Đánh giá mức độ ảnh hưởng của tảo haematococcus pluvialis lên sức đề kháng cá tra nuôi (pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuẩn (edwardsiella ictaluri)​

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP.
HCM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ẢNH HƯỞNG CỦA TẢO
Haematococcus pluvialis LÊN SỨC ĐÊ KHÁNG CÁ TRA
NUÔI (Pangasianodon hypophthalmus) ĐỐI VỚI BỆNH
GAN THẬN MỦ DO VI KHUẨN (Edwardsiella ictaluri)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. VÕ MINH SƠN
Sinh viên thực hiện
MSSV: 0851110182

: NGÔ THANH PHONG

Lớp: 08DSH4

TP. Hồ Chí Minh, 2012


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG I : GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là một trong những loài thủy sản
nước ngọt xuất khẩu chiến lược của Việt Nam.Theo Tổng cục Thủy sản năm (2011),
diện tích nuôi cá tra đạt 5.400 ha và sản lượng đạt trên 1,141 triệu tấn trong năm 2010;
diện tích nuôi và sản lượng cá tra ước đạt 6.000 – 6.300 ha và 1,2 – 1,3 triệu tấn năm
2011 (Phạm Thị Kim Oanh, 2011). Sản lượng cá tra ngày càng gia tăng đi đôi với sự
suy thoái môi trường do nước thải và bùn ao nuôi cá tra thâm canh, dẫn đến bùng phát
dịch bệnh gây thiệt hai cho người nuôi cá tra. Trong đó bệnh gan thận mủ do vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri xảy ra thường xuyên gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi
cá. Để quản lý dịch bệnh thì kháng sinh đã và đang là sự lựa chọn hàng đầu của người
nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên việc làm dụng sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất
diệt khuẩn đã dẫn đến hệ lụy là tạo ra những chủng vi khuẩn, virus có khả năng kháng
lại kháng sinh, tăng độc lực. Do đó nhiều phương pháp thân thiện với môi trường đã và
đang được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản như vaccine, probiotic, chất tăng cường
hệ miễn dịch. Trong đó chất kích thích miễn dịch cũng đang được sử dụng rất rộng rãi
trong nuôi trồng thủy sản nhằm mục đích tăng cường sức đề kháng thông qua tăng
cường hệ miễn dịch không đặc hiệu, tiết ra các chất kháng khuẩn, kích thích khả năng
sinh trưởng và phát triển. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên chúng tôi thực hiện đề
tài “Đáng giá mức độ ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên sức đề kháng
của cá tra nuôi (Pangasianodon hypophthalmus) đối với bệnh gan thận mủ do vi khuần
Edwardsiella ictaluri” nhằm mục đích tăng cường khả năng chống chịu của cá tra đối
với vi khuẩn gây bệnh.

1


Đồ án tốt nghiệp

1.2 Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên

của cá tra nuôi kháng bệnh gan thận mủ.
1.3 Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis đến khả năng kháng bệnh

-

bệnh gan thận mủ của cá tra nuôi.
-

Khảo sát ảnh hưởng của tảo Haematococcus pluvialis lên hệ miễn dịch tự nhiên

cá tra nuôi thông qua các thông số miễn dịch
 Hoạt động thực bào (Phagocyte activity)
-

 Sản sinh O2 (Superoxide anion production)
 Hoạt tính lysozyme (Lysozyme activity assay)

2


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG II : TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1

Tổng quan Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)

2.1.1 Giới thiệu chung Cá tra
2.1.1.1 Phân bố

Cá tra (Pagasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị
kinh tế cao, được nuôi phổ biến ở một số quốc gia như: Việt Nam, Lào, Thái Lan,
Campuchia…Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số
tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền
Giang…(Đồng Thanh Hà và ctv, 2009).
2.1.1.2 Phân loại
Giới: Animalia
Ngành: Chordata
Phân ngành: Vertebrata
Lớp: Actinopterygii
Phân lớp: Neopterygii
Liên bộ: Ostariophysi
Bộ: Siluriformes
Họ: Pangasiidae
Hình 2.1: Cá Tra [ 50]

Loài: Pangasianodon
hypophthalmus
(Sauvage, 1878)

2.1.2 Đặc điểm cá Tra
2.1.2.1 Đặc điểm sinh lý
Cá tra có thân dài, không vẩy, màu sắc đen xám, bụng hơi bạc, miệng rộng và có
2 đôi râu dài. Cá sống chủ yếu ở nước ngọt, chịu được nước lợ nhẹ (độ muối dưới
10%0), chịu đựng được nước phèn có pH > 4. Cá tra có cơ quan hô hấp phụ nên có thể

