định tính flavonoid .................................................................................... 25
Hình 13 Dịch chiết EtOH ......................................................................................... 27
Hình 14 Lắc cao PE ................................................................................................. 28
Hình 15 Sơ đồ điều chế cao ..................................................................................... 29
Hình 16 TLC cao PE ................................................................................................ 30
Hình 17 Sắc ký cột thường cao PE ........................................................................... 30
Hình 18 Sắc ký cột phân đoạn P2 ............................................................................. 32
Hình 19 TLC phân đoạn P2.3.3................................................................................ 33
Hình 20 TLC phân đoạn P2.3.3 với 3 hệ dung môi giải ly ........................................ 34
viii


Hình 21 Cấu trúc MI01 (Stigmasta-5,22E,25-trien-3β-ol)..............................................35

DANH MỤC BẢNG
----o0o----

Bảng 1

Các hóa chất sử dụng thực hiện đề tài ......................................................... 17

Bảng 2

Kết quả định tính một số nhóm hợp chất hữu cơ ......................................... 25

Bảng 3

Kết quả sắc ký cột trên cao PE .................................................................... 31

Bảng 4

Kết quả sắc ký cột phân đoạn P2 ................................................................. 32

Bảng 5

Kết quả sắc ký cột phân đoạn P2.3 .............................................................. 33

Bảng 6

So sánh số liệu phổ 1H-NMR đo được với số liệu được công bố...................35

ix

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT
----o0o----

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR

Proton Nuclear Magnetic Resonance



Chemical shift

d

Doublet (NMR)

t

Triplet (NMR)

s

Singlet (NMR)

TLC

Thin Layer Chromatography

EtOH

Ethanol

PE

Petroleum ether (60-90)

EtOAc

Ethyl acetate

Bu

n-Butanol

MeOH

Methanol

ppm

Parts per milion

Rf

Retention factor

HPLC

High-performance liquid chromatography

x


LỜI MỞ ĐẦU
----o0o---Từ ngàn xưa, khi nền khoa học kỹ thuật chưa phát triển, những lúc đau yếu, con
người thường sử dụng những vị thuốc có nguồn gốc từ cây cỏ để chữa bệnh.
Ngày nay, khi xã hội đã phát triển, sức khỏe con người được đảm bảo bởi những
điều kiện sống tốt hơn, những phương pháp điều trị bệnh hiện đại và các loại dược phẩm
tổng hợp. Thế nhưng, con người vẫn không quên đi những vị thuốc kinh nghiệm của ông
cha vì chúng ít gây ra các tác dụng phụ gây ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người.
Vì thế, xu hướng của ngành dược hiện nay là hướng tới các sản phẩm có nguồn gốc từ
thiên nhiên và bằng chứng ngày càng có nhiều các chế phẩm dược phẩm như thế được
nhiều người ưa chuộng.
Một trong số những vị thuốc quý trong y học dân gian phải kể đến là cây Chỉ thiên.
Theo kinh nghiệm dân gian, cây Chỉ thiên thường mọc hoang, được hái về từ những bãi
đất trống, phơi khô rồi nấu lấy nước uống để trị bệnh viêm xoang mũi dị ứng, bệnh cảm
sốt, hen suyễn,…. Tuy nhiên, đó chỉ là kinh nghiệm của người xưa để lại, chưa được
chứng thực bằng căn cứ khoa học. Do đó, để góp phần giải thích bằng cơ sở khoa học
hiện đại về dược tính của loài cây này, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học
trong cao petroleum ether của cây Chỉ thiên”. Qua đó còn nhằm tìm hiểu thêm về
phương pháp cô lập các hợp chất thiên nhiên từ cây Chỉ thiên nói riêng và các loài thảo
dược nói chung.

xi


PHẦN I

TỔNG QUAN

1


1. KHÁI QUÁT VỀ NGUYÊN LIỆU
1.1 Khái niệm về cây Chỉ thiên5, 18
Tên thường dùng: Chỉ thiên, một số tài liệu còn gọi là Chỉ thiên giả, Ngọc nữ Ấn
Độ.
Tên khoa học: Clerodendrum indicum (L.) O. Ktze.
Phân loại khoa học
Giới: Thực vật
Ngành: Magnoliophyta
Lớp: Magnoliopsida
Bộ: Lamiales
Họ: Verbenaceae
Chi: Clerodendrum
Loài: C.indicum
Tên đồng nghĩa: Tube-flowers, Turk’s Turban.
1.1.1 Đặc điểm cây Chỉ thiên

