(Luận văn thạc sĩ) áp dụng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hóa học phổ thông

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
------------------------------------------

TRẦN MẠNH CƢỜNG

ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP
SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG
VÀO GIẢNG DẠY HỐ HỌC PHỔ THƠNG

Chun ngành: Hố phân tích
Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐÀO HỮU VINH

HÀ NÔI – 2011


1

MỤC LỤC
Mở đầu
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký
1.2. Định nghĩa, nguyên tắc của sắc ký và phân loại các phƣơng pháp
sắc ký
1.2.1. Định nghĩa
1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký
1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký

1.3. Cơ sở lý thuyết về sắc ký
1.3.1. Các khái niệm cơ bản
1.3.2. Thuyết đĩa
1.3.3. Thuyết tốc độ
1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography)
1.4.1. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng
1.4.2. Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu
1.5. Sắc ký giấy (paper chromatography)
1.5.1. Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy
1.5.2. Giấy sắc ký
1.5.3. Dung môi trong sắc ký giấy
1.5.4. Ứng dụng của sắc ký giấy
1.6. Sắc ký hấp phụ lỏng (trên cột)
1.6.1. Nguyên tắc
1.6.2. Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng
1.7. Khái quát về chất diệp lục (chlorophyl) và carotenoit
1.7.1. Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl)
1.7.2. Carotenoit
1.7.3. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các diệp lục
và carotenoit.
1.8. Khái quát về ion Co2+, Cu2+, Fe3+, Ni2+ và muối của chúng
1.8.1. Sơ lược về muối sắt(III) và ion Fe3+
1.8.2. Sơ lược về muối đồng(II) và ion Cu2+
1.8.3. Sơ lược về muối coban(II) và ion Co2+
1.8.4. Sơ lược về muối niken(II) và ion Ni2+
1.8.5. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các ion Fe3+,
Cu2+, Co2+ và ion Ni2+

Trang
1

3
3
4
4
4
4
7
7
11
14
16
17
18
18
19
19
20
21
21
21
24
24
24
26
28
29
29
31
32
33

34


2
CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Các hoá chất và thiết bị cần thiết
2.2. Chế tạo bản mỏng từ tinh bột sắn dây
2.3. Chiết dịch từ lá xanh
2.4. Tiến hành sắc ký cột
2.5. Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography)
2.6. Tiến hành sắc ký giấy (paper chromatography)
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Sắc ký cột
3.1.1. Tách chất màu trong lá xanh
a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi ete dầu
hoả - axton.
b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi
toluen - axeton.
c) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi
ete dầu hoả - axeton
d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi
toluen - axeton.
e) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi
ete dầu hoả - axeton.
f) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi
toluen - cồn etylic nguyên chất.
3.1.2. Tách các ion Fe3+, Cu2+, Co2+
a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi
NH4NO3 4M - NH3 4M
b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

CH3COONH4 1,5M -CH3COOH 1,5M
c) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi
Axeton – HCl đặc
d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi
NH4NO3 4M - NH3 4M
e) Pha tĩnh là silicagel, pha động dung dịch axit axetic
f) Pha tĩnh là tinh bột sắn dây
2.7.3. Kết luận
3.2. Sắc ký lớp mỏng

Trang
35
35
36
36
37
38
39
40
40
40
40
41
42
43
45
46
46
46
48

49
49
49
49
49
50


3
3.2.1. Tách chất màu trong lá xanh
a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi
ete dầu hoả - axeton
b) Bản mỏng sắc ký tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung
môi ete dầu hoả - axeton
3.2.2. Tách các ion kim loại Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+
a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi
NH3 4M – NH4NO3 4M
b) Bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi
axeton - HCl đặc
3.2.3. Kết luận
3.3. Sắc ký giấy
3.3.1. Tách chất màu trong lá xanh
a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton
b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton
c) Giấy sắc ký là loại 3S, hệ dung môi toluen - cồn etylic
tuyệt đối
d) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi toluen - cồn etylic
tuyệt đối
3.3.2. Tách các ion Fe3+, Cu2+ và Co2+
a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi axeton - HCl đặc

b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi axeton - HCl đặc
3.3.3. Kết luận
KẾT LUẬN CHUNG
KIẾN NGHỊ
Tài liệu tham khảo
I. Tiếng việt
II. Tiếng Anh

Trang
50
50
52
54
54
56
58
59
59
59
61
63
65
66
66
68
68
70
71
72
72

73


4

MỞ ĐẦU
1/Lý do chọn đề tài
Sắc ký được ra đời từ năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Mikhail
Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến nay sắc ký đã phát triển mạnh mẽ trở
thành mơn học quan trọng của hố phân tích hiện đại và được ứng dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực.
Nhờ có khả năng tách riêng rẽ các chất cho kết quả phân tích định tính
hoặc định lượng đều rõ ràng. Sắc ký tham gia vào phân tích các mẫu phức tạp
trong các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục
vụ đời sống như chữa bệnh, điều tra hình sự. Ngồi ra sắc ký cịn là cơng cụ
phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học.
Thí dụ trong sản xuất nơng nghiệp, sắc ký góp phần tách và định lượng
các chất dinh dưỡng trong sản phẩm, phân tích các độc tố, như các hóa chất bảo
vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống…
Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ
phân tích thuốc kháng sinh, phân tích các dược phẩm, dược liệu…
Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác
động của môi trường tới đời sống con người. Thí dụ tách và định lượng hàm
lượng các chất độc hại trong khơng khí.
Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức về sắc ký là rất cần thiết, tuy nhiên
chương trình mơn Hố Học ở bậc học phổ thơng của nước ta hiện nay chưa có
phần nào nói về sắc ký. Có lẽ khó khăn là các thí nghiệm thực hành về sắc ký
thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ hiện đại đắt tiền, thời gian làm thí
nghiệm lâu có trường hợp diễn ra trong thời gian dài, nhiều hố chất khó kiếm
đắt tiền khơng phù hợp với trường THPT.

