(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào từ bacillus subtilis gen mã hoá kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN

Phạm Kiên Cƣờng

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN

Phạm Kiên Cƣờng

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM

Chun ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2015
1


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trin
̀ h nghiên cƣ́u mà tôi đã th ực hiện dƣới sự
hƣớng dẫn của GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa và PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh. Các số
liê ̣u, kế t quả nêu trong luâ ̣n án là trung thƣ̣c và chƣ a tƣ̀ng đƣơ ̣c ai công bố trong bấ t
kỳ công trình nào khác.

NCS. Phạm Kiên Cường

2


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS. Nguyễn Thi ̣ Vân Anh , những người thầy đã tận tình dìu
dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt
q trình làm luận án nghiên cứu sinh.
Tơi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, cơ trong Bộ mơn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của
Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ Quân
sự, các anh chị bạn bè đồng nghiệp trong Viện Công nghệ mới, các thành
viên trong nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp và Phịng Sinh học
nano và ứng dụng, tḥc Phịng Thí nghi ệm trọng điểm Công nghê ̣ Enzym

và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên .
Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ
nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng ch ức năng của Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điề u kiê ̣n cho tơi h ọc tập, hồn thành các
thủ tục cần thiết của một nghiên cứu sinh.
Tôi xin chân thành cám ơn đến TS. Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi
trồng thủy sản I và TS. Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần
Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp và chia sẻ thông tin trong quá trình thử ng hiê ̣m
ứng dụng thực tế sản phẩm của đề tài luận án.
Luận án đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương
trình Trọng điểm cấp nhà nước do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ, mã số
KC.04.09/11-15 và bản thân tơi cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với
tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài.
Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới bố , mẹ, vợ, con, gia đình, những
người đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điề u kiê ̣n tḥn lợi nhất cho tơi có thời
gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.
NCS. Phạm Kiên Cường

3


MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC..................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU
̣ VÀ CHỮ VIẾT TẮT..............................................3
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................7
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................8
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................11
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................14

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM .......14
1.1.1. Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm .....................................14
1.1.2. Cấu trúc của WSSV ........................................................................................16
1.1.3. Hệ gen của WSSV ...........................................................................................22
1.1.4. Bệnh đốm trắng do WSSV gây ra ở tôm.........................................................28
1.1.5. Chẩn đoán WSSV ...........................................................................................32
1.2. NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV
...................................................................................................................................34
1.2.1. Một số biện pháp phòng chống WSSV ...........................................................34
1.2.2. Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV .................................40
1.2.3. Các protein bề mặt khác và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV ................46
1.3. BÀO TỬ B. subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT
BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE ...............................................48
1.3.1. Bào tử B. subtilis và đặc tính hình thành bào tử .............................................48
1.3.2. Một số protein bề mặt của B. subtilis ..............................................................50
1.3.3. Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử ................................................52
2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................54
2.1.1. Mẫu tôm thử nghiệm .......................................................................................54
2.1.2. Các hoá chất và nguyên vật liệu......................................................................54
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ .................................................................56
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................................56

4


2.3.1. Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh ........................56
2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B. subtilis .........................................................................56
2.3.3. Tách chiết, định lƣợng DNA ...........................................................................57
2.3.4. Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E. coli và B. subtilis .................................60
2.3.5. Phát hiện, định lƣợng và tinh sạch VP28 ........................................................64

2.3.6. Thử nghiệm khả năng phòng WSSV của bào tử B. subtilis tái tổ hợp ...........68
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................72
3.1. NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA
GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAM .............................72
3.1.1. Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằ ng PCR ..................................................72
3.1.2. Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-T ........................................74
3.1.3. Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 .............75
3.2. NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 .........................................79
3.2.1. Biể u hiê ̣n VP28 bằng hệ thống vector pET28b trong E. coli ..........................79
3.2.2. Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B.
subtilis .......................................................................................................................84
3.3. KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN
TRẮNG CỦA BÀO TỬ B. subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT ................99
3.3.1. Sự tồn tại của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân trắng
...................................................................................................................................99
3.3.2. Khả năng kích thích miễn dịch trên tơm thẻ chân trắng của bào tử B. subtilis
biểu hiện VP28 ........................................................................................................102
3.3.3. Đánh giá khả năng bảo hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp .....105
KẾT LUẬN .............................................................................................................114
KIẾN NGHỊ ............................................................................................................114
DANH MỤC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN ...............................................................................................................115
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................116

5


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BCIP

5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

BSA

Albumin huyết thanh bị (Bovine Serum Albumin)

Cm

Chloramphenicol

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

DSM

Mơi trƣờng tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium)

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GST

Glutathione S-transferase

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

NBT

p- nitro blue tetrazolium chloride

PAGE

Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis)

PBS

Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PVDF

Polyvinylidere Fluoride

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

GST

Glutathione S-transferase

TSA

Tryptic Soy Agar

TTFC

Phân đoạn đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the
tetanus toxin)