Hình 1

Thân, lá và hoa của cây Chỉ thiên

Chỉ thiên là một loại tiểu mộc, cao 1-3.5 m, không nhánh hay có ít nhánh. Lá
mọc chụm 3-5 lá, phiến lá hẹp dài đến 20 cm, không lông, cuống ngắn, ở mắt có một
2

hàng lông to nối liền cuống. Hoa nằm ở ngọn hay nằm đơn độc ở nách lá. Hoa có màu
trắng, đài hoa dài 1.5 cm, có tuyến ở trong, vành dài đến 19 cm, 5 tai đều, tiểu nhụy có
chỉ đỏ, không lông. Quả cứng, có màu lam đen.
1.1.2 Vùng phân bố
Cây Chỉ thiên thường mọc dựa theo lộ, đất hoang, thường mọc nhiều ở các tỉnh
miền Tây. Cây còn phân bố nhiều ở các nước như Ấn Độ, Mianma, Nam Trung Quốc,
Lào, Campuchia, Thái Lan và Malaysia.
1.1.3 Bộ phận dùng
Bộ phận sử dụng gồm rễ, thân, lá. Thường hái về rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô rồi
sử dụng.
1.2 Một số bài thuốc y học cổ truyền có sử dụng cây Chỉ thiên 12-17, 19, 20
Theo y học dân gian thì cây có vị đắng, tính mát, có tác dụng bổ đẳng, thông khí,
hạ đờm, tiêu viêm, trừ giun.
 Trị viêm xoang mũi dị ứng
Toàn cây Viễn chí 12 g, lá hoặc quả Từ bi biển (viticis Rotundifoliae) 10 g, lá
cây Chỉ thiên (Clerodendrum indicum (L.)) 10 g. Tất cả đem nấu với 600 ml nước đến
khi sắc lại còn 200 ml chia 2 lần uống/ngày. Đơn thuốc này dùng liên tục 7-10 ngày,
nghỉ 7 ngày rồi tiếp tục liệu trình.
 Chữa viêm phế quản cấp tính
Tía tô 12 g, lá Hẹ, Kinh giới, mỗi vị 10 g, Bạch chỉ, rễ Chỉ thiên, mỗi vị 8 g,
Xuyên khung, Trần bì, mỗi vị 6 g. Sắc uống ngày một thang.
 Chữa cảm mạo, sốt cao, ho
Ngày dùng 16-20 g cây khô, hoặc 50 g cây tươi sao vàng, sắc uống.
 Chữa cảm sốt
Bài 1: Chỉ thiên, lá Cối xay mỗi vị 40 g; Bạc hà, Cam thảo đất mỗi vị 20 g, Gừng
3 lát. Tất cả dùng tươi sắc uống.
Bài 2: Chỉ thiên, Sắn dây, Rau má, lá Chanh, Cam thảo đất mỗi vị 30 g; nếu ra
nhiều mồ hôi thêm lá Tre 1 nắm. Sắc uống nguội.
3

 Trị ho cho trẻ em khi thời tiết thay đổi
Cây Sồi nước (Tinh lang), rễ cây Chỉ thiên, cây Tía tô, các vị trên phơi khô, sắc
uống.
 Chữa đau lưng, đau khớp
Ớt chín 15 quả, lá Đu đủ 3 lá, rễ Chỉ thiên 80 g, tất cả giã nhỏ ngâm cồn với tỉ lệ
½, xoa bóp sẽ mau khỏi.
 Ngoài ra cây Chỉ thiên còn được dùng để chữa các bệnh như
Dùng làm thuốc chữa cảm gió, cam tẩu mã, hen suyễn. Lá dùng làm thuốc trị
giun; còn dùng phối hợp với Trang đỏ, tán bột cuốn như điếu thuốc lá để hút trị mũi có
mủ.
 Ở Ấn Độ, người ta dùng rễ cây làm thuốc trị hen suyễn, ho và bệnh lao hạch.
Nhựa cây dùng trị bệnh thấp khớp do giang mai. Dịch lá trộn với sữa lỏng dùng làm
thuốc đắp trị phát ban do nấm và bệnh chốc lở (pemphigut). Lá cũng được dùng làm
thuốc trừ giun.
1.3 Thành phần hóa học2
Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Clerodendrum. Thành
phần hóa học chủ yếu của chi này gồm có phenolic, flavonoid, terpenoid và steroid.
Hiện nay, ở Việt Nam hiện vẫn chưa có tài liệu ngiên cứu nào về Clerodendrum
indicum (L.). Một số nghiên cứu về loài cây này ở nước ngoài đã được công bố gồm
có:
 Năm 1997, Tain và các cộng sự đã cô lập được nhóm chất cleroindicin A-F từ
các phần trên mặt đất của cây Clerodendrum indicum (L.).

