(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn streptomyces toxytricini (VN08 a12) kháng bệnh bạc lá lúa do xanthomonas oryzae

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN
Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO
Xanthomonas oryzae

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------

NGUYỄN THỊ VÂN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CHỦNG XẠ KHUẨN
Streptomyces toxytricini (VN08 - A12) KHÁNG BỆNH BẠC LÁ LÚA DO
Xanthomonas oryzae
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Dương Văn Hợp
TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS. TS. Dương Văn Hợp
và TS. Phạm Thế Hải, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong cả
quá trình thực hiện đề tài, giúp em vượt qua khó khăn và hồn thành tốt luận văn
này.
Em xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại
Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em
những kiến thức bổ ích trong suốt hai năm học vừa qua và giúp đỡ em rất nhiều
trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi
sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, chỉ
bảo, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin chân thành cảm ơn TS. Phan Thị Phương Hoa (chủ nhiệm đề
tài Nafosted số 106.03 - 2010.34 “Sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học từ xạ
khuẩn dùng cho đấu tranh sinh học và diệt vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.
oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam”) và các thành viên tham gia đề tài đã hỗ
trợ cho em kỹ thuật chun mơn để em hồn thành luận văn.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị Viện Vi sinh vật và
Công nghệ sinh học đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn trong suốt quá
trình em thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn TS. Kyung Sook Bae, TS.

Song Gun Kim và cử nhân

Hyangmi Kim Bảo tàng giống chuẩn (KCTC), Viện Khoa học và Công nghệ sinh

học Hàn Quốc (KRIBB) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ em trong thời gian
học tập ngắn hạn tại Hàn Quốc để em hoàn thành luận văn.
Em xin cảm ơn TS. Hiroshi Kinoshita trường Đại học Osaka Nhật Bản đã hỗ
trợ và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu để em hoàn thành luận văn này.

i


Xin cảm ơn sinh viên Vũ Thị Kim Chi đã hỗ trợ em một số cơng việc thí
nghiệm trong q trình nghiên cứu để em hồn thành luận văn.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình thân yêu và bạn bè đã luôn ở
bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.

Hà Nội, ngày 2 tháng 10 năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Vân

ii


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .................................................................................... 3
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 4
1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa ................................................... 4
1.1.1. Giới thiệu chung............................................................................................4
1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa........................................................................5
1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa ................................................................... 7

1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học..................................................................................7
1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh...........................................................................8
1.2.3. Khống chế sinh học.....................................................................................11
1.3. Xạ khuẩn ........................................................................................................ 12
1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn......................................................................12
1.3.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn..............................................14
1.3.3. Sử dụng xạ khuẩn trong khống chế sinh học...............................................16
1.4. Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn trong kiểm sốt bệnh bạc lá lúa ..................... 17
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 19
2.1. Nguyên liệu và hóa chất .................................................................................. 19
2.1.1 Nguyên liệu..................................................................................................19
2.1.1.1. Các chủng Xoo ................................................................................... 19

iii


2.1.1.2. Các chủng xạ khuẩn ........................................................................... 20
2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định ......................................................................... 20
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.......................................................................20
2.1.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 20
2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 21
2.1.2.3. Môi trƣờng nghiên cứu ....................................................................... 21
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................ 22
2.2.1. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật..............................................22
2.2.1.1. Phƣơng pháp thỏi thạch ...................................................................... 22
2.2.1.2. Phƣơng pháp đục lỗ thạch .................................................................. 23
2.2.2. Phân loại bằng đặc điểm hình thái...............................................................23
2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc ............................................................................ 23
2.2.2.2. Hình thái chuỗi sinh bào tử và bề mặt bào tử ...................................... 23
2.2.3. Hóa phân loại...............................................................................................24

2.2.3.1. Phân tích thành phần axit amin trong thành tế bào .............................. 24
2.2.3.2. Phân tích thành phần menaquinone .................................................... 24
2.2.3.3. Phân tích thành phần axit béo ............................................................. 25
2.2.3.4. Phân tích thành phần G+C trong ADN ............................................... 25
2.2.4. Phân loại sinh học phân tử giải trình tự 16S - rADN..................................25
2.2.5. Tối ƣu hóa điều kiện ni cấy xạ khuẩn......................................................27
2.2.5.1. Lựa chọn mơi trƣờng ni cấy thích hợp ............................................ 27
2.2.5.2. Lựa chọn thời gian ni cấy thích hợp ................................................ 27
2.2.5.3. Lựa chọn thể tích ni cấy thích hợp .................................................. 28
2.2.5.4. Lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy ................................................................ 28