Với mong muốn có thể đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hố Học
phổ thơng ở nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, đã
trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn “Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột
và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thơng”.
2/ Mục đích nghiên cứu
Khảo sát để lựa chọn ra những thí nghiệm sắc ký có thể áp dụng dạy cho
học sinh phổ thơng. Nghĩa là thiết bị, hố chất, đơn giản, ít hoặc khơng độc hại,
dễ tìm kiếm ở phịng thí nghiệm của một trường THPT ở Việt Nam. Chọn thành
phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích sao cho thí nghiệm dễ làm, thời gian
cho một nghiệm chỉ khoảng từ 5 đến 15 phút nhưng vẫn đảm bảo chuyển tải


5
được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và ứng
dụng của sắc ký.
3/ Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu
Kiến thức về sắc ký là khá rộng, nhưng do mục tiêu đã nêu trên hơn nữa
thời gian nghiên cứu và khả năng của bản thân có hạn, nên tơi chỉ tập trung
nghiên cứu khảo sát việc thay đổi các hoá chất dụng cụ để thực hiện thí nghiệm
sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy ở mức tách định tính các chất màu
trong lá xanh (chlorophyl, carotenoit), một số ion kim loại thơng dụng có màu
đặc trưng (Fe3+, Cu2+, Co2+, Ni2+).
4/ Phƣơng pháp nghiên cứu
Nghiên cứu các tài liệu về cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, tài liệu hướng
dẫn thực hành sắc ký.
Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy; nghiên
cứu sự thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích để tìm ra những
thí nghiệm phù hợp với mục đích đã nêu.

6

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19]
Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet đã dùng cột nhơm
oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả
tách thành công chlorophyl từ lá cây. Ơng đã giải thích hiện tượng bằng ái lực
hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp
sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có
màu.
Tuy nhiên phát minh của Tsvet gần như bị lãng quên trong một thời gian
dài. Mãi tới năm 1931 sau khi Vinterstin và Lederer dùng phương pháp của
Tsvet tách caroten thô thành  và  caroten và nhận thấy giá trị của phương
pháp về phương diện điều chế, phương pháp sắc ký mới bắt đầu được chú ý
đúng mức và phát triển nhanh chóng. Đặc biệt trong những năm 30 của thế kỷ
XX, nhu cầu về phân tích và tách hỗn hợp các chất trở nên rất cấp thiết nên sắc
ký phát triển nhanh chóng. Năm 1938 Izmailov và Shraiber đặt nền móng đầu
tiên cho sắc ký lớp mỏng và sau đó những cơng trình của Stahl đã làm cho sắc
ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. Năm 1941
Tiselius phát triền các kỹ thuật tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích
tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải. Cũng trong năm 1941 sắc ký
phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo
ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các
cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên đã phát triển một dạng
mới của sắc ký phân bố: sắc ký giấy. Do có cơng đóng góp các tác giả đã nhận
giải Nobel năm 1952. Vào năm 1941 – 1942, Martin đã làm một bước ngoặt lớn
trong sắc ký do dùng sắc ký giấy tách thành công các ancaloit chiết được từ các
cây thuốc. Năm 1952, Martin cơng bố cơng trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên
sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí. Vào
những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao

hiệu quả của phương pháp, các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến,
từ đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể
như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố đất
hiếm), các ancaloit, các hiđrocacbon trong các mẫu dầu…Ngày nay trong sắc ký
lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7  m, có khả
năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả
(Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) có thể tách nhanh các hợp
chất khó trong thời gian vài chục giây. Ngồi ra phương pháp siêu tới hạn


7
(Supercritical fluid chromatography – SFC) cũng được phát triển để phù hợp với
các chất có khối lượng phân tử lớn. Vào cuối thể kỷ trước, một phương pháp
tách mới được đời là các phương pháp điện di, đặc biệt là điện di mao quản.
Phương pháp có hiệu lực tách rất cao, nhanh, có thể tách được nhiều các đối
tượng vơ cơ và hữu cơ. Năm 1994, những máy điện di mao quản đầu tiên được
bán trên thị trường, được sử dụng rất có hiệu quả để phân tích các dược phẩm,
các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu cực kỳ khó như protein, enzim…
Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” khơng
cịn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký
đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn
hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng
mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một
chất khí hoặc chất lỏng (pha động).
1.2. Định nghĩa, nguyên tắc và phân loại các phƣơng pháp sắc ký [10, 15]
1.2.1. Định nghĩa
Tính đa dạng mn màu của phương pháp sắc ký đã làm nảy sinh nhiều định
nghĩa, nhiều tên gọi trong lĩnh vực sắc ký. Nhưng định nghĩa được nhiều nhà
hố học thừa nhận là hồn chỉnh nhất, tổng quan nhất như sau:
Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố

không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.
- Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.
1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký
Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các
chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh(stationary phase) và
một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn
hợp chất cần phân tích đã được hồ tan trong dung mơi thích hợp (pha động) di
chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác
nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau
một thời gian nhất định.
1.2.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký
1.2.3.1. Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha
tĩnh
- Theo cách phân loại này tất cả các phương pháp sắc ký được phân thành hai
nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Đây là cách phân loại lôgic
nhất và được sử dụng rộng rãi.
- Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng (được mang trên chất rắn).
1.2.3.2. Phân loại theo cơ chế của quá trình tách


8
Phương pháp phân loại này dựa trên cơ chế của quá trình hấp thụ - giải hấp thụ,
nghĩa là theo tương tác của chất được sắc ký với pha động. Có bốn cơ chế sắc ký
chính sau đây.
A. Sắc ký hấp phụ.
Sự tách do ái lực khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh). Đối
với các chất hấp phụ phân cực, ái lực đó chủ yếu do tương tác của các cực. Do
đó các nhóm phân cực trong phân tử ảnh hưởng tới kết quả tách mạnh hơn các
mạch hiđrocacbon không phân cực.
B. Sắc ký phân bố.