4


OH
O
HO

OH
O

Cleroindicin A

Cleroindicin B
R2

O

R1

R3

Cleroindicin C: R1 = O, R2 = β-OH, R3 = β-H
Cleroindicin D: R1 = O, R2 =  -OH, R3 =  -H
Cleroindicin E: R1 =  -OH, β-H, R2 =  -OH, R3 =  -H
OH

O

O
H

Cleroindicin F

Nhóm chất cleroindicin A-F là nhóm có hoạt tính kháng ung thư, thuộc nhóm
phenolic. Cây Clerodendrum indicum được chiết với cao cồn, sau đó loại béo bằng PE,
phần còn lại sau khi loại béo được đem đi tiến hành sắc ký sẽ thu được Cleroindicin.



Năm 1973, Sankara Subramanian, Ramachandran Nair và năm 1993,

Gunasegaran cùng với những cộng sự đã cô lập được một số chất thuộc nhóm flavonoid
gồm hispidulin, scutellarein, scutellarein-7-O-β-D-glucuronide từ hoa của cây
Clerodendrum indicum (L.).
Hispidulin có đặc tính giảm chứng động kinh, an thần, chống oxy hóa, kháng
sinh. Chiết cao EtOH bằng EtOAc. Pha hữu cơ được hòa tan lại với EtOH, phần không
tan đem sắc ký pha đảo với hệ dung môi (chloroform/MeOH/n-propanol/nước) để thu
được hispidulin tinh khiết.

5


R3
R2

O

R1
OH

O

Hispidulin: R1 = OMe, R2 = OH, R3 = H
Scutellarein: R1 = R2 = OH, R3 = H

OH
OH

CO2 H
OH

O

OH

O

O

H
OH

OH

O

Scutellarein-7-O-β-D-glucuronide

2. CÁC KỸ THUẬT CHIẾT TÁCH THÔNG DỤNG7
2.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng
Cao alcol thô ban đầu chứa nhiều loại hợp chất từ không phân cực đến rất phân
cực. Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng được dùng để phân chia cao alcol thô thành những phân
đoạn có tính phân cực khác nhau.
Nguyên tắc của sự chiết là dung môi không phân cực (ví dụ như PE,…) sẽ hòa
tan tốt những hợp chất có tính không phân cực, dung môi phân cực trung bình (ví dụ
như diethyl ether, chloroform,…) hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cực trung bình,
dung môi phân cực mạnh (ví dụ như MeOH,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính
phân cực mạnh.

Việc chiết lỏng-lỏng được thực hiện trong bình lóng, chiết lần lượt từ dung môi
hữu cơ kém phân cực đến dung môi phân cực ví dụ như PE, ether ethyl, chloroform,
EtOAc, n-butanol,…Với từng loại dung môi, tiến hành chiết đến khi nào không còn
chất hòa tan vào dung môi thì đổi sang chiết với loại dung môi khác. Việc chiết được
tiến hành nhiều lần, mỗi lần dùng một lượng nhỏ thể tích dung môi.
6


(1)
Hình 2

(2)

(3)

Minh họa sự phân bố của chất tan vào các pha dung môi.

1)

Trước khi tiến hành lắc, pha nước và pha hữu cơ chưa phân bố vào nhau.

2)

Lắc bình lóng, khuấy trộn 2 pha.

