(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu chế tạo đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT TK liên quan đến bệnh ty thể 21

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK
LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ PHƢƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM NHẰM
SÀNG LỌC ĐỘT BIẾN Ở GEN ND6 VÀ MT-TK
LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH TY THỂ
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60 42 01 21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân
thành nhất tới PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Vân, người thầy tâm huyết, đã ln tận
tình dìu dắt, hướng dẫn, khích lệ tôi từ những ngày đầu tiên tôi bắt đầu làm quen với
khoa học. Cô luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tơi có thể hồn thành được luận
văn này, dành nhiều thời gian trao đổi và chia sẻ với tơi những kiến thức, kinh
nghiệm và nhờ đó tơi trưởng thành hơn rất nhiều.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Trần Thị Thùy Anh, người thầy
luôn đồng hành, sát cánh trong suốt q trình tơi thực hiện đề tài, đồng thời chia sẻ
với tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập cũng như trong cuộc
sống.
Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cô giáo trong Bộ môn Di
truyền học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên – ĐHQGHN đã dạy dỗ, chỉ bảo
trong suốt q trình tơi học tập và làm việc nghiên cứu tại bộ môn, giúp tôi tiếp cận
được nhiều kiến thức và kĩ thuật mới.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các phịng thí nghiệm thuộc Bộ mơn Di truyền
học, phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme và Protein, Trung tâm
nghiên cứu Khoa học sự sống đã tạo điều kiện về trang thiết bị và vật chất cho tơi
hồn thành luận văn này.
Cuối cùng, tơi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, các
anh chị em trong phịng thí nghiệm bộ môn Di truyền học, đã luôn giúp đỡ, khích
lệ, động viên để tơi có được ngày hơm nay.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
Học viên

Võ Thị Phƣơng


MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... v
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................vii
DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................................... viii
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................. 3
1.1.

Cấu trúc và chức năng của ty thể người ............................................................ 3

1.1.1. Cấu trúc của ty thể ............................................................................................ 3
1.1.2. Chức năng của ty thể ........................................................................................ 5
1.2.

Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể ........................................ 7

1.2.1. Hệ gen ty thể .................................................................................................... 7
1.2.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của các gen ty thể......................................... 10
1.2.3. Heteroplasmy và homoplasmy ....................................................................... 12
1.3.

Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan ...................................................... 13

1.3.1. Đột biến gen ty thể ......................................................................................... 13
1.3.2. Một số hội chứng phổ biến do đột biến gen ty thể gây ra .............................. 15
1.3.2.1. Hội chứng LHON (Leber’s hereditary optic neuropathy – hội chứng liệt
thần kinh thị giác di truyền Leber) ............................................................................ 15
1.3.2.2. Hội chứng MERRF (Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers – bệnh
động kinh co giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác) ......................................................... 15
1.3.2.3. Hội chứng MELAS (Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and
stroke-like episodes – bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai biến

mạch)………………………………………………………………………………16
1.3.2.4. Hội chứng Leigh (Leigh syndrome – bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo
Leigh)………………………………………………………………………………16
1.4.

Gen MT-TK và các đột biến A8344G, T8356C, G8363A .............................. 16

1.4.1. Gen MT-TK .................................................................................................... 16
1.4.2. Đột biến A8344G, T8356C, G8363A ............................................................ 17
1.5.

Gen ND6 và đột biến T14484C ...................................................................... 18

1.5.1. Gen ND6 ......................................................................................................... 18
i


1.5.2. Đột biến T14484C .......................................................................................... 19
1.6.

Một số phương pháp tạo đột biến điểm định hướng ....................................... 20

1.6.1. Phương pháp Kunkel ...................................................................................... 20
1.6.2. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp thiết kế vector tái tổ hợp 20
1.6.3. Tạo đột biến điểm định hướng bằng phương pháp PCR ................................ 21
1.6.3.1. Sử dụng PCR truyền thống .......................................................................... 21
1.6.3.2. Sử dụng Primer extention ............................................................................ 21
1.6.3.3. Sử dụng PCR đảo (Inverse PCR) ................................................................. 22
1.7.

Một số phương pháp phát hiện đột biến điểm ................................................ 23

1.7.1. Phát hiện đột biến điểm ADN ty thể bằng PCR- RFLP ................................. 23
1.7.2. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng xác định trình tự gen ............................. 24
1.7.3. Phát hiện đột biến điểm ty thể bằng phương pháp SSCP (Single-stranded
conformational polymorphism) ................................................................................. 25
1.8.

Tình hình nghiên cứu đột biến ADN ty thể ở Việt Nam ................................ 25

1.9.

Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài ................................................... 26

1.9.1. Mục tiêu.......................................................................................................... 26
1.9.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 26
CHƢƠNG 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 27
2.1. Đối tượng nghiên cứu......................................................................................... 27
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ............................................................................................... 27
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 28
2.2.1. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................. 28
2.2.1.1. Quy trình tách chiết ...................................................................................... 28
2.2.1.2. Kiểm tra và định lượng ADN tách chiết ...................................................... 29
2.2.2. Nhân bản các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385,
8342-8582 bằng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) ..................................... 29
2.2.3. Kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP: Restriction Fragment
Length Polymorphism).............................................................................................. 32