WSSV

Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn ......................15
Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc của WSSV ...........................................26
Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng ..................................................30
Bảng 1.4: Các chiến lƣợc vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm ..............................46
Bảng 1.5: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B. subtilis ...........................51
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sƣ̉ du ̣ng trong nghiên cƣ́u nhân bản và biể u hiê ̣n gen
vp28 ...........................................................................................................................55

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR .......................................................................59
Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR ......................................................60
Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE ..................66
Bảng 3. 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác nhau ...........72
Bảng 3.2: Một số sai khác về trình tự nucleotide và acid amin của VP28 thu nhận tại
Việt Nam so với trình tự đã công bố (AY168644) ...................................................78
Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B. subtilis tái tổ hợp trên một số môi
trƣờng khác nhau .......................................................................................................95
Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp trên môi trƣờng DSM ở các thời gian
khác nhau...................................................................................................................96
Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn ở mẫu thức ăn trộn bào tử B. subtilis biểu hiện VP28
.................................................................................................................................100
Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV ....................................................107

7


DANH MỤC HÌ NH

Hình 1.1: Vị trí của WSSV trong cây phát sinh chủng loại [124] ............................16
Hình 1.2: Cấu trúc của virion WSSV dƣới kính hiển vi điện tử [54] .......................17
Hình 1.3: Hình ảnh mô ruột của tôm (Procambarus clarkii) sau 48 giờ lây nhiễm
WSSV dƣới kính hiển vi điện tử ...............................................................................17
Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc chính của WSSV [97] .....................................18
Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng của VP19, VP24, VP26, VP28 và VP51A [21]...19
Hình 1.6: Mô hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21] .................................19
Hình 1.7: Mơ hình tổ chức hệ gen trên DNA vịng sợi đôi của WSSV-CN .............23
Hình 1.8: Bản gel SDS-PAGE 12% nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) của
protein vỏ WSSV (EP) và protein lõi nucleocapsid (NP) [120] ...............................25
Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dƣới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng [6].28

Hình 1.10: Sơ đồ của hệ thống miễn dịch ở tơm [98] ...............................................35
Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch khơng đặc hiệu của tơm khi bị kích thích
bởi β-glucan [3]. ........................................................................................................36
Hình 1.12: Cấu trúc khơng gian của protein VP28 [97] ...........................................42
Hình 1.13: Hình dạng ngoài của nội bào tử B. subtilis [27] .....................................48
Hình 1.14: Cấu tạo nội bào tử B. subtilis [27]. .........................................................49
Hình 1.15: Mô hiǹ h bi ểu hiện protein ngoa ̣i trên b ề mặt bào tử B. subtilis sử dụng
protein của lớp áo bào tử. Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng là protein
chuyên chở và phần màu hồng là một protein ngoại lai [74] ....................................52
Hình 3.1: Nhân bản vp28 bằng PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV ở các địa điểm 73
Hình 3.2: Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của vp28 trong các
thể biến nạp sử dụng cặp mồi pGEM Fw/Rv và cặp mồi VP28.1 Fw/Rv ................74
Hình 3.3: So sánh mức độ tƣơng đồng giữa trình tự nucleotide của gen vp28 từ các
mẫu WSSV thu thâ ̣p đƣơ ̣c và trình tƣ̣

vp28 Việt Nam đã công bố trƣớc đây

(AY168644) ..............................................................................................................77

8


Hình 3.4: Điện di gel agarose sản phẩm cắt vector biểu hiện và vector nhân dòng
mang gen vp28 bằng enzyme giới hạn sau khi tinh sạch ..........................................80
Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen vp28 trong các khuẩn
lạc ..............................................................................................................................80
Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện VP28 ở E.
coli .............................................................................................................................81
Hình 3.7: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh sạch của
VP28 ..........................................................................................................................83

Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt giới hạn pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB,
pGEM-vp28 với hai cặp enzyme EcoRI và HindIII .................................................86
Hình 3.9A: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t ừ đĩa thạch biến nạp sản
phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB bằ ng că ̣p mờ i vp 28, cotB và
pDG364 .....................................................................................................................87
Hình 3.9B: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t ừ đĩa thạch biến nạp sản
phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB-GST bằ ng că ̣p mờ i pDG 364 và
vp28. ..........................................................................................................................88
Hình 3.10: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong DNA hệ gen B. subtilis .....89
Hình 3.11: Kiểm tra sự có mặt của gen cotB-vp28 trong hệ gen của B. subtilis ......90
Hình 3.12: Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi ...........................................................91
Hình 3.13: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28
trên bào tử B. subtilis.................................................................................................92
Hình 3.14: Ảnh chụp phân tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB-VP28
và CotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B. subtilis ...................................................94
Hình 3.15: Mức độ bền nhiệt của bào tử tái tổ hợp ..................................................96
Hình 3.16: Mức độ bền với muối của bào tử tái tổ hợp ............................................97
Hình 3.17: Mức độ bền với pH của bào tử tái tổ hợp ...............................................98
Hình 3.18: Thức ăn của tôm thẻ chân trắng sau khi trộn bào tử B. subtilis dạng dại
PY79 và dạng tái tổ hợp cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28 ......................................99

