Xác định rhodamine b trong thực phẩm bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC sử dụng detector UV VIS
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.14 MB, 91 trang )
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
1
HPLC
High performance
liquid chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
2
UV
Vùng tử ngoại
3
Vis
Vùng khả kiến
4
ADN
5
LC- MS
Sắc ký lỏng khối phổ
6
SPE
Cột chiết pha rắn
7
TLC
Sắc ký bản mỏng
8
MSD
Detectơ khối phổ
9
DAD
10
NP- HPLC
Sắc ký hấp phụ pha
thường
11
RP- HPLC
Sắc ký hấp phụ pha đảo
12
Ex- HPLC
Sắc ký trao đổi ion
13
Gel- HPLC
Sắc ký rây phân tử
14
TCVN
Tiêu chuẩn Việt Nam
15
SD
Độ lệch chuẩn
16
LOD
Limit of detection
Giới hạn phát hiện
17
LOQ
Limit of quanlity
Giới hạn định lượng
Acid dedonucleoic
Diod array
Điốt array
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Danh môc b¶ng
Bảng 3.1. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector
đối với hệ dung môi 75% metanol-25% nước................................................................... 25
Bảng 3.2. Diện tích và chiều cao của pic phụ thuộc vào bước sóng detector
đối với hệ dung môi 85% axetonitril- 15% nước (0,005M natri 1heptansunfonat)................................................................................................................................ 27
Bảng 3.3. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động.............................31
Bảng 3.4. Hệ số dung tích phụ thuộc vào thành phần pha động.............................37
’
Bảng 3.5. Sự phụ thuộc k vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 40
’
Bảng 3.6. Sự phụ thuộc k vào giá trị pH của dung dịch đệm trong pha động 43
Bảng 3.7. Hệ số dung lượng ki’ phụ thuộc vào nồng độ trietylamin ................ 45
Bảng 3.8. Diện tích píc phụ thuộc vào nồng độ natri heptansunfonat ............ 48
Bảng 3.9. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .... 51
Bảng 3.10. Diện tích píc của Rhodamine B phụ thuộc vào tốc độ pha động .. 54
Bảng 3.11. Diện tích píc sắc ký phụ thuộc vào nồng độ Rhodamine B ........... 58
Bảng 3.12. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,1ppm ............................... 65
Bảng 3.13. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 0,5ppm ............................... 66
Bảng 3.14. Độ chính xác của phép đo ở nồng độ 1,0ppm ............................... 67
Bảng 3.15. Độ lặp lại của các phép đo tại các nồng độ .................................. 69
Bảng 3.16. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới hàm lượng Rhodamine B ....... 70
Bảng 3.17. Ảnh hưởng của dung môi chiết tới diện tích píc Rhodamine B ..... 72
Bảng 3.18. Kết quả phân tích mẫu hạt dưa ..................................................... 75
Bảng 3.19. Kết quả phân tích mẫu bánh xu xê ................................................ 77
Bảng 3.20. Kết quả phân tích mẫu siro dâu .................................................... 79
Bảng 3.21. Kết quả phân tích mẫu nước ngọt hương dâu ............................... 81
91
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.................15
Hình 3.1. Phổ hấp thụ ánh sáng của dung dịch chuẩn rhodamine B......................... 23
Hình 3.2. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B phụ thuộc vào bước sóng của
detectơ......................................................................................................................................................... 26
Hình 3.3. Diện tích píc sắc ký của rhodamine B................................................................... 28
Hình 3.4. Sắc ký đồ của Rhodamine B ở các cột tách khác nhau................................29
Hình 3.5. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % MeOH trong pha động...................................... 32
Hình 3.6. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau.............34
Hình 3.7. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần ACN khác nhau.......................35
Hình 3.8. Sự phụ thuộc k’ vào tỷ lệ % ACN trong pha động........................................... 37
Hình 3.9. Sắc đồ píc sắc ký tại các tỷ lệ thành phần pha động khác nhau.............39
Hình 3.10. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm.................................... 41
Hình 3.11. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhauđối với pha động MeOH-đệm42
Hình 3.12. Sự phụ thuộc ki’ vào giá trị pH của dung dịch đệm.................................... 43
Hình 3.13. Sắc đồ pic sắc ký tại các pH khác nhau............................................................ 44
Hình 3.14. Sự phụ thuộc của hệ số dung lượng vào nồng độ TEA..............................46
Hình 3.15. Sắc đồ píc sắc ký của các Rhodamine B với các nồng độ TEA.............47
Hình 3.16. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào nồng độ natri heptansunfonat.....49
Hình 3.17. Sắc đồ píc sắc ký của Rhodamine B với các nồng độ................................ 50
Hình 3.18. Sự phụ thuộc của diện tích píc sắc ký vào tốc độ pha động...................52
Hình 3.19. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động............................... 53
Hình 3.20. Sự phụ thuộc của diện tích pic vào tốc độ pha động.................................. 54
Hình 3.21. Sắc đồ sắc ký tại các tốc độ khác nhau của pha động............................... 56
Hình 3.22. Đường chuẩn theo diện tích pic trong khoảng nồng độ............................ 59
Hình 3.23 Sắc đồ píc sắc ký tại các nồng độ khác nhau của Rhodamine B...........61
Hình 3.24. Sắc đồ píc sắc ký mẫu chuẩn Rhodamine B tại các nồng độ.................63
Hình 3.25. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,1ppm..................................... 66
Hình 3.26. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 0,5ppm..................................... 67
Hình 3.27. Sắc đồ pic sắc ký sau 8 lần đo tại nồng độ 1,0ppm..................................... 68
Hình 3.28. Sắc đồ píc sắc ký mẫu hạt dưa với các dung môi chiết............................. 71
Hình 3.29 Sắc đồ píc sắc ký Rhodamine với các tỷ lệ dung môi chiết.......................73
Hình 3.30. Đường chuẩn (a) và sắc đồ (b) khi thêm chuẩn đối với mẫu hạt dưa75
Hình 3.31. Đường chuẩn và sắc đồ khi thêm chuẩn đối với mẫu bánh xu xê........78
Hình 3.32. Đường chuẩn(a) và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu siro..........80
Hình 3.33. Đường chuẩn (a)và sắc đồ (b)khi thêm chuẩn đối với mẫu nước ngọt82
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
MỞ ĐẦU
Khi xã hội ngày càng phát triển thì vấn đề sức khoẻ của con người ngày
càng được chú trọng, trong đó vấn đề an toàn thực phẩm và vệ sinh môi trường
được đặt lên hàng đầu vì nó có ảnh hưởng trực tiếp đến sức khoẻ của con người.
