Nghiên cứu nấm phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA
PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ
CA CAO VÀ MỘT SỐ
VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣


Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
----------------------------

PHẠM THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU NẤM PHYTOPHTHORA
PALMIVORA GÂY BỆNH THỐI ĐEN QUẢ
CA CAO VÀ MỘT SỐ
VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG TRONG PHÒNG TRỪ BỆNH
Chuyên ngành : Vi sinh vâṭhocC̣
Mã số

: 60420107

LUÂṆ VĂN THACC̣ SĨ KHOA HOCC̣

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. PHẠM NGỌC DUNG
2. TS. PHẠM THẾ HẢI


Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quátrình học tập và thực hiện đề tài, em đa ̃nhâṇ đươcc̣ sư gc̣ iúp đỡ
và ủng hộ nhiệt tình của nhiều tập thể và cá nhân .
Đầu tiên, em xin bày tỏlòng biết ơn chân thành vàsâu sắc nhất đến tâpc̣ thể
hương dâñ khoa hocc̣ : TS. Phạm Ngọc Dung và TS. Phạm Thế Ha i,
́

thầy tâm huyết ,
hiêṇ đềtai va hoan thanh luâṇ văn nay.
̀

Em xin gưi lơi cam ơn sâu sắc đến Ban lanh

̀

Bô c̣môn An toan va Đa dangc̣ sinh hocc̣ ,
̀

tạo điều kiện cho em về thời gian học tập và thực hiện đề tài .

Em xin gưi lơi cam ơn chân thanh tơi cac can bô tc̣ huôcc̣ nhom Bênḥ haịcây
ăn qua va
̉
̀
điều kiêṇ giup đơ trong qua trinh thưcc̣ hiêṇ cac thi nghiêṃ đềtai .
́

Em xin gưi lơi cam ơn tơi quy thầy cô taịKhoa Sinh hocc̣ ,
cô ơ Bô c̣môn Vi sinh vâṭhocc̣, trương Đaịhocc̣ Khoa hocc̣ Tư c̣nhiên
̉

dạy và truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích
khoa hocc̣, làm hành trang quý báu cho sự phát triển công việc của em .
Cuối cùng, xin bay to long biết ơn chân thanh
ngươi thân, bạn bè và đồng nghiệp đa luôn
̀
cảm thân thương - đo la nguồn đôngc̣ lưcc̣ manḥ me
luâṇ văn nay.
̀
HỌC VIÊN

Phạm Thị Tâm


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG
DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU....................................................................................................................................1

Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
1.1. Tình hình nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen
qua ca cao trên Thếgiới vàViêṭNam................................................................3
1.1.1. Tình hình thiệt hại do nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen
quả ca cao gây nên..........................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora..................5
1.1.3. Qui luật phát sinh và phát triển của bệnh.........................................................6
1.1.4. Một số nghiên cứu về phân lập nấm Phytophthora..........................................8
1.1.5. Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định
các loài nấm Phytophthora gây hại cây trồng..................................................9
1.2. Tình hình nghiên cứu biện pháp phòng trừ sinh học bệnh thối đen qua
ca cao trên Thếgiới vàViêṭNam...................................................................... 11
1.2.1. Nấm Trichoderma sp. đối kháng nấm P. palmivora.......................................12
1.2.2. Nghiên cứu về vi khuẩn đối kháng nấm P. palmivora.................................... 18
Chƣơng 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............21
2.1. Nội dung nghiên cứu....................................................................................... 21
2.2. Vật liệu nghiên cứu......................................................................................... 21
2.2.1. Môi trường nuôi cấy...................................................................................... 21
2.2.2. Các trang thiết bị và dụng cụ.......................................................................... 22
2.2.3. Nguồn vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu.................................................. 22
2.3. Địa điểm nghiên cứu....................................................................................... 23
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu............................................................................... 23


2.4.1. Phương pháp phân lập, xác định nấm Phytophthora palmivora gây bệnh
thối đen quả ca cao........................................................................................ 23
2.4.2. Phương pháp lây bệnh nhân tạo để xác định độc tính gây bệnh của nấm
Phytophthora palmivora trên quảca cao........................................................ 25

2.4.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái , sinh học, sinh thái của nấm
P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao.................................................... 25
2.4.4. Phân lập và tuyển chọn một số vi sinh vật đối kháng nấm P. palmivora
gây bệnh thối đen quả ca cao trong điều kiện phòng thí nghiệm...................26
2.4.5. Nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái và sinh hóa của một số nấm
Trichoderma sp. có khả năng đối kháng cao với nấm P. palmivora..............28
2.4.6. Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối
kháng với nấm P. palmivora.......................................................................... 30
2.4.7. Định loài nấm bằng kỹ thuật sinh học phân tử............................................... 33
2.4.8. Xác định loài vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử.................................. 35
2.4.9. Chỉ tiêu theo dõi chung.................................................................................. 36
2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu............................................................................ 36

́

Chƣơng 3: KÊT QUẢNGHIÊN CƢ́U VÀTHẢO LUÂṆ........................................ 37
3.1. Xác định tác nhân gây bệnh thối đen qua ca cao.......................................... 37
3.1.1. Phân lập nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao............................37
3.1.2. Lây bệnh nhân tạo để xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao
.........................................................................................................................................42

3.1.3. Xác định nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao bằng kỹ thuật
sinh học phân tử............................................................................................ 44
3.2. Đặc điểm hình thái nấm P. palmivora gây bệnh thối đen qua ca cao...........48
3.3. Đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm Phytophthora palmivora gây
bệnh thối đen qua ca cao............................................................................... 52
3.3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của sợi nấm..............52
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của sợi nấm...................................54
3.3.3. Ảnh hưởng của độ pH tới sự phát triển của sợi nấm P. palmivora ……...….60
3.3.4. Ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến nấm P. palmivora..............................57