3


Đồ án tốt nghiệp

sống được trong các ao hồ chật hẹp, thiếu oxi nên nuôi được mật độ rất cao (Phạm Văn
Khánh và ctv, 2011).
2.1.2.2 Đặc điểm sinh học cá tra
Hiện nay đã có 11 loài thuộc họ cá tra được tìm thấy ở Việt Nam. Khi nuôi trong
ao, cá tra có khả năng thích nghi với nhiều loại thức ăn: mùn bã hữu cơ, cám, rau, động
vật đáy, thức ăn hỗn hợp.
Trong tự nhiên, cá tra có thể sống trên 20 năm. Tuổi thành thục của cá tra từ 3 4 năm. Vào mùa thành thục từ tháng 4 trở đi cá có tập tính bơi ngược dòng di cư tìm
đến các bãi đẻ, nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh dục
và đẻ trứng. Vì vậy, cá không đẻ tự nhiên ở phần sông MêKông của Việt Nam. Bãi đẻ
của cá nằm ở khu vực từ địa phận Cratie của Campuchia trở lên. Tại các bãi đẻ, cá bố
mẹ đẻ trứng thụ tinh tự nhiên, trứng dính vào cây cỏ thủy tinh ven bờ. Sau khi nở, cá
bột trôi theo dòng nước về hạ lưu đến các vùng ngập nước ở Campuchia và xuôi dòng
theo sông MêKông về phía Việt Nam (Phạm Văn Khánh và ctv, 2011).
2.1.3 Tình hình nuôi cá tra ở Việt Nam
Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có hệ thống sông rạch chằng chịt, là điều
kiện thuận lợi cho việc phát triển nông nghiệp và đánh bắt thủy sản. Từ năm 1940 nghề
nuôi cá nước ngọt bắt đầu phổ biến và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) và cá basa (Pangasius bocourti) là loài nuôi trồng thủy sản được nuôi
thông dụng nhất đang đươc phát triển với tốc độ nhanh tại các tỉnh ĐBSCL (chủ yếu ở
2 tỉnh An Giang và Đồng Tháp). Đến nay, cá tra đã được nuôi ở hầu hết các tỉnh thành
như Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long, Hậu Giang
(Tạp chí thủy sản, 2012).

4


Đồ án tốt nghiệp

2.1.4 Một số bệnh thường gặp trên cá tra

 Bệnh đốm đỏ
Tác nhân gây bệnh
Bệnh đốm đỏ còn gọi là bệnh xuất huyết, bệnh nhiễn trùng máu, bệnh sởi... Là bệnh
do vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây ra. Ngoài ra, một số trường hợp phân lập được
vi khuẩn A. sobria, A. caviae hoặc Pseudomonas sp trên cá bị bệnh đốm đỏ.

Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh đốm đỏ có 4 loại hình biểu hiện qua mức độ và trạng thái bệnh của cá: bệnh
cấp tính, bệnh thứ cấp tính, bệnh ác tính, bệnh mãn tính (Từ Thanh Dung và ctv, 2005).
 Bệnh nấm thủy mi

Tác nhân gây bệnh
Nguyên nhân gây ra bệnh này là 2 giống nấm thường có trong nước, nhất là nước
bẩn và trong bùn ao là Saprolegnia và Achlya, thuộc họ Saprolegniaceae. Sợi nấm dài
và trong, có phân nhánh hoặc không phân nhánh, không có vách ngăn. Phần dưới cắm
sâu vào tổ chức cơ thể cá, phần trên lơ lửng trong nước trông như bông, vì thế người
nuôi cá miền Nam gọi là bệnh "bệnh bọ gòn".
Dấu hiệu bệnh lý
Khi mới ký sinh, mắt thường khó nhìn thấy, phần cuối sợi nấm đâm sâu vào khe
của tổ chức da và mang của cá. Phần đầu lơ lửng trong nước có màu trắng. Cá có cảm
giác ngứa ngáy, gầy, đen sẫm. Bệnh thường xảy ra ở cá mè, rô phi, tra bị thương... Khi
nấm đã phát triển trong tổ chức của cá, điều kiện phục hồi bệnh này khó khăn. Nấm
ngày càng phát triển lớn hơn. Vi khuẩn có điều kiện xâm nhập vào làm bệnh nặng
thêm. Kết quả dẫn đến sự chết của các tổ chức của cá và làm chúng rời ra khỏi cơ thể,
tuy cá còn sống mà trên thân có chỗ chỉ còn xương.
0

Khi ấp trứng cá gặp thời tiết lạnh, nhiệt độ nước dưới 20 C trong một thời gian
ngắn nấm thủy mi phát triển bao phủ toàn bộ trứng. Nấm làm hư trứng vì nấm hút chất