9


Hình 3.19: Sự tồn tại của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân
trắng .........................................................................................................................100
Hình 3.20: Hoạt độ phenoloxidase (PO) trong dich
̣ chiế t cơ tim c ủa tôm thẻ chân
trắng ăn bào tử tái tổ hợp.........................................................................................103
Hình 3.21: Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tơm thẻ chân trắng ................104

Hình 3.22: Đồ thị tín hiệu quang phản ánh số copy sản phẩm PCR nhân bản từ các
mẫu DNA tinh sạch từ các mẫu tôm nghi nhiễm đốm trắng sau các chu kỳ ..........106
Hình 3.23: Đƣờng chuẩn thể hiện mối tƣơng quan giữa nồng độ WSSV (copy/ml)
và chu kỳ ngƣỡng, với E = 97.2%, R2 = 0.991 .......................................................106
Hình 3.24: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng
khác nhau là 2,6x105, 2,6x104, 2,6x103 và 2,6x102 copy/ml ..................................108
Hình 3.25: Tỷ lệ chết tích lũy của các lơ tơm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng độ
khác nhau là 2,6 x 104, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml .........................109
Hình 3.26: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi đánh giá khả năng bảo hộ của bào
tử tái tổ hợp .............................................................................................................110

10


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ni tơm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở
thành một ngành kinh tế quan trọng. Diện tích ni tơm cả nƣớc tăng từ 324,1 hecta
năm 2000 lên đến 652.612 hecta vào cuối năm 2013. Chỉ tính 6 tháng đầu năm 2014
cả nƣớc đã thả nuôi 638.422,7 hecta với sản lƣợng thu hoạch đạt 258.730 tấn trong
đó tôm sú là 113.309 tấn và tôm thẻ chân trắng là 149.507 tấn, đạt giá trị xuất khẩu
đạt 1,7 tỷ USD, tăng 54,7% so với cùng kỳ năm 2013.
Tuy nhiên, ngành ni trồng tơm thƣờng xun gặp khó khăn về việc kiểm
soát các dịch bệnh, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus WSSV) là một trong những tác nhân gây bệnh chính ở tơm. Tơm mỗi khi bị nhiễm
WSSV thì gần nhƣ 100% bị chết sau đó một đến vài tuần. Bệnh đốm trắng có tỷ lệ
lây lan nhanh, cho nên khó có thể lƣờng hết các thiệt hại mỗi khi có dịch. Năm
2013, dịch bệnh đốm trắng trên tôm đã xuất hiện tại 280 xã của 94 huyện thuộc 28
tỉnh, thành phố trong phạm vi cả nƣớc. Tổng diện tích ni bị bệnh là 12.259 ha.
Theo báo cáo của Cục Thú y, từ đầu năm 2014 đến 20/7/2014, thiệt hại về nuôi
trồng thủy sản là rất lớn, khoảng 25.000 ha diện tích ni tơm bị thiệt hại tại 232 xã,

của 60 huyện trực thuộc 19 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ƣơng.
Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã đƣợc tiến hành để tìm ra giải pháp chống lại
WSSV nhƣng kết quả thu đƣợc còn hạn chế, phần lớn là do chƣa hiểu biết rõ về cơ
chế lây nhiễm, nhân lên của virus trong tôm và hệ thống đáp ứng miễn dịch của tôm
chống lại virus này. Một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới
hƣớng đến là tạo các vaccine dựa trên protein cấu trúc kháng nguyên vỏ của WSSV
nhƣ các protein VP28, VP26 của WSSV để kích thích đáp ứng miễn dịch ở tôm
chống lại bệnh đốm trắng. VP28 là một loại protein vỏ chính của WSSV đƣợc mã
hóa bởi gen wsv421 và có khối lƣợng phân tử khoảng 27,5 kDa, đóng vai trị chủ
đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm, là bƣớc khởi đầu cho quá trình lây
nhiễm. Chính vì vậy, VP28 là protein đƣợc lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đoán
WSSV cũng nhƣ tạo vaccine cho tơm phịng bệnh đốm trắng. Tuy nhiên, những kết

11


quả nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng do WSSV cũng chỉ mới dừng lại
ở mức thử nghiệm nhỏ lẻ, chƣa tạo đƣợc một vaccine chính thức, hiệu quả.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân
dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên
VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu
hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất
vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
-

Nhân dòng, xác định đƣợc trình tự và một số đặc trƣng của gen VP28 từ các
mẫu WSSV thu nhận đƣợc ở các địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam.

-

Tạo đƣợc chủng B. subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng
nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử.