Sự tồn dư của các chất độc hại có trong thực phẩm đang là vấn đề đáng lo ngại
đối với người tiêu dùng. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật,
nhiều kỹ thuật phân tích mới, hiện đại đã được áp dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau đặc biệt trong đánh giá, kiểm định các chất độc trong thực phẩm.
Trong quá trinh chế biến thực phẩm, để tạo cho thực phẩm màu sắc đẹp,
bắt mắt, người ta sử dụng phẩm màu công nghiệp. Phẩm màu công nghiệp nói
chung, rhodamine B nói riêng đều độc hại, bị cấm sử dụng trong thực phẩm vì
khó phân huỷ, ảnh hưởng đến gan, thận hoặc tồn dư lâu ngày gây độc hại đến cơ
thể con người, đặc biệt có thể gây ung thư. Phẩm màu thực phẩm và tự nhiên có
độ bền kém hơn, lại đắt hơn phẩm màu công nghiệp. Do vậy nhiều người đã lạm
dụng phẩm màu công nghiệp mặc dù chất này đã bị cấm sử dụng trong thực
phẩm. Vì vậy việc nghiên cứu xác định hàm lượng của các rhodamine B là vấn
đề cần thiết để bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.
Tuy nhiên, ngoài sự có mặt của rhodamine B còn có các thành phần hoá
học khác có trong phẩm nhuộm như Sudan- I, Sudan- IV,…Phương pháp tối ưu
nhất để xác định rhodamine B là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đây là một
phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong những năm gần đây. Nó được áp
dụng để tách nhận dạng và xác định hàng loạt các hợp chất mà một số phương
pháp khác gặp nhiều khó khăn như các hợp chất không bền với nhiệt, các hợp
chất có tính chất hoá học tương tự nhau,…Phương pháp HPLC cũng có nhiều ưu
1
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
điểm mà các phương pháp khác không có như: xác định đồng thời được nhiều
chất, tốn ít mẫu, thao tác đơn giản,…
Trong phân tích bằng phương pháp HPLC có hai loại cột tách thường sử
dụng là cột trao đổi ion và cột tách pha đảo. Trong luận văn này, chúng tôi sẽ tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình tách và xác định hàm
lượng của rhodamine B trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) ghép nối detetor UV- Vis. Phương pháp này có độ
chọn lọc cao, độ nhạy tốt và được trang bị ở nhiều cơ sở kiểm nghiệm ở nước ta,
có tính khả thi và tính ứng dụng thực tế cao. Phân tích một số mẫu thực phẩm
như hạt dưa, bánh xu xê, mứt, …và các mẫu thực phẩm khác nhằm đánh giá hàm
lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm này. Dựa trên các kết quả nghiên
cứu về phân tích hàm lượng rhodamine B trong các mẫu thực phẩm mà có thể
đánh giá vấn đề an toàn thực phẩm của các cơ sở sản xuất.
2
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Chƣơng 1: TỔNG QUAN
1.1.
Một vài nét về rhodamine B
1.1.1. Công thức cấu tạo
Rhodamine B là một hợp chất hóa học, là một thành phần của phẩm màu
công nghiệp.
Công thức phân tử là C28H31ClN2O3
Phân tử khối là 479,02g/mol.
Công thức cấu tạo của rhodamine B
[9-(2-carboxyphenyl)-6-diethylamino-3-xanthenylidene]-diethylammonium chloride
1.1.2. Tính chất vật lý
Rhodamin B là những tinh thể màu tối có ánh xanh hay ở dạng bột màu
nâu đỏ. Nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 2100 C đến 2110C
Rhodamine B là một thuốc nhuộm lưỡng tính, độc hại, tan tốt trong
methanol, ethanol, nước (khoảng 50 g/l). Dung dịch nước và rượu etylic có màu
đỏ ánh xanh nhạt phát huỳnh quang màu đỏ mạnh, đặc biệt rõ trong các dung
dịch loãng. Dung dịch nước hấp thụ cực đại với ánh sáng có = 526 và 517 nm.