5


Đồ án tốt nghiệp

dinh dưỡng của trứng và tạo điều kiện thuận lợi cho vi trùng trong nước phát triển trên
bề mặt của vỏ trứng, làm cho trứng bị ung và thối rữa nhanh (Từ Thanh Dung và ctv,
2005).
 Bệnh mủ gan do vi khuẩn E. ictaluri trên cá tra

Tác nhân gây bệnh
Tác nhân chính gây bệnh được xác định là Edwardsiella ictaluri (Crumlish và
ctv, 2002).
Dấu hiệu bệnh
Dấu hiệu bên ngoài: Cá bệnh nổi trên mặt nước , bơi lờ đờ cặp mé, màu sắc nhợt
nhạt nhưng chỉ có dấu hiệu giảm ăn trong một thời gian ngắn sau đó ăn trở lại bình
thường. Trên cơ thể có những đốm xuất huyết ở mõm, các gốc vi, nắp mang, hậu môn,
mang màu sắc nhạt, bụng chướng to, đôi khi có những hiện tượng mắt lồi (Nguyễn Thị
Thúy Liễu và ctv, 2008).
Dấu hiệu bên trong: Cá bệnh dạ dày trướng hơi, mạch máu trương to, gan màu
sắc nhạt, thận sưng, có dịch lỏng hơi đỏ bên trong xoang nội quan. Trên gan, thận, tỳ
tạng có những đốm nhỏ màu trắng đục kích cỡ không đều (đường kính khoảng 1-3
mm). Đôi khi có hiện tượng nhũng thận ở cá bệnh nặng. Cá mới chớm bệnh chỉ thấy
xuất hiện những đốm trắng trên thận (Nguyễn Thị Thúy Liễu và ctv, 2008).
Theo Bùi Quang Tề và ctv (2006) cá bệnh còn có dấu hiệu bụng trương to, xuất
huyết gốc vây, mắt lồi, xung quanh miệng xuất hiện các đốm xuất huyết.
Tình hình bệnh gan thận mủ trên cá tra
Bệnh xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở một số vùng nuôi cá tra thâm
canh trọng điểm như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó lan rộng ra hầu hết các
tỉnh ĐBSCL trong thời gian gần đây (Từ Thanh Dung và ctv, 2009).

Bệnh xuất hiện ở hầu hết các giai đoạn phát triển của cá tra, tập trung ở giai
đoạn cá giống và cá thịt có khối lượng nhỏ hơn 300 gram. Bệnh có thể gây chết tích

6


Đồ án tốt nghiệp

lũy 10-90% cá nuôi nếu không có biện pháp can thiệp kịp thời khi bênh xảy ra (Từ
Thanh Dung và ctv, 2009).
Phòng và trị bệnh E.ictaluri trên cá tra
Trong quá trình nuôi tác phòng ngừa dịch bệnh luôn được xem là quan trọng hơn
chữa trị. Việc phòng ngừa bệnh tốt không những hạn chế sự xuất hiện của dịch bệnh
mà còn là tiêu chí hàng đầu làm tăng giá trị sản phẩm cá tra, giảm chi phí nuôi và tăng
lợi nhuận cho người nuôi. Có thể áp dụng các biện pháp sau để phòng trị bệnh mủ gan
trên cá tra: quản lý tốt môi trường ao nuôi, mật độ thả nuôi thích hợp, chế độ dinh
dưỡng phù hợp, sử dụng chế phẩm vi sinh học, sử dụng vaccine để phòng (Từ Thanh
Dung và ctv, 2005).
2.2

Tổng quan vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

2.2.1 Hệ thống phân loại theo Bergey
Ngành: Proteobacteria
Lớp: Gramma Proteobacteria
Bộ: Enterobacteriales
Họ: Enterobacteriaceae
Chi: Edwardsilla
Loài: Edwardsiella ictaluri
Hình 2.2: Vi khuẩn

2.2.2 Đặc điểm sinh hóa

Edwardsiella ictaluri [48]
Edwardsiella ictaluri là vi khuẩn Gram âm, yếm khí tùy nghi, có dạng hình que,

kích thước 1 x 2-3 µm, không sinh bào tử. Trên môi trường Blood agar sau 48 giờ
khuẩn lạc có màu trắng đục, tròn, bờ đều bóng, đường kính từ 1,5 – 2 mm. Phát triển
0

tốt trên môi trường thạch máu, BHI, nhiệt độ thích hợp ở 28 - 30 C, pH 6 - 7 (Holt và
ctv, 1994)

7


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 2.1: Bảng thử nghiệm sinh hóa của Edwardsiella ictaluri (Holt và ctv, 1994)

Thử nghiệm sinh hóa
Indol
Methyl red
Simmons Citrate
H2S
Lysine decarboxylase
Ornithin decarboxylase
Motility
Malonate
D-Glucose, gas production

Acid production from:
L-Arabinose
Lactose
D-Mannitol
Melblose
L-Rhamnose
D-Sorbitol
Trehalose
D-Xylose
ONPG
Chú thích: D (Depend): phụ thuộc tùy từng nơi mà có kết quả dương hoặc âm.