3.4. Xác định một số vi sinh vật có kha năng đối kháng với nấm P. palmivora. 59
3.4.1. Phân lập các vi sinh vật đối kháng ở các vùng trồng ca cao của tỉnh Bình
Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông.......................................................................... 59
3.4.2. Xác định khả năng đối kháng của các vi sinh vật có ích với nấm gây bệnh...62
3.4.3. Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của các chủng nấm Trichoderma
phân lập được................................................................................................ 67
3.4.4. Định danh nấm Trichoderma bằng kỹ thuật sinh học phân tử........................73
3.4.5. Nghiên cứu một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn đối
kháng với nấm P. palmivora

74

3.4.6. Xác định đặc điểm phân loại của các vi khuẩn đối kháng nấm P. palmivora
bằng kỹ thuật sinh học phân tử...................................................................... 79
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................................81
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................................82
PHỤ LỤC


́

́

DANH MUCC̣ KÝHIÊỤ CÁC CHƢƢ̃VIÊT TĂT
Viết tắt
a, b, c, d
AFLP
CA

CMA
cs
CT
CV
DNA
ĐC
ĐK
HQ
IRRISTAT
KH
PCA
PCR
PDA
RFLP
sp.
spp.
VSV


DANH MUCC̣ BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của vật liệu bẫy đến khả năng bẫy nấm
Phytophthora gây bệnh thối đen quả ca cao................................................... 37
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của thuốc Benlat 80WP đến khả năng phân lập
nấm Phytophthora sp. gây bệnh thối đen quả ca cao................................... 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của thuốc Tachigaren 30L đến khả năng phân lập
nấm Phytophthora sp. gây thối đen quả ca cao.............................................. 40
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thuốc kháng sinh RH đến khả năng phân lập
nấm Phytophthora gây thối đen quả ca cao..................................................... 41
Bảng 3.5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo các chủng nấm Phytophthora sp.

gây bệnh thối đen quả ca cao................................................................................. 43
Bảng 3.6. Kết quả giải trình tự các mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao...............44
Bảng 3.7. Định danh các loài nấm Phytophthora gây bệnh thối đen quả
ca cao dựa trên tìm kiếm cơ sở dữ liệu.............................................................. 46
Bảng 3.8. Đặc điểm hình thái các loài nấm Phytophthora palmivora
phân lập từ ca cao...................................................................................................... 51
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao......................................... 54
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P.
palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao........................................................... 56
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P. palmivora
gây bệnh thối đen quả ca cao................................................................................. 57
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm
Phytophthora palmivora gây thối đen quả ca cao......................................... 59
Bảng 3.13. Số chủng Trichoderma spp. phân lập được từ 3 tỉnh Bình
Phước, Đăk Lăk và Đăk Nông.............................................................................. 60
Bảng 3.14. Số chủng vi khuẩn phân lập được từ 3 tỉnh Bình Phước, Đăk
Lăk và Đăk Nông có khả năng đối kháng nấm P. palmivora....................61
Bảng 3.15. Khả năng ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp. đối với
nấm P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao............................................ 63
Bảng 3.16. Khả năng ức chế nấm P. palmivora bằng chất kháng sinh bay
hơi của các chủng nấm Trichoderma spp......................................................... 65


Bảng 3.17. Hiệu quả ức chế của một số chủng vi khuẩn phân lập được với
nấm P. palmivora gây thối đen quả ca cao

66

Bảng 3.18. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của

nấm Trichoderma sp. (F30711)

69

Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng, phát triển của nấm
Trichoderma sp. (F30711) 71
Bảng 3.20. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sinh trưởng và phát
triển của nấm Trichoderma sp. (F30711) 72
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của nấm Trichoderma sp.
(F30711)

73

Bảng 3.22. Định tính hoạt độ enzyme của các chủng nấm Trichoderma sp.
có triển vọng đối kháng cao với nấm P. palmivora

73

Bảng 3.23. Giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi trên Ngân hàng
Gen (GenBank)

75

Bảng 3.24. Khả năng lên men yếm khí của một số chủng vi khuẩn đối
kháng nấm P. palmivora

76

Bảng 3.25. Khả năng khử nitrat của một số chủng vi khuẩn đối kháng nấm
P. palmivora 77

Bảng 3.26. Khả năng đồng hóa nguồn Các bon từ

đường Glucose,

Sacarose, tinh bột tan và rượu Mannitol của các chủng vi
khuẩn có triển vọng 78
Bảng 3.27. Khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn đối kháng nấm P.
palmivora

79

Bảng 3.28. Định tính hoạt độ enzyme của một số chủng vi khuẩn đối
kháng nấm P. palmivora

80

Bảng 3.29. Kết quả xác định loài vi khuẩn đối kháng nấm P. palmivora
bằng sinh học phân tử

81


DANH MUCC̣ HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồchu trinh̀ sống của nấm Phytophthora........................................................................................ 6

Hình 1.2. Hình thái học của Phytophthora palmivora.................................................................... 6

Hình 3.1. Cây phả hệ không rễ dựa trên chuỗi ITS cho thấy mối quan hệ của
20 mẫu Phytophthora phân lập từ ca cao ở Việt Nam với các loài