3
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
1.1.3. Tính chất sinh học
Rhodamine B gây độc cấp và mãn tính. Qua tiếp xúc, nó gây dị ứng hoặc
làm mẩn ngứa da, mắt,... Qua đường hô hấp, nó gây ho, ngứa cổ, khó thở, đau
ngực. Qua đường tiêu hóa, nó gây nôn mửa, có hại cho gan và thận. Nếu tích tụ
dần trong cơ thể nó gây nhiều tác hại đối với gan, thận, hệ sinh sản, hệ thần kinh
cũng như có thể gây ung thư [17,21]. Thực nghiệm trên chuột cho thấy
rhodamine B gây ung thư với liều lượng 89,5mg/kg qua đường uống hoặc tiêm
vào tĩnh mạch [21], khi rhodamine B đi vào cơ thể có thể chuyển hóa thành amin
thơm tương ứng có phần độc hại hơn loại rhodamine B thường, gây ung thư và
phát triển khối u dạ dầy. Tại đây rhodamine B và dẫn xuất của nó sẽ tác động
mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào gây ung thư gan, vì gan là cơ
quan tạng đầu tiên lọc chất rhodamine B [29]. Một số thực nghiệm khác cho thấy
rhodamine B tác động phá vỡ cấu trúc ADN và nhiễm sắc thể khi đưa vào nuôi
cấy tế bào [24,19].
1.1.4. Ứng dụng
Rhodamine B thường được sử dụng trong nước để xác định tốc độ và
hướng của dòng chảy vận chuyển [22].
Được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng công nghệ sinh học như kính
hiển vi huỳnh quang, đếm tế bào dòng chảy, quang phổ huỳnh quang [22].
Rhodamine B đang được thử nghiệm để sử dụng trong vắcxin bệnh dại
cho động vật hoang dã [22].
Nó cũng được trộn vào thuốc diệt cỏ. Ngoài ra Rhodamine B còn được sử
dụng để tạo mầu và nhuộm mầu trong công nghiệp sợi, nhuộm màu trong phòng
thí nghiệm, để xét nghiệm tế bào do tính bền mầu [23].
Rhodamine B được sử dụng trong sinh học như là một thuốc nhuộm
huỳnh quang. Tận dụng đặc tính phát quang của rhodamine B, người ta dùng
4
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
chúng để giúp kiểm soát lượng thuốc bảo vệ thực vật phun lên cây ớt, cây lấy
dầu [23].
Tại Indonesia, phẩm mầu được đưa vào thực phẩm làm cho món hàng hấp
dẫn hơn, đánh lừa cảm quan của người dân Indonesia. Việc tổng hợp màu ngày
càng tăng trong một số loại thực phẩm do chi phí rất rẻ [21].
Kết quả phân tích Hóa Lý cho thấy việc sử dụng phẩm màu tổng hợp trong
đồ ăn nhẹ và thức uống chứng minh rhodamine B là phẩm màu được sử dụng
rộng rãi tại Jakarta. Thông tin này dựa trên những nghiên cứu chứng minh rằng
trong 20 đồ ăn nhẹ, 10 loại thức uống và 8 thương hiệu của chất màu đều có
chứa rhodamine B [21]. Một số loại phẩm mầu sử dụng tại Indonesia được cho
vào các loại thực phẩm như: thức ăn snack, tôm, kẹo bông, siro,…Nghiên cứu
cũng chỉ ra trong đồ uống được bán tại các trường tiểu học tiểu bang Bangdung
có chứa phẩm mầu công nghiệp với hàm lượng từ 7,841- 3226,55 ppm [21].
Theo Ủy ban an toàn thực phẩm châu Âu, nhiều thuốc nhuộm màu thuộc
nhóm azo có khả năng gây ung thư. Năm 2005, Ủy ban châu Âu đã quy định rất
rõ các chất nhuộm màu nhóm azo không được dùng trong thực phẩm và mỹ
phẩm [11,17] nên không có giới hạn chấp nhận đối với nhóm chất nhuộm này.
Do tính độc hại của rhodamine B nên ở các nước thuộc khối EU và hầu hết các
nước trên thế giới đều cấm sử dụng rhodamine B cho sản xuất và chế biến thực
phẩm [24, 19].
1.2.
Các phƣơng pháp xác định rhodamine B
Hiện nay trên thế giới có nhiều phương pháp phân tích rhodamine B đã
được triển khai và chuẩn hóa tại phòng thí nghiệm bao gồm các phương pháp vi
sinh và hóa học. Phương pháp vi sinh phân tích rhodamine B cho độ nhạy và độ
chọn lọc kém [12]. Vì vậy, các phương pháp hóa học được áp dụng rất rộng rãi
trên thế giới như: phương pháp sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng khối
phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng sử dụng detectơ huỳnh quang.
5
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Nhưng phương pháp sắc ký bản mỏng có độ nhạy, độ chọn lọc kém, thời
gian xử lý mẫu lâu, sử dụng nhiều hóa chất gây độc hại và tốn kém [21, 15, 10].
Vì vậy phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC- MS), phương pháp sắc ký lỏng
sử dụng detectơ huỳnh quang là các phương pháp được sử dụng hiện nay [19]…
Tuy các phương pháp này có độ nhạy và độ chọn lọc cao với giới hạn phát hiện
10ppb, giới hạn định lượng 35 ppb [27] nhưng đòi hỏi trang thiết bị hiện đại,
thường phải chiết bởi các dung môi độc hại, làm sạch qua cột chiết pha rắn
(SPE) [12] trước khi bơm vào cột sắc ký.
Năm 2006, Brian Stuart và M Walker [11] đã đưa ra một phương pháp xử
lý mẫu nhanh, đơn giản, ít phải sử dụng đến các dung môi độc. Rhodamine B có
khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến rất nhạy nên thiết bị sắc ký lỏng
với detectơ UV- Vis là rất phù hợp cho việc phân tích rhodamine B. Vì vậy
chúng tôi chọn phương pháp của Brian Stuat và M.Walker để áp dụng cho
nghiên cứu này. Hiện nay các phương pháp phân tích rhodamine B trong gia vị
vẫn tiếp tục được hoàn thiện nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu phục vụ cho các
nghiên cứu trong lĩnh vực khoa học thực phẩm và y học.