Trong phương pháp này người ta lợi dụng sự phân bố khác nhau của các chất
giữa pha tĩnh lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha động. Trong sắc ký lỏng
pha tĩnh thường phân cực hơn pha động, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược
lại. Về nguyên tắc có thể có rất nhiều tổ hợp hai pha lỏng. Tuy nhiên trong thực
tế số đó bị hạn chế rất lớn. Như chúng ta đã biết qui tắc về độ tan “các chất
giống nhau hồ tan vào nhau”, do đó độ phân cực của các chất được sắc ký cũng
như của các pha tĩnh và pha động có ảnh hưởng tới quá trình tách.
C. Sắc ký trao đổi ion.
Sự tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung
tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh. Chất rắn quan trọng
nhất trong trường hợp này là các nhựa trao đổi ion. Sắc ký trao đổi ion chủ yếu
dùng trong dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước - dung mơi hữu cơ trong mơi
trường có độ điện mơi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền.
D. Sắc ký rây phân tử.
Trong phương pháp này người ta sử dụng các vật liệu rắn có độ xốp lớn. Có các
lỗ với kích thước nhất định để rây chọn lọc các cấu tử tuỳ theo kích thước và
hình dạng phân tử. Các zeolit tổng hợp có giá trị rất lớn trong sắc ký rây các chất
khí. Có thể dùng các hợp chất vơ cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách các chất
vô cơ và hữu cơ; đặc biệt nhóm polime ưa nước (loại dextran mạng) được dùng
để tách các chất có hoạt tính sinh học.
Ngồi ra cịn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxi hoákhử, nhưng chúng ít có giá trị thực tế.
Cuối cùng cần nhấn mạnh rằng, đối với một q trình sắc ký có một cơ chế chủ
đạo, nhưng có thể xảy ra các cơ chế phụ khác. Ví dụ trong sắc ký hấp phụ có thể
có một phần trao đổi ion (hấp phụ hố học, tạo phức) hoặc cơ chế phân bố.
1.2.3.3. Phân loại theo cách hình thành sắc đồ.
Cơ sở của phương pháp phân loại này dựa trên cách chuyển dịch tương đối của
pha động so với pha tĩnh. Có thể khai triển sắc đồ theo ba phương pháp: tiền lưu,


9

đẩy và rửa giải. Phương pháp rửa giải quan trọng và phổ biến nhất, sau đó là
phương pháp đẩy, cịn phương pháp tiền lưu ít được sử dụng.
A. Phương pháp tiền lưu.
Theo phương pháp này, người ta cho hỗn hợp chất phân tích, ví dụ, dung mơi
chứa các cấu tử A, B liên tục đi vào lớp đầu tiên của pha tĩnh (đầu cột) và di
chuyển tới lớp cuối cùng của pha tĩnh (cuối cột). Nếu chất B bị hấp thụ mạnh
hơn chất A thì tuyến dung mơi phía trước sẽ nghèo cấu tử B hơn và kết quả là
dung môi đi ra khỏi cột chứa cấu tử A nguyên chất. Cấu tử B sẽ không bị hấp
thụ ở những lớp chất hấp thụ đã bão hoà cấu tử B và chuyển động dọc cột cùng
với cấu tử A. Cuối cùng dung môi chứa hỗn hợp A, B đi ra khỏi cột. Như vậy
phương pháp này cho phép thu được một lượng nào đó A nguyên chất.
B. Phương pháp đẩy.
Nguyên tắc của phương pháp này là đưa một mẫu tương đối nhỏ hỗn hợp chất
phân tích chứa các cấu tử A, B lên lớp đầu của pha tĩnh (lúc này xảy ra q trình
tiền lưu nhưng rất ít). Sau đó cho dung môi chứa chất E (pha động) đi qua. Điều
kiện quan trọng là chất E bị hấp thụ mạnh hơn A, B. Do đó E đẩy các cấu tử A,
B chuyển động xuống phía dưới. Vì B bị giữ mạnh hơn A cho nên B lại đẩy A
về phía trước. Kết quả ta được các vùng A nguyên chất, B nguyên chất và pha
động chứa E nguyên chất

Hình 1.1. Phương pháp đẩy
Như vậy, khác với phương pháp tiền lưu, nhờ phương pháp đẩy ta có thể
thu được các phân đoạn chứa từng cấu tử nguyên chất.
C. Phương pháp rửa giải.
Trước hết đưa các mẫu nhỏ gồm hỗn hợp các cấu tử A, B vào lớp đầu tiên của
pha tĩnh. Giả sử B bị hấp thụ mạnh hơn A. Sau đó cho pha động chứa cấu tử E
đi qua cột. Điều kiện quan trọng là cấu tử E bị hấp thụ yếu hơn cả. Lúc đó pha
động sẽ rửa A, B với tốc độ khác nhau tuỳ theo mức độ các cấu tử đó bị pha tĩnh
giữ. Vì A bị hấp thụ yếu hơn nên nó dịch chuyển nhanh hơn cùng với pha động.

10
Đó là kết quả của sự chuyển dịch cân bằng hấp thụ-giải hấp thụ giữa các cấu tử
A, B, E. Nếu tốc độ chuyển dịch của A, B đủ khác nhau, thì các vùng A, B
chồng chập nhau lúc đầu dần dần được tách ra và cuối cùng tạo thành hai vùng
riêng biệt và được ngăn cách bởi dung môi nguyên chất (chứa E). Vùng A
chuyển dịch trước vùng B

Hình 1.2. Phương pháp rửa giải
Nếu đường đẳng nhiệt hấp thụ là tuyến tính, thì đường cong biểu diễn sự
biến thiên nồng độ các cấu tử có dạng hình chng (phân bố Gauss). Nhược
điểm của phương pháp này là dùng lượng lớn dung mơi do đó nồng độ chất đi ra
khỏi đầu cột rất lỗng.
1.2.3.4. Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ.
Theo phương pháp phân loại này, tất cả các phương pháp sắc ký được chia thành
hai nhóm: Sắc ký cột và sắc ký phẳng. Trong sắc ký cột (kể cả sắc ký cột mao
quản) quá trình tách hỗn hợp được thực hiện trên các cột hình trịn nạp các chất
hấp thụ thích hợp. Cịn trong sắc ký phẳng sự hình thành sắc đồ được tiến hành
trên các lớp phẳng chất hấp thụ (giấy hoặc lớp mỏng).
Cuối cùng cần nói rằng tuyệt đại đa số phương pháp sắc ký đều tiến hành theo
lối động, nghĩa là một pha đứng im và một pha chuyển động; tuy nhiên có một
số trường hợp tách theo lối tĩnh nghĩa là cả hai pha đều đứng im tương đối và
phải khuấy trộn mạnh để cân bằng hấp thụ - giải hấp thụ xảy ra nhanh. Lý thuyết
sắc ký không áp dụng cho lối tĩnh.
1.3. Cơ sở lí thuyết về sắc ký [10, 15]
1.3.1. Các khái niệm cơ bản
. Hệ số phân bố
Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động và pha tĩnh sẽ phân bố giữa
hai pha theo tỷ số nồng độ nhất định, như vậy, nó có hệ số phân bố riêng, nói
một cách khác cân bằng phân bố được thiết lập, có phương trình:

11

 Am
As 


(3.1)

Hệ số phân bố là tỷ số nồng độ chất phân tích giữa hai pha
KD =

[A s ]
[A m ]

(3.2)

Trong đó

[As] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh
[Am] là nồng độ chất phân tích trong pha động
. Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của các chất
trong hệ sắc ký.
Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động.
Gọi fa là phần thời gian của chất A ở pha động
fa = Số milimol A trong pha động/số milimol A trong toàn cột
fa =

[A]m .Vm

[A]m .Vm +[A]s .Vs

(3.3)

Biến đổi phương trình 3.3 (chia phân sơa cho [A]m.Vm ta có:
fa 

1
1  K DA

Đặt k 'A  K DA .

(3.4)

Vs
Vm

Vs
1
, ta có f A 
Vm
1  k ,A

(3.5)

Trong đó k ,A được gọi là hệ số lưu.
Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động, UA là:
u A  u.f A hay u A 

u

(1  k ,A )

u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Qua đó ta thấy hệ số KD và hệ
số lưu k ,A đều tỉ lệ nghịch với tốc độ di chuyển của chất tan.
. Thời gian lƣu tR và thời gian lƣu hiệu chỉnh tR’
Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới
khi pic đạt giá trị cực đại.
t RA 

L L(1  k ,A )

uA
u

L/u = tm là thời gian cấu tử khơng lưu giữ trên cột, cịn gọi là thời gian chết.
t RA  t m (1  K DA .

Vs
)  t m (1  k ,A )
Vm

(3.6)

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R là thời gian lưu không tính thời gian chết
,

,

t’RA = tRA – tm = tm.k’A  k ,A  t R  VR
tm

(3.7)

Vm

. Thể tích lƣu VR và thể tích lƣu hiệu chỉnh VR’
Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơmmẫu


12
vào cột đến khi pic đạt giá trị cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động
(ml/phút). Thể tích lưu VR được tính theo cơng thức:
VRA = tRA.F; Vm = tm.F; thay vào 3.6 ta có
VRA = Vm(1+ K’A)
(3.8)
Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột.
V’RA = VR – Vm = Vm.k’A = KDA.Vs
(3.9)
Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch
rửa giải để rửa giải chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của
pha tĩnh.
V’RA/Vs = KDA = Vg
. Hệ số tách
Hệ số tách  là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương
pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỉ số của hệ số
phân bố của 2 chất, một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất
chuẩn.
Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là   1
(3.10)
Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động

phải khác nhau. Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t’RA/t’RB cũng
chính là tỉ số của hệ số phân bố
,
K DA k ,A t ,RA VRA


 ,
Vậy có thể tóm tắt là:  
K DB k ,B t ,RB VRB

. Đĩa lý thuyết
+ Khái niệm đĩa lý thuyết
Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập.
Theo quan niệm của Martin và synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh
chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích sự giãn rộng
vùng mẫu, hiện tượng pic sắc ký không cân đối. Amoudson và Lapidus và sau
đó là Van Deemter cho rằng đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối
lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại,
+ Sắc đồ và tính số đĩa lí thuyết
Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích S hoặc chiều cao h tín
hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện, hoặc tần số
xung điện…liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời
gian. Các tín hiệu này được gọi là “pic” sắc ký. Định lượng các chất phân tích
dựa vào diện tích pic sắc ký là chính xác nhất. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký
hiện đại đều được trang bị phần mềm để tính diện tích của pic một cách tự động.
Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân


13
bằng phân bố chất phân tích tại đó được đáp ứng.

Gọi N là số đĩa lí thuyết,  là độ lệch chuẩn;  tỉ lệ thuận với N . Đối với
cột sắc ký N càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tR tỉ lệ thuận với số đĩa lí
thuyết N, nên ta có thể viết:
tR
t
N
hay N  ( R )2



N

Mặt khác w = 4  hay  

(3.11)
w
4

Số đĩa lí thuyết N có thể viết lại là:
N  16(

tR 2
t
)  5,54( R ) 2
w
w1/2

(3.12)

Trong sắc ký cột nhồi, số đĩa lí thuyết được tính tương đối dựa vào chiều

dài cột và chiều cao đĩa lí thuyết, H  2-3dp
. Độ phân giải
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử ra khỏi nhau trong một phép
tách sắc ký. Hay cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải
càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian
lưu tRA, tRB, độ rộng pic wA, wB.
Độ phân giải R được định nghĩa: R 

2(t RB  t RA ) t RB  t RA

WA WB
WA  WB

2
2

(3.13)

Trong đó: tRB – tRA = t R là sự chênh lệch thời gian lưu (cũng có thể dùng thể
tích lưu VRA – VRB) của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng
bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc ml nói lên khả năng tách của cột.
Khi R = 1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95%, nghĩa là còn
2,5% của A ở trong B, 2,5% ở trong A. Khi R = 1,5 thì hai cấu tử A và B đã tách
khỏi nhau đạt 99,8% có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại.
Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng:
t R  N , chiều rộng pic tỉ lệ với N
R

N
hay R  L

N

Thí dụ tăng gấp đơi chiều dài cột, độ phân giải mới R’ sẽ là R’= 2R
Cách làm tăng độ phân giải
a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột:
- Tăng chiều dài cột
- Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn.
- Thay đổi pha tĩnh.
- Giảm đường kính cột.