3)

Sau khi lắc, để yên 1 thời gian sẽ xuất hiện hiện tượng phân chia pha, pha

có tỷ trọng cao nằm dưới, pha có tỷ trọng thấp nằm phía trên.

Pha có tỷ trọng thấp
Pha có tỷ trọng cao

Hình 3

Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

2.2 Kỹ thuật chiết rắn-lỏng
2.2.1 Kỹ thuật chiết ngấm kiệt
 Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình trụ đứng, đáy bình có
van khóa, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dịch chiết. Phía trên bình ngấm kiệt là
bình lóng để chứa dung môi tinh khiết.

7


 Thực hành: bột cây được xay thô, lọt được qua lỗ rây 3 mm. Mẫu không nên to
hơn vì sẽ chiết không kiệt, còn mẫu nếu xay quá mịn hoặc có tính nhầy nhụa hoặc có
tính trương nở sẽ cản trở dòng chảy. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông thủy
tinh và một tờ giấy lọc. Bột cây được đặt lên trên lớp bông thủy tinh, đến gần đầy
bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi
thủy tinh để dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi vào bình
đến khi dung môi phủ xấp xấp phía trên lớp mặt.
 Để yên một thời gian (thường là 12-24 giờ). Mở khóa bình ngấm cho dịch chiết
chảy ra, đồng thời mở khóa bình lóng để dung môi chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều
chỉnh sao cho vận tốc dung môi chảy vào bằng với vận tốc dịch chiết chảy ra khỏi bình
ngấm.
 Hiệu quả của phương pháp: phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn
nhưng hiệu quả lại cao hơn và ít mất công hơn phương pháp ngâm dầm, vì đây là quá

trình chiết liên tục, dung môi trong bình ngấm kiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ liên tục
được thay thế bằng dung môi tinh khiết
2.2.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm
Kỹ thuật này không đòi hỏi thiết bị phức tạp nên có thể dễ dàng thao tác với một
lượng lớn mẫu cây. Ngâm bột cây trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy. Dung môi
tinh khiết được rót vào bình cho đến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt
độ phòng trong 24 giờ, để dung môi thấm vào cấu trúc tế bào thực vật và hòa tan các
hợp chất tự nhiên. Đem lọc dịch chiết và cô quay thu hồi dung môi, ta được cao chiết.
Lặp lại quá trình trên cho đến khi chiết kiệt mẫu cây.
Ngoài các phương pháp chiết cổ điển trên, còn có những phương pháp chiết hiện
đại khác như: chiết bằng máy chiết Soxhlet, máy chiết Kumagawa, chiết lôi cuốn theo
hơi nước, chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn…

3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ4, 9-11
Sự sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất ra
riêng thành từng loại đơn chất, dựa vào tính ái lực khác nhau của những loại hợp chất
đó với một hệ thống gồm hai pha: một pha động và một pha tĩnh.

8


Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí hay
lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn. Dựa vào trạng thái tập
hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (Gas
Chromatography- GC) và sắc ký lỏng (Liquid Chromatography). Dựa vào cơ chế trao
đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc ký
thành các nhóm nhỏ hơn: sắc ký hấp thu, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel,…
Có rất nhiều phương pháp sắc ký khác nhau, tuy nhiên trong điều kiện phòng thí
nghiệm, phương pháp sắc ký chủ yếu được sử dụng là phương pháp sắc ký cột hở và
sắc ký lớp mỏng.

3.1 Phương pháp sắc ký cột hở

Hình 4

Minh họa phương pháp sắc ký cột hở

Phương pháp này được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là
những hạt hấp thu có kích thước 50-150 µm được nạp trong một cột bằng thủy tinh.
Mẫu chất cần phân tích được cho vào phía trên bề mặt chất hấp thu. Dung môi giải ly
được cho vào ở đầu cột, tiến hành quá trình rửa giải. Phương pháp này có hiệu quả
tách chậm so với sắc ký lỏng hiệu nâng cao, tuy nhiên pha tĩnh sử dụng trong sắc ký
và dụng cụ thí nghiệm tương đối rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn
mẫu chất.