Tại Việt Nam, do ý thức chủ quan của con người, môi trường và thực
phẩm ngày càng bị ô nhiễm, nhiều chất độc hại làm ảnh hưởng đến sức khỏe và
gia tăng số người mắc bệnh ung thư. Đặc biệt là việc lạm dụng các chất phụ gia
trong chế biến thực phẩm như sử dụng rhodamine B để làm tăng màu đỏ của gia
vị: bột điều xay, ớt đỏ, bột sa tế, các loại gia vị nấu bò kho, nấu thịt hầm ragu và
hạt dưa đỏ làm cho món hàng hấp dẫn hơn. Ngày 02 tháng 02 năm 2010, sở y tế
Thành phố Hồ Chí Minh đã lấy mẫu ớt bột và mẫu gia vị có mầu đỏ tại cơ sở
Kim Nga- quận Bình Tân để kiểm tra kết quả đã phát hiện mẫu ớt bột sản xuất
ngày 20 tháng 01 năm 2010 có chứa 51 mg/kg rhodamine B và các mẫu bột gia
vị nhuộm màu đỏ lấy cùng ngày có chứa 33,4 mg/kg. Cơ sở này buộc phải tiêu
hủy 77,5kg ớt bột và 258kg gia vị có mầu đỏ vì không đảm bảo vệ sinh an toàn
6
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
thực phẩm [13]… Điều này hết sức nguy hại đối với sức khỏe người tiêu dùng và
góp phần làm gia tăng trực tiếp số người mắc bệnh ung thư trong cộng đồng.
Hiện ở Việt Nam đã có một số công trình nghiên cứu về phẩm mầu công
nghiệp nhóm azo [7, 8], nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về rhodamine B trong
lĩnh vực thực phẩm. Do đó việc xây dựng một quy trình chuẩn áp dụng cho
phòng thí nghiệm địa phương là rất cần thiết. Tiêu chuẩn giới hạn hàm lượng
phẩm màu rhodamine B trong thực phẩm, hàng tiêu dùng…, và những quy định
tiêu chuẩn sức khỏe liên quan tới sức khỏe cộng đồng của Việt Nam hiện nay
vẫn chưa có.
1.2.1. Phƣơng pháp sắc ký cổ điển- phƣơng pháp sắc ký giấy hay sắc ký bản
mỏng (TLC)
Phương pháp này khá đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt, dùng để
kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích. Phương pháp này có tính ưu việt, tiến
hành nhiều mẫu song song trong một lúc rất tiện lợi. TLC được trang bị phần
phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng [25,26].
Trong phương pháp này, người ta hòa tan Rhodamine B chuẩn trong
ethanol tuyệt đối để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10g/ml. Rồi tiến
hành xác định định tính trong điều kiện sắc ký sử dụng bản mỏng silicagel
60F254, hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút. Pha động được sử dụng gồm hai hệ:
Hệ 1: CHCl3- MeOH- H2O (65: 35: 10)
Hệ 2: EA- MeOH- H2O
(100: 17: 13)
Phát hiện vết bằng cách quan sát vết ở ánh sáng thường hoặc soi dưới
đèn tử ngoại, bước sóng 366nm. So sánh vị trí và màu sắc của các vết trên sắc
ký đồ của dung dịch thử với vết mẫu của rhodamine B trên sắc ký đồ của dung
dịch chuẩn để đánh giá kết quả [26].
7
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
1.2.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng vai trò vô cùng
quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau,
nhất là các lĩnh vực của hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu,
hoá học hợp chất thiên nhiên, các loại chất có tác dụng độc hại, phân tích môi
trường,…đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
Phương pháp HPLC được sử dụng rộng rãi để xác định rhodamine B trong
thực phẩm với các loại mẫu khác nhau, khá ưu thế so với các phương pháp khác
vì có độ chính xác, độ nhạy và độ lặp lại cao…
Detectơ ghép nối HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau rửa giải.
Ngày nay có rất nhiều loại detectơ được sử dụng đã mở rộng khả năng phát hiện
nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng thì người
ta hay sử dụng detector khối phổ (MSD), nhất là tách và phân tích chất trong các
đối tượng phức tạp. Còn thông dụng người ta dùng detectơ UV-Vis hay detectơ
huỳnh quang. Dùng detectơ UV-Vis thì xác định được nhiều loại chất, nhưng
detectơ huỳnh quang thường nhạy hơn, chọn lọc hơn và ít hơn các tương tác do
các hợp chất có trong nền mẫu. Ngoài ra còn dùng một số detectơ khác như
detectơ điot array (DAD), detectơ điện hoá [16],… các detectơ này cũng thường
được ứng dụng để phân tích các chất có trong phẩm nhuộm.
1.2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phƣơng pháp HPLC
Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách chất dựa trên sự tổ hợp của nhiều quá
trình. Nó là những cân bằng động xảy ra trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha
động, là sự vận chuyển và phân bố lại liên tục của các chất tan (hỗn hợp mẫu
phân tích) theo từng lớp chất trong cột (pha tĩnh) từ đầu cột tách đến cuối cột
tách. Trong quá trình đó chất tan luôn luôn được phân bố lại giữa hai pha, trong
khi pha động chảy liên tục qua cột tách với một thành phần pha động nhất định,
8
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
hay gradient. Nghĩa là đối với một phân tử chất tan, thì trong quá trình sắc ký, nó
luôn chuyển từ pha này sang pha kia nhiều lần từ dầu cột đên cuối cột sắc ký.