14
b) Dựa trên thay đổi vận hành cột
- Tối ưu hoá tốc độ pha động.
- Giảm lượng mẫu.
- Giảm nhiệt độ (GC).
- Thay đổi thành phần pha động (LC)
1.3.2. Thuyết đĩa
* Thiết lập phƣơng trình rửa giải
Đĩa lý thuyết là một khái niệm vừa trừu tượng vừa hiện thực. Nó hiện thực ở chỗ
là một phần của cột sắc ký, tuy nhiên nó cũng trừu tượng ở chỗ khơng thể phân
biệt được ranh giới cụ thể của nó. Có thể định nghĩa: “đĩa lý thuyết là phần nào
đó của cột mà trên đó cân bằng phân bố được thiết lập trong quá trình tách”. Số
đĩa lý thuyết của một sắc ký thường không cố định cho một cột sắc ký nào, thậm
chí cho các phép sắc ký khác nhau trên cùng một cột.
Gọi là thuyết đĩa vì các tác giả đã xây dựng phương trình tính thể tích lưu
cho phép tách sắc ký dựa trên việc tính tốn lượng chất tan có trong từng đĩa lý
thuyết. Đặt KD là hệ số phân bố, V là thể tích trống của một đĩa và Vm là thể tích
trống của tồn cột.
Gọi Sx,n là phần chất phân tích đi vào pha tĩnh, Lx,n là phần chất phân tích cịn lại

ở pha động. Theo định nghĩa về hệ số phân bố ta có:
KD 

Sx,n

(3.14)

L x,n

Trong đó x là số lần đưa V ml dung dịch rửa giải vào, n là số thứ tự của đĩa
Khi nạp chất phân tích
Mẫu được nạp vào đĩa số 0, tại đây, cân bằng phân bố được thiết lập:
S0,0 = KD.L0,0
(3.15)
Mặt khác do nạp chất phân tích vào cột là 1 đơn vị khối lượng, ta có:
S0,0 + L0,0 = 1
(3.16)
Thay (3.15) vào (3.16) ta có: KD.L0,0 + L0,0 = 1
Từ đó dễ dàng suy ra: L0,0 
Và S0,0 

1
1 KD

KD
1 KD

(3.17)
(3.18)

Khi đƣa 1V ml dung dịch rửa giải vào:
Pha động của đĩa số 0 di chuyển xuống đĩa số 1.
Tại đĩa số 0:
Chất phân tích từ đĩa số 0 phân bố lại:
S1,0  L1,0  S0,0 

KD
(1  K D )

từ (3.14) ta có S1,0  K D .L1,0 thay vào biểu thức vừa rồi


15
ta có: K D .L1,0  L1,0 
L1,0 

KD
suy ra:
(1  K D )

K 2D
KD
;
S

1,0
(1  K D )2
(1  K D )2

(3.19)

Tại đĩa số 1:
Khi x = 1, toàn bộ chất phân tích ở pha động ở đĩa số 0 chuyển xuống đĩa số 1,
phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có
S1,1  L1,1  L0,0 

1
từ (3.14) ta có S1,1  K D .L1,1 thay vào biểu thức vừa rồi ta
(1  K D )

có: K D .L1,1  L1,1 
L1,1 

1
và suy ra:
(1  K D )

KD
1
; S1,1 
2
(1  K D )
(1  K D )2

(3.20)

Khi đƣa 2V ml dung dịch rửa giải vào:
Tại đĩa số 0:
Pha động của đĩa số 0 lại di chuyển xuống đĩa số 1 lần nữa, sau đó cân bằng tại
đĩa này lại được phân bố lại, ta có:

S2,0  L2,0  S1,0 

K 2D
từ (3.14) ta có S2,0  K D .L2,0 thay vào biểu thức vừa rồi ta
(1  K D )2

có: K D .L2,0  L2,0

K 2D

và suy ra:
(1  K D )2

L2,0 

K 3D
K 2D
S

;
2,0
(1  K D )3
(1  K D )3

(3.21)

Tại đĩa số 1:
Khi x = 2, lượng chất phân tích trong đĩa 1 gồm 2 nguồn, một là do từ đĩa số 0
chuyển xuống, và hai là do từ pha tĩnh của đĩa số 1 cân bằng lại:
S2,1  L2,1  S1,1  L1,0 

KD
KD
2K D


2
2
(1  K D ) (1  K D )
(1  K D )2

từ (3.14) ta có S2,1  K D .L2,1 thay vào biểu thức vừa rồi ta có:
K D .L2,1  L 2,1 

L2,1 

2K D
và suy ra:
(1  K D ) 2

2K 2D
2K D
S

;
2,1
(1  K D )3
(1  K D )3

(3.22)

Tại đĩa số 2:
Khi x = 2, tồn bộ chất phân tích ở pha động của đĩa số 1 chuyển xuống đĩa số 2,
phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có:
S2,2  L2,2  L1,1 

1
(1  K D )2


16
từ (3.14) ta có S2,2  K D .L2,2 thay vào biểu thức vừa rồi ta có:
K D .L2,2  L2,2 
L2,2 

1
và suy ra:
(1  K D )2

KD
1
; S2,2 
3
(1  K D )
(1  K D )3

(3.23)

Tính tốn tương tự cho các đĩa tiếp theo lượng chất trong pha động có kết quả
như ở bảng sau:

Bảng 1.1. Giá trị của Lx,n
n=0

n=1

n=2

n=3

n=4

n=5

x=0

1
1 KD

x=1

KD
(1  K D ) 2

1
(1  K D ) 2

x=2

K 2D
(1  K D )3

2K D
(1  K D )3

1
(1  K D )3

x=3

K 3D
(1  K D ) 4

3K 2D
(1  K D ) 4

3K D
(1  K D ) 4

1
(1  K D ) 4

x=4

K 4D
(1  K D )5

4K 3D
(1  K D )5

6K 2D

(1  K D )5

4K D
(1  K D )5

1
(1  K D )5

x=5

K 5D
(1  K D )6

5K 4D
(1  K D )6

10K 3D
(1  K D )6

10K 2D
(1  K D )6

5K D
(1  K D )6

1
(1  K D )6

x=6

K 6D
(1  K D )7

6K 5D
(1  K D )7

15K 4D
(1  K D )7

20K 3D
(1  K D )7

15K 2D
(1  K D )7

6K D
(1  K D )7

x=7

K 7D
(1  K D )8

7K 6D
(1  K D )8

21K 5D
(1  K D )8

35K 4D

(1  K D )8

35K 3D
(1  K D )8

21K 2D
(1  K D )8

Phương trình tổng qt tính lượng chất phân tích cho một đĩa bất kỳ như sau:
Sx,n + Lx,n = Sx-1,n + Lx-1,n-1
(3.24)
Sx,n 