iv


2.2.5.5. Lựa chọn cách cấy giống .................................................................... 28
2.2.6. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo...................................................................28
2.2.6.1. Tách dịch chiết thô ............................................................................. 28
2.2.6.2. Tinh sạch bằng silica gel .................................................................... 28
2.2.6.3. Tinh sạch bằng HPLC ........................................................................ 29
2.2.7. Xác định khối lƣợng phân tử bằng khối phổ (MS)......................................29
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 31
3.1. Khả năng kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12. ........................ 31
3.2. Phân loại chủng VN08 - A12 .......................................................................... 32
3.2.1. Phân loại bằng hình thái..............................................................................32
3.2.2. Hóa phân loại..............................................................................................33
3.2.2.1. Thành phần axit amin trong thành tế bào ............................................ 33
3.2.2.2. Thành phần menaquinone ................................................................... 34
3.2.2.3.Thành phần axit béo ............................................................................ 35
3.2.2.4. Thành phần G + C trong ADN............................................................ 37
3.2.3. Trình tự 16S rADN......................................................................................38

3.3. Tối ƣu hóa điều kiện ni cấy của chủng VN08 - A12 .................................... 39
3.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp....................................................................39
3.3.2. Thời gian ni cấy thích hợp.......................................................................40
3.3.3. Thể tích ni cấy thích hợp.........................................................................41
3.3.4. Nhiệt độ ni cấy thích hợp........................................................................41
3.3.5. Cách cấy giống thích hợp............................................................................42
3.4. Tinh sạch và phân tích hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12 .............. 43
3.4.1. Tinh sạch hoạt chất kháng Xoo của chủng VN08 - A12.............................43

v


3.4.2. Phân tích trọng lƣợng phân tử.....................................................................47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................... 51
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 51
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 52
PHỤ LỤC........................................................................................................... - 1 -

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37] ............ 8
Bảng 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15] ............... 9
Bảng 3. Danh sách 10 chủng Xoo phân lập đƣợc ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử
dụng trong nghiên cứu ........................................................................................... 19
Bảng 4. Chƣơng trình phân tích HPLC .................................................................. 29
Bảng 5. Hoạt tính kháng 10 chủng Xoo của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ............. 31
Bảng 6. Hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ................... 31

Bảng 7. Hoạt tính kháng vi sinh vật có lợi của chủng xạ khuẩn VN08 - A12 ......... 32
Bảng 8 : Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 ........ 35
Bảng 9. Kết quả phân tích thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12 ......... 36
Bảng 10. Kết quả phân tích thành phần GC của chủng VN08 - A12 ...................... 38
Bảng 11. Hoạt chất của VN08 - A12 thu đƣợc từ các phân đoạn khi tinh sạch bằng
silica gel ................................................................................................................ 44
Bảng 12. Hoạt chất của VN08 - A12 thu đƣợc từ HPLC từ phân đoạn 4.1 ............. 45
Bảng 13. Chƣơng trình chạy HPLC phân tích thành phần axit amin ................... - 1 Bảng 14. Phân tích thành phần menaquinone chuẩn........................................... - 2 Bảng 15. Phân tích thành phần axit béo chuẩn .................................................... - 3 Bảng 16. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S ..................... - 5 -

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo. ................................................. 5
Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9] ................................................... 6
Hình 3. Tổn thƣơng ít trên lá của giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 do bệnh bạc lá
lúa ở Ấn Độ [19] ................................................................................................... 10
Hình 4. Khuẩn lạc của một số chủng xạ khuẩn. ..................................................... 14
Hình 5. Cuống sinh bào tử của một số chủng xạ khuẩn. ......................................... 14
Hình 6. Bản đồ phân bố của 10 chủng Xoo ở miền Bắc Việt Nam đƣợc sử dụng
trong nghiên cứu .................................................................................................... 20
Hình 7. Khuẩn lạc và chuỗi bào tử của chủng VN08 - A12 .................................... 33
Hình 8. Chuỗi bào tử và bào tử của chủng VN08 - A12 ......................................... 33
Hình 9. Kết quả chạy sắc ký bản mỏng thành phần axit amin trong thành tế bào của
chủng VN08 - A12. ............................................................................................... 34
Hình 10. Kết quả phân tích LC thành phần menaquinone của chủng VN08 - A12. 35
Hình 11. Sắc ký đồ thành phần axit béo của chủng VN08 - A12 ............................ 36
Hình 12. Sắc ký đồ thành phần GC của chủng VN08 - A12 ................................... 37
Hình 13. Cây phân loại chủng VN08 - A12 dựa trên trình tự gen 16S – rADN. ..... 39
Hình 14. Ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất

kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 ....................................... 40
Hình 15. Ảnh hƣởng của thời gian cấy khác nhau đến sự sản sinh hợp chất kháng
sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 .................................................. 40
Hình 16. Ảnh hƣởng của thể tích mơi trƣờng ni cấy khác nhau đến sự sản sinh
hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 (S. toxytricini) .. 41
Hình 17. Ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy khác nhau đến sự sản sinh
hợp chất kháng sinh ức chế vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12 ......................... 42
Hình 18. Ảnh hƣởng của cách cấy giống đến sự sản sinh hợp chất kháng sinh ức chế
vi khuẩn Xoo của chủng VN08 - A12. ................................................................... 43
Hình 19. Quy trình tách dịch chiết thô của chủng VN08 - A12 .............................. 44
Hình 20. Phổ HPLC của hoạt chất chủng VN08 - A12........................................... 46

viii


Hình 21. Phổ HPLC của hoạt chất sau tinh sạch .................................................... 47
Hình 22. Phổ hấp thụ UV của hoạt chất sau tinh sạch ............................................ 47
Hình 23. Kết quả phân tích khối phổ của chủng VN08 - A12 ................................ 48
Hình 24. Cấu trúc hóa học của factumycin [31] ..................................................... 48
Hình 25. Cấu trúc của factumycin [46] .................................................................. 49
Hình 26. Cụm gen sinh tổng hợp factumycin (A) WAC5292 (Streptomyces
toxytricini) và (B) Streptomyces cattleya………………………………………………..49
Hình 27. Sắc ký đồ thành phần menaquinone chuẩn ........................................... - 2 Hình 28. Sắc ký đồ thành phần axit béo chuẩn.................................................... - 4 Hình 29. Hoạt tính kháng Xoo của VN08 - A12 trong các điều kiện nuôi cấy khác
nhau ................................................................................................................... - 7 Hình 30. Hoạt chất kháng sinh của chủng VN08 - A12 ....................................... - 7 -

ix


TỪ VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

Ala

Alanine

DAP

Diaminopimelic

DW

Distilled Water (Nƣớc cất)

ĐHQGHN Đại học Quốc Gia Hà Nội
GC

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

Glu

Glutamic acid

Gly

Glycine

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

Lys

Lysine

MQ

Milli- Q water

MS

Mass Spectrometry ( Phƣơng pháp khối phổ)

MT

Môi trƣờng

SKS

Sinh kháng sinh

TLC

Thin- layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

VTCC
Xoo

Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật)
Xanthomonas oryzae pv. Oryzae

x


MỞ ĐẦU
Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo) gây ra,
xuất hiện khá phổ biến trên các khu vực trồng lúa ở Việt Nam, đặc biệt tập trung ở
khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Bệnh gây hại trong vụ lúa hè thu nhiều hơn
trong vụ đông xuân do thời tiết ẩm ƣớt, nhiều sƣơng mù, độ ẩm khơng khí cao.
Bệnh xuất hiện và gây hại từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến đòng trổ và chín. Bệnh bạc
lá lúa gây thiệt hại rất nặng nề cho ngành nông nghiệp, làm giảm năng suất lúa 25 50 %, thậm chí mất trắng (Số liệu thống kê của cục bảo vệ thực vật). Do đó, việc
kiểm sốt và ngăn chặn sự bùng phát của bệnh bạc lá lúa là vấn đề rất quan trọng và
là mối quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu khoa học. Một trong những giải pháp
quan trọng nhất phòng trừ bệnh bạc lá lúa hiện nay là sử dụng các dòng lúa mang
gen kháng bệnh. Tuy nhiên, các dòng lúa chỉ mang một vài gen kháng đơn lẻ, đƣợc
nuôi trồng liên tục trên diện rộng dẫn đến tình trạng các chủng Xoo có khả năng gây
bệnh ngay cả khi có các gen kháng đó [18]. Chính vì vậy, việc kiểm sốt bệnh bạc
lá lúa bằng biện pháp sinh học đang thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhà nghiên
cứu [36]. Một trong những biện pháp sinh học đó là việc sử dụng xạ khuẩn để
khống chế vi khuẩn gây bệnh, đây là biện pháp có triển vọng cao, an tồn với mơi
trƣờng và có hiệu quả về kinh tế.
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, đƣợc biết đến nhƣ nguồn sinh các
chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học. Trong số khoảng hơn 10000 loại
thuốc kháng sinh đƣợc phát hiện do vi sinh vật thì có đến hai phần ba đƣợc phân lập
từ xạ khuẩn mà chủ yếu thuộc chi Streptomyces; và nhiều chất trong đó là các thuốc
kháng sinh đang đƣợc ứng dụng và sản xuất rộng rãi hiện nay [6]. Ngồi ra xạ
khuẩn cịn là nguồn sinh các loại vitamin, enzym, chất ức chế miễn dịch, hocmơn
sinh trƣởng. Số lồi xạ khuẩn trong tự nhiên ƣớc tính lớn hơn rất nhiều so với con

số 1000 lồi đƣợc công bố. Đồng thời xạ khuẩn luôn là nguồn vi sinh vật rất giá trị
trong việc tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học mới. Bộ sƣu tập hơn 3000 chủng