8


Đồ án tốt nghiệp

2.2.3 Con đường xâm nhiễm của Edwardsiella ictaluri
Từ nguồn nước vi khuẩn có thể xâm nhập vào cá qua 2 con đường:

Vi khuẩn trong nước có thể qua đường mũi của cá xâm nhập vào cơ quan khứu
giác vào bên trong dây thần kinh khứu giác và sau đó lên não. Sự truyền nhiễm lan
rộng từ màng não đến sọ và da (thường được gọi là “hole in the head”) (Shotts và ctv,

1986).
E.ictaluri có thể theo đường tiêu hóa và đi vào trong máu xuyên qua ruột dẫn
đến bệnh nhiễm trùng máu. Bằng con đường này, vi khuẩn xâm chiếm mạnh đến những
mạch mao quản bên trong da, đây là nguyên nhân dẫn đến hoại tử và làm mất sắc tố
của da cá (Shotts và ctv, 1986).


Bệnh tiến triển gây viêm ruột, viêm gan và viêm cầu thận trong vòng 2 tuần sau
khi nhiễm khuẩn.

A

Hình 2.3: Cá Tra khỏe mạnh với nội tạng bình thường (A); Cá Tra bị bệnh mũ gan thận
với nội tạng sưng to và nhiều đốm mủ trắng trên thận, lá lách và gan (B).

9


Đồ án tốt nghiệp

2.2.4 Mùa vụ xuất hiện bệnh và mức độ gây thiệt hại
Bệnh thường xuất hiện trên cá tra ở các mô hình nuôi thâm canh trong điều kiện
môi trường bất lợi. Theo Plumb (1999) khả năng gây bệnh của E. ictaluri trên cá nheo
Mỹ tùy theo điều kiện nhiệt độ. Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là từ 18o

28 C.
o

Ở nước ta nhiệt độ nước dao động là từ 26-28 C vì thế đây là điều kiện thuận

lợi cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển. Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) bệnh mủ gan
thường xuất hiện vào mùa lũ và cao điểm từ tháng 7, 8. Cũng theo Lê Thị Bé Năm
(2002) bệnh xuất hiện vào mùa lũ trong năm khi nước mang nhiều phù sa, chất lượng
nước biến động, cá dễ bị sốc, sức khỏe giảm, giảm khả năng đề kháng với bệnh, chính
vì thế bệnh dễ dàng bộc phát. Tuy nhiên trong 2 năm gần đây, bệnh này hầu như xuất
hiện trên cá tra quanh năm. Trong 1 vụ nuôi, bệnh mủ gan có thể xuất hiện 3 – 4 lần. Tỉ

lệ hao hụt từ 10 – 50%, tùy thuộc vào chế độ chăm sóc và quản lý.
2.3

Tổng quan tảo Haematococcus pluvialis

2.3.1 Phân loại
Ngành: Chlorophyta
Lớp: Chlorophyceae
Bộ: Volvocales
Họ: Haematococcaceae
Giống: Haemotococcus
Loài: Pluvialis
(Lorenz và Cysewski, 2000)
Hình 2.4: Haematococcus pluvialis [49]

10


Đồ án tốt nghiệp

2.3.2 Đặc điểm

Haematococcus pluvialis là loài vi tảo nước ngọt, đơn bào, sinh sản vô tính
bằng cách nhân đôi. Loài tảo này có vòng đời phức tạp với 2 dạng tế bào. Trong điều
kiện thuận lợi, phần lớn là các tế bào sinh dưỡng màu xanh có hai roi, có thành tế bào,
kích thước từ 10 - 20 µm, có khả năng chuyển động. Khi điều kiện môi trường không
thuận lợi (thiếu dinh dưỡng, cường độ chiếu sáng cao, nhiệt độ cao…), tế bào tảo
chuyển sang dạng nang bào tử hình cầu, mất roi, không có khả năng chuyển động. Ở
giai đoạn này, đường kính tế bào tảo tăng mạnh từ 10 - 20 µm lên 40 - 50 µm, thành tế
bào dầy và chứa 1 lượng lớn astaxanthin (4 - 6% trọng lượng khô) có thể tích lũy

(Đặng Diễm Hồng và ctv, 2010).