ii

2.2.4. Nhân dịng sản phẩm PCR từ khn là ADN bình thường (khơng chứa các
đột biến quan tâm) ..................................................................................................... 34
2.2.4.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E.coli DH5α ........................................................ 34
2.2.4.2. Phản ứng gắn các đoạn ADN đã được nhân bản bằng PCR vào vector
PTZ57R/T.................................................................................................................. 34
2.2.4.3. Biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào tế bào E. coli khả biến ............. 35
2.2.4.5. Tách chiết plasmid ....................................................................................... 38
2.2.4.6. Giải trình tự các plasmid nhân dòng ............................................................ 38
2.2.5. Thiết kế đối chứng dương cho các phản ứng sàng lọc .................................... 38
2.2.5.1. Thiết kế mồi tạo đột biến điểm định hướng ................................................. 39
2.2.5.2. PCR plasmid chứa các đoạn gen 14455-14578; 8155-8366; 8166-8385;
8342-8582 với cặp mồi chứa vị trí đột biến tương ứng ............................................ 40
2.2.5.3. Đóng vịng sản phẩm PCR sử dụng T4-ligase ............................................. 42
2.2.5.4. Biến nạp plasmid đã được đóng vịng vào tế bào khả biến E. coli DH5α và
tách chiết plasmid từ khuẩn lạc mang đoạn gen đột biến ......................................... 42
2.2.6. Sàng lọc kiểm tra sự có mặt của các đột biến T14484C, A8344G, T8356C,
G8363A ở 128 mẫu bệnh phẩm. ............................................................................... 42
2.2.7. Điện di trên gel agarose................................................................................... 43
2.2.8. Điện di trên gel polyacrylamide ...................................................................... 43
2.2.9. Giải trình tự ..................................................................................................... 44
CHƢƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 45
3.1. Kiểm tra ADN tổng số của mẫu bệnh phẩm ...................................................... 45
3.2. Kết quả nhân bản bằng PCR các đoạn gen từ nucleotide 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582. ................................................................................... 45
3.3. Nhân dòng các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582
không chứa đột biến vào vector PTZ57R/T .............................................................. 47
3.3.1. Kiểm tra khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp bằng PCR trực tiếp .................. 47
3.3.2. Tách và kiểm tra plasmid mang đoạn gen nhân dịng ..................................... 49
3.3.3. Giải trình tự các đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 8342-8582

đã được nhân dòng .................................................................................................... 51
iii


3.3.3.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 ................................................................... 51
3.3.3.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 ....................................................................... 51
3.3.3.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 và ngẫu nhiên phát hiện đột biến mất 9bp trên
gen MT-TK ................................................................................................................ 52
3.3.3.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 ....................................................................... 54
3.4. Tạo đột biến điểm nhân tạo A8344G, T8356C, G8363A, T14484C ................. 55
3.4.1. PCR plasmid chứa đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 8166-8385, 83428582 với 4 cặp mồi chứa điểm đột biến tương ứng .................................................. 55
3.4.2. Đóng vịng plasmid dạng thẳng và kiểm tra kết quả biến nạp ........................ 56
3.4.3. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc ... 58
3.4.4. Tách và kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................ 59
3.4.4.1. Tách plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................................ 59
3.4.4.2. Kiểm tra plasmid chứa đoạn gen mang đột biến .......................................... 60
3.4.5. Giải trình tự các plasmid chứa đoạn gen mang đột biến ................................. 61
3.4.5.1. Trình tự đoạn gen 14455-14578 có chứa vị trí đột biến T14484C .............. 62
3.4.5.2. Trình tự đoạn gen 8155-8366 có chứa vị trí đột biến A8344G .................... 63
3.4.5.3. Trình tự đoạn gen 8166-8385 có chứa vị trí đột biến T8356C .................... 64
3.4.5.4. Trình tự đoạn gen 8342-8582 có chứa vị trí đột biến G8363A .................... 66
3.5. Khẳng định sự có mặt của các đột biến A8344G, T8356C, G8353A, T14484C
bằng PCR-RFLP........................................................................................................ 67
3.5.1. Sàng lọc đột biến T14484C ............................................................................. 68
3.5.2. Sàng lọc đột biến A8344G .............................................................................. 69
3.5.3. Sàng lọc đột biến T8356C ............................................................................... 70
3.5.4. Sàng lọc đột biến G8363A .............................................................................. 71
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 74

iv


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể....................................................................................... 4
Hình 1.2. Cấu trúc màng trong của ty thể ................................................................... 5
Hình 1.3. Ty thể và quá trình trao đổi năng lượng trong tế bào.................................. 6
Hình 1.4. Hệ gen ty thể người ..................................................................................... 7
Hình 1.5. Thuyết nút cổ chai di truyền ..................................................................... 12
Hình 1.6. Sơ đồ các đột biến gen ty thể liên quan đến một số bệnh phổ biến .......... 14
Hình 1.7. Tạo đột biến điểm (thay thế) định hướng sử dụng PCR truyền thống ...... 21
Hình 1.8. Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR primer extention ................ 22
Hình 1.9. Tạo đột biến điểm định hướng sử dụng PCR đảo ..................................... 22
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu sàng lọc một số đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên
quan đến bệnh do đột biến gen ty thể........................................................................ 28
Hình 2.2. Bản đồ vector PTZ57R/T và vị trí đa điểm cắt ......................................... 35
Hình 2.3. Quy trình tạo đột biến điểm định hướng ................................................... 39
Hình 2.4. PCR plasmid đích với cặp mồi đột biến và nối 2 đầu sản phẩm PCR ...... 39
Hình 3.1. Điện di sản phẩm ADN tổng số từ mẫu máu của các bệnh nhân.............. 45
Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 14455-14578, 8155-8366, 81668385, 8342-8582 ....................................................................................................... 46
Hình 3.3. Khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385 và 8342-8582 ................................................................................ 47
Hình 3.4. Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đoạn chèn và cặp mồi vector ..... 49
Hình 3.5. Kết quả tách chiết plasmid nhân dịng ...................................................... 50
Hình 3.6. So sánh trình tự đoạn gen 14455-14578 nhân dịng với trình tự gen chuẩn51
Hình 3.7. So sánh trình tự đoạn gen 8155-8366 với trình tự gen chuẩn ................... 52
Hình 3.8. So sánh trình tự đoạn gen 8166-8385 với trình tự gen chuẩn ................... 53
Hình 3.9. So sánh trình tự đoạn gen 8342-8582 với trình tự gen chuẩn ................... 54
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid đích với cặp mồi tạo đột biến .. 55
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra các khuẩn lạc ............ 57
Hình 3.12. Kết quả điện di cắt enzyme giới hạn sản phẩm PCR trực tiếp kiểm tra