1


xạ khuẩn đang đƣợc bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi Sinh và Công nghệ
sinh học, ĐHQGHN hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới
dùng cho việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở Việt Nam
hiện nay. Trong nghiên cứu này, đƣợc sự tài trợ của quỹ đề tài NAFOSTED, TS.
Phan Thị Phƣơng Hoa và các cộng sự đã sàng lọc 2690 chủng xạ khuẩn và lựa chọn
đƣợc 17 chủng có khả năng kháng tất cả 10 chủng Xoo. Trong đó, lựa chọn chủng
VN08 - A12 là một tác nhân kiểm soát sinh học của bệnh bạc lá lúa. Chủng VN08 A12 có nhiều ƣu điểm nổi bật đã đƣợc thử nghiệm ngoài đồng ruộng và thu đƣợc
kết quả rất đáng mừng. Kết quả cho thấy chủng VN08-A12 khơng chỉ có thể làm
giảm chiều dài tổn thƣơng của cây lúa do nhiễm Xoo, mà còn làm giảm đáng kể tổn
thất năng suất của giống lúa bị nhiễm Xoo [23] [24]. Chính vì vậy, để phát triển một
chế phẩm khống chế sinh học để kiểm soát bệnh bạc lá lúa, chúng tôi đã tiến hành
thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces
toxytricini (VN08 - A12) kháng bệnh bạc lá lúa do Xanthomonas oryzae”.

2


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu này đƣợc thực hiện nhằm thực hiện các mục tiêu cụ thể nhƣ sau:
 Phân loại chủng xạ khuẩn VN08 - A12.
 Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ƣu nhất để khả năng sinh hoạt chất của
chủng xạ khuẩn là cao nhất.
 Tinh sạch và xác định cấu trúc của hoạt chất kháng Xoo sinh ra bởi chủng xạ
khuẩn VN08 - A12.

3


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN
1.1. Bệnh bạc lá lúa và tác hại của bệnh bạc lá lúa
1.1.1. Giới thiệu chung
Bệnh bạc lá lúa - hay cịn gọi là bệnh cháy bìa lá lúa (Bacterial leaf blight
disease) là một trong những bệnh phổ biến trong các nƣớc trồng lúa. Bệnh bạc lá lúa
đƣợc phát hiện lần đầu ở vùng Fukuoko, Kyushu, Nhật Bản ngay từ những năm
1884 [45]. Hiện nay, bệnh bạc lá đã xảy ra trên rất nhiều quốc gia, đặc biệt ở châu
Á. Ở nhiều nƣớc châu Á, căn bệnh này đã trở thành đại dịch trên lúa. Bệnh có thể
làm giảm sản lƣợng ở mức độ khác nhau, tùy thuộc vào giai đoạn nhiễm bệnh của
cây, mức độ nhạy cảm của giống lúa và ảnh hƣởng của môi trƣờng. Ở một số nƣớc
châu Á và Đông Nam Á, bệnh bạc lá lúa thƣờng làm giảm năng suất 10 - 20 %
nhƣng có thể lên đến 50% [33] [38]. Ở Nhật Bản, thiệt hại năng suất ƣớc tính là 20 30% thậm chí đến 50%. Ở vùng nhiệt đới, bệnh phá hoại gây ảnh hƣởng nặng tới
hàng triệu ha lúa. Ở Ấn Độ, thiệt hại về sản lƣợng từ 6 đến 60%. Việc giảm sản
lƣợng chủ yếu là do giảm số lƣợng bông và trọng lƣợng hạt [43].
Ở Việt Nam, tuy khả năng lây lan thành dịch của bệnh bạc lá lúa không cao
nhƣ các bệnh dịch hại khác nhƣ rầy nâu, đạo ôn, hậu quả do bệnh bạc lá lúa gây ra
không hề thua kém những dịch hại khác. Theo số liệu thống kê của cục Bảo vệ Thực
vật, từ năm 1999 - 2003 diện tích lúa bị hại do bệnh bạc lá gây ra trong cả nƣớc là
108.691,4 ha (miền Bắc là 86.429,2 ha; miền Nam là 22.262,2 ha), trong đó diện tích
bị hại nặng nhất là 156,76 ha và diện tích mất trắng là 80 ha. Cho đến năm 2013 diện
tích lúa nhiễm bệnh bạc lá là 135,4 nghìn ha, tăng gấp 6,5 lần so với năm 2010. Từ
năm 2010 đến năm 2011 diện tích cây mắc bệnh tăng nhẹ và đột ngột tăng cao trong
giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2012. Diện tích lúa bị mắc bệnh năm 2012 là 90,543
nghìn ha, cao gấp gần 4 lần so với năm 2011 (26 nghìn ha) đến năm 2013 diện tích
lúa bị mắc bệnh đã tăng đến 135,4 nghìn ha. Trong đó diện tích lúa bị nhiễm nặng là
hơn 9,5 ngàn ha. Tình trạng mất trắng vẫn đang diễn ra và tăng cao trong các năm trở