Phytophthora.................................................................................................................... 47
Hình 3.2. Đặc điểm của bào tử nang........................................................................................... 48
Hình 3.3. Bào tử nang hình thành trên cành bào tử mọc dạng sym................................. 49
Hình 3.4. Bào tử hậu hình thành ở đỉnh sợi và ở giữa sợi................................................... 49
Hình 3.5. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm P. palmivora 53

Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P. palmivora................56
Hình 3.7. Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P. palmivora....................58
Hình 3.8. Ảnh hưởng của độ chiếu sáng đến sự phát triển của nấm P. palmivora.....58
Hình 3.9. Đồ thị thể hiện tỷ lệ phân lập được các chủng nấm Trichoderma spp. thu
thập từ các mẫu đất tại 3 tỉnh Bình Phước, Đăk Lăk, Đăk Nông..................61
Hình 3.10. Đồ thị thể tiện tỷ lệ phân lập được các chủng vi khuẩn có triển
vọng đối kháng nấm P. palmivora............................................................................ 62
Hình 3.11. Hiệu quả ức chế của các chủng nấm Trichoderma spp. đối với
nấm P. palmivora............................................................................................................ 63
Hình 3.12. Khả năng ký sinh của các chủng nấm Trichoderma sp. đối kháng
với nấm P. palmivora.................................................................................................... 64
Hình 3.13. Hiệu quả ức chế nấm P. palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi
của các chủng nấm Trichoderma spp...................................................................... 65
Hình 3.14. Khả năng ức chế nấm P. palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi
của các chủng nấm Trichoderma spp...................................................................... 66
Hình 3.15. Hiệu quả ức chế của một số chủng vi khuẩn phân lập được với
nấm P. palmivora............................................................................................................ 67
Hình 3.16. Khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với nấm P. palmivora........67


Hình 3.17. Nấm Trichoderma (F30711)..................................................................................... 68
Hình 3.18. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm
Trichoderma 70
Hình 3.19. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Trichoderma.............71

Hình 3.20. Định tính hoạt độ enzyme cellulase của chủng nấm F30711....................... 74
Hình 3.21. Khả năng lên men yếm khí của 3 chủng vi khuẩn đối kháng nấm
P. palmivora 77
Hình 3.22. Khả năng khử nitrat của 3 chủng vi khuẩn đối kháng nấm P.
palmivora

77

Hình 3.23. Khả năng đồng hóa nguồn các bon của chủng vi khuẩn B14.1..................78
Hình 3.24. Định tính hoạt độ enzyme cellulase của các chủng vi khuẩn đối
kháng nấm P. palmivora

80


MỞ ĐẦU
Cây ca cao (Theobroma cocoa L) có nguồn gốc từ lưu vực sông Amazon
nằm ở Nam, Trung Mỹ và cũng đã được trồng rộng rãi hơn 500 năm trước. Cây ca
cao có ưu thế sinh thái tự nhiên ở tầng thấp trong những cánh rừng mưa nhiệt đới.
Cây ca cao được trồng nhiều ở vùng Trung Mỹ, Đông Châu Phi, Tây Châu Phi đến
các nước Đông Nam Á. Năm 2002, chỉ riêng mức tiêu thụ hạt ca cao trên thế giới
đạt 4 tỷ USD, nhu cầu này sẽ tăng trong thời gian tới và tăng nhanh nhất ở thị
trường Châu Á. Tính đến niên vụ 2004 sản lượng ca cao trên thế giới đạt 3.075
ngàn tấn.
Cây ca cao hiêṇ là đối tượng chính trong các chương trình giữ gìn sinh thái,
tạo cảnh quan cho các vùng đất trống, đồi trọc, đem lại cơ hội tốt để cải thiện đời
sống, tăng thu nhập cho người nông dân sản xuất nhỏ và nghèo. Theo Ross Jaaz,
trưởng đại diện của Tổ chức hợp tác phát triển nông nghiệp và trợ giúp quốc tế cho
biết, hơn 80% ca cao trên thế giới được sản xuất từ mảnh đất nhỏ dưới 1ha.
Bệnh thối đen quả ca cao (black pod) do nấm Phytophthora palmivora (P.

palmivora) gây ra là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng nhất đối với các vùng
trồng ca cao trên thế giới, ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng hạt ca
cao. Bệnh gây hại không những trên quảtừ giai đoạn còn non cho đến khi quả chín
mà còn hại cả trên thân, cành và lá. Nấm P. palmivora gây hại không chỉ trên các
bộ phận khí sinh của cây mà còn có khả năng tồn tại trong đất và hạn chế sự sinh
trưởng của cây con được trồng lại trên các diện tích trồng ca cao trước đây đã bị
bệnh. Ước tính thiệt hại do loại bệnh này gây ra rất lớn từ 10% (thập niên 80) tăng
lên 30% (thập niên 90) và có thể lên đến 90 - 100%, phụ thuộc vào vị trí địa lý,
giống trồng trọt, chủng gây bệnh và điều kiện môi trường từng vùng.
Ở Việt Nam, mặc dù ban đầu việc trồng ca cao không được chú trọng nhưng

gần đây khi có sự hình thành các vùng sản xuất ca cao hàng hoá tập trung, nhiều
loài dịch hại quan trọng đã phát triển nhanh và gây hại nặng, làm giảm năng suất,
chất lượng quả ca cao. Bệnh thối đen quả cũng là bệnh chính gây hại ca cao ở Việt