khuẩn lạc với mồi LHTC (A), MRAG (B), MRTC (C), MRGA (D). ...................... 59
v


Hình 3.13. Kết quả tách plasmid mang đoạn gen 14455-14578 (A), 8166-8385 (B),
8155-8366 (C), 8342-8582 (D) chứa các vị trí đột biến T14484C, A8344G,
T8356C, G8363A ...................................................................................................... 60
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid tách chiết với các cặp mồi
LHTC, MRTC, MRAG, MRGA và M13 .................................................................. 61
Hình 3.15. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 14455-14578 sau khi tạo
đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu
NC_012920.1 ............................................................................................................ 62
Hình 3.16. Một phần trình tự tạo đột biến T14484C ................................................ 63
Hình 3.17. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8155-8366 sau khi tạo
đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu
NC_012920.1 ............................................................................................................ 63
Hình 3.18. Một phần trình tự tạo đột biến A8344G .................................................. 64
Hình 3.19. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8166-8385 sau khi tạo
đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu
NC_012920.1 ............................................................................................................ 65
Hình 3.20. Một phần trình tự tạo đột biến T8356C .................................................. 65
Hình 3.21. Kết quả so sánh trình tự plasmid chứa đoạn gen 8342-8582 sau khi tạo
đột biến với trình tự plamid trước khi tạo đột biến và trình tự gen tham chiếu
NC_012920.1 ............................................................................................................ 66
Hình 3.22. Một phần trình tự tạo đột biến G8363A .................................................. 67
Hình 3.23. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến
T14484C .................................................................................................................... 68
Hình 3.24. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến
A8344G ..................................................................................................................... 69
Hình 3.25. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến

T8356C ...................................................................................................................... 70
Hình 3.26. Kết quả PCR-RFLP mẫu đối chứng âm và đối chứng dương của đột biến
G8363A ..................................................................................................................... 71

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể ........................................................................ 8
Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đặc hiệu cho PCR nhân bản các đoạn ADN trên gen
ND6 và MT-TK .......................................................................................................... 30
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân bản các đoạn gen 14455-14578, 81558366, 8166-8385, 8342-8582 .................................................................................... 31
Bảng 2.3. Chu trình nhiệt và kích thước của phản ứng PCR với các cặp mồi đặc
hiệu cho đoạn gen ...................................................................................................... 31
Bảng 2.4. Dự đoán sản phẩm phản ứng cắt các đoạn ADN với enzyme giới hạn. ... 32
Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng cắt enzyme giới hạn ....................................... 33
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng ligase ..................................................................... 35
Bảng 2.7. Trình tự mồi M13 ..................................................................................... 36
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng PCR với mồi M13 ................................................. 37
Bảng 2.9. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với mồi M13 ........................................... 37
Bảng 2.10. Kích thước sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc với mồi đoạn chèn và
mồi vector M13 của các loại đột biến ....................................................................... 37
Bảng 2.11. Trình tự mồi oligonucleotide cho PCR tạo đột biến định hướng. .......... 40
Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR plasmid nhân dòng với mồi chứa vị trí đột
biến ............................................................................................................................ 41
Bảng 2.13. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với từng loại mồi chứa vị trí đột biến..... 41
Bảng 2.14. Thành phần phản ứng đóng vịng sản phẩm PCR .................................. 42
Bảng 2.15. Thành phần trong bản gel polyacrylamide ............................................. 44

vii

DANH MỤC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ADN

Axit Deoxyribonucleic

ADP

Adenosine diphotphate

ARN

Axit ribonucleic

ATP

Adenosine Triphosphate

bp

Base pair (cặp bazơ nitơ)

DDW

Deionized Distilled Water (Nước cất loại ion, khử trùng)

D-loop

Displacement Loop (vịng chuyển vị)

dNTP

Deoxyribonucleoside Triphosphate

IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb

Kilobase

LB

Mơi trường Luria Bertani

Leigh

Leigh syndrome (bệnh viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh)

LHON

Leber’s hereditary optic neuropath (hội chứng liệt thần kinh thị
giác di truyền Leber)

LHTC

Mồi nhân bản đoạn gen 14455-14578

LHCFw/Rv

Cặp mồi tạo đột biến điểm T14484C

MELAS

Mitochodrial encephalomyopathy lactic acidosis and stroke-like
episodes (bệnh viêm não giật cơ có tăng axit lactic máu và giả tai
biến mạch)

MERRF

Myoclonic Epilepsy and Ragged Red Fibers (bệnh động kinh co
giật cơ với các sợi cơ đỏ rải rác)

mtDNA

Mitochondrial DNA (ADN ty thể)