4


lại đây tập trung nhiều tại các tỉnh phía bắc và một số tỉnh vùng đồng bằng sông Cửu
Long. Tuy nhiên, kết quả khảo sát mới đây của chi cục cho thấy, vụ hè thu 2014, lần
đầu tiên bệnh này đã xuất hiện tập trung ở cánh đồng huyện Đạ Tẻh , Lâm Đồng và
diện tích nhiễm bệnh lên đến 25 ha và tỷ lệ gây hại từ 50% - 80% (cao hơn nhiều so
với bình quân chung cả nƣớc).
Bệnh bạc lá phát sinh trong suốt thời kỳ lúa chín nhƣng các triệu chứng bệnh
điển hình thƣờng xuất hiện từ thời kỳ đẻ nhánh đến thời kỳ trổ và chín, đạt đỉnh ở
giai đoạn ra hoa [33]. Bệnh bạc lá lúa đƣợc chia làm hai giai đoạn: giai đoạn
“Kresek” và giai đoạn cháy lá. Kresek là giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất, toàn
bộ lá của cây chuyển màu vàng nhạt và héo. Nếu xảy ra trong thời kỳ đẻ nhánh sớm
sẽ dẫn đến mất mùa một phần hoặc hoàn toàn. Cây con dƣới 21 ngày tuổi dễ bị
kresek ở nhiệt độ từ 28oC đến 34oC [5]. Chính vì vậy, bệnh lây lan dễ dàng hơn ở
vùng khí hậu ấm áp và ẩm. Trong giai đoạn cháy lá, lá có màu vàng đặc trƣng với
gợn sóng trên phiến lá (hình 1).

Hình 1. Lúa bị nhiễm bệnh bạc lá do vi khuẩn Xoo.
(www.thaibinhseed.com.vn/benh-bac-la-lua)
1.1.2. Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa
Tác nhân gây bệnh bạc lá lúa là vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
(Xoo). Vi khuẩn này có tế bào hình que với đầu tròn, với chiều dài từ 0,8 đến 1 µm,

5


chiều rộng 0,4 đến 0,7 μm, bao quanh tế bào là một màng nhầy. Đây là loại vi
khuẩn Gram âm và khơng sinh bào tử, khuẩn lạc hình trịn, lồi, bề mặt nhẵn, màu

vàng (hình 2) [9]. Vi khuẩn này chủ yếu xâm nhập vào hệ thống mạch dẫn rồi dẫn
đến nhiễm trùng toàn thân cây lúa . Ngoài ra vi khuẩn cịn có thể xâm nhập qua lỗ
thùy khổng ở mép lá, đầu mút lá dễ dàng gây tổn thƣơng dọc theo gân lá [39].

5µm

Hình 2. Khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn Xoo [9]
Loại vi khuẩn này đầu tiên đƣợc các nhà khoa học Nhật Bản, Hori và Bokura
đặt tên là Bacillus oryzae từ năm 1911 và đƣợc đổi tên nhiều lần [33]. Sau đó, do
phát hiện là tác nhân gây bệnh bạc lá lúa, loài vi khuẩn này đƣợc đổi tên thành
Xanthomonas campestris pv. oryzae để phân biệt với các tác nhân gây bệnh sọc lá
X. campestris pv. oryzicola [51]. Năm 1990, Swings phát hiện ra vi khuẩn gây bệnh
bạc lá và bệnh sọc lá khác biệt với các vi khuẩn gây bệnh X. campestris khác nên
phân loại lại thành một loài riêng biệt X. oryzae, bao gồm pv. oryzae và pv.
oryzicola. Bằng các phân tích giải trình tự DNA, protein và phân tích thành phần
acid béo, vị trí phân loại của Xanthomonas oryzae đã đƣợc khẳng định và công nhận
đến ngày nay [49] [50].
Xoo là một loại vi khuẩn Gram âm, màu vàng, sản sinh lƣợng lớn
polysaccharide ngoại bào (EPS). Các chủng đột biến thiếu EPS khơng có khả năng
gây bệnh bạc lá lúa [44]. Xoo chỉ có thể tồn tại trong đất từ một đến hai tháng, ngồi
ra Xoo có thể tồn tại trong hạt giống của các cây lúa bị nhiễm, hay trong rơm rạ. Vi