-

Bƣớc đầu đánh giá đƣợc khả năng phịng bệnh đốm trắng trên tơm thẻ chân
trắng của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.

3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu
WSSV thu nhận đƣợc ở Việt Nam
- Nghiên cứu biểu hiện gen vp28 trên bề mặt bào tử B. subtilis
- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân
trắng khi cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử B. subtilis biểu hiện VP28.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận án đƣợc thực hiện chủ yếu tại Phịng Thí nghiệm
trọng điểm Cơng nghệ Enzym và Protein, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia Hà Nội.
Phần thử nghiệm khả năng bảo hộ tơm thẻ chân trắng phịng bệnh virus đốm
trắng đƣợc thực hiện tại Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ Enzym và
Protein với sự hỗ trợ, hợp tác của Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I.

12


5. Đóng góp mới của đề tài

- Đã xác định trình tự và một số đặc trƣng của gen vp28 từ các mẫu WSSV
thu nhận đƣợc ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide (A125G,
A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã công bố (AY168644).
Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến sự sai khác về acid amin.
- Đã tạo đƣợc chế phẩm bào tử B. subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện gen mã
hóa protein VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử B. subtilis dƣới dạng các cấu trúc
protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, trong đó, CotB là protein vỏ của
B. subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm hạn chế
cản trở không gian đối với VP28.
- Đã tối ƣu đƣợc điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B. subtilis biểu hiện tốt
kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu các tính chất của
bào tử tái tổ hợp B. subtilis CotB-GST-VP28 trong một số điều kiện môi trƣờng
khác nhau.
- Đã đánh giá đƣợc sƣ̣ tăng ho ạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO),
superoxide dismutase (SOD) có liên quan đến đáp ƣ́ng miễn dịch của tơm và đánh
giá khả năng phịng bệnh đốm trắng trên tơm thẻ chân trắ ng với mƣ́c bảo hô ̣ trên
70% của bào tử B. subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt.
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tạo chế phẩm probiotic dạng bào
tử B. subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt, có khả năng tăng
cƣờng miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm trắng, giúp góp phần kiểm
soát dịch bệnh trên tôm.
- Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine tái tổ hợp
dạng bào tử B. subtilis tái tổ hợp có khả năng phịng bệnh do các vi sinh vật khác
gây ra ở tôm.

13


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM
1.1.1. Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm
Dịch bệnh đốm trắng bùng phát đƣợc công bố đầu tiên tại trang trại nuôi tôm
P. japonicus ở Nhật Bản vào năm 1993 [41, 71]. Sau đó, có nhiều báo cáo về sự
bùng phát của căn bệnh do virus với các tên gọi khác nhau nhƣng đều có những dấu
hiệu tƣơng tự gây ra bởi virus hình que đến từ các nơi khác nhau ở châu Á (Bảng
1.1). Cho đến nay, bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở các hầu hết các nƣớc nuôi tôm
trên thế giới. Ở Việt Nam hầu hết các tỉnh nuôi tôm đều bị nhiễm mầm bệnh đốm
trắng.
Ban đầu, tác nhân gây bệnh đƣợc miêu tả là một virus gây bệnh có vỏ, hình
dạng giống bacilli, gọi là RV - PJ (virus có nhân hình que của P. japonicus), sau đó
tác nhân này đƣợc định danh lại thành virus Penaeid có DNA hình que [41]. Virus
gây chết các tế bào da và tế bào máu của tôm đƣợc coi là nhân tố gây bùng phát
dịch bệnh ở tôm tại Trung Quốc vào năm 1993 - 1994 [15]. Một năm sau đó, virus
chính thức đƣợc gọi là baculovirus gây ảnh hƣởng đến hệ thống biểu bì và ngoại bì
trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái và thông tin về mô bệnh học của chúng
[116]. Virus này đƣợc phân loại vào cùng nhóm với baculovirus, virus gây bệnh đỏ,
virus gây bệnh đốm trắng. Đến nay, virus này đƣợc gọi phổ biến là WSSV. Vào
năm 1995, các nhà khoa học đề xuất rằng dựa trên hình thái, kích thƣớc, vị trí lắp
ráp, bệnh học phân tử và thành phần nucleic acid, WSSV cần đƣợc xế p vào phân họ
Nudibaculovirinae, họ Baculoviridae, với tên chính thức là PmNOBII, giống nhƣ
baculovirus thứ 2 khơng có lỗ hổng đƣợc tìm thấy ở trên một giống tôm sú [117].
Trong cùng năm này, một chủng khác đã đƣợc phân lập và đƣợc coi là virus mới
tìm thấy, gọi là PmNOBIII [131]. Các nghiên cứu dựa trên gen mã hóa cho enzyme
ribonucleotide reductase (rr1 và rr2), trình từ DNA vp26 và vp28, cùng với việc
14


phát hiện các promoter của gene WSSV rr không đƣợc tìm thấy ở các virus
baculovirus [103-105] và phân tích về nguồn gốc loài khi so sánh gen protein kinase

của WSSV với protein kinase của một số virus và sinh vật nhân chuẩn cuối cùng đã
tách WSSV ra khỏi baculovirus.
Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn
Tên
Rod-shaped virus of Penaeus japomicus (RV-