Hình 2.5: Vòng đời tảo Haematococcus pluvialis. (A) Giai đoạn tảo có màu xanh và 2 roi;
(B) Giai đoạn trung gian không thể di động; (C) Giai đoạn trung gian tạo một lượng
carotenoid; (D) Giai đoạn nang chứa một lượng lớn carotenoid (Kamath, 2007).

11


Đồ án tốt nghiệp

Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về điều kiện nuôi trồng tảo
H.pluvialis để tách chiết hợp chất astaxanthin đã được công bố. Tuy nhiên ở Việt Nam
vẫn chưa có một công trình nghiên cứu nào nuôi trồng thành công tảo H.pluvialis trong
phòng thí nghiệm lẫn qui mô lớn. Khó khăn lớn nhất khi nuôi trồng loại tảo này là tốc
độ sinh trưởng rất chậm, chu trình sống phức tạp, chuyển qua nhiều giai đoạn khác
nhau, xen kẽ giữa các tế bào chuyển động và không chuyển động…Mặc khác, để sản
xuất astaxanthin một cách có hiệu quả từ tảo H.pluvialis đòi hỏi qui trình công nghệ
nuôi cấy 2 pha: pha đầu tảo được nuôi cấy trong điều kiện tối ưu, các tế bào chủ yếu là
pha sinh dưỡng, có màu xanh. Sau khi đạt mật độ nhất định, tảo được chuyển sang nuôi
cấy ở pha thứ 2 bất lợi về điều kiện môi trường như đói dinh dưỡng (nito hoặc
photpho), nhiệt độ hay cường độ chiếu sáng cao… Lúc này tế bào tảo từ màu xanh
chuyển sang dạng nang bào, màu đỏ chứa chủ yếu astaxanthin (Đặng Diễm Hồng và
ctv, 2010).
2.3.3 Ứng dụng tảo Haematococcus pluvialis
Từ những năm 1930, tảo H.pluvialis đã được biết đến rộng rãi là nguồn cung
cấp astaxanthin tự nhiên. Trong những năm gần đây, loài tảo này lại thu hút sự quan
tâm nghiên cứu do nhu cầu sử dụng astaxanthin ngày càng cao. Nhiều vi sinh vật như
nấm, địa y, vi khuẩn, vi tảo, khác cũng có khả năng tổng hợp astaxanthin nhưng hàm
lượng astaxanthin ở tảo H.pluvialis là cao nhất. Astaxanthin được sử dụng bổ sung vào

thức ăn cho một số đối tượng nuôi trồng thủy sản như cá hồi, tôm hùm… nhằm tăng
chất lượng thịt hoặc tạo màu sắc rực rỡ cho cá cảnh. Astaxanthin được tách chiết từ tảo
còn được bổ sung vào các loại sản phẩm mỹ phẩm, dược phẩm cho con người (Đặng
Diễm Hồng và ctv, 2010).
Tảo H.pluvialis được ứng dụng như một sắc tố ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản. Ngoài ra nó còn có khả năng như một chất chống oxi hóa, tiền vitamin A, tăng
cường miễn dịch, tiền thân hormone, sinh sản và phát triển (Lorenz và ctv, 2000).

12


Đồ án tốt nghiệp

2.3.4 Astaxanthin
2.3.4.1 Đặc điểm
Astaxanthin là sắc tố thuộc họ xanthophyll (Higuera–ciapara và ctv, 2006), có
nguồn gốc là lycopen (Olaizola, 2003). Astaxanthin tổng hợp keto - carotenoid (3,3’dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) phổ biến nhất sắc tố màu hồng đỏ có nhiều ở sinh
vật sông hồ và biển, cá hồi (Dragos và ctv, 2010). Carotenoid là những sắc tố tan trong
lipid, tham gia vào các quá trình của quang hợp của sinh vật. Đến nay có hơn 700
carotenoid trong tự nhiên được xác định. Nó chịu trách nhiệm tạo màu sắc cam và đỏ
cho thực vật và tảo và cho nhiều màu xanh, đỏ, tím ở động vật thủy sản. Chỉ có thực
vật phù du, tảo, một số vi khuẩn và nấm tổng hợp carotenoid. Astaxanthin có mặt nhiều
ở một số loài thủy sản như cá hồi, cá vền biển, tôm và tôm hùm…( Wiener và ctv,
2003).
Bảng 2.2: Nguồn Astaxanthin trong tự nhiên
Nguồn Astaxanthin tự nhiên
Cá hồi
Phiêu sinh vật
Nhuyễn thể
Tôm Arctic

Nấm Phaffia
Haematococcus pluvialis
Trong tự nhiên, thực vật, nấm, vi khuẩn, tảo đặc biệt sản xuất astaxanthin. Sắc
tố này thông qua chuỗi thức ăn như vi tảo được tiêu thụ bởi động vật phù du và động
vật giáp xác khác sau đó được tiêu thụ bởi cá. Một số loài động vật giáp xác ( Penaeus
japonicus và Penaeus monodon) có khả năng tiết ra enzyme để phân giải carotenoid
thành astaxanthin (Lorenz và ctv, 2000).
13