1


Nam. Nấm P. palmivora gây hại còn có thể gây hại mọi bộ phận (lá, thân, hoa), qua
các giai đoạn từ vườn ươm cho đến khi thu hoạch. Vì vây, việc nghiên cứu một
cách hệ thống nấm P. palmivora gây bệnh cho cây ca cao là hết sức cần thiết để đưa
ra được đối sách phòng trừ bệnh.
Để phòng trừ bệnh, chủ yếu các biện pháp hóa học vẫn được sử dụng. Tuy
nhiên, sử dụng nhiều thuốc hóa học đã gây nên những hiệu quả tiêu cực như ô
nhiễm môi trường, tạo ra tính kháng thuốc của sâu bệnh, ảnh hưởng đến sức khỏe
của con người và vật nuôi. Do đó, việc tìm ra biện pháp an toàn hiệu quả phòng trừ
bệnh hại nói chung và bệnh thối đen quảca cao nói riêng là một trong những vấn đề
cấp thiết hiện nay khi mà Việt Nam đã gia nhập WTO, đòi hỏi sản phẩm nông
nghiệp phải an toàn, không có dư lượng thuốc hóa học để đảm bảo cho nhu cầu nội
tiêu và xuất khẩu.

Trong các biện pháp phòng trừ đang được nghiên cứu để dần thay thế biện
pháp hóa học thì biện pháp sinh học là một hướng đi được các nhà khoa học của
nhiều nước trên thế giới cũng như Việt Nam quan tâm. Biện pháp sinh học, là việc
sử dụng các vi sinh vật (VSV) có ích, các loài thảo mộc, các hợp chất hữu cơ như là
tác nhân sinh học, không những phòng trừ bệnh hại cây trồng mà còn được sử dụng
để tăng cường độ màu mỡ cho đất, kích thích cây trồng sinh trưởng phát triển và
hấp thụ dinh dưỡng, tăng cường hệ sinh thái bền vững trong hệ thống nông nghiệp.
Vì vậy, xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và để đáp ứng được một phần của sản
xuất, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây
bệnh thối đen quả ca cao và một số vi sinh vật đối kháng trong phòng trừ bệnh”.
Đề tài nhằm hướng tới hai mục tiêu chính: (i) xác đinh được đặc điểm các chủng
nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả trên cây ca cao ở Việt Nam, và
(ii) tuyển chọn được một số vi sinh vật đối kháng có khả năng phòng trừ nấm
Phytophthora palmivora.

2


Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen qua
ca cao trên Thếgiới vàViêṭNam
1.1.1. Tình hình thiệt hại do nấm Phytophthora palmivora gây bệnh thối đen quả
ca cao gây nên
Bệnh thối đen quả ca cao (black pod), do nấm Phytophthora palmivora gây
ra, là bệnh phổ biến và gây hại nghiêm trọng nhất đối với các vùng trồng ca cao trên
thế giới , ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng hạt ca cao . Bệnh không
chỉ gây hại trên quả từ giai đoạn còn non cho đến khi quả chín mà còn gây hại cả
trên thân, cành và lá. Ước tính thiệt hại hàng năm do bệnh thối đen quảca cao
gây ra trên thếgiới làrất lớn

, làm giảm năng suất ca cao từ

10 - 30% và có thể

lên đến 90 - 100%, phụ thuộc vào vị trí địa lý, giống trồng trọt, chủng gây bệnh và
điều kiện môi trường từng vùng [43; 21]. Một số quốc gia như Cameroon, Nigeria
hay Ghana bệnh đã làm giảm gần 30% sản lượng với tỷ lệ quả bị bệnh từ 30 - 80%
có khi lên tới 100%. Còn tại Malaysia bệnh đã làm giảm sản lượng từ 5
- 70% [47]. Tại Indonesia, nấm Phytophthora đã tấn công trên 138 loài cây trồng,

chỉ riêng loài P. palmivora gây bệnh thối đen quả ca cao đã làm thiệt hại
26 - 56% sản lượng ca cao tại Java
quả ca cao cũng lên đến

[52]. Tại Samoa , thiêṭhaịdo bênḥ thối

60 - 80%. Tại Papua New Guinea

gây haịquảca cao làm thiêṭhaịnăng suất từ

đen

, nấm P. palmivora

5 - 39% [53]. Tại đảo Solomon,

bệnh thối thân hàng năm làm giảm 13% năng suất, cá biệt có những vùng bị thiệt
hại đến 40% năng suất [49]. Tại Malaysia, bệnh thối quả ca cao do nấm P.
palmivora gây ra có những năm có thể làm giảm tới 70% sản lượng ca cao [47].

Cho đến nay trên thế giới có 8 loài nấm Phytophthora gây hại trên cây ca cao
đã được phát hiện, bao gồm: P. palmivora, P. megakarya, P. capsici, P. katsurae, P.
citrophthora, P. arecae, P. nicotianae và P. megasperma. Trong đó xuất hiện phổ
biến nhất là loài P. palmivora. Chỉ riêng loài nấm này đã làm thiệt hại hàng năm
khoảng 1 tỷ đôla trên cây ca cao.