Địa điểm

Tài liệu tham

phân lập

khảo

Nhật Bản

[95]

Trung Quốc

[40]

Trung Quốc

[15]

Thái Lan

[116]

Thái Lan

[117]

Đài Loan

[131]

Penaeid rod- shaped DNA virus (PRDV)

Nhật Bản

[41]

White spot baculovirus (WSBV)

Đài Loan

[63]

Yellow head disease-like virus

Đài Loan

[111]

China Baculovirus (CBV)

Trung Quốc

[65]

White spot syndrome baculovirus (WSSB)

Thái Lan

[30]

White spot syndrome virus (WSSV)

Đài Loan

[65]

PJ)
Hypodermal and hematopoietic necrosis
baculovirus (HHNBV)
Shrimp explosive epidermic disease (SEED)
Systemic ectodermal and mesodermal
baculovirus (SEMBV)
Penaeus monodon non-occluded Baculovirus II
(PmNOII)
Penaeus monodon non- occluded Baculovirus
III (PMNOIII)

Ngoài ra, dẫn liê ̣u giải trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều
gen không giống gen của virus nào khác trong họ Baculoviridae [107, 123]. Sự khác
biệt về genome và phổ vật chủ rộng của WSSV chứng tỏ virus này là đại diện cho
một họ mới [32, 104]. Gần đây nhất, tại Hội nghị Virus học Quốc tế lần thứ 12,
15

WSSV đã đƣợc xếp vào chi Whispovirus thuộc họ virus mới là Nimaviridae (Hình
1.1) [124].

Hình 1.1: Vị trí của WSSV trong cây phát sinh chủng loại [124]
1.1.2. Cấu trúc của WSSV
Các thông tin từ trƣớc tới nay cho thấy WSSV đƣợc tạo thành bởi ít nhất 58
protein cấu trúc, một vài trong số này đã đƣợc nghiên cứu cụ thể và là cơ sở để xây
dựng hình ảnh toàn diện về cấu trúc chi tiết của WSSV [59].
WSSV có dạng hình que với chiều dài 240-380 nm và đƣờng kính 70-159 nm,
kích thƣớc trung bình của nucleocapsid là 80 x 350 nm và có phần phụ giống nhƣ
đi ở cuối các virion [130]. Một số hạt virus khác còn chứa đi ở đầu cuối [116,
131]. Lớp vỏ kéo dài có thể tạo nên cấu trúc dạng đuôi dài, chiều dài 270-310 nm
[29]. Nucleocapsid trần có dạng hình que, kích thƣớc khoảng 330-350 nm × 58-67
nm, thƣờng dài hơn và mảnh hơn hạt virus hồn chỉnh [131]. Nucleocapsid có hình
thái phân mảnh, bao gồm các mảnh xếp vng góc với trục thẳng đứng của chúng.
Một nucleocapsid thông thƣờng chứa khoảng 14-19 phân mảnh. Thực chất, các
phân mảnh này có cấu trúc hình vịng, do đó nucleocapsid đƣợc tạo thành do một
chuỗi các cấu trúc vòng xếp chồng lên nhau [131]. Mỗi phân mảnh (hoặc vòng)
đƣợc tạo thành từ hai hàng song song, mỗi hàng gồm từ 12-14 tiểu đơn vị hình cầu,
mỗi tiểu đơn vị có đƣờng kính khoảng 8-10 nm. Quan sát dƣới kính hiển vi điện tử,
đơi khi cịn bắt gặp những nucleocapsid to hơn và có hình trứng với vỏ ngoài phân

16


mảnh tách biệt [29, 30]. Cấu trúc bề mặt khác nhau của các nucleocapsid có hình
dạng khác nhau (hình que, hình trứng…) và cho thấy rằng chính sự sắp xếp của các
tiểu phần hình cầu quyết định đến hình dạng tổng thể của nucleocapsid.

Nhìn theo chiều dọc, các thể virus có vỏ bao bọc hình trụ hoặc elip (Hình
1.2); theo chiều ngang, chúng có hình ngũ giác hoặc lục giác (Hình 1.3) [30, 116].
Một thể virus đƣợc đóng gói hồn chỉnh có kích thƣớc 275-335 nm × 116-138 nm,
trong khi một capsid có kích thƣớc 246-296 nm × 75-93 nm, lớp vỏ dày khoảng 7-9
nm [112].