Mặt khác, cũng vì cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử của chất tan là khác
nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của mỗi chất tan là khác nhau. Khi ở
trong pha động, nó chuyển dịch theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên
pha tĩnh nó lại không dịch chuyển, mà bị pha tĩnh giữ lại. Như vậy là có một
khoảng thời gian nhất định chất tan bị giữ lại trong cột tách sắc ký, thời gian này
phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cũng như tính chất và cấu trúc
của mỗi chất tan khác nhau đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành
phần pha động dùng để rửa giải chất tan, có chất tan ít bị lưu giữ, điều đó dẫn
đến kết quả là, có quá trình tách của các chất xảy ra trong cột sắc ký [6].
Quá trình tách chất có thể xảy ra theo ba cơ chế chính như sau:
Tương tác hấp thụ
Tương tác trao đổi ion
Tương tác theo cơ chế rây phân tử
Tương ứng với ba cơ chế trên có ba phương pháp tiến hành tách khác nhau.
Sắc ký hấp phụ (hấp phụ pha thường NP- HPLC và hấp phụ pha ngược
RP- HPLC)
Sắc ký trao đổi ion (EX- HPLC)
Sắc ký rây phân tử (Gel- HPLC)
Vậy phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một kỹ thuật tách
chất trong đó xảy ra quá trình các chất tan chuyển dịch trong cột tách có chứa
các chất nhồi kích thước nhỏ, chất tan chuyển dịch với vận tốc khác nhau phụ
thuộc vào hệ số phân bố của nó. Các chất nhồi cột có kích thước đủ nhỏ để đáp
ứng hiệu quả tách sắc ký tốt. Thành phần pha động có thể thay đổi để đạt được
lực rửa giải phù hợp nhất. Sau khi chất tan chuyển tới cuối cột tách được chuyển
9
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
tới detectơ để phát hiện. Tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan mà dùng các loại
detectơ khác nhau [6].
1.2.2.2. Giới thiệu chung về phƣơng pháp chiết lỏng- lỏng
Mẫu phân tích trong kỹ thuật HPLC thường ở trạng thái lỏng, đa số các
trường hợp không thể chuyển mẫu trong trạng thái nguyên thủy lên cột tách
được. Phương pháp xử lý mẫu hay được áp dụng trong phân tích là chuyển mẫu
về trạng thái lỏng. Phương pháp chiết lỏng- lỏng được áp dụng để xử lý mẫu cho
sắc ký lỏng. Cơ sở chính của phương pháp này dựa vào cân bằng phân bố của
chất tan trong hai hệ dung môi, hệ dung môi chiết và nền của chất mẫu. Yêu cầu
chủ yếu là chọn được một dung môi chiết thích hợp để chiết chất phân tích cho
hiệu suất thu hồi tốt và không ảnh hưởng cho quá trình chạy sắc ký sau này.
Ví dụ theo thạc sĩ Nguyễn Đắc Kiên- Trường Đại học Nha Trang- Khoa nuôi
trồng thủy sản, để phân tích độc tố aflatoxin B 1 trong thức ăn nuôi trồng thủy sản,
mẫu phân tích được cân từ 10- 20 gam cho vào bình nón dung tích 250ml. Chiết
mẫu bằng 100ml clorofom (CHCl 3), lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút. Sau đó tiến
0
hành lọc vào bình 250ml và cô quay cạn ở 40 C. Hòa cặn bằng 10ml diclometan
(CH2Cl2), sau đó mẫu phân tích mới được bơm vào cột tách.[5]
Theo tiêu chuẩn xác định hàm lượng Histamin trong sản phẩm thủy sản
bằng phương pháp HPLC dựa theo tiêu chuẩn NMKL số 99-1981(Nordic
committee on food analysis No 99- 1981), mẫu được nghiền bằng máy nghiền
đồng thể, cho vào bình tam giác 150ml, thêm 50ml etanol, lắc đều trong hai phút.
Đặt bình chứa dung dịch mẫu trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 60 0C trong 15 phút,
sau đó chuyển sang bình định mức 100ml, tráng bình tam giác bằng metanol. Để
dung dịch nguội tới nhiệt độ phòng rồi định mức tới vạch bằng metanol. Lắc đều
dung dịch rồi lọc qua giấy lọc. Mẫu đã chiết được bơm vào cột tách [28].
10
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
1.2.2.3. Các kết quả nghiên cứu về Rhodamine B bằng phƣơng pháp HPLC
Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu để xác định rhodamine B.
Tháng 2 năm 1989, Carcinogen và Pesticide Branch [13], phòng thí nghiệm hóa
phân tích OSHA, thành phố Salt Lake, Utah, đã xác định rhodamine B bằng
phương pháp HPLC, sử dụng detectơ huỳnh quang với các điều kiện như sau:
Cột tách: hypersil ODS, 100mm x 2,1mm, 5m.
Nhiệt độ: 400C
Pha động: 85% axetonitrile, 15% nước với 0,005M axit 1- heptansunfonic, được
điều chỉnh pH tới 3,5 bằng axit H3PO4.
Tốc độ dòng: 0,2ml/phút
Bước sóng: 556nm
Vòng mẫu: 1,0l.
Với các điều kiện như trên rhodamine B có trong mẫu đã được phát hiện ở
4,5 phút.