3


Theo Fulton (1989), nấm P. palmivora có thể tồn tại trong đất trên 3 năm sau
khi đã nhổ bỏ cây bệnh [36]. Jackson và Newhook (1978) quan sát thấy nguồn bệnh
có thể tồn tại trên vỏ cây, lá cây khỏe, trên cả cây che bóng. Tác giả đã phát hiện
thấy nấm P. palmivora trên lá của cây keo dậu Cuba (Leucaena leucocephala L) là
một loài cây được khuyến cáo làm cây che bóng tốt cho cà phê và ca cao [40].
Theo Drenth và Guest (2004) có khoảng 60 loài nấm Phytophthora gây hại
cho cây trồng. Nấm Phytophthora là một trong những vi sinh vật gây bệnh và phá
hủy cây trồng lớn nhất ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới , gây thiệt hại hàng năm
đến hàng tỷ đôla . Sự tác động qua lại giữa một loạt các cây ký chủ, yếu tố gây bệnh
và môi trường làm cho nấm Phytophthora trở thành một loại tác nhân gây bệnh rất
khó phòng trừ tại vùng nhiệt đới ẩm, nguyên nhân do nấm có khả năng tạo ra nhiều
dạng bào tử, thời gian xâm nhiễm vào mô cây ký chủ của bào tử nấm rất ngắn, chỉ
trong vòng 3 - 5 ngày, nhiều loại thuốc trừ nấm không có tác dụng trong phòng trừ
và nấm phát triển mạnh trong điều kiện ẩm ướt [30]. Theo Burgess và cs (2008),
nấm Phytophthora là đối tượng gây hại nguy hiểm và khó phòng trừ vì chúng có
khả năng sống sót ở trong đất trong một thời gian dài khi không có mặt của cây ký
chủ thông thường [24].
Việt Nam là nơi khá thích hợp cho việc trồng ca cao. Theo dự án phát
triển ca cao của Bộ Nông Nghiệp & PTNT, diện tích trồng ca cao của ViêṭNam là
20.000 ha vào năm 2010 và se ̃tăng lên 100.000 ha vào năm 2020, gồm 4 khu vực
tiềm năng là Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, Duyên Hải Trung Bộ và Trung Nam Bộ.

Cây ca cao đáp ứng cho 3 chương trình lớn của quốc gia là phủ xanh đồi trọc, xóa
đói giảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa và đa dạng hóa hệ thống cây trồng [1]. Khi
hình thành các vùng sản xuất ca cao hàng hóa tập trung đã có nhiều loài dịch hại
quan trọng phát triển nhanh và gây hại nặng, làm giảm năng suất, chất lượng ca cao
đặc biệt là bệnh thối đen quả ca cao. Bệnh phát triển mạnh vào mùa mưa, trong môi
trường có độ ẩm cao [10].
Theo kết quả điều tra của Trần Kim Loang và cs
đen quảca cao ở Đăk Lăk lên đến

(2001 ), tỷ lệ bệnh thối

25 - 30%, có những vườn tỷ lệ quả nhiễm

4


bệnh chiếm 65 - 70% và hầu như không cho thu hoạch . Ở Bình Phước, tỷ lệ bệnh
trung bình cũng chiếm khoảng 20 - 25%, có nhiều vườn cũng không cho thu hoạch
[7].
Để phát triển ca cao có hiệu quả, bền vững cần phải có các biện pháp phòng
chống dịch hại hiệu quả để áp dụng sản xuất. Tuy nhiên cho đến nay chưa có các cơ
quan chuyên môn nào quan tâm đến việc xác định các loài dịch hại quan trọng, đề
xuất các biện pháp phòng trừ, trên cơ sở đó xây dựng các mô hình sản xuất ca cao
hiệu quả bền vững chuyển giao cho sản xuất.
1.1.2. Đặc điểm sinh học và sinh thái của nấm Phytophthora palmivora
P. palmivora có sợi nấm to nhỏ không đều, đường kính sợi từ 2 - 6 µm. Cành
bào tử phân sinh dài 120 - 150 µm. Bào tử nang hình quả chanh, núm đỉnh rõ ràng,
kích thước 29,3 - 49,4 µm. Khi nảy mầm tạo nhiều động bào tử, có hai lông roi có
khả năng bơi lội trong nước. Trong điều kiện sống bất thuận có khả năng sản sinh
ra bào tử hậu hình tròn, rìa mép nhăn, vỏ dày 3 - 4 µm màu vàng nhạt. Bào tử hữu

tính (bào tử trứng) hình tròn vỏ nhẵn, không màu, đường kính 15 - 27 µm [34].
Trong điều kiện có nước và nhiệt độ thấp, bào tử tạo thành nhiều bào tử
động nhanh chóng di chuyển theo nước xâm nhiễm lây bệnh qua miệng cắt mặt
cạo, qua vết thương cơ giới và lỗ hở tự nhiên của cây. Sợi nấm xuyên sâu vào các
mô tế bào mạch libe, qua mô phân sinh tới mạch gỗ. Bệnh hại trên mặt cạo có thời
kỳ tiềm dục từ 3 - 8 ngày [35].
o

Nấm P. palmivora phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 16 đến 32 C, độ
ẩm không khí từ 80 đến 95%, nhất là trong mùa mưa. Tuy nhiên, ở nhiệt độ dưới
o

o

10 C hay trên 35 C nấm ngừng phát triển.

5


Hình 1.1. Sơ đồchu trinh̀ sống của nấm Phytophthora [8]

Hình 1.2. Hình thái học của Phytophthora palmivora [8]. Hàng
dƣới là túi noãn hình cầu với túi đực có nhụy kép và một bọc bào
tử hình trứng với một cuống ngắn. Hàng trên là sự thay đổi trong
hình dạng của các bọc bào tử.
1.1.3. Qui luật phát sinh và phát triển của bệnh
a. Chu kỳ phát triển bệnh
Nấm Phytophthora là loài nấm tồn tại trong đất. Tuy nhiên P. palmivora có
khả năng xâm nhiễm vào những bộ phận bên trên của cây ca cao gây loét thân,

6


cháy lá và thối quả. Khi điều kiện môi trường thuận lợi, mầm bệnh nguyên thuỷ bắt
đầu gây dịch bệnh. Trong điều kiện nhiệt đới ẩm ướt, sự phát triển của Phytophthora
kéo dài liên tục suốt năm, có thể chu kỳ bệnh không bị gián đoạn [54].