MRAFw/Rv

Cặp mồi tạo đột biến điểm G8363A

MRAG

Mồi đặc hiệu đoạn gen 8155-8366

MRCFw/Rv

Cặp mồi tạo đột biến điểm T8356C

MRGFw/Rv

Cặp mồi tạo đột biến điểm A8344G

MRGA

Mồi đặc hiệu đoạn gen 8342-8582

MRTC

Mồi đặc hiệu đoạn gen 8166-8385

viii


MT-TK

Mitochondrially encoded tRNA lysine

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide

ND6

Gen mã hóa NADH dehydrogenase 6

PCR

Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp)

RFLP

Restriction fragment length polymorphism (Sự đa hình độ dài các
đoạn cắt giới hạn)

TAE

Tris Acetate EDTA

ix


MỞ ĐẦU
Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào nhân thực. Vai trị chính của ty
thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP. Ngồi ra, ty thể cịn có vai trị trong
q trình tạo hemoglobin, tổng hợp các purine và pyrimidine, viên gạch cấu trúc
giúp xây dựng ADN và ARN, tham gia vào quá trình chết theo lập trình (Apoptosis
- Programmed cell death) của tế bào và nhiều quá trình trao đổi chất khác. Để thực
hiện hết được các vai trị của mình và đảm bảo về nhu cầu năng lượng nhằm duy trì
sự sống và hỗ trợ sự tăng trưởng, ty thể phải thực hiện các quá trình trao đổi chất
với tần suất cao. Các phản ứng trao đổi chất này giải phóng nhiều sản phẩm có tính
ứng ơxy hóa, đồng thời với sự tác động thêm của một số yếu tố khác là nguyên nhân
gây ra sự tổn thương cho ty thể, đặc biệt là ADN ty thể. Các đột biến trong hệ gen
ty thể là nguyên nhân gây nên nhiều bệnh khác nhau, đặc biệt là bệnh cơ não ở
người, các bệnh này có thể là nguyên nhân kéo theo nhiều bệnh khác nghiêm trọng
hơn, ảnh hưởng rất nhiều tới đời sống con người.
Trong số các gen ty thể, gen MT-TK và ND6 được quan tâm nghiên cứu bởi
sự đột biến gen MT-TK được khẳng định liên quan đến nhiều bệnh ty thể khác nhau,

với các hội chứng bao gồm tiểu đường và điếc di truyền theo dòng mẹ (mateARNlly
inherited diabetes and deafness – MIDD), hội chứng động kinh giật cơ với các sợi
cơ đỏ rách nham nhở (myoclonic epilepsy with ragged-red fibers – MERRF), hội
chứng não giật cơ, tăng axit lactic máu và giả tai biến mạch (mitochondrial
encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes -MELAS). Còn gen
ND6 được coi là “điểm nóng” đột biến của hội chứng LHON (Leber’s hereditary
optic neuropathy). Các đột biến trên hai gen này phần lớn là các đột biến điểm thay
thế đồng hoán hay dị hốn.
Các đột biến thay thế nucleotit có thể được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật
phân tích ADN khác nhau, trong đó RFLP-PCR là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp,
giúp sàng lọc nhanh đột biến ở các mẫu bệnh phẩm mà không cần quá nhiều thiết bị
phức tạp. Để thiết lập quy trình sàng lọc đột biến điểm là thay thế nucleotit bằng
RFLP-PCR, các mẫu đối chứng chuẩn là đoạn ADN bình thường và ADN mang đột
biến là cần thiết được tạo ra. Do vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo
1


đột biến điểm nhằm sàng lọc đột biến ở gen ND6 và MT-TK liên quan đến bệnh
ty thể” nhằm tạo ra một số đối chứng dương mang đột biến cần xác định cho các
phản ứng sàng lọc các đột biến trên gen ND6 và trên gen MT-TK.
Đề tài được thực hiện tại phịng thí nghiệm Bộ mơn Di truyền học – Khoa
Sinh học và phịng Genomic - Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và
Protein – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.

2


CHƢƠNG 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cấu trúc và chức năng của ty thể ngƣời

1.1.1. Cấu trúc của ty thể
Cơ thể con người là một thể thống nhất, bao gồm rất nhiều cơ quan, hệ cơ
quan khác nhau. Mỗi cơ quan đảm nhận một nhiệm vụ riêng, nhưng tất cả đều được
cấu tạo bằng các tế bào, nên tế bào được coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của cơ
thể sống.
Ty thểlàmột trong những bào quan có mặt trong tất cả các tế bào nhân thực.
Vai trị chính của ty thể là tạo ra năng lượng dự trữ dưới dạng ATP cung cấp cho
các hoạt động sống của tế bào.
Ty thể bắt đầu được nghiên cứu từ giữa thế kỷ XIX. Năm 1857, nhà giải
phẫu học người Thụy Sĩ, Kolliker lần đầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế bào
cơ. Năm 1890, nhà mô học người Đức, Richard Altmann, bằng phương pháp nhuộm
fuchsine đã quan sát được ty thể ở nhiều tế bào khác nhau dưới kính hiển vi quang
học[13].
Hình dạng đặc trưng của ty thể là thon dài với đường kính 0,5-2 µm và chiều
dài 7-10 µm. Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có hình dạng và
kích thước khác nhau. Ty thể có khả năng thay đổi kích thước, hình dạng, có thể
liên kết với nhau tạo ra những cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành những cấu trúc
ngắn hơn. Ngồi ra, ty thể có khả năng di chuyển để phản ứng với những thay đổi
sinh lý trong tế bào [13].
Trong tế bào, ty thể nằm rải rác ở nguyên sinh chất nhưng cũng có thể nằm
tập trung ở khu vực cần nhiều năng lượng như đuôi của tinh trùng. Số lượng của ty
thể ở một tế bào cũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của tế bào đó, có
thể từ vài ty thể ở tế bào da cho đến vài nghìn ty thể ở tế bào cơ [13].