6


khuẩn này sẽ đƣợc kích hoạt khi gặp độ ẩm thích hợp và sinh trƣởng trong gốc rạ
cũng nhƣ trong một số loại cỏ nhƣ Leersia sp.. Giả thuyết tác nhân gây bệnh là từ
giống lúa hay từ ADN của hạt giống nhiễm bệnh đã bị loại bỏ [16] [48]. Các vi
khuẩn gây bệnh bạc lá xâm nhập vào cây qua các vết thƣơng xây xát ở trên lá do
mƣa bão gây ra và qua các lỗ khí khổng, sau đó sẽ gây bệnh trên các mơ và từ đó sẽ

nhân và lây lan toàn bộ cây dẫn đến nhiễm trùng tồn thân [26]. Vi khuẩn lây lan
thơng qua nƣớc tƣới, mƣa và gió. Nƣớc tƣới cũng đƣợc coi là tác nhân đóng góp lớn
vào sự lây lan của bệnh này trên diện rộng đất canh tác. Tuy nhiên, vi khuẩn chỉ tồn
tại đƣợc trong nƣớc dƣới 15 ngày [45].
1.2. Các cách phòng trừ bệnh bạc lá lúa
Bệnh bạc lá lúa gây tổn thất nặng nề và ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sản
xuất lúa gạo trên toàn thế giới, do vậy địi hỏi phải có chiến lƣợc quản lý nhằm
chống lại sự bùng phát của dịch bệnh. Bƣớc đầu cần thực hiện để kiểm soát bệnh
bạc lá lúa là làm giảm tác nhân gây bệnh và ngăn chặn phát triển của tác nhân gây
bệnh trên cây chủ. Điều này có thể đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng các hóa
chất, giống kháng bệnh, và tác nhân sinh học.
1.2.1. Sử dụng thuốc hóa học
Thuốc hóa học đƣợc sử dụng để giết chết hoặc ức chế sự nhân lên của các tác
nhân gây bệnh bằng cách ngăn chặn con đƣờng trao đổi chất của vi khuẩn. Một số
hóa chất đƣợc sử dụng để kiểm soát bệnh bạc lá lúa nhƣ Bordeaux có hoặc khơng
có đƣờng, hỗn hợp đồng xà phịng, thuốc diệt nấm và đồng thủy ngân, dịch phun
oxychloride. Ở Ấn Độ, sử dụng bột Clo trong xử lý nƣớc cũng làm giảm bệnh [11].
Một số chất hữu cơ tổng hợp diệt khuẩn cũng đã đƣợc sử dụng nhƣ niken dimethyl
dithiocarbamate, dithianone, phenazine và phenazine N- oxit. Ngoài ra, thuốc diệt
nấm dithiocarbamate cũng ức chế sự phát triển của Xoo bằng cách ngăn chặn quá
trình sinh tổng hợp acid béo và lipid [54]. Một vài loại thuốc kháng sinh nhƣ
streptocycline và các thuốc diệt nấm nhƣ zineb, carbendazim cũng đƣợc chứng
minh là có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh in vitro. Một số chất diệt khuẩn nhƣ

7


kasugamycin, phenazin và streptomycin có thể ngăn chặn đƣợc các vi khuẩn gây
bạc lá lúa, nhƣng lại có nhƣợc điểm là giá thành đắt và không thân thiện với môi
trƣờng. Việc sử dụng các thuốc hóa học ln mang lại hậu quả rất nặng nề đối với

môi trƣờng. Đồng thời, cũng chƣa có phƣơng thức kiểm sốt bằng hóa chất nào
mang lại hiệu quả cao bởi vì khả năng tồn tại và phát triển của các chủng kháng
thuốc.
1.2.2. Chọn giống lúa kháng bệnh
Chọn giống lúa kháng bệnh hiện nay cũng là phƣơng pháp đang đƣợc quan
tâm. Hiện nay, 23 gen kháng bệnh bạc lá lúa (Xa) đã đƣợc công bố (bảng 1). Các
đoạn mồi cũng đã đƣợc thiết kế để phát hiện các gen Xa trên các giống lúa khác
nhau (bảng 2).
Bảng 1. Đặc điểm và nguồn gốc của các gen Xa kháng bệnh bạc lá lúa [37]
Tên gen Xa