K Dx n 1
x!
.
(x  n)!n! (1  K D ) x 1

(3.25)

L x,n 

K Dx n
x!
.
(x  n)!n! (1  K D ) x 1

(3.26)

Điều kiện x  n , nếu x < n thì Lx,n = 0; Sx,n = 0

Khi x tăng, Lx,n sẽ qua giá trị cực đại sau đó giảm dần tới 0. Trong sắc ký, số
đĩa lý thuyết thường rất lớn. Giá trị Lx,n tại cực đại được ký hiệu là Lx*,n sẽ
không khác nhau nhiều so với Lx-1,n. Ta có thể viết:
Lx*,n = Lx*-1,n. Giá trị của n rất lớn, như vậy, giá trị của Lx*,n được viết lại là:


17
K Dx n
K Dx 1n
x* !
(x*  1)!
 *
.

L

.
*
*
x* 1,n
(x  n)!n! (1  K D ) x 1
(x *  1  n)!n! (1  K D ) x
*

L x* ,n

*

Nhân cả hai vế của phương trình trên với phân số:
(x*  1  n)!n! (1  K D ) x

.
ta có:
*
(x*  1)!
K Dx 1n
*

K Dx n
KD
x* !
(x*  1  n)!n! (1  K D ) x
x*
.
.
.
 *
.
1
*
*
x*  n
x* 1 n
(x  n)!n! (1  K D )
(x  1)!
x  n 1 KD
KD
*

*

x*.K D  (x*  n).(1  K D ) ; rút ra được: x* = n(1+KD)

(3.27)

x*.V = VR là lượng dung dịch tại cực đại của đường cong rửa
n.V = Vm là thể tích trống của cột. Nhân phương trình (3.27) với V ta có phương
trình quan trọng để giải thích q trình sắc ký:
VR = Vm(1+KD)
(3.28)
1.3.3. Thuyết tốc độ, phƣơng trình Van Deemter
Sự giãn rộng vùng mẫu
Theo thuyết này, yếu tố tốc độ của pha động có vai trị cực kỳ quan trọng đối với
hiệu quả tách sắc ký. Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa là hệ số
khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều
bởi tốc độ pha động. Ngồi ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột..., cũng ảnh
hưởng rất nhiều tới sự giãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng của
pic thu được trong sắc đồ. Các tác giả đưa ra đại lượng đặc trưng cho độ giãn
rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết, H. Chiều cao đĩa lý
thuyết được cấu thành do 3 yếu tố H1, H2, H3 là 3 đại lượng độ giãn rộng thành
phần.
H = H1 + H2 + H3
(3.29)
H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng đều của hạt nhồi,
đường kính hạt nhồi, khả năng nạp cột, được viết:
H1  2d p
(1.30)
trong đó  là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt,  = 1,5; d p là đường kính hạt nhồi
H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự
khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha
động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất

phân tích, được biểu diễn bằng phương trình:
H2 = B/u
Trong đó B  2 Dm là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất
phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt,


18
đường đi của chất phân tích khơng q khúc khuỷu,   1 ; Dm là hệ số khuếch
tán của chất phân tích trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là:
(1.31)
H2  2 Dm / u
H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc
nhiều vào tốc độ hấp thụ và giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và
pha động vì vậy H3 có thể viết:
(1.32)
H3  (Cs  Cm )u
trong đó Cs là hệ số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha
tĩnh phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ, khi tốc độ dòng,
F  1ml / phút, Cs  0 .
Cs  K.d f2 / Ds

(1.33)

K – là hệ số.
Ds – là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh.
d f2 - là chiều dày pha tĩnh.
Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong
pha động, phụ thuộc vào pha động,
Cm   d p2 / Dm
(1.34)

 là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1
D m là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:
H  2d p  2 Dm / u  (K.d f2 / Ds   d p2 / Dm )u

(1.35)

Phương trình (1.35) thường được viết tắt là
H = A + B/u + Cu
Trong thực tế có thể tính gần đúng H  3  4d p
Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm phương trình Van Deemter,
ta có: H'  B/ u 2  C. Tại cực tiểu, H'  0 hay B/ u 2  C  0  u2t.ư=B/C
2
1/2
 u t.ư= (B/C)
(1.36)
1/2
 Hmin = A + 2.(B/C)
(1.37)


19

Hình 1.3. Đường cong Van Deemter
Ngồi ra cịn có các yếu tố làm giãn rộng vùng mẫu do nguyên nhân ở
ngồi cột như thể tích pha động giữa đầu ra cột sắc ký và detector lớn, thể tích
mẫu bơm vào cột lớn, lượng mẫu lớn…
Vì mục đích và phạm vi nghiên cứu của luận văn đã được trình bày ở trên
nên chúng tôi sẽ giới thiệu chi tiết hơn về sắc ký lớp mỏng (thin layer

chromatography), sắc ký giấy (paper chromatography) và sắc ký hấp phụ lỏng
trên cột (Adsorption liquid chromatography on columns)
1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) [15, 18]
Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn –
lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ
như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng,
đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhơm, hoặc tấm plastic. Do chất
hấp thụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp
mỏng (hay sắc ký lớp mỏng). Trước đây Sắc ký lớp mỏng chủ yếu dùng trong
phân tích định tính, nhưng đến nay đã áp dụng sang cả phân tích định lượng do
những tiến bộ của kỹ thuật làm tăng tính lặp lại và độ chính xác. Hệ số di
chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách. Hệ số di chuyển R f
được tính theo cơng thức:
Rf 

l
v
hoặc R f 
l0
v0


20

Hình 1.4. Cách xác định giá trị Rf.
Trong đó l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký, lo là
khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi, v là tốc độ di chuyển của
chất tan và vo là tốc độ của dung môi. Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Khi
Rf = 0 thì chất tan hồn tồn khơng di chuyển, cịn khi Rf = 1 thì chất tan di
chuyển bằng tốc độ của dung mơi.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:
+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ
+ Bề dày của lớp mỏng
+ Chất lượng và độ tinh khiết của pha động
+ Độ bão hồ của dung mơi trong bình sắc ký
+ Lượng mẫu đưa lên bản mỏng
1.4.1. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng
Trong sắc ký lớp mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau:
, nhôm oxit, xenlulozơ, tinh bột, nhựa trao đổi ion… ngoài ra cịn dùng các chất
hấp thụ biến tính khác
Bảng 1.2. Các chất hấp thụ thƣờng dùng trong sắc ký lớp mỏng
Chất hấp thụ
Silicagel
Nhơm oxit
Magie photphat
Canxi hiđroxit
Canxi sunfat
sắt(III)hiđroxit
Than hoạt tính