3


Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể [61]

Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong,
tương tự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong,
khoang giữa hai màng được gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn sâu vào
chất nền tạo thành các mào răng lược [8; 19].
Màng ngồi ty thể có độ dày 6 nm, trong đó protein chiếm khoảng 60% và
lipid chiếm khoảng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các
chất với khối lượng phân tử lớn đến 10 kDa và các ion di chuyển tự do từ ngoài
nguyên sinh chất vào xoang gian màng và ngược lại. Màng ngồi ty thể cịn chứa
nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase,
acyl CoA synthetase [8].
Màng trong của ty thể cũng là màng lipoprotein, có độ dày 6 nm, protein
chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và một lượng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ giữa cholesterol
và phospholipid là 1/53. Màng trong ăn sâu vào chất nền tạo nên các mào răng lược.
Cấu trúc “mào” làm tăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần so với màng
ngoài và điều này liên quan đến chức năng của nó là tăng cường vận chuyển điện tử
và tổng hợp ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ động ATP, ADP,
acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và H+. Màng trong là
nơi bám của 5 phức hợp thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận chuyển điện tử

4


(phức hợp I-IV), ATP synthase (phức hợp V, còn gọi là F1F0-ATPase) và adenine
nucleotit translocase (ANT)[8; 19].

Hình 1.2. Cấu trúc màng trong của ty thể [33]
Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể) là nơi
trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ từ chất
nền đi ra do hoạt động của chuỗi vận chuyển điện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là
chất mang điện tử cơ động cho chuỗi hô hấp. Sự giải phóng Cyt c vào bào tương sẽ

hoạt hóa enzyme caspase có vai trị trong q trình tự chết của tế bào (apoptosis).
Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các
enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty
thể. Như vậy, ở tế bào động vật, thực vật và người ngoài hệ gen nhân, cịn có hệ gen
tế bào chất nằm trong ty thể [8; 19].
Khi đạt kích thước lớn tối đa, ty thể tiến hành phân đôi tạo ra hai ty thể mới.
Trước tiên, hệ gen ty thể được sao chép để tăng số lượng bản sao. Sau đó, màng
trong thắt lại rồi đến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty
thể không phân đôi và bị phân hủy trong lyzosome theo cơ chế tự tiêu (autophagy).
Cơ chế này giúp duy trì số lượng ty thể đặc trưng trong một tế bào [13].
1.1.2. Chức năng của ty thể
Ty thể là bào quan sản xuất năng lượng cho tế bào bằng cách oxy hóa các
hợp chất hữu cơ tạo ra CO2, H2O và giải phóng tồn bộ năng lượng dưới dạng ATP

5


(hình 1.3). Các phản ứng này được xúc tác bởi các phức hợp của chuỗi hô hấp I, II,
III và IV nằm ở màng trong của ty thể [17; 23]. Nguồn tạo ra năng lượng trong ty
thể là carbohydrate, chất béo và protein được lấy từ thức ăn, trong đó chủ yếu là
carbohydrate. Các hợp chất này được oxy hóa để tạo ra các chất khử giàu năng
lượng, sau đó các đương lượng khử được chuyển thành năng lượng dự trữ ở dạng
liên kết phosphate cao năng trong ATP thông qua con đường hóa thẩm. Có hai giai
đoạn tạo ra ATP ở ty thể, đó là chu trình Krebs diễn ra trong chất nền và q trình
phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển điện tử nằm ở màng trong ty thể với sự
xúc tác của các phức hệ enzyme.

Hình 1.3. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [62]
ATP là nguồn năng lượng lớn được sử dụng cho tất cả các quá trình trao đổi
chất cần thiết bên trong tế bào [18; 33]. Do đó, khi ty thể bị tổn thương, quá trình

sản sinh ra năng lượng để cung cấp cho tế bào và cơ thể bị chậm lại, thậm chí bị
ngừng lại hồn tồn.
Gần như tất cả các tế bào đều dựa vào nguồn năng lượng ổn định do ty thể
cung cấp, do đó sự tổn thương của ty thể có thể gây ra sự rối loạn đa hệ thống, ảnh
hưởng đến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và cơ quan. Triệu chứng của bệnh ty thể
khơng giống nhau, bởi vì người bệnh có thể có một hỗn hợp ty thể bình thường lẫn
ty thể đột biến với sự phân bố riêng trong cơ thể. Đơi khi, số ty thể bình thường đủ
để bù đắp cho những ty thể bị đột biến [19].

6


1.2.

