slide thuyết trình tìm hiểu kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ FISH (florescence in situ hybridization) trên vi sinh vật

TÌM HIỂU KỸ THUẬT
LAI HUỲNH QUANG
TẠI CHỖ TRÊN VI
SINH VẬT
SVTH : TRƯƠNG THÀNH ĐẠT
MSSV : 60604096
GVHD : NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN


MỤC ĐÍCH
Cung cấp chính xác thơng tin về
hình thái, số lượng, không gian
phân bố hay mối tương quan với
môi trường sống của vi sinh vật.


1. Quy trình thực hiện
• Chuẩn bị mẫu và đầu dị.
• Trộn mẫu với đầu dị.
• Lai giữa đầu dị và trình tự đích đặc hiệu nằm
trong tế bào.
• Rửa mẫu để loại bỏ các đầu dị khơng được
lai.
• Dị tìm mẫu (bước này có thể bỏ qua nếu sử
dụng đầu dị phát huỳnh quang trực tiếp).
• Quan sát, hiển thị và lưu trữ kết quả.



1. Quy trình thực hiện

Đầu dị
- Đầu dị: Là những
oligonucleotide dài
từ 15 đến 30 bp, có
trình tự bổ sung với
các rRNA 16S của
tế bào vi sinh vật.


1. Quy trình thực hiện

Đánh dấu huỳnh quang lên đầu dị
Có 2 cách cơ bản:
- Đánh dấu trực tiếp: khơng cần
bước dị tìm sau q trình lai.
- Đánh dấu gián tiếp: đánh dấu bằng
một số hợp chất chỉ thị trung gian,
đồng thời phải tiến hành dị tìm sau
q trình lai.


1. Quy trình thực hiện


1. Quy trình thực hiện

Thuốc nhuộm huỳnh quang
Đặc điểm quan trọng: các chất huỳnh quang
có các mức năng lượng kích thích và phát xạ
khác nhau.

Cho phép phát hiện đồng thời hai hay nhiều
vi sinh vật khi chỉ lai một lần duy nhất.


1. Quy trình thực hiện

Thuốc nhuộm huỳnh quang
Tên thuốc

Bước sóng
Kích thích

Phát xạ

(nm)

(nm)

AMCA

351

450

Xanh dương

FITC*

492

528

Xanh lá cây

FluoXE**

488

520

Xanh lá cây

TRITC***

557

576

Đỏ

Texas Red

578

600

Đỏ

Cy3

550

570

Cam/Đỏ

Cy5

651

674

Hồng ngoại

nhuộm

Màu


1. Quy trình thực hiện

Chuẩn bị mẫu và xử lý sơ bộ
Mục đích: đưa được sớ lượng lớn các
đầu dò thấm được vào tế bào, giữ lại tối
đa số lượng các trình tự đích RNA, đồng
thời bảo quản toàn vẹn cấu trúc tế bào và
hình thái của chúng.
Hình thức: ngâm mẫu trong các dung
dịch hoặc xử lý bằng enzym.

1. Quy trình thực hiện

Lai
Yêu cầu:
Kết hợp chính xác các đầu dò
đánh dấu huỳnh quang với trình tự
đích bổ sung với chúng với số
lượng lớn nhất.


1. Quy trình thực hiện

Lai
Điều kiện:

Mơi trường tới ẩm.
 Nhiệt độ vào khoảng 37 đến 50oC.
 Thời gian lai có thể kéo dài từ 30
phút đến vài giờ.



1. Quy trình thực hiện

Quan sát và xử lý tín hiệu
Kính hiển vi có trang bị dải lọc nhiều
tần (hoặc kính hiển vi laze quét đồng tiêu).
 Máy ảnh CCD.




Phần mềm xử lý ảnh kỹ thuật số.


1. Quy trình thực hiện

Kính hiển vi laze qt đồng tiêu


2. Trở ngại của FISH

Kết quả khơng chính xác
 Các chất tự phát huỳnh quang
 Đầu dị thiếu tính đặc hiệu


2. Trở ngại của FISH

Không thu được kết quả
 Số lượng đầu dị q ít
 Cấu trúc của đầu dị hay trình tự
đích q phức tạp
 Hàm lượng rRNA thấp
 Ảnh chụp bị mất màu


3. Ứng dụng của FISH

Sự đa dạng của vi sinh vật
FISH được sử dụng trên toàn thế giới
để nghiên cứu các quần thể vi khuẩn
trong tự nhiên như môi trường dưới
nước, trong đất hay trên bề mặt rễ
thực vật.


3. Ứng dụng của FISH

Sự đa dạng của vi sinh vật
Một ví dụ điển hình khi sử dụng FISH
để phát hiện sự nổi trội chủng Bacillus
trong đất đồng cỏ tại Hà Lan.
Đây là một loại vi khuẩn hình que, có
chứa ribotype DA001 16S rRNA.


3. Ứng dụng của FISH

Sự đa dạng của vi sinh vật
Quá trình lai được thực hiện trong dung dịch bao
gồm:

Dung dịch đệm (630 mM NaCl, 10mM Tris-HCl,
0,01% natri dodecyl sulfate; pH 7.2)

Formamide 20%.

Đầu

dò
oligonucleotide
REX72
(5’TGGGAGCAAG CTCCCAAAG-3’).

Đầu
dò
LGC353b
(5’-GCGGAAGATT
CCCTACTGC-3’).


3. Ứng dụng của FISH

Sự đa dạng của vi sinh vật
Cuối cùng, mẫu được nhuộm với
dung dịch chứa 1mg 4,6-diamidino-2phenylindole (DAPI).


3. Ứng dụng của FISH

Sự đa dạng của vi sinh vật
DAPI nhận biết tất cả các vi sinh vật
với tín hiệu màu xanh.
Các đầu dò LGC252b sẽ được nhuộm
với Cy3 để phát hiện các tế bào vi khuẩn
Bacillus và bào tử với tín hiệu màu đỏ
Đầu dị REX72 gắn nhãn huỳnh quang
với các ribotype DA001 của Bacillus.

3. Ứng dụng của FISH
Sự đa dạng của vi sinh vật

Dị tìm vi khuẩn bacillus mang gen DA001 sử dụng
ba chất nhuộm khác nhau trên cùng một mẫu đất


3. Ứng dụng của FISH

Hệ vi sinh vật trong nước thải
FISH
sử
dụng
các
đầu
dò
oligonucleotideđược tạo ra bằng những kỹ thuật
phân tử như PCR để nghiên cứu các quần thể vi
khuẩn trong nước thải, bùn hoạt tính.


3. Ứng dụng của FISH

Vi sinh vật cộng sinh
Khi sử kỹ thuật FISH với các trình tự
rRNA 16S, các vi khuẩn cộng sinh có thể
được phát hiện, từ đó tiến hành định danh
và phân cấp phát sinh loài.

3. Ứng dụng của FISH
Ứng dụng vào y học
Nghiên cứu các quần thể vi khuẩn phức
tạp trong cơ thể người và động vật.
Khoang miệng

Dạ dày

Phổi