Hoạt năng
Có
Có
yếu
yếu
yếu
Có
Có

Cơ chế

hấp thụ và phân bố
Phân bố
hấp thụ
hấp thụ
hấp thụ
hấp thụ
hấp thụ

Công dụng
Cho tất cả các hợp chất
steroit
Carotenoit, tocopherol
tocopherol
tocopherol
Chất phân cực
chất không phân cực


21
1.4.2. Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu
Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung mơi
và thuốc thử khác nhau, sau đây là một số hệ dung môi và thuốc thử trong
SKLM các hợp chất tự nhiên
Bảng 1.3. Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự
nhiên
hợp
chất hấp
hệ dung môi
thuốc thử hiện
chất

thụ
màu
Ankaloit
SiO2G
CHCl3-MeOH (9:1)
hơi I2
CHCl3-axetol-MeOH-NH3
(20:20:3:1)
CHCl3-EtOAC-MeOH (20:201)
Benzen-ETOAC-dietylamin
(7:2:1)
Saponin
SiO2G
n-butan-ACOH-H2O (4:1:5)
Vanillin | H3PO4
n-butan-EtOH-NH4OH (7:2:5)
SbCl3 | CHCl3
CHCl3-MeOH-H2O (61:32 : 7)
H2SO4
EtOAC-MeOH-H2O (100 :17
:13)
CHCl3-MeOH (9 :1) Genin
Caroten
SiO2G
Ete dầu hoả – toluen – axeton
Hơi I2
(45: 1: 5)
Tinh dầu
SiO2G
Benzen EtOAC (95 :5)

I2, H2SO4, H3PO4
Benzen MeOH (95: 5)
Tanin
SiO2G
EtOAC-MeOH-H2O (100 :17
FeCl3
:13)
Toluen-MeOH-H2O (4 :3:1)
Flavonit
SiO2G
Toluen – Etyl fomiat – axit
MeOH
formic (5:4:1)
10%(H2O)
sắc tố lá
CaCO3
Ete petrol
cây
1.5. Sắc ký giấy (paper chromatography) [15, 19]
Là một phương pháp sắc ký dùng giấy hấp thụ để phân tích một lượng nhỏ chất
lỏng mang (chất hoà tan) và lấy ra khi vạch chất hoà tan tiến gần đến đầu kia của
một băng giấy. Trong quá trình sắc ký các cấu tử được tách dọc theo lớp mỏng


22
của tờ giấy. Đặc trưng cho sự chuyển động của các chất trên giấy là hệ số di
chuyể Rf như sau:
Rf 

l

; hoặc Rf = tốc độ chuyển động của một cấu tử/ tốc độ chuyển
l0

động của tuyến pha động
Trong đó l là đoạn đường đi của cấu tử, lo là đoạn đường đi của dung môi. Nếu
Rf lớn quá thì khơng tách được các chất, Rf bé q thì tách chậm.
1.5.1. Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy
Có các phương pháp sắc ký giấy như sau: một chiều, hai chiều, vịng và
điện di. Tuy nhiên do mục đích nghiên cứu đã trình bày nên ở đề tài này tơi xin
phép chỉ trình bày sắc ký một chiều đi lên.
A. Sắc đồ một chiều đi lên
Sắc ký một chiều đi lên là phương pháp đơn giản nhất. Dùng mao quản
hoặc micropipet chấm một giọt dung dịch mẫu lên phần đuôi giấy cách mép một
khoảng nhất định. Nếu pha tĩnh là nước thì giấy khơng phải xử lý đặc biệt, vì
giấy trong khơng khí đã chứa một lượng nước khá đủ (20 – 22%). Rót pha động
đã được bão hồ trước bằng pha tĩnh vào bình sắc ký (xi lanh hoặc ống nghiệm).
Nhúng mép dưới giấy vào pha động, trên mép treo để giấy bng tự do xuống
dưới. Đậy bình và để vào nơi điều hoà nhiệt, dao động của nhiệt độ trong suốt
q trình sắc ký khơng nên q  2oC. Nhờ lực hút mao quản, chất lỏng được
thấm lên theo giấy và các cấu tử được tách thành vùng riêng do các chất chuyển
động với tốc độ khác nhau. Khi tuyến dung môi đạt tới chiều cao nhất định,
thường cách mép trên của băng giấy 1 cm, thì lấy giấy ra, sấy khơ giấy và hiện
sắc đồ. Vì kết quả tách Rf phụ thuộc vào lượng chất đưa lên giấy, thường lấy
không quá 0,001 – 0,005 ml. Chiều rộng băng giấy cho một giọt là 2 – 5 cm.
Chiều dài băng phụ thuộc vào điều kiện tách.
1.5.2. Giấy sắc ký
Các yêu cầu đối với giây sắc ký như sau: tinh khiết hố học, trung tính về
phương diện hố học hấp phụ, đồng nhất về tỉ trọng, bảo đảm cho dung mơi
chuyển động với tốc độ nhất định.
Để có giấy tinh khiết hoá học, xử lý giấy lọc thường bằng các tác nhân

khác nhau, ví dụ axit amino axetic, 8-oxiquinonlin v.v để tạo phức tan với các
ion vơ cơ có trong giấy. Sau đó rửa bằng dung mơi để loại hết tạp chất vơ cơ ra
khỏi giấy. Có thể dùng giấy lọc lọai mịn, giấy vatmam…
Để đặc trưng cho giấy dùng khối lượng 1m2 (tính theo gam). Chiều dày
(mm), chiều cao nước thấm lên một đơn vị thời gian (cm/h) và chiều cao thấm
của hỗn hợp ancol n-butylic, axit axetic, nước theo tỉ lệ 4:1:5 trong một đơn vị