Đồ án tốt nghiệp

Astaxanthin có mối liên hệ chặt chẽ với các carotenoid khác như: β - carotene,
zeaxanthin và lutein. Sự hiện diện của hydroxyl và keto kết thúc trên mỗi vòng ionone
giải thích khả năng este hóa, chống oxi hóa cao hơn, khả năng phân cực cao hơn các
carotenoid khác. Astaxanthin tự do đặc biệt nhạy cảm với quá trình oxy hóa (Guerin và
ctv, 2003).
Astaxanthin rất được quan tâm nghiên cứu bởi nó được phát hiện có hoạt tính
chống oxi hóa mạnh hơn β-caroten, lycopen, lutein hay vitamin E. Một số nghiên cứu
khác chứng minh astaxanthin còn có khả năng chống oxi hóa mạnh hơn cả tocopherol
(Higuera–ciapara và ctv, 2006). Astaxanthin còn được xem như là chất có khả năng
chống oxy hóa cao gấp 10 lần so với các chất chống oxy hóa khác như zeaxanthin,
lutein, canthaxanthin, β–carotenoid, và gấp 500 lần so với α-tocopherol. Một ứng dụng
khác của astaxanthin là làm tăng hoạt động của các tế bào B và tế bào T–helper để sản
xuất kháng thể như immunoglobulin A, M, G (Cysewski và ctv, 2004).
Do đó astaxanthin đang ngày càng được sử dụng nhiều trong y dược và công
nghệ mỹ phẩm như tạo ra những sản phẩm bảo vệ da tránh tia cực tím (O’Connor và
O’Brien, 1998), chống tác nhân gây ung thư bằng hóa học (Nishino và ctv, 1998), tăng
cường hệ miễn dịch (Jyonouchi và ctv, 1996) và nhiều ứng dụng khác trên lĩnh vực sức
khỏe và dinh dưỡng cho người (Guerin và ctv, 2003).

2.3.4.2 Tính chất hóa học
Astaxanthin là một tetraterpenoids, trong phân tử của chúng có 2 carbon bất đối
xứng ở vị trí 3 và 3’ của vòng bezenoid do đó nó có 4 dạng đồng phân lập thể, cấu trúc
của nó có một số điểm đặc trưng riêng so với một số hợp chất thuộc nhóm carotenoids
khác như β-caroten, zeaxanthin, luetin đó là có sự hiện diện nhóm hydroxy và nhóm
keto cuối mạch trên vòng ionone, điều đó cho thấy chúng có khả năng tạo ester hóa và
khả năng chống oxi hóa cao hơn các hợp chất carotenoid khác (Orosa và ctv, 2005;
Zhao và ctv, 2009).
Tên hóa học: 3,3’-dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione
14


Đồ án tốt nghiệp

Công thức phân tử: C40H52O4
Khối lượng phân tử: 596.82

Hình 2.6 Cấu hình đồng phân của Astaxanthin (Kamath, 2007)

15


Đồ án tốt nghiệp

2.3.4.3 Vai trò Astaxanthin
 Chất chống oxy hóa
Carotenoid là chất chống oxy hóa mạnh có thể hấp thụ năng lượng kích thích
oxi nguyên tử vào trong chuỗi carotenoid ngăn chặn các phân tử hoặc các mô bị hư
hỏng. Astaxanthin bảo vệ màng photpholipid và các acid béo chống lại quá trình
peroxy hóa. Đặc tính chống oxi hóa của astaxanthin có một vai trò quan trọng bảo vệ

chống tia cực tím, ung thư, nhiễm trùng Helicobacter pylorri gây viêm loét (Guerin và
ctv, 2003).
Carotenoid là chất chống oxi hóa cực kì hiệu quả, nó có khả năng loại bỏ các
gốc tự do bằng các phản ứng lại với chúng để tạo ra các sản phẩm vô hại hoặc bằng các
phá vỡ các gốc tự do của phản ứng dây chuyền (Dutta và ctv, 2005).
Các chất chống oxi hóa có thể làm giảm nguy cơ gây đột biến còn đối với các tế
bào ung thư thì ngăn chặn các tế bào phân chia liên tục. Trong tế bào người có một
mảng nội sinh chất chống oxi hóa như catalase, superoxide dismutase. Tuy nhiên, các
chất ngoại sinh cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chống oxi hóa được bổ sung
vào cơ thể thông qua chế độ ăn như ascorbic acid (vitamin C), α-tocopherol (vitamin
E), carotenoid (Dore và ctv, 2008).
Astaxanthin bảo vệ tế bào chống lại quá trình oxi hóa thông qua cơ chế
 Ngăn chặn các oxi nguyên tử và tiêu hao năng lượng dưới dạng nhiệt.
 Phá vỡ các phản ứng dây chuyền của peroxide (Lorenz và ctv, 2000).
 Tăng cường hệ miễn dịch