Hình 1.2: Cấu trúc của virion WSSV dƣới kính hiển vi điện tử [54]
(a) Cấu trúc của một thể virus WSSV đầy đủ với phần phụ giống đuôi.
(b) Cấu trúc của một nucleocapsid hình trụ.
(c) Mô hình cấu trúc các lớp của một thể virus WSSV bao gồm: lớp vỏ ngoài,
lớp vỏ capsid, lõi nucleocapsid và những protein cấu tạo chính.

Hình 1.3: Hình ảnh mơ ruột của tôm (Procambarus clarkii) sau 48 giờ lây
nhiễm WSSV dƣới kính hiển vi điện tử

17


a: Các thể virus sắp xếp theo dạng tinh thể nằm bao quanh nhân. b: Các thể virus
tập trung xung quanh cấu trúc hình que dài (LRS) trong nhân [55]
Hầu hết các protein cấu trúc của WSSV đều là các protein vỏ và chúng đóng
vai trị quan trọng trong việc bám dính, xâm nhập và đóng gói của virus [22]. Vỏ
của virus WSSV bao gồm ít nhất 35 loại protein khác nhau [61]. Trong số các
protein cấu trúc của WSSV đã đƣợc xác định, có 4 protein cấu trúc chính là VP28
(28 kDa), VP26 (26 kDa), VP24 (24 kDa) và VP19 (19 kDa). Hai protein VP26 và
VP24 liên kết với nucleocapsid, còn hai protein VP28 và VP19 liên kết với lớp vỏ
và là hai protein cấu trúc chủ yếu nhất, chiếm khoảng 60% các protein vỏ (Hình
1.4) [97, 103].

Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc chính của WSSV [97]

Các protein vỏ của WSSV có quan hệ mật thiết với nhau. Trong mô hình phức
hợp protein vỏ, 3 protein xuyên màng VP19, VP28 và VP51A đều có vùng tiếp xúc
lớn trên bề mặt của virus (Hình 1.5). Chính những vùng này sẽ đóng vai trị quan
trọng trong quá trình lây nhiễm của virus bằng cách liên kết với thụ thể tế bào vật
chủ hoặc thúc đẩy quá trình dung hợp tế bào [17, 80].
Trong suốt quá trình xâm nhiễm của WSSV, có một số protein tham gia gắn vào
thụ thể trên tế bào tơm. Vì vậy, rất có khả năng phức hợp protein vỏ đã đƣợc xác
định (Hình 1.6) sẽ hoạt động nhƣ một phức hệ lây nhiễm (infectome) đóng vai trò
gắn bám và giúp virus xâm nhập vào tế bào tơm [21]. Trong đó, VP28 và VP26
đƣợc đƣợc xem là quan trọng nhất.

18


Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng của VP19, VP24, VP26, VP28 và VP51A [21]

Hình 1.6: Mơ hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21]

19


VP28, đƣơ ̣c mã hóa bởi gene wsv421, là một potein vỏ đóng vai trị rất quan
trọng trong những bƣớc đầu tiên của quá trình nhiễm WSSV vào tôm [107]. Các
nhà khoa học đã giả định rằng VP28 có thể góp phần quan trọng để nhận biết các
thụ thể bề mặt tế bào tơm do một số vị trí glycosyl hóa tiềm năng [102]. Tuy nhiên,
điều này chƣa đƣợc chứng minh. Các nghiên cứu về vai trò của VP28 trong quá
trình xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ sƣ̉ du ̣ng kháng thể kháng VP 28 cho
thấy protein này liên quan đến sự xâm nhập mang tính hệ thống của WSSV ở tôm
[106, 108]. Những nghiên cứu sau này của Robalino và tập thể [82] đã chứng minh
rằng hoạt tính trung hịa WSSV này thực ra là do các chất ức chế khơng đặc hiệu có

trong huyết thanh của thỏ đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu ban đầu. Sự tƣơng tác
của VP28 với protein màng của tế bào máu ở tơm đã đƣợc chứng minh. Có ít nhất 3
protein màng có thể tƣơng tác với protein VP28 tái tổ hợp, và một trong số đó là
protein Rab7 của tơm [90].
VP26, đƣợc hóa bởi gene wsv311, có liên kết với nucleocapsid [107] và phần
khung đọc mở (ORF) của nó cũng là một protein vỏ của WSSV [126]. Protein này
nằm trên khoảng trống giữa lớp vỏ và nucleocapsid, đóng vai trị nhƣ một protein
liên kết. Có thể là đầu N của protein VP26 (vùng kỵ nƣớc mạnh) gắn vào lớp vỏ
trong khi đầu C (chứa trình tự ƣa nƣớc) thì gắn vào nucleocapsid. Hơn nữa, VP26
có khả năng gắn với actin hoặc các protein liên kết với actin. Các nghiên cứu gần
đây cho thấy rằng cả VP28 và VP26 đều tạo thành các cấu trúc trimer gắn trong vỏ
của virus và có thể có chức năng quan trọng trong việc tƣơng tác khi xâm nhập giữa
màng vỏ virus và các thụ thể tế bào vật chủ.
Cho tới nay, có ít nhất 6 loại protein vỏ (VP31, VP36A, VP36B, VP110,
VP187 và VP281) của WSSV đƣợc chứng minh là có chứa motif RGD đóng vai trị
tín hiệu gắn vào tế bào vật chủ, trong đó đặc trƣng của motif RGD (Arg-Gly-Asp)
đƣợc coi là có liên quan đến việc gắn vào bề mặt tế bào. WSSV vào trong tế bào vật
chủ có thể bắt đầu bằng việc trình tự protein gắn vào bề mặt và thụ thể virus, nhƣ
integrin đƣợc biểu hiện trong tế bào đích. Tuy nhiên, các peptide tổng hợp có chứa
motif RGD lại khơng ức chế quá trình lây nhiễm của WSSV, chứng tỏ rằng integrin