9


3.1.1 Chọn chất hấp thu để nhồi cột
Tùy thuộc vào tính phân cực của mẫu chất cần phân tích mà ta chọn chất hấp thu
phù hợp. Với những hợp chất rất phân cực, nên nên sử dụng sắc ký trao đổi ion hoặc
sắc ký lọc gel. Còn bình thường thì sử dụng sắc ký hấp thu.
3.1.2 Chọn hệ dung môi giải ly cột
Trước khi tiến hành sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò
tìm hệ dung môi giải ly cho phù hợp.
Đối với mẫu cao thô chiết xuất từ cây cỏ (cao có chứa nhiều hợp chất có tính
phân cực khác nhau) thì chọn dung môi giải ly đầu tiên là dung môi có thể đẩy vết ít
phân cực nhất của cao chiết lên vị trí ở bảng mỏng là Rf = 0.5 và chọn dung môi chấm
dứt sắc ký cột là dung môi có thể đẩy vết phân cực nhất của cao chiết lên vị trí Rf =
0.2.
Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp, có thể áp dụng hệ dung môi này cho

sắc ký cột, tuy nhiên phải chỉnh tỷ lệ dung mội của sắc ký cột sao cho có tính kém
phân cực một ít so với hệ dung môi đã chọn vì chất hấp thu trên bản mỏng có độ chặt
chẽ lớn hơn chất hấp thu trong cột.
Muốn tăng tính phân cực cho bất kỳ một dung môi giải ly nào, nhất thiết phải
tăng chậm: thêm mỗi lần vài phần trăm một dung môi mới có tính phân cực hơn vào
dung môi cũ đang sử dụng. Ví dụ đang giải ly với hexan, muốn chuyển sang benzene,
sẽ pha benzene vào hexan theo tỷ lệ 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 50% và 100%
benzene…Các kết quả nghiên cứu thực nghiệm cho thấy các dung dịch với nồng độ
1%, 2%, 3%, 5%, 10% có tính phân cực tăng theo lượng dung môi phân cực cho thêm
vào, còn các dung dịch 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% lại có tính phân cực
tăng lên rất ít, gần như tương đương nhau. Do đó việc giải ly với các nồng độ như thế
rất mất thời gian.
Nếu tăng tính phân cực nhanh, đột ngột sẽ làm gãy cột. Do alumin hay silisa gel
khi trộn với bất kỳ một loại dung môi nào cũng tạo ra nhiệt, nhiệt này làm dung môi
bốc hơi một cách cục bộ, tạo nên bọt khí làm nứt gãy cột. Cột gãy sẽ làm mất đi tính
liên tục của chất hấp thu vì thế không tách tốt được.

10


3.1.3 Kích thước cột và lượng chất hấp thu
Các khảo sát thực nghiệm cho thấy muốn tách chất tốt thì tỷ lệ chiều cao chất hấp
thu : đường kính cột vào khoảng 10:1. Lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần
trọng lượng của mẫu cần sắc ký.
3.1.4 Nạp chất hấp thu vào cột
Có hai cách nạp chất hấp thu vào cột: nạp sệt và nạp khô.
 Nạp sệt: cho chất hấp thu ở dạng khô vào becher chứa một lượng dung môi gấp
5-10 lần lượng chất hấp thu, mỗi lần cho vào một ít, đồng thời khuấy đều. Tránh
trường hợp cho vào một lúc lượng lớn chất hấp thu hay cho dung môi vào chất hấp
thu, vì điều này sẽ làm cho chất hấp thu trương nở nhanh, không đồng đều, sinh nhiệt

cục bộ, gây ra hiện tượng không đồng nhất trong cột, dẫn đến gãy cột, nứt cột.
Chất hấp thu dạng sệt này được cho vào cột có sẵn dung môi. Dung môi chảy ra
ở phía dưới cột sẽ được rót trả lại đầu cột. Tiếp tục rót chất sệt vào đến hết, vừa rót vừa
dùng một thanh cao su gõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đều trong
cột.
 Nạp khô: cột được đổ đầy dung môi, mở khóa cho dung môi chảy ra chầm
chậm bên dưới, đồng thời cho từng ít một chất hấp thu ở dạng bột vào đầu cột. Cùng
lúc đó dùng thanh cao su gõ nhẹ vào thân cột. Khi chất hấp thu đạt chiều cao hợp lý thì
ngưng không cho thêm vào nữa. Sau đó cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần để
ổn định cột.
3.1.5 Nạp mẫu vào đầu cột
Có hai cách nạp mẫu vào cột: nạp mẫu ở dạng dung dịch và nạp mẫu ở dạng bột
khô.
 Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch
Nếu mẫu ở dạng lỏng, có thể cho trực tiếp mẫu lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu ở
dạng rắn, hòa tan vào một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi khởi đầu cho sắc ký cột.
Cần lưu ý dung dịch mẫu có nồng độ càng đậm đặc càng tốt.
Quá trình nạp mẫu tiến hành như sau: mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột.
Khi mức dung môi vừa sát với mặt thoáng của chất hấp thu trong cột thì khóa cột lại,
11