Astaxanthin được ứng dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản như là chất bổ sung
vào thức ăn. Astaxanthin không chỉ dùng để cung cấp sắc tố cho cá mà còn giúp tăng
sức đề kháng và khả năng sinh sản (Cysewski and Lorenz, 2004).
Một yếu tố quan trọng khác trong hệ thống miễn dịch chính là T-helper (tế bào
Th) mà chủ yếu là kích hoạt tế bào kháng nguyên. Astaxanthin kích thích việc sản sinh
tế bào T-heper kháng thể. Trong các thí nghiệm nuôi cấy tế bào, astaxanthin kích thích
16


Đồ án tốt nghiệp

sự gia tăng tế bào tuyến ức và tế bào lá lách sản xuất globulin miễn dịch và yếu tố gây
hoại tử Interleukin - 1A. Bên cạnh đó, astaxanthin cũng kích thích kháng nguyên T sản
xuất kháng thể ở loài chuột. Ở người, astaxanthin cũng tăng cường sản xuất ra các

immunoglobulin ở các tế bào đơn nhân ngoại vi để đáp ứng sự gia tăng kháng thể. Tóm
lại, những nghiên cứu về astaxanthin đều có khả năng kích thích miễn dịch cả trong
môi trường in vivo và in vitro (Dore và ctv, 2008).
Astaxanthin kích thích hệ thống miễn dịch mạnh mẽ bởi các nhân tố sau
 Kích thích sự sinh sản của tế bào bạch huyết
 Tăng số lượng tế bào T
 Không gây hại đến DNA
 Tăng cường khả năng giết các tế bào gây độc (Capelli và ctv, 2007).

2.3.5 Độ an toàn
Tảo Haematococcus đã được Nhật Bản sử dụng để bổ sung vào thực phẩm và thức
ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, Haematococcus cũng được ứng dụng trong nuôi trồng thủy
sản như một sắc tố và nguồn vitamin cho cá hồi, tôm, cá cảnh (Lorenz và ctv, 2000).
Astaxanthin tự nhiên được bổ sung vào chế độ ăn của người với một lượng rất nhỏ
đặc biệt là từ cá hồi và các động vật giáp xác. Astaxanthin được tách chiết và bổ sung
vào thức ăn từ năm 1999. Nguồn astaxanthin được chiết xuất phổ biến nhất là tảo
Haematococcus pluvialis (Dore và ctv, 2008).

17


Đồ án tốt nghiệp

Hình 2.7 Con đường chuyển hóa astaxanthin trong Haematococcus pluvialis
(Kamath, 2007)
Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về sự an toàn của astaxanthin vào chế độ ăn nhưng
nó ít được biết về khả năng chuyển hóa carotenoid trong cơ thể con người. Sự chuyển
hóa các carotenoid ở động vật có vú có liên quan đến một vài các yếu tố sau: sự vận
chuyển của các mixen lipid trong ruột non, sự hấp thu bởi các tế bào niên mạc ruột vận
chuyển đến hệ thống bạch huyết và cuối cùng là sự lắng đọng của các carotenoid

chuyển hóa cụ thể đến các mô. Quá trình hấp thụ và chuyển hóa astaxanthin khá tốt
được nghiên cứu nhiều ở chim, cá, động vật giáp xác. Nhưng chỉ có một vài nghiên
cứu đề cập đến sự hấp thụ trên người và 1 vài động vật có vú khác. Trong tế bào gan

18


Đồ án tốt nghiệp

chuột, astaxanthin được chuyển hóa ở 2 dạng hợp chất: 3-hydroxy-4-oxo-β-ionone và
3-hydroxy-4-oxo-7,8-dihydro- β-ionone. (Dore và ctv, 2008).
2.3.6 Ứng dụng astaxanthin trong nuôi trồng thủy sản
Astaxanthin hay beta-carotene (100 - 200 mg/kg thức ăn) từ tảo Dunaliella
salina và red yeast Phaffia rhodozyma có khả năng kích thích hệ miễn dịch tự nhiên
của cá hồi rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) (Amar và ctv, 2004). Cùng
tác giả (Amar và ctv 2000, Amar và ctv, 2001) nghiên cứu sử dụng β - carotene và
astaxanthin tổng hợp có khả năng làm tăng cường hệ miễn dịch tự nhiên trên cá hồi
(Rainbout trout).