Hệ gen ty thể và cơ chế di truyền của các gen ty thể

1.2.1. Hệ gen ty thể
Ty thể là bào quan hiếm hoi trong tế bào có hệ gen riêng, nhân bản độc lập
với gen nhân. Hệ gen của ty thể người được Clayton mô tả lần đầu tiên vào năm
1976. Đến năm 1981, Anderson đã cơng bố trình tự và cấu trúc của hệ gen ty thể
người [5; 8].
ADN ty thể người tồn tại ở dạng mạch vòng, sợi đơi, có kích thước 16.569 bp,
bao gồm 37 gen (bảng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rARN, 22 phân tử tARN và 13 phân
tử protein là thành phần cần thiết trong các phức hợp của chuỗi hô hấp. ND1-ND6 và
ND4L mã hóa 7 tiểu đơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone oxidoreductase),
cytochrome b (Cyt b) là tiểu đơn vị của phức hệ III chỉ được mã hóa bởi ADN ty thể
(ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII) mã hóa cho 3 tiểu
đơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen ATP 6 và ATP 8 mã hóa
cho 2 tiểu đơn vị của phức hệ V, chính là ATP synthase (hình 1.4). Các phân tử protein
cịn lại của chuỗi hơ hấp được mã hóa bởi gen nhân, được dịch mã trong tế bào chất,

sau đó được vận chuyển vào bên trong ty thể [28].

Hình 1.4. Hệ gen ty thể ngƣời

7


Đặc biệt, hệ gen ty thể chứa ít trình tự khơng mã hóa xen kẽ giữa các vùng
mã hóa. Vùng D-loop dài khoảng 1,1 kb là vùng khơng mã hóa lớn nhất và có vai
trị quan trọng, điều hịa q trình sao chép và phiên mã của hệ gen ty thể, chứa
promoter cho sự phiên mã chuỗi nặng (chuỗi H), chuỗi nhẹ (chuỗi L) và chứa điểm
khởi đầu của quá trình tái bản. Chức năng của các vùng này chưa được biết đầy đủ
nhưng dường như chúng quan trọng đối với quá trình tái bản và phiên mã của hệ
gen. Hai gen mã hóa cho rARN (rARN 12S và 16S) và 22 gen mã hóa cho 22 tARN
được nằm giữa các gen mã hóa cho protein. Các gen này cung cấp các ARN cần
thiết cho sự tổng hợp protein bên trong ty thể. Đa số thơng tin được mã hóa trên
chuỗi nặng, gồm các gen mã hóa cho 2 rARN, 14 tARN và 12 chuỗi polypeptide.
Các gen trên chuỗi nhẹ mã hóa cho 8 tARN và 1 chuỗi polypetide [8].
Bảng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể [8]
Gen

Vị trí

Sản phẩm

MTATP6

8527–9207

ATPase 6 của ATP synthase (phức hợp V)

MTATP8

8366–8572

ATPase 8 của ATP synthase (phức hợp V)

MTCO1

5904–7445

Tiểu đơn vị I của Cyt c oxidase (phức hợp IV)

MTCO2

7586–8269

Tiểu đơn vị II của Cyt c oxidase (phức hợp IV)

MTCO3

9207–9990

Tiểu đơn vị III của Cyt c oxidase (phức hợp IV)

MTCYB

14747–15887

MTND1

3307–4262

ND1 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND2

4470–5511

ND2 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND3

10059–10404

ND3 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND4

10760–12137

ND4 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND4L

10470–10766

ND4L của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND5

12337–14148

ND5 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTND6

14149–14673

ND6 của ubiquinone oxidoreductase (phức hợp I)

MTRNR1

1671–3228

rARN 16S

MTRNR2

648–1601

rARN 12S

MTTA

5587–5655

tARNAla

MTTC

5761–5826

tARNCys

MTTD

7518–7585

tARNAsp

MTTE

14674–14742

tARNGlu

MTTF

577–647

tARNPhe

MTTG

9991–10058

tARNGly

Apocytochrome b subunit of ubiquinol (phức hợp III)

8


MTTH

12138–12206

tARNHis

MTTI

4263–4331

tARNIle

MTTK

8295–8364

tARNLys

MTTL1

3230–3304

tARNLeu (UUR)

MTTL2

12266–12336

tARNLeu (CUN)

MTTM

4402–4469

tARNMet và tARNfMet

MTTN

5657–5729

tARNAsn

MTTP

15955–16023

tARNPro

MTTQ

4329–4400

tARNGln

MTTR

10405–10469

tARNArg

MTTS1

7445–7516

tARNSer

MTTS2

12207–12265

tARNSer

MTTT

15888–15953

tARNThr

MTTV

1602–1670

tARNVal

MTTW

5512–5576

tARNTrp

MTTY

5826–5891

tARNTyr

Khác với ADN nhân (nADN), ADN ty thể không liên kết với protein histone,
điều này làm cho ADN ty thể giống ADN của vi khuẩn. ADN ty thể khơng có
intron (ngoại trừ một số nucleotit khơng mã hóa ở giữa một vài gen) và có các gen
nằm gối lên nhau.
Hệ gen ty thể sao chép độc lập với hệ gen nhân bằng một hệ thống riêng
trong ty thể nhưng các enzyme cho quá trình tái bản lại do hệ gen nhân mã hóa. Q
trình phiên mã và dịch mã của ADN ty thể được điều khiển bởi gen nhân. Hệ gen ty
thể được phiên mã từ một điểm khởi đầu nằm trên vùng D-loop, bản phiên mã sau
đó được endonuclease phân cắt để hình thành nên các phân tử tARN, rARN12S và
16S, ARN thông tin (mARN) tiền thân. Phân tử mARN hoàn thiện của ty thể không
được gắn mũ nhưng được gắn đuôi polyA [5].
Điểm khởi đầu sao chép (origin) ở hai mạch H và L là khác nhau và duy
nhất. Quá trình sao chép của ty thể vẫn là một vấn đề đang được nghiên cứu và bàn
luận. Trong đó, hai mơ hình chiếm ưu thế là tái bản chuyển vị (displacement
replication), trong đó mạch mới bổ sung với mạch H được tổng hợp gần hoàn thiện