Ban đầu mầm bệnh nguyên thuỷ của Phytophthora sp. là những sợi nấm và
hậu bào tử tồn tại ở rễ, vỏ cây và quả bị nhiễm bệnh trước đây. Trong điều kiện
thuận lợi mầm bệnh nguyên thuỷ nảy mầm và bắt đầu xâm nhiễm. Nếu sự nhiễm
bệnh này phát triển thì việc nảy mầm của mầm bệnh thứ cấp được hình thành, đó là
nguồn lan truyền của dịch bệnh. Tỷ lệ phát sinh và lan truyền của mầm bệnh là cơ
sở quyết định sự nhiễm bệnh mới. Dịch bệnh bùng phát do sự gia tăng một cách
nhanh chóng của mầm bệnh thứ cấp [30].
Ví dụ chỉ có một bào tử động đầu tiên nhiễm vào quả ca cao, mô bệnh phát
triển nhanh chóng và sẽ phóng thích ra 4 triệu bào tử nang từ một quả bệnh trong
một tuần [50]. Bào tử nang cũng được hình thành trên tàn dư cây bệnh ở bề mặt đất
và được phóng thích vào những vũng nước hoặc kênh rạch, sông và những đập
nước, nguồn bệnh được lan truyền nhanh chóng theo nguồn nước. Sau khi tiếp xúc
và xâm nhập vào cây, chỉ trong vòng ba ngày nấm có thể nhân đủ số lượng để gây
bệnh và hình thành triệu chứng điển hình [15].
b. Quá trình lây lan của nấm
Việc kiểm tra chặt chẽ triệu chứng bệnh có thể giúp xác định được đặc điểm
sinh học và chu kỳ bệnh của tác nhân gây bệnh. Nấm Phytophthora có thể xâm
nhiễm trên những bộ phận khác nhau của quả ca cao. Đốm bệnh có thể bắt đầu từ
cuống và lan xuống là do tiếp xúc trực tiếp với đốm bệnh loét thân, quả hoặc với
những tổ kiến được tha từ đất bị tạp nhiễm bệnh, hoặc du động bào tử có thể theo
dòng nước chảy từ đất xâm nhiễm vào quả trong mùa mưa, do đó nấm
Phytophthora còn được gọi là nấm thủy sinh. Mô bệnh hình thành tại đầu mút của
quả là do mầm bệnh truyền qua nước từ nhựa quả hoặc nhựa gỉ của bệnh loét thân

chảy xuống hoặc từ đất bắn vào những quả tiếp giáp với mặt đất. Nấm xâm nhập
vào thân cây, quả qua vết thương cơ giới do sâu hoặc vết xước trên cây.
Những phân tích ở trên cho thấy nguồn gốc của mầm bệnh và hình thức lan
truyền của P. palmivora trên cây ca cao. Mầm bệnh lan truyền từ đất vào cây là kết

7


quả tác động của con người, của mưa, của kiến, mối, sên và bọ cánh cứng. Khi đó
trên cây mầm bệnh thứ cấp xuất hiện để nhiễm vào quả, thân, hoa và lá. Mầm bệnh
thứ cấp lại tiếp tục xâm nhiễm bằng sự tiếp xúc trực tiếp qua các công cụ lao động,
qua nước mưa, kiến và bọ cánh cứng [44].
1.1.4. Một số nghiên cứu về phân lập nấm Phytophthora
1.1.4.1. Sử dụng hóa chất chọn lọc trong môi trường phân lập nấm Phytophthora
Một trong những nguyên lý cơ bản của sự phân lập chọn lọc là sử dụng một
hoặc nhiều hóa chất trong môi trường để ngăn cản sự phát triển của cả nấm và vi
khuẩn tạp nhiễm, nhưng ít hoặc không ảnh hưởng tới sự phát triển của nấm
Phytophthora.
Việc khám phá ra những kháng sinh đặc hiệu có thể kháng được nhiều loại
nấm khác như: pimaricin, nystatin đã làm thay đổi trong phương pháp phân lập và
khuyến khích nghiên cứu trên toàn thế giời về những môi trường chọn lọc để phân
lập nấm Phytophthora, nhằm loại bỏ sự phát triển của vi khuẩn và các loại nấm
khác. Theo Larkin và cộng sự (1995), tỷ lệ nảy mầm của bào tử hậu của nấm P.
parasitica và bào tử nang của nấm P. palmivora trên môi trường bột ngô agar kết
hợp với pimaricin với các liều lượng 1,5; 3; 6 và 12 µg/ml cao hơn trên môi trường
bột ngô agar không kết hợp với pimaricin. Ở liều lượng 25, 50 và 600 µg/ml làm
giảm tỷ lệ nảy mầm 20 - 30% so với đối chứng [46].
Rifampicin (10µg/ml) làm giảm khoảng một nửa sự nảy mầm của du động
bào tử và sự phát triển của ống mầm nấm Phytophthora, nhưng là hợp chất ngăn cản
hoàn toàn sự tạp nhiễm của vi khuẩn [38].