Tên gen Xa

mới

cũ

Nhiễm sắc thể

Giống, dòng lúa đại diện

Xa1

Xa1

NST 4

Kogyoku

Xa1-h

Xa-1h

NST 4

IR28, IR29, IR30

Xa2

Xa2

NST 4

Rentai Emas2, tẻ tép

Xa3

Xa-w

NST11

Wase Aikoku3

Xa-4b

NST11

Semora Mangga

Xa-6

NST-5

Zenith

Xa-9

NST-6

Sateng

Xa4

Xa-4

NST11

TKM6, IR20, UR22

Xa5

Xa-5

NST 4

DZ192,IR1545-339

Xa7

Xa-7

NST 4

DV85, DZ78

Xa8

Xa-8

NST 4

PI231129

Xa10

Xa-10

NST11

Cas 209

Xa11

Xa-11

RP 9-3, IR8

8

Tên gen Xa

Tên gen Xa

mới

cũ

Nhiễm sắc thể

Giống, dòng lúa đại diện

Xa12

Xa-kg

NST4

Kogyoku, Java14

Xa12-h

Xa-kgh

NST 4

IR28, IR29, IR30

Xa13

Xa-13

NST 5

BJ1, Chinsura Boro II

Xa14

Xa-14

Tai chung Native 1

Xa15 (t)

Xa-nm (t)

M41

Xa16

Xa-16

Tẻ tép

Xa17

Xa-as(t)

Xa18

Xa-18

Xa19

Xa19

Đột biến

XM5

Xa20

Xa-20

Đột biến

M6

Xa21

Xa-21

NST 11

IRBB21

Xa22 (t)b

Xa-22 (t)

NST 11

Zachanglong

Xa23 (t)b

Xa-23 (t)

NST 11

WBB1

NST 4

Asominori
IR24, Milyang 23

Bảng 2. Trình tự các đoạn mồi đặc hiệu để phát hiện gen Xa trên lúa [15]
Mồi

Trình tự nucleotide

MP1

5'-ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG-3'

MP2

5'-dTG-CTA-TAA-AAG-GCA-TTC-GGG-3'

RG556 F

5'-TAG-CTG-CTG-CCG-TGC-TGT-GC-3'

RG556 R

5'-AAT-ATT-TCA-GTG-TGC-ATC-3'

P3 F

5'-CAG-CAA-TTC-ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3'

P3 R

5'-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT-ATC-GGA-3'

Xa21F

5'-ATA-GCA-ACT-GAT-TGC-TTT-GC-3'

Xa 21 R

5'- CGA - TCG - GTA - TAA- CAG-CAA-AAC-3'

RG136 F

5' - TCC-CAG-AAA-GCT - ACA-GC-3'

RG136 R

5' - GCA-GAC-TCC-AGT=TTG-ACT-TC-3'

9

Xa-gen
Xa-4

Xa-5

Xa-7

Xa-21

Xa-13


Gen Xa21 lần đầu tiên đƣợc phát hiện trong một giống lúa hoang dại Oryza
longistaminata và đã dƣợc chuyển vào giống lúa IR24 để tạo ra giống lúa kháng
bệnh IRBB21 [30]. Ở Ấn Độ và Philippin, giống lúa này đã đƣợc chứng minh là có
khả năng kháng với hầu hết các chủng Xoo. Tuy nhiên, cho đến nay một số chủng
Xoo ở một số vùng của châu Á đã đƣợc phát hiện là có thể vƣợt qua đƣợc gen
kháng Xa21 trong giống lúa IRBB21 (hình 3) [18]

Hình 3. Tổn thƣơng ít trên lá của giống lúa IRBB21 chứa gen Xa21 do bệnh bạc lá
lúa ở Ấn Độ [19]
Các nghiên cứu về bệnh Xoo cuối những năm 2000 đã đƣợc phát triển lên từ
việc phân lập, chuẩn đoán và định dạng bằng hình thái vi khuẩn, lên mức sử dụng
các kĩ thuật phân tử (ví dụ nhƣ chuẩn đốn bệnh nhanh bằng PCR, giải trình tự các
gen kháng bệnh Xoo trên lúa, dùng phƣơng pháp đánh dấu gen để chuyển gen kháng
vào các dòng lúa) [3] [47]. Các nhà khoa học Việt Nam kết hợp với Viện nghiên

cứu lúa quốc tế (IRRI) của Nhật Bản và xác định các gen kháng Xa7, Xa21 (trội) và