9


thì mạch mới bổ sung với mạch L mới bắt đầu tổng hợp; tái bản đồng thời

(symmetric replication), trong đó hai mạch mới được tổng hợp đồng thời [10].
Ty thể người có hệ thống dịch mã riêng với các mã di truyền, đặc biệt là mã
khởi đầu và mã kết thúc có nhiều điểm khác biệt so với các mã di truyền của hệ gen
nhân. Ở ADN ty thể người, bộ ba UGA chỉ mã hóa cho tryptophan mà khơng phải
là bộ ba kết thúc, AUA mã hóa cho methionine mà khơng mã hóa cho isoleucine,
AGA và AGG là các bộ ba kết thúc, AUA và AUG là các bộ ba khởi đầu. Gen COI
và URF6 có mã kết thúc là AGA và AGG hay gen ATP6 có mã khởi đầu là GUG
[10]. Cả 22 phân tử tARN do hệ gen ty thể mã hóa đều tham gia vào quá trình tổng
hợp các protein. Ở người, các nhà nghiên cứu khơng tìm thấy hiện tượng phân tử
tARN do hệ gen nhân mã hóa đi từ nguyên sinh chất vào ty thể để tham gia tổng
hợp protein. Tuy nhiên, ở một số đối tượng khác như nấm men, hiện tượng này có
xảy ra và hướng nghiên cứu cơ chế vận chuyển tARN từ tế bào chất vào ty thể ở đối
tượng trên mở đường cho phương pháp đưa tARN bình thường vào ty thể của người để
điều trị các bệnh liên quan đến đột biến trên gen tARN của ty thể [47].
Các tế bào người có thể chứa hàng ngàn bản sao ADN ty thể trong một tế
bào và có số lượng dao động tùy thuộc vào nhu cầu sử dụng năng lượng của từng
loại tế bào.Số bản sao ADN ty thể giảm nhiều lần trong quá trình tạo tinh trùng
nhưng dường như tăng đột ngột trong quá trình tạo trứng. Số lượng bản sao ADN ty
thể thay đổi rất lớn ở các mơ khác nhau và được kiểm sốt nghiêm ngặt trong thời
kỳ đầu của quá trình phát triển của động vật. Số bản sao ADN ty thể tăng khi quá
trình trao đổi chất tăng [8].
1.2.2. Cơ chế di truyền theo dòng mẹ của các gen ty thể
Sự di truyền của các gen trên ADN ty thể là sự di truyền qua tế bào chất. Đối
với các gen nằm trong nhân của tế bào sinh vật nhân chuẩn, chúng tuân theo các
quy luật hoạt động của nhiễm sắc thể trong các cơ chế phân bào. Nhưng hệ gen ty
thể lại khơng tn theo những quy luật đó mà các tính trạng do chúng xác định có
những kiểu di truyền riêng đặc trưng cho chúng. Giống như tất cả ADN ngoài nhân,
ADN ty thể được di truyền theo mẹ. Người mẹ truyền hệ gen ty thể cho các người
con và chỉ có những người con gái mới truyền hệ gen đó cho thế hệ tiếp theo.

10


Ở người, tế bào trứng có rất nhiều ty thể, khoảng hơn 100.000 bản sao, trong
khi đó tinh trùng chỉ chứa khoảng 100-1.500 bản sao, tập trung ở đuôi tinh trùng.
Khi thụ tinh, nhân tinh trùng đi vào trứng còn đi tinh trùng rụng ra, tế bào tinh
trùng chỉ đóng góp hệ gen nhân cho tế bào trứng chứ khơng đóng góp hệ gen ty thể.
Do đó, gần như khơng có ty thể của tinh trùng đi vào trong trứng, nhưng nếu có thì
tế bào trứng có cơ chế tiêu diệt các ty thể này. Vì vậy, ty thể trong hợp tử mới tạo
thành hoàn toàn là của tế bào trứng và tất cả các tính trạng được mã hóa trên hệ gen
ty thể được di truyền từ mẹ sang con [8]. Tuy nhiên, các rối loạn của ADN ty thể
không phải luôn luôn được di truyền theo mẹ. Một vài đột biến điểm xuất hiện ở
mức độ cá thể và chỉ ở một số mơ. Mất đoạn với kích thước lớn trong ADN ty thể
thường xảy ra ngẫu nhiên và không được phát hiện ở người mẹ hoặc thế hệ con cái
[48]. Theo thống kê, khoảng 2/3 bệnh liên quan ADN ty thể chứa các đột biến được
di truyền theo mẹ, còn 1/3 là các rối loạn ở dạng ngẫu nhiên [10].
Đột biến ADN ty thể được truyền từ mẹ sang con nhưng tỷ lệ số bản sao mang
đột biến ở mẹ và con khác nhau, các cá thể mang đột biến trong một phả hệ gia đình
cũng có sự thay đổi về tần suất đột biến vì vậy mức độ biểu hiện bệnh ở mẹ và các
con có thể rất khác nhau. Sự thay đổi tỷ lệ đột biến trong số các con của một người
phụ nữ được xác định ở giai đoạn đầu trong quá trình tạo trứng ở người mẹ trước khi
hình thành nỗn bào đầu tiên. Các nghiên cứu ở nhiều phả hệ cho rằng cơ chế tương
tự cũng hoạt động trong quá trình truyền đột biến ADN ty thể gây bệnh [10].
Trứng của người phụ nữ được hình thành ở giai đoạn rất sớm trong quá trình
phát triển. Tế bào tiền thân phân chia thành nhiều trứng, vì thế ty thể từ tế bào đó
được phân phối ngẫu nhiên thơng qua các trứng này và chỉ có một lượng nhỏ phân
tử ADN ty thể từ người mẹ được truyền cho thế hệ sau. Các trứng khác nhau có thể
chứa một lượng ADN ty thể đột biến khác nhau, điều này quyết định lượng nguyên
liệu di truyền đột biến được truyền cho thế hệ sau. Sự khác nhau này có thể giải
thích sự khác nhau về mức độ nghiêm trọng của bệnh giữa các người con [40; 50].