19


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 VẬT LIỆU
3.1.1 Mẫu thí nghiệm
3.1.1.1 Mẫu cá dùng cho thí nghiệm thực nghiệm
Cá có trọng lượng 20 g/con (mua từ Trung Tâm Quốc Gia Giống Thủy Sản Nam
Bộ), được kiểm tra và xác định không nhiễm E. ictaluri trước khi thí nghiệm.

3

Cá được thuần dưỡng trong bể compozit 20 m trong 4 tuần tại phòng thí
nghiệm ướt của Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II.
Trước khi tiến hành thí nghiệm bắt ngẫu nhiên 10 con cá để kiểm tra bằng cách
mổ và cấy trên môi trường thạch máu kiểm tra vi khuẩn. Sau thời gian thuần trong bể
compozit cá được chuyển vào bể kính ít nhất 1 tuần trước khi bố trí thí nghiệm với mật
độ 30 cá/bể. Hệ thống nuôi bán tuần hoàn sử dụng máy lọc khí và có sục khí liên tục.
Cá được cho ăn bằng thức ăn tổng hợp dạng viên nổi .
Địa điểm nuôi thử nghiệm nuôi trồng thủy sản ở số 139/1552 Lê Đức Thọ
Phường 13 Quận Gò Vấp.
3.1.1.2 Tảo Haematococcus pluvialis khô
Sinh khối tảo Haematococcus pluvialis khô được phòng Công Nghệ Tảo, Viện
Công Nghệ Sinh Học, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam cấp cho Viện Nuôi
Trồng Thủy Sản II (RIA II). Khối lượng : 1,3 kg.

20


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.1 Thức ăn GP và sinh khối tảo khô Haematococcus pluvialis
3.1.1.3 Vi khuẩn
Edwardsiella ictaluri Gly09M từ Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo
Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu
nuôi trồng thùy sản II để làm vật liệu nghiên cứu.

Hình 3.2 Vi khuẩn Edwardsiella ictaluria trên môi trường thạch máu

21

Đồ án tốt nghiệp

3.1.2 Môi trường và hóa chất
Môi trường
Blood agar (BA)
Brain Heart Infusion Broth (BHI broth)
Hóa chất
Cồn; NaCl; H2SO4, NaOH, KOH
L-fifteen (Sigma)
Dung dich PBS
Dịch lòng trắng trứng gà
Đệm natriphosphat
Dịch huyền phù vi khuẩn Micrococcus
luteus Dung dịch poly-L-lysine Zymosan
(Sigma)
Nitroblue tretrazolium (NBT)
McHBSS
Dimethylsulfoxide (DMSO)
Thuốc nhuộm fluorescent latex
3.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Tủ cấy vô trùng (Microflow).
Máy lắc (Orbital incubator SI 50).
Máy li tâm lạnh (Hermle)
Tủ sấy (Memmert).
Tủ ấm (Memmert).
Tủ lạnh SANYO.
Cân điện tử bốn số lẻ Precise XB 220A.
Nồi hấp vô trùng (HIRAYAMA).

Các loại micropipet (20 µl,100-1000 µl, 20-200 µl).
22


Đồ án tốt nghiệp

Các loại đầu típ.
Erlen loại 1000 ml, 500ml, 250 ml.
Ống đong 100 ml, 1000 ml.
Đĩa petri.
Ống nghiệm, eppendort
Bộ lọc 0,2 µm
Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX 50, Tokyo, Japan
Microrray 96 giếng, 24 giếng, 12 giếng. Kim tiêm 1ml;
5 ml; 10ml.
Hồ kiếng kích cỡ (0,35m; 0,2m; 0,2m)
Bộ lọc nước, hệ thống cung cấp oxy liên tục.
Máy Elisa.
Một số dụng cụ khác bao gồm: đèn cồn, que cấy tròn, que cấy thủy tinh.

23


Đồ án tốt nghiệp

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm
3.2.1.1 Chuẩn bị thức ăn
Chuẩn bị thức ăn cho cá: cân thức ăn Green fish cho vào 4 hủ mỗi hủ 172,8 gam.
Sinh khối tảo đem đi pha loãng ở 2 nồng độ: 100 mg và 200 mg

Bảng 3.1 Mật độ tảo và khối lượng tảo cân trộn vào thức ăn
Nghiệm thức
NT 100 mg/kg
NT 200 mg/kg
Đối chứng
Sau khi cân khối lượng tảo cho vào nước muối sinh lý 0.9% pha loãng vortex
o

đều phối trộn với thức ăn. Trộn đều thức ăn bổ sung thêm dầu mực sấy 30 C trong 15
phút



thành phẩm.

Hình 3.3 Thức ăn trộn Haematococcus pluvialis

24