20


của vật chủ tế bào không đƣợc nhận biết đầy đủ bởi WSSV nhƣ là một thụ thể tiềm
năng để xâm nhập vào vật chủ, và do vậy WSSV có thể sử dụng các thụ thể khác
ngoài intergrin để xâm nhập vào tế bào [47].
Khi toàn bô ̣ genome của WSSV đƣợc giải trình tự, gen wsv001 mã hóa cho
protein giống collagen (WSSV-CLP) hay cịn có tên là VP1684 đã đƣợc xác định.
Sự có mặt của collagen trong virus hiếm khi đƣợc đề cập. Trong nghiên cứu của Li

và tập thể [57], WSSV-CLP đƣợc tinh sạch và xử lý với N - glycopeptidase F để
xác định mƣ́c đô ̣ glycosyl hóa. Sự giảm khối lƣợng phân tử của nó đã đƣợc quan sát
và cho thấy protein bị glycosyl hóa đầu N. Kết quả này khá đặc biệt vì sự cải biến
sau dịch mã chƣa từng đƣợc phát hiện ở bất kỳ protein nào của WSSV [57].
Các protein cấu tạo nên nucleocapsid ít đƣợc biết đến hơn so với các protein
vỏ virus. VP15, sản phẩm mã hóa bởi gene wsv214 là một trong những protein
chính nằm ở nucleocapsid. wsv214 mã hóa cho chuỗi peptide gồm 80 acid amin,
bao gồm các amino acid cơ bản (44,2%) và serine (24,6%). Đặc tính này cũng giống
nhƣ một số protein gắn DNA khác [114, 127]. VP15 có khả năng gắn với DNA sợi
kép một cách khơng đặc hiệu, nhƣng có xu hƣớng lớn là gắn vào DNA siêu xoắn,
có chức năng chính trong việc gói genome của WSSV trong nucleocapsid. Các phân
tử protein VP15 tƣơng tác lẫn nhau nhƣng không tƣơng tác với các protein cấu trúc
khác của hạt virus [114].
VP35 là một protein khác của nucleocapsid. Các nghiên cứu thực nghiệm cho
thấy rằng đầu N của VP35 chứa 2 nhóm bao gồm 4 acid amin tiềm năng (KRKR từ
vị trí 24 đến 27 và KRPR từ vị trí 53 đến 56) kết hợp với một số tín hiệu hƣớng
nhân đã đƣợc xác định đặc tính chi tiết. Sự phân bổ của VP35 cho thấy rằng nó
nhắm đến đích là nhân. Khi 4 acid amin cơ bản của các motif này đƣợc thay bằng
AAAA, thì protein đột biến chỉ có ở trong tế bào chất, chƣ́ng tỏ chức năng của nó
nhƣ một tín hiệu hƣớng nhân của WSSV [23].
Một trong những đặc tính độc đáo trong genome WSSV là sự tồn tại của gen
wsv360, với một trình tự khổng lồ dài 18.234 bp mã hóa cho protein VP664 gồm
6077 gốc acid amin, nằm ở trên nucleocapsid, và phân bổ theo lớp phù hợp với đặc

21


tính của các tiểu đơn vị xếp chồng lên nhau. Giống nhƣ trong các protein cấu trúc
khác của WSSV, phân tích VP664 bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy rằng đoạn này
đƣợc phiên mã 12 giờ sau khi xâm nhập. Điều này chứng tỏ protein VP664 có thể