Các nghiên cứu trên đã chứng tỏ sự tồn tại nút cổ chai di truyền trong sự di
truyền của ADN ty thể, nghĩa là chỉ có một lượng nhỏ phân tử ADN ty thể từ người
mẹ được truyền cho thế hệ sau (hình 1.5).

11


Hình 1.5. Thuyết nút cổ chai di truyền [63]
1.2.3. Heteroplasmy và homoplasmy
Bản chất đa bội của bộ gen ty thể, lên đến vài nghìn bản sao mỗi tế bào, dẫn
đến một tính năng quan trọng của di truyền ty thể đó là homoplasmy và
heteroplasmy.
Trong một tế bào có thể có một số ty thể có đột biến ở ADN ty thể và mộtsố
thì khơng. Hiện tượng này được gọi là heteroplasmy. Tỉ lệ ADN ty thể có đột biến
sẽ quyết định cả tỉ lệ phần trăm và mức độ nghiêm trọng trong biểu hiện của một số
bệnh. Vì vậy, hiện tượng này là một nguyên nhân quan trọng giải thích tính đa dạng
trong biểu hiện của các bệnh lý di truyền ty thể.
Homoplasmy là thuật ngữ để chỉ một tế bào chỉ có hoặc ADN ty thể hồn
tồn bình thường hoặc ADN ty thể hoàn toàn bị đột biến. Các khái niệm về
homoplasmy rõ ràng thực tế hơn vì trong hầu hết các trường hợp người ta khơng có
bằng chứng của heteroplasmy, nhưng tất cả các bằng chứng đều cho thấy ADN ty
thể liên tục trải qua đột biến, với sự mất hoặc xóa bỏ đột biến điểm. Bởi vì những
đột biến này là đột biến ngẫu nhiên và tỉ lệ đột biến rất thấp nên không được phát
hiện trong một mẫu mô hoặc mẫu máu đồng nhất [43].

12


Một số đột biến ảnh hưởng đến tất cả các bản sao của hệ gen ty thể (đột biến
homoplasmic), trong khi những số khác chỉ biểu hiện trong một số bản sao của gen

ty thể (đột biến heteroplasmic).
Hiện tượng heteroplasmy có thể được phát hiện bằng giải trình tự tồn bộ hệ
gen ty thể bằng phương pháp High-Throughput Sequencing. Ngoài ra, một số
phương pháp khác cũng được sử dụng như DHPLC (Denaturing highperformance
liquid chromatography), HRM (high resolution melt)… Tuy nhiên, các phương
pháp trên có một số nhược điểm như: khơng cho phép xác định rõ ràng vị trí của
heteroplasmy, khơng xác định chính xác số lượng vị trí có heteroplasmy, địi hỏi
cần nhiều trang thiết bị để có thể xử lí số lượng lớn mẫu… Vì vậy, để tăng hiệu quả
phát hiện và xác định được mức độ heteroplasmy, các phương pháp có thể được kết
hợp với nhau [6; 30].
1.3.

Đột biến gen ty thể và các bệnh liên quan

1.3.1. Đột biến gen ty thể
Ty thể là bào quan có tần suất diễn ra các phản ứng ơxy hóa khử liên tục,
đồng thời thiếu cơ chế sửa chữa sai hỏng một cách hiệu quả, khơng có khả năng tự
phục hồi dễ dàng như ADN nhân và thiếu sự bảo vệ của histone, khơng chứa các
trình tự khơng mã hóa, làm cho ADN ty thể có nguy cơ đột biến cao hơn ADN nhân
[53]. Tỷ lệ đột biến của ADN ty thể cao hơn ADN nhân khoảng 17 lần [12].ADN ty
thể có nhiều bản sao nên các phân tử mang đột biến có thể tồn tại cùng với các phân
tử ở dạng kiểu dại tạo nên hiện tượng không đồng nhất (heteroplasmy), hoặc hiện
tượng đồng nhất (homoplasmy) khi các bản sao của phân tửADN ty thể là như nhau
[46]. Trong trường hợp có đột biến và các phân tửADN ty thể tồn tại ở dạng
heteroplasmy, thì có thể dựa vào tỷ lệ số bản sao kiểu dại để xác định triệu chứng
lâm sàng của bệnh. Tỷ lệ này thay đổi cho các đột biến và khác nhau giữa các mô,
thông thường tỷ lệ này thường chiếm từ 60-90% trong các dạng đột biến để biểu
hiện kiểu hình của các ADN ty thể kiểu dại [20]. Tỷ lệ này có thể giải thích được
một phần các kiểu hình quan sát được ở bệnh nhân nhưng xét về tính tương quan
chính xác về mức độ nghiêm trọng giữa biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ đột biến ADN

ty thể là chưa đủ [55]. Cho tới nay, đã có hơn 300 đột biến khác nhau gồm hơn 100
đột biến điểm gây bệnh và 200 đột biến mất, đột biến thêm và đột biến sắp xếp lại
13