nạp ducng dịch mẫu vào đầu cột. Sau đó mở khóa cho dung môi chảy ra khỏi cột, làm
cho mẫu được thấm hết vào chất hấp thu trên đầu cột. Cần chú ý không cho bề mặt
chất hấp thu ở đầu cột bị khô. Tiếp theo dùng pipette cho nhè nhẹ một lương dung môi
mới lên đầu cột. Sau đó cho thêm lên mặt thoáng của cột một lớp cát, hay bông gòn,
bông thủy tinh,…để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào cột để bắt đầu quá
trình giải ly.
 Nạp mẫu chất ở dạng bột khô
Nếu chất mẫu không tan trong dung môi loại dung môi lựa chọn để bắt đầu quá

trình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phân cực, thay vì phải hòa tan mẫu trong
dung môi phân cực có thể ảnh hưởng vào quá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.
Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (X g) được hòa tan
trong dung môi như EtOAc hoặc MeOH (50X g), cho thêm vào silica gel cỡ hạt lớn
(10X g). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khi có bột silica gel khô, bấy giờ,
mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt của những hạt silica gel.
Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu
quá trình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel. Cho một lớp cát dầy khoảng
3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệ mặt cột. Cuối cùng cho
dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá trình giải ly.
3.1.6 Theo dõi quá trình giải ly cột
Với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, quá trình giải ly bằng sắc ký cột có thể
theo dõi bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau, đang
tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng, khi được giải ly ra khỏi cột.
Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dung dịch giải ly cũng
trong suốt không màu, phải theo dõi bằng những cách khác nhau.
Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ có đánh
số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau. Nên pha một lượng lớn dung môi giải ly
để hạn chế sai lệch nồng độ trong mỗi lọ.
Dung dịch trong những lọ hứng sẽ được sắc ký lớp mỏng trên cùng một bản
mỏng. Những lọ nào có kết quả sắc ký lớp mỏng giống nhau sẽ được gom chung lại
với nhau thành một phân đoạn. Đuổi dung môi các phân đoạn này sẽ cho cao của phân
đoạn đó.
12


3.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
3.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu
vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung

môi di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, ví dụ như silica gel,
hoặc oxyt nhôm. Pha tĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền
phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành
một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng.
 Bình sắc ký: một chậu, hủ, lọ…bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng có nắp đậy.
 Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, ví dụ như
silica gel, alumin…được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như
tấm kiếng, tấm nhôm, hoặc tấm placstic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ canxi sunfat
khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ.
 Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là một hỗn hợp gồm nhiều
hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1 µl dung dịch mẫu với nồng độ
loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía
trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình.
 Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai hay nhiều dung môi, di chuyển chầm
chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi
lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với mỗi
vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc
vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh
(hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi.
Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di
chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm.
 Dung môi giải ly: nên chọn loại dung môi rẻ tiền, vì phải cần một lượng lớn, có
độ tinh khiết cao, tránh có các vết kim loại. Dung môi không được quá dễ bay hơi, ví
dụ như ethyl ether, nhiệt độ sôi xấp xỉ 35C, gần bằng nhiệt độ của phòng thí nghiệm
vào mùa nóng (miền nam Việt Nam). Dung môi dễ bay hơi sẽ dễ dàng bay đi khỏi tấm
lớp mỏng sau khi giải ly.
Một mẫu chất cần phân tích có chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khả năng tách riêng
các hợp chất này bằng sắc ký lớp mỏng tùy thuộc vào tỷ lệ phân phối của các hợp chất
13