đóng góp vào quá trình đóng gói và phát sinh hình thái của thể virus [54]. Ngoài
chức năng này, VP664 đƣợc xem là protein cấu trúc của virus lớn nhất đã từng đƣợc
nghiên cứu [54]. Gần đây VP51 và VP76 đƣợc biết đến nhƣ là những thành phần
cấu trúc nhỏ liên kết với nucleocapsid virus [118], tuy vậy chức năng của 2 loại
protein là gì thì vẫn chƣa đƣợc làm rõ.
1.1.3. Hệ gen của WSSV
Genome của WSSV là sợi DNA kép, dạng vịng có kích thƣớc khoảng 300
kb (Hình 1.7). Những mẫu WSSV phân lập đƣợc ở Trung Quốc (WSSV-CN,
Accession No. AF332093), Thái Lan (WSSV-TH, Accession No. AF369029), và
Đài Loan (WSSV-TW, Accession No.AF440570) đã đƣợc giải trình tự và có kích
thƣớc lần lƣợt là 305 kb, 297 kb và 307 kb. Tổng hàm lƣợng G+C trong genome
của WSSV chiếm khoảng 41%, 2 loại nucleotide này phân bố rải rác trong genome
của virus [107, 123]. Các trình tự của các mẫu (WSSV-CN, WSSV-TH, WSSVTW) đều chứa gen đặc trƣng hoặc hệ thống mã khung đọc mở riêng, nhƣng các
nhóm nghiên cứu về whispovirus ICTV đã quyết định chọn chủng virus phân lập
đƣợc tại Trung Quốc, WSSV-CN là chủng điển hình.

22


Hình 1.7: Mơ hình tổ chức hệ gen trên DNA vịng sợi đơi của WSSV-CN
bao gồm những vị trí và chiều phiên mã tương ứng với các gen. Điểm bắt đầu G
(GGATCC) của phân đoạn BamHI lớn nhất được quy định là vị trí 1 [55]
Hầu hết trình tự genome của WSSV là tƣơng đồng và có khoảng 3% genome
chứa các trình tự lặp lại. Những trình tự lặp lại này đƣợc xếp vào 9 vùng tƣơng
đồng, phân bố trong khắp genome và chủ yếu tập trung ở vùng đa gen. Những vùng
tƣơng đồng có chứa 47 đoạn lặp lại nhỏ bao gồm cả lặp lại trực tiếp, lặp lại ngƣợc
không điển hình và các đoạn lặp lại song song nhƣng ngƣợc chiều khơng hồn tồn.
Mặc dù cấu trúc của các vùng tƣơng đồng của WSSV là tƣơng tự nhƣ vùng tƣơng
đồng ở các baculovirus nhƣng chức năng của các vùng này ở WSSV vẫn chƣa đƣợc

23


xác định. Tuy nhiên, trong thí nghiệm in vitro, có ít nhất một loại protein của
WSSV, WSV021 là sản phẩm của gen sớm có khả năng bám vào các vùng tƣơng
đồng này [128].
Phân tích trình tự WSSV cho thấy genome của nó có tổng số 531 khung đọc
mở (ORF), chứa ít nhất 60 codon trong genome của chủng WSSV-CN (Hình 1.7).
Có khoảng 1/3 trong số đó (181 ORF) là khơng chồng gối lên nhau. Khoảng 80%
trong số 181 ORF này có chứa các vị trí polyA (ATAAA) ở cuối ORF. Kích thƣớc
của các protein đƣợc mã hóa bởi bộ khung đọc mở này đƣợc ƣớc tính khoảng 60
đến 6077 acid amin. Chỉ có khoảng 45% ORF khơng chồng gối mã hóa cho protein
hoặc motif đã biết (> 20% acid amin đƣợc xác định) [123]. Ngƣợc lại, một số ORF
của WSSV mã hóa cho các protein có độ tƣơng đồng cao (tới 40% hoặc hơn) do đó
những ORF này có thể đƣợc xếp chung vào một họ gen. Tổng số 27 ORF có thể
đƣợc phân loại vào 10 họ gen WSSV và có thể coi rằng những họ gen này xuất phát
từ sự sao chép DNA trong hệ gen WSSV [106].
Khi so sánh trình tự genome hoàn chỉnh của WSSV-CN, SSV-TH và WSSVTW ngƣời ta đã xác định đƣợc 5 loại đô ̣t biế n:
1. Mất đoạn lớn 13 kb trong genome WSSV-TH khi so sánh với genome của
WSSV-CN và WSSV-TW.
2. Vùng đô ̣t biế n khoảng 750 bp trong genome của WSSV-TH.
3. Trình tự gen nhảy với kích thƣớc khoảng 1337 bp chỉ xuất hiện trong mẫu
WSSV-TW.
4. Thay đổi về số lƣợng các phân đoạn lặp lại trong vùng tƣơng đồng và lặp lại
trực tiếp.
5. Đột biến một nucleotide, bao gồm thêm nucleotide hoă ̣c mất [67].
Ở WSSV-CN, vùng tƣơng ứng với vị trí mất đoạn 13 kb ở WSSV-TH có chứa
13 ORF. Những đơ ̣t biế n trong vùng này là nguyên nhân gây nên tính độc khác
nhau ở các chủng WSSV khác nhau [51]. Do đó, mặc dù những vùng này không
quan trọng đối với sự tồn tại của WSSV nhƣng chúng có thể liên quan đến các chất

gây độc. Ngồi ra chúng cịn mã hóa cho một loại nucleocapsid protein VP35, có

24