Cũng trong năm 1989, R.W. Mason và L.R.Edwards [20] cũng đã tiến
hành thí nghiệm phân tích rhodamine B ở trong huyết tương thỏ và người, sử
dụng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu DR-3 sử dụng detector huỳnh
quang với các điều kiện:
Cột tách: Bondapak CN (25mm x 4,6mm)
Pha động: axetonitril và nước (35: 65 hoặc 40: 60) chứa 0,1% axit octophotphoric.
Tốc độ dòng: 1,8ml/phút.
Nhiệt độ cột: 18 20C
Mẫu huyết tương: 0,5ml huyết tương được pha loãng trong 0,5ml dung dịch
0,05M kali đihidro photphat, pH= 5,5, được chiết trong 5ml etylaxetat.
Kết quả phân tích: Rhodamine B được phát hiện ở 9,7 phút. Mẫu huyết tương
đem phân tích có chứa từ 25 đến 50 ng/ml [25].
11
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Tháng 6 năm 1996, L. Gagliardi, D. De Orsi, G. Multari, D. Tonelli [16]
đã phân tích rhodamine B trong mỹ phẩm với các điều kiện phân tích được thực
hiện như sau:
Cột tách: C- 18
Pha động: Axetonitril và nước chứa 0,1M natri peclorat với tỷ lệ thành phần thay
đổi từ 50: 50 đến 70: 30.
Mẫu phân tích được pha trong metanol và nước với tỷ lệ 8: 2
Kết quả phân tích mẫu thực cho thấy dung dịch phân tích có chứa
0,3g/ml rhodamine B, píc xuất hiện ở 9,15 phút [16].
Ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn và sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector
huỳnh quang tác giả J.W.Hofstraat và cộng sự đã xác định rhodamine B trong
nước bề mặt. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10 pg/l [17].
Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc trung ương [1] đã tiến hành phân
tích Rhodamine B trên các mẫu dược liệu. Các điều kiện sắc ký đã được thực
hiện như sau:
Cột tách: RP- C18 (5m, 4,6mm x 250mm)
Pha động: 50% Axetonitril- 50% đệm kaliđihidrophotphat 20mM- trietylamin
(100: 0,3), điều chỉnh pH tới 3,0 bằng axit photphoric.
Tốc độ dòng: 1,4ml/phút
Detector: UV-Vis
Bước sóng: 525nm.
Lượng tiêm: 20l.
Kết quả phân tích cho thấy trong dược liệu có chứa Rhodamine B[1].
Tháng 4 năm 2011, Việt Nam đã có TCVN 8670-2011, xác định
Rhodamine B bằng HPLC [10] trên cơ sở của viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm quốc gia đã xây dựng và thực nghiệm cho một số loại thực phẩm có
nhuộm màu.
12
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
1.2.2. Phƣơng pháp UV- Vis xác định rhodamine B
Để xác định rhodamine B, người ta còn sử dụng phương pháp UV- Vis.
Lấy mẫu chất đem hoà tan trong dung môi thích hợp, lắc, rung siêu âm và chiết
lấy dung dịch. Đem dung dịch chiết được đo bằng máy UV- Vis, dựa vào cực đại
hấp thụ ta có thể định tính và định lượng rhodamine B [11, 15].
13
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Chƣơng 2:
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tƣợng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1.1. Đối tƣợng và mục tiêu nghiên cứu
Trong luận văn này, hướng nghiên cứu tập trung vào phân tích rhodamine
B có trong thực phẩm, cụ thể là các mẫu thực phẩm: siro dâu, bánh xu xê, hạt
dưa, nước ngọt hương dâu.
Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector hấp thụ phân tử UVVis được lựa chọn. Từ đó xây dựng một quy trình phân tích để áp dụng xác định
rhodamine B trong thực phẩm.
2.1.2. Nhiệm vụ nghiên cứu
Với mục tiêu nghiên cứu trên, trong luận văn này chúng tôi nghiên cứu
tách và xác định rhodamine B bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC) sử dụng cột tách pha ngược dùng detector UV- Vis.
Xây dựng phương pháp xác định Rhodamine B trong thực phẩm bằng kỹ
thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao với độ nhạy và độ chính xác cao.Vì vậy, cần
nghiên cứu một cách có hệ thống các vấn đề sau:
1- Tối ưu hóa các điều kiện tách và định lượng Rhodamine B bằng HPLC,
cụ thể là:
Chọn bước sóng của detector.
Chọn pha tĩnh.
Tối ưu hóa pha động: pH, thành phần, tốc độ pha động.
Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
Đánh giá độ lặp lại và độ đúng của phép đo.
2- Tối ưu hóa các điều kiện xử lý mẫu phân tích:
14
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Chọn phương pháp tiền xử lý mẫu và xác định độ thu hồi.
Chọn dung môi chiết Rhodamine B ra khỏi nền mẫu.
3- Xây dựng quy trình phân tích và ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác
định hàm lượng rhodamine B trong một số loại thực phẩm để đánh giá mức độ
an toàn của thực phẩm.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
Trong luận văn này đối tượng phân tích là các mẫu thực phẩm và chất
phân tích là phẩm mầu. Thông thường, trong các mẫu thực phẩm có rất nhiều
thành phần, nền rất phức tạp. Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp HPLC (High
Performance Liquid Chromatography- Sắc ký lỏng hiệu năng cao) để khảo sát
điều kiện tách và định lượng Rhodamine B.
Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao được tóm tắt
như trong hình 2.1.