Theo Papavizas và cs (1981), Benomyl là một thuốc trừ nấm (tên thương
phẩm là Benlat) thường được sử dụng để thay thế hoặc bổ sung cho pimaricin, ở
liều lượng 10 - 25 µg/ml nó có thể khử được nhiều loại nấm đất (nhưng không diệt
Phytophthora) [51].
Hymexazol ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm Pythium, những loài nấm
này tồn tại trong đất và xung quanh vùng rễ của hầu hết các cây. Hợp chất kháng
nấm pimaricin hoặc benomyl sử dụng trong môi trường phân lập nấm Phytophthora

8


đều không có khả năng ức chế được nấm Pythium, trong khi đó nấm Pythium cũng
là trở ngại lớn trong quá trình phân lập Phytophthora do khả năng mọc của chúng
trên môi trường nhanh hơn các loài Phytophthora [48].
1.1.4.2. Một số phương pháp sử dụng mồi bẫy trong phân lập nấm Phytophthora sp.
Hầu hết các loài Phytophthora thường khó phân lập từ các mô bệnh cũ hoặc từ đất,
vì thế phương pháp bẫy được sử dụng trong gần nửa thế kỷ để hỗ trợ cho
việc phân lập loài nấm này.
Về nguyên tắc, phương pháp bẫy lợi dụng tính gây bệnh chọn lọc của loài
Phytophthora đối với mô ký chủ còn sống, các mô cây ký chủ này sẽ được coi là môi
trường chọn lọc, sau đó vết bệnh do nấm Phytophthora gây ra sẽ được phân lập trên
môi trường chọn lọc nhân tạo. Ví dụ, đặc điểm vết bệnh trên quả táo do nấm
Phytophthora gây nên thường rắn, cứng dễ nhận biết, còn những vết hoại do Pythium
và vi khuẩn gây nên thường thối mềm, nhũn. Một số cây ký chủ được sử dụng để bẫy
nấm Phytophthora như: quả táo, quả ca cao xanh, quả lê, quả bơ, quả chanh, cánh hoa
cẩm chướng, cánh hoa hồng, lá thông, mẩu lá đậu tương, cây đậu lupin [31].

1.1.5. Một số nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong xác định các
loài nấm Phytophthora gây hại cây trồng
Theo Duncan và Cooke (2002), trước giai đoạn phát triển của sinh học phân

tử, tất cả các loài nấm thật (fungi) và nấm noãn (oomyces, kể cả các loài thuộc chi
Phytophthora) đều được xác định dựa trên các đặc điểm hình thái và sinh học. Cách
xác định truyền thống này nhìn chung khá khó và dễ tạo ra kết quả không chính xác
đối với các loài nấm Phytophthora. Các đặc điểm hình thái của nấm Phytophthora
có giá trị chuẩn đoán thường không thống nhất, phụ thuộc nhiều vào loài và điều
kiện nuôi cấy [32].
Hiện nay, việc xác định và phân loại cũng như phân tích quan hệ của các loài
Phytophthora có thể được thực hiện khá dễ dàng dựa trên các kỹ thuật phân tích
phân tử, nhiều vùng gen của Phytophthora đã được lựa chọn làm đối tượng nghiên
cứu như các vùng mã hóa và không mã hóa của DNA ribosome (rDNA), các gen mã
hóa cytochrome oxidase I và II của ty thể [18].

9


Một số phương pháp hiện đại đã được ứng dụng trong nghiên cứu về nấm
Phytophthora. Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn giới hạn (Restriction fragment
length polymorphism - RFLP) là một trong những kỹ thuật được sử dụng. Kỹ thuật
này dựa trên việc cắt bằng Enzyme cắt giới hạn (RE - Restriction enzyme) các gen
nghiên cứu của vi sinh vật. Mặc dù 2 cá thể cùng loài có bộ gen đồng nhất thì chúng
vẫn khác nhau một số nucleotide do các nguyên nhân sau: đột biến điểm, thêm/ mất,
chuyển vị trí, đảo vị trí và lặp (duplication) nucleotide. Kết quả là sản phẩm cắt
DNA sẽ có số lượng và kích thước thay đổi. Phân tích rDNA-RFLP đã được sử
dụng trong xác định nấm P. palmivora MF4 từ các loài phân lập trên cây ớt [34].
Kong và cs (2004), đã sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chuỗi đơn PCRSSCP (Single strand conformational polymorphism) cho rDNA- ITS để chẩn đoán
nhanh Phytophthora ramorumich. Các tác giả đã sử dụng một cặp mồi đặc hiệu với
nấm thuộc oomycete (mồi xuôi (forward primer) ITS6: 5’-GAA GGT GTC GTA
ACA AGG-3’, tại vị trí trong 18S rDNA và mồi ngược (reverse primer) ITS7: 5’AGC GTT CTT CAT CGA TGT GC-3’, được định vị trên 5-8 S rDNA) để khuếch
đại các đoạn rDNA [26]. Các rDNA sợi đơn có trình tự khác nhau sẽ có cấu hình
không gian khác nhau và vì vậy khi được phân tích điện di sẽ dừng lại ở những vị trí

khác nhau trên bản gel.
Kỹ thuật dựa trên phân tích đa hình đoạn dài khuếch đại (Amplified fragment
length polymorphism - AFLP) cũng được áp dụng để nghiên cứu nấm
Phytophthora. AFLP là một trong các kỹ thuật hiệu quả nhất khi nghiên cứu DNA
fingerprinting và kỹ thuật này kết hợp ưu điểm của RFLP (RE trên toàn bộ bộ gen)
và PCR. Đặc điểm quan trọng nhất của AFLP là khả năng đánh giá mức độ đa hình
trên toàn bộ bộ gen hay nói cách khác là kiểm tra đồng thời một cách ngẫu nhiên
các sản phẩm từ nhiều locus trên [39].
Theo tác giả Blair và cộng sự (2008), các phân tích phân tử nhằm xác định
cũng như đánh giá mối quan hệ của các loài nấm Phytophthora chủ yếu dựa vào các
vùng liên gen ITS (internally transcribed spacers) của cụm gen rDNA. Các rDNA
của nấm Phytophthora cũng như của các sinh vật nhân thật (Eukaryote) được tổ