23
thời gian. Để tách tốt cần chú ý hướng sợi giấy trùng với hướng chuyển động
của dung môi. Giấy sắc ký phải chứa một lượng pha tĩnh cần để tách các chất.
Các loại giấy thường là hyđrophyl ưa nước. Do đó nếu dùng nước làm
pha tĩnh khơng cần phải làm ẩm.
Để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước cần chuyển giấy từ
ưa nước thành kị nước theo cách tẩm bằng các chất kị nước khác nhau và axetyl
hoá.
Tẩm giấy bằng dung dịch parafin 1% trong ete dầu hoả dung dịch cao su
0,5% trong bezen, dung dịch dầu thực vật sạch 1- 2% trong ete etylic. Kiểm tra
độ kị nước của muối sau khi tẩm dung môi nói trên: cho bay hơi bằng một giọt
nước. Nếu giọt nước trượt theo tờ giấy, không bị thấm là tốt. Giữ giấy trong
bình kín bão hồ hơi dung mơi sẽ làm pha tĩnh.
Axetyl hố giấy bằng cách xử lí giấy bằng hỗn hợp 90ml axit axetic, 10ml
ete dầu hoả và 8 – 10 giọt H2SO4 đặc. Nhúng giấy vào hỗn hợp axetyl hố này
trong 45 phút, sau đó lấy ra, rửa cẩn thận bằng dòng nước trong 15 phút, ngâm
trong nước cất 10 – 15 phút, rửa và sấy. Kiểm tra độ kị nước của giấy như trên.
Phương pháp thu sắc đồ trên giấy kị nước dùng để tách các hỗn hợp các
chất không tan trong nước gọi là phương pháp pha biến tính. Trong trường hợp
này pha tĩnh là dung mơi khơng phân cực, cịn pha động là dung môi phân cực.
1.5.3. Dung môi trong sắc ký giấy
Chọn đúng pha tĩnh và pha động là yếu tố quan trọng nhất để tách các

chất trong sắc ký giấy. Khả năng tách phụ thuộc vào sự khác nhau của hệ số
phân bố (Kp)các cấu tử giữa hai pha lỏng. Pha lỏng phải đạt được những yêu cầu
sau:
+ Hai chất không được trộn lẫn vào nhau
+ Các cấu tử phải có độ tan trong dung môi làm pha động nhỏ hơn trong
dung môi làm pha tĩnh. Độ tan của chất trong dung môi làm pha động phải vừa
đủ. Nếu lớn quá chất sẽ chuyển động theo tuyến của dung môi động, nếu bé quá
chất sẽ gần như ở tuyến xuất phát;
+ Độ tan, hệ số phân bố của các cấu tử phải khác nhau đối với cặp dung
môi đã chọn;
+ Thành phần dung mơi trong q trình sắc ký giấy, phải khơng biến đổi;
+ Dung môi phải dễ loại khỏi giấy và không độc với người.
+ Đối với các chất tan trong nước, dùng dung mơi hữu cơ bão hồ nước
làm pha động, dùng nước làm pha tĩnh. Đối với các chất không tan trong nước
phải sắc ký bằng dung dịch nước của các chất hữu cơ, dùng các chất hữu cơ
không phân cực làm pha tĩnh.


24
1.5.4. Ứng dụng của sắc ký giấy
Sắc ký giấy được ứng dụng khá rộng rãi điển hình là:
- Phân tích để xác định hệ số phân bố của các chất trước khi chọn phương pháp
tách sắc ký một hỗn hợp nào đó.
- Phân tích định tính hỗn hợp các cation.
- Phân tích định lượng một số axit hữu cơ.
- Phân tích định lượng glucozơ trong dung dịch.
- Phân tích định lượng hàm lượng nhựa trong các sản phẩm dầu mỏ.
- Phân tích định tính và định lượng các axit amino.
1.6. Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột (Adsorption liquid chromatography on
columns) [15, 19]

1.6.1. Nguyên tắc của sắc ký hấp phụ lỏng
Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các
cấu tử trong hỗn hợp cần tách. Giữa nồng độ chất trong dung dịch và nồng độ
chất bị hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ có một cân bằng động, cân bằng đó
phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp thụ vào nồng độ của
nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi đường đẳng
nhiệt hấp phụ. Căn cứ vào đường đẳng nhiệt hấp phụ ta có thể chọn được điều
kiện sắc ký thích hợp.
Theo thuyết Langmuir có hai giả thiết: 1) trên bề mặt chất hấp phụ có
những trung tâm hoạt động, trường lực tự do của chúng có thể hút các phân tử
khí hoặc chất tan trong dung dịch; 2)chỉ một lớp đơn phân tử tạo thành trên bề
mặt chất rắn do các phân tử đó làm mất trường lực của chất hấp phụ. Mặt khác
các phân tử bị hấp phụ lại có thể được giải phóng trở lại mơi trường xung quanh
(bay hơi hoặc giải hấp). Kết quả là cân bằng được thiết lập giữa chất hấp phụ và
môi trường xung quanh, nghĩa là tốc độ hấp phụ (dính) và tốc độ giải hấp (nhả)
bằng nhau.
Trước khi bị hấp phụ, phân tử chuyển động tự do và phải va chạm vào bề
mặt chất hấp phụ và dính vào chỗ trống (chỗ bề mặt chưa bị hấp phụ). Vì số lần
va chạm tỷ lệ với nồng độ chất trong dung dịch C, còn xác suất rơi vào chỗ
trống tỉ lệ với diện tích trống nên tốc độ q trình hấp phụ Uh được biểu diễn bởi
phương trình:
Uh = k1C(1-fs)
(1)
Trong đó: k1 là hằng số
fs là phần chỗ đã bị chiếm trên bề mặt chất hấp phụ
1-fs là phần chỗ trống.