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát của một hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
15
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
2.2.1. Detector UV-Vis
Loại detector này thực chất là các máy đo hấp thụ phân tử vùng tử ngoại
(UV) và vùng khả kiến (Vis). Nhưng ở đây buồng đặt cuvet đo được thay thế
bằng các cuvet đo dòng chảy (flowcell). Việc đo để phát hiện các chất phân tích
hay hợp chất của nó vẫn dựa trên cơ sở tính chất hấp thụ quang phân tử của chất
ở trong dung dịch tại một độ dài sóng nào đó, nhưng dung dịch ở đây là pha
động của quá trình sắc ký, nó chứa chất phân tích và chảy liên tục qua buồng đo
(flowcell). Các chất phân tích tan trong pha động có thể cho phổ hấp thụ trực tiếp
của chính nó. Như vậy nói chung tất cả các chât phân tích hay hợp chất của nó
đối với một thuốc thử mà có khả năng hấp thụ quang nhạy tại một bước sóng nào
đó trong vùng phổ UV-Vis đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại
detector này. Nguyên tắc của việc phát hiện định lượng ở đây là dựa theo định
luật hấp thụ ánh sáng
I
A lg I0 .l .C
Trong đó:
A là độ hấp thụ quang của chất phân tích hay hợp chất phức của nó với thuốc
thử phân tích ở bước sóng .
là hệ số độ hấp thụ quang phân tử (độ tắt phân tử)
l là bề dầy của lớp hấp thụ (chiều dài của flowcell).
Về nguyên tắc cấu tạo, loại detector này bao gồm các phần chính như sau:
Nguồn sáng điểm S: là đèn D2 (cho vùng phổ UV), hay đèn W- Halid (cho
vùng phổ Vis).
Buồng mẫu và môi trường hấp thụ (flowcell).
Bộ đơn sắc để thu chùm sáng, phân ly và chọn tia sáng cần đo. Trong các
detector đơn giản thì đây là một kính lọc cho các vùng phổ nhất định.
Bộ phận điện tử thu nhận và khuếch đại tín hiện đo.
16
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Bộ phận chỉ thị kết quả.
Trong thực tế, rất nhiều chất hữu cơ và hợp chất phức của kim loại với
một thuốc thử phân tích đều có thể được phát hiện và xác định bằng loại detectơ
này. Detectơ UV- Vis đang được dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật HPLC vì nó
có độ nhạy tương đối cao, đơn giản, dễ dùng và không quá đắt.
2.2.2. Phân tích định lƣợng bằng HPLC
Trong điều kiện phân tích đã chọn, đại lượng đặc trưng cho một chất là
thời gian lưu tRi của chất đó trên cột tách. Chúng ta có thể dựa vào thời gian lưu
này để định tính (thông qua mẫu chuẩn). Sau đó dựa vào các tín hiệu phân tích
thu được (chiều cao pic hoặc diện tích pic) để định lượng các chất.
Để biết tỷ số khối lượng của chất tan phân bố vào mỗi pha là bao nhiêu, ta
dựa vào hệ số lưu k’i
ki'
m( SP)
t
Ri
t
m( MP )
R0
tR0
Trong đó:
k’I là hệ số lưu
m(SP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha tĩnh.
m(MP) là khối lượng chất tan phân bố vào pha động.
tRi là thời gian lưu của chất thứ i
tR0 là thời gian chết của cột tách.
Thông thường trong phương pháp HPLC người ta biểu diễn quan hệ nồng
độ chất phụ thuộc vào chiều cao píc hoặc diện tích.
H= k.Cb
S= k. Cb
Trong đó:
17
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
H là chiều cao pic sắc ký của chất
S là diện tích pic sắc ký của chất
k là hằng số của điều kiện thực nghiệm tách sắc ký
b- là hằng số bản chất, nó nhận giá trị trong vùng: 0 < b 1
Ở vùng nồng độ nhỏ thì b= 1, mối quan hệ giữa H(S) với C là tuyến tính:
H= k1.C = f(C)
S= k2.C =f(C)
Sử dụng các quan hệ đó có thể xác định nồng độ chất phân tích theo
phương pháp đường chuẩn hay phương pháp thêm chuẩn. Dùng phương pháp
đường chuẩn nhanh, đơn giản. Còn khi thành phần mẫu phức tạp, lượng chất cần
xác định nhỏ thì người ta dùng phương pháp thêm chuẩn.
Đối với các píc tách rời nhau hoàn toàn thì biểu diễn mối tương quan của
diện tích píc vào nồng độ chất phân tích cho kết quả vùng tuyến tính lớn hơn.
Tuy nhiên, trong thực nghiệm, việc đo chiều cao pic là dễ dàng hơn đo diện tích.
Nên trong phân tích lượng nhỏ (nồng độ nhỏ) người ta thường đo chiều cao pic.
Tuy nhiên đối với các pic sắc ký có hiện tượng kéo đuôi (peak tailling) thì việc
đo diện tích pic lại chính xác hơn.
Trong luận văn này chúng tôi thiết lập quan hệ diện tích pic phụ thuộc vào
nông độ chất phân tích, khảo sát khoảng tuyến tính sau đó tiến hành xác định
nồng độ chất theo cả hai phương pháp đường chuẩn và thêm chuẩn.
2.3. Hoá chất và dụng cụ trong nghiên cứu
2.3.1. Hoá chất
Các loại hoá chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích và HPLC
Dung dịch chuẩn:
18
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Dung dịch chuẩn gốc 50 ppm: cân một lượng chính xác chất chuẩn
Rhodamine B vào cốc 50 ml, hoà tan và chuyển vào bình định mức 50 ml,
định mức bằng methanol ở nhiệt độ phòng, lắc kỹ, bảo quản tránh ánh
sáng ở 40 C.