10


chức thành các đơn vị phiên mã. Mỗi đơn vị phiên mã có thể được lặp lại nhiều lần
trên bộ genome. Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các đơn vị phiên mã thường lặp
lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm đơn vị phiên mã. Một đơn vị phiên mã gồm
các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-28S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS
ký hiệu là ITS1 (ở đầu 5’) và ITS2 (ở đầu 3’) [22].
Theo Duncan & Cooke (2002), các vùng ITS do có tốc độ đột biến tương
ứng với tốc độ biến hóa loài (tiến hóa trung tính) nên có thể phân biệt mối quan hệ
tới mức loài, như đã được chứng minh đối với các loài nấm Phytophthora [32].
1.2. Tình hình nghiên cứu biêṇ pháp phòng trừ sinh học bệnh thối đen qua ca
cao trên Thếgiới vàViêṭNam
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng phòng trừ sinh học là biện pháp hữu hiệu
bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của bệnh hại và an toàn với môi trường. Phòng
trừ sinh học được định nghĩa là làm giảm mật độ của VSV gây hại hoặc hoạt động
của VSV gây hại bằng một hay một số tác nhân VSV có ích khác [20]. Tác động

trực tiếp của phòng trừ sinh học là sử dụng các VSV đối kháng đặc hiệu để hạn chế
tác hại của bệnh hoặc sự tồn tại của VSV gây hại. Cơ chế tác động của các tác nhân
VSV có ích trong phòng trừ sinh học bao gồm: cạnh tranh dinh dưỡng và nơi cư trú
của VSV có ích và VSV gây hại; các VSV có ích sản sinh ra các chất kháng sinh,
enzyme phân giải, các hoạt chất có độc tính hạn chế mật độ của VSV gây hại; ký
sinh bậc hai và tăng cường hiệu quả của các loài VSV khác dưới tác động của VSV
có ích [27].
Những tiến bộ đạt được gần đây trong biện pháp sinh học bao gồm việc định
danh các tác nhân phòng trừ sinh học như các xạ khuẩn, nấm trong đó có
Trichoderma sp., Gliocladium sp. và Chaetomium globosum. Các tác nhân này đều
có thể hạn chế sự phát triển của nấm Phytophthora sp., phần lớn bằng sự phân giải
sợi nấm, nhưng cũng có thể kích thích sự phát triển của vật chủ [56; 25; 41; 33].
Hoạt động phòng trừ sinh học có thể được tiến hành một cách thủ công bằng
cách đưa các vật đối kháng ngoại lai vào trong đất, hoặc bằng cách kích thích hoạt
động của các đối kháng nội sinh thông qua việc bổ sung thêm các lớp che phủ hoặc

11


phân hữu cơ [34]. Chẳng hạn, sử dụng chất hữu cơ (lớp che phủ, vỏ gỗ thông được
chế thành phân trộn...) có vi sinh vật hoạt động mạnh và độ pH thấp sẽ giúp phòng
chống được P. cinnamomi ở trong các cây được trồng tại các vườn ươm [56].
Mycorhizae cũng có tác dụng phòng trừ sinh học đối với P. cinnamomi giống như đã
được xác định trên cây thông và dứa [19].
Theo Broadley (1992), rất nhiều nấm có ích đã được chỉ ra có thể bảo vệ ca
cao chống lại nấm gây bệnh bao gồm cả Phytophthora. Cách thức hoạt động chủ
yếu của những loài ký sinh này thông qua hoạt động của các vi sinh vật đối kháng
trực tiếp [23].
1.2.1. Nấm Trichoderma sp. đối kháng nấm P. palmivora
1.2.1.1. Cơ chếtác đôngg̣ của nấm Trichodermasp. lên các tác nhân gây bênḥ cây

trồng Từ thập kỷ 60 trở đi có nhiều công trình trên thế giới nghiên cứu về nhóm
nấm Trichoderma. Diby và cs (2003) công bố rằng nấm Trichoderma là những
thành viên phổ biến của hệ vi sinh vật đất. Sự phân bố của chúng trong đất phụ
thuộc vào vùng địa lý, kiểu đất, điều kiện khí hậu, thảm thực vật. Nhóm nấm này có
khả năng đối kháng với các vi sinh vật khác do nó có khả năng tiết ra các chất
kháng sinh, enzyme hoặc các chất có hoạt tính sinh học cao khác. Các chất này
thường độc hại đối với vi sinh vật gây bệnh. Nấm Trichoderma có khả năng ức chế
các nấm bệnh nhất là đối với các loại nấm gây bệnh đường ống dẫn: Rhizoctonia,
Sclerotium, Verticillium, Pythium. Bên cạnh tác động qua lại trong quần thể, nấm
Trichoderma còn tác động trực tiếp lên sự phát triển của cây trồng. Trong hoạt động
sống, nấm Trichoderma sản sinh ra các enzyme phân huỷ như glucolase, xenlulase.
Nhờ các enzyme này mà các chất hữu cơ trong đất được phân huỷ nhanh hơn làm
tăng các chất dinh dưỡng dưới dạng dễ hấp thụ cho cây trồng. Từ đó làm cho cây
trồng sinh trưởng phát triển tốt hơn [29].
Rất nhiều nghiên cứu về vi sinh vật đã cho thấy nấm Trichoderma là một
trong những nhóm đứng đầu của vi sinh vật trong đất có tính đối kháng với VSV
gây bệnh cây trồng và được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới. Việc

12