Dung dịch chuẩn 2 ppm: lấy 2 ml dung dịch chuẩn gốc 50 ppm cho vào
bình định mức 50 ml, định mức tới vạch bằng methanol và lắc kỹ, bảo
quản ở 40 C, tránh ánh sáng.
Các dung dịch chuẩn nhỏ hơn được pha từ dung dịch chuẩn làm việc, sử
dụng trong ngày.
Các loại hoá chất khác
Methanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Acetonitril loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axit fomic loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Trietyl amin loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Natri 1-heptansunfonat của Merk
Ethanol loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
Axeton loại tinh khiết phân tích > 99,9% của Merk
2.3.2. Máy móc và thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis 8453 của hãng Agilent- Mỹ với dải phổ từ 1901100 nm, điều khiển bằng phần mềm Chemstation.
Máy đo pH TIM 800 của hãng Radiometer- Đan Mạch với điện cực thủy
tinh Red- Rod cho phép đo pH và bổ chính nhiệt độ tự động.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của hãng Shimadzu, Nhật Bản
gồm:
Bộ loại khí cho dung môi, Degasser- DGU- 14AM
19
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
Bộ trộn dung môi FCV- 10ALVP.
Bơm dung môi bốn kênh LC- 10ATVP.
Bộ ổn nhiệt cho cột tách CTO- 10ASVP
Van bơm mẫu 6 chiều VS- 7725i của Rheodyne, Mỹ với thể tích
vòng mẫu (sample loop) 20 l.
Detector UV-Vis SPD- 10AVVP.
Hệ điều khiển SCL- 10AVP.
Phần mềm điều khiển và xử lý LC solution Version 1.11SP1.
Cân phân tích độ chính xác 0,1mg, bể siêu âm, tủ lạnh, máy điều nhiệt, tủ
sấy
Dụng cụ
Ống đong
Các bình định mức: 5, 10, 20, 50 ml
Lọc chân không
Pipet: 1, 2, 5, 10 ml
Cattrige lọc cỡ 0,45m, 0,2m, cột chiết pha rắn
Pipet man,...
20
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát các điều kiện sắc ký
3.1.1 Chọn thể tích vòng mẫu (sample loop)
Hệ bơm mẫu cho sắc ký lỏng sử dụng nguyên lý cơ bản là mẫu ban đầu
được nạp vào trong vòng chứa mẫu có thể tích nhất định bằng một xilanh ở áp
suất bình thường, sau đó nhờ hệ thống chuyển van mà mẫu được dòng pha động
nạp vào cột tách. Độ chính xác, độ đúng và lượng mẫu cần thiết nạp vào cột tách
không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ
thuật nạp mẫu vào trong cột.
Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi
được thể tích mẫu bơm vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng góp phần vào sự mở
rộng chân pic sắc ký (doãng pic). Nếu như vòng chứa mẫu quá dài, lượng mẫu
bơm vào cột quá lớn thì hiện tượng doãng píc xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn
píc trong quá trình tách.
Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta chọn. Với
thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì bơm mẫu vào cột tách chiều cao
hay diện tích của píc sẽ tăng một cách tuyến tính. Đến giới hạn V mẫu > V0, nếu ta
tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao píc sắc ký cũng không tăng được nữa mà
lúc đó píc sắc ký sẽ tù và doãng, không sắc nét nữa. Vì vậy việc chọn thể tích
vòng mẫu cũng rất quan trọng.
Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường chỉ nên dùng vòng mẫu càng nhỏ
càng tốt để tạo nên píc có độ sắc nét cao, tránh sự doãng píc. Trong phân tích
HPLC người ta thường dùng vòng mẫu 10, 20, 50, 100l, trong đó vòng mẫu
20l là phổ biến nhất. Trong trường hợp phân tích Rhodamine B chúng tôi lựa
chọn van bơm mẫu 6 chiều và thể tích vòng mẫu là 20l.
21
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
Luận văn tốt nghiệp
Chuyên ngành phân tích
3.1.2. Chọn bƣớc sóng của detectơ
Việc chọn bước sóng đo phát hiện chất rất quan trọng vì nó quyết định
trực tiếp tới độ nhạy của phép phân tích. Vì phương pháp nghiên cứu được lựa
chọn là HPLC ghép nối detectơ UV- Vis, detectơ cố định bước sóng do vậy phải
tiến hành khảo sát điều kiện để chọn ra được bước sóng phù hợp nhất cho phân
tích chất.
Việc đo phát hiện các chất phân tích hay hợp chất của nó dựa trên cơ sở
tính chất hấp thụ quang phân tử của chất trong dung dịch tại một bước sóng nào
đó. Chính vì thế để thu được pic cao, rõ ràng đủ để định lượng cần phải đo ở cực
đại hấp thụ.
Chúng tôi tiến hành ghi phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng khả kiến trên
máy UV-Vis 8453 với dung dịch chuẩn rhodamine B được pha trong các thành
phần dung môi khác nhau:
Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước
Rhodamine B 1ppm trong 80% methanol- 20% nước có 3% trietylamin
Rhodamine B 1ppm trong 80% axetonitril- 20% nước 0,005M natri 1heptansunfonat
Rhodamine B 1ppm trong 100% methanol
Rhodamine B 1ppm trong 100% nước
Kết quả phổ thu được đưa ra trong hình 3.1.
22
Trần Thị Thanh Nga - Cao học hoá K20