10


Xa5 (lặn) có tính kháng cao đối với hầu hết các dòng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá
lúa ở các tỉnh phía Bắc [47], đồng thời xác định các dạng bệnh gây ra bởi các chủng
Xoo đã phân lập đƣợc từ các mẫu lúa trồng tại đồng bằng sông Cửu Long [13].
Tuy nhiên, việc sử dụng liên tục và trên diện rộng các gen kháng bệnh đơn lẻ
đã dẫn đến sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh có khả năng phá vỡ sức kháng
bệnh của cây. Vì thế, việc chuyển tổ hợp các gen kháng đƣợc cho là giải pháp lâu
dài cho việc làm chậm lại sự xuất hiện các dòng vi khuẩn gây bệnh miễn dịch với
các dịng lúa có gen kháng bệnh. Các gen khác nhau kháng các dòng, các chủng, các
dạng sinh học của vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Tổ hợp các gen đó làm rộng phổ
tác động kháng lại sự đa dạng của các chủng Xoo gây bệnh. Hơn nữa, bằng cách tổ
hợp các gen chính và các gen phụ kháng bệnh bạc lá lúa sẽ làm kéo dài sức kháng
bệnh ở cây lúa [8]. Do vậy, các nghiên cứu hiện nay đang tìm cách chuyển nhiều
gen kháng vào một giống lúa tạo tính kháng ổn định cao.
1.2.3. Khống chế sinh học
Các thuốc hóa học đã đƣợc chứng minh là có hiệu quả trong việc kiểm sốt
bệnh bạc lá lúa nhƣng khơng đƣợc ứng dụng rộng vì những biến đổi khó lƣờng của
các tác nhân gây bệnh. Sự xuất hiện các quần thể kháng thuốc đặt ra mối đe dọa
nghiêm trọng cho chiến lƣợc kiểm sốt hóa học lâu dài. Đồng thời, các chất hóa học
thƣờng rất độc hại đối với ngƣời sử dụng, gây ảnh hƣởng đến các loài sinh vật khác,
và tích lũy qua thời gian dài sẽ gây ảnh hƣởng trầm trọng lên hệ sinh thái. Việc
chọn tạo giống kháng bệnh cũng đã đƣợc áp dụng nhƣng các nhóm quần thể kháng
lại gen kháng bệnh cũng phát triển nhanh chóng. Do đó, kiểm sốt sinh học đƣợc
cho là một giải pháp sinh thái có hiệu quả cho việc ngăn ngừa bệnh bạc lá lúa. Vì
thế khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên có thể là giải pháp tốt hơn
để điều trị bệnh bạc lá lúa. Islam và Bora (1998) đã đƣa ra biện pháp phòng trừ

bệnh bạc lá bằng việc sử dụng 2 chủng vi khuẩn Rhizobacterial vào việc khử trùng
hạt giống. Kết quả cho thấy việc xử lý hạt giống khơng chỉ có tác dụng làm giảm
ảnh hƣởng của bệnh bạc lá mà cịn có tác dụng làm tăng năng suất lúa [27].

11


Ngoài ra, các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự của ơng ở Ấn
Độ và Philipin đã tìm thấy chủng Pseudomonas fluorescens và một số chủng
Bacillus đƣợc phân lập từ các mẫu vùng rễ lúa, có khả năng ức chế sự phát triển của
Xoo trong phịng thí nghiệm [17]. Năm 2008, Ji và cộng sự công bố chủng
Lysobacter antibioticus đƣợc phân lập từ rễ cây lúa ở tỉnh Yunnan, Trung Quốc, có
khả năng ức chế sự phát triển của nhiều loại nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật,
trong đó có Xoo [29].
1.3. Xạ khuẩn
1.3.1. Giới thiệu chung về xạ khuẩn
Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram dƣơng, thƣờng có tỷ lệ GC trong ADN cao
hơn 55%. Trong số khoảng 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã cơng bố có
khoảng 100 chi và 1000 lồi xạ khuẩn [12]. Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria,
bộ Actinomycetales, 10 dƣới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Xạ khuẩn phân bố chủ
yếu trong đất và đóng vai trị rất quan trọng trong chu trình tuần hồn vật chất trong
tự nhiên. Chúng sử dụng axit humic và các chất hữu cơ khó phân giải khác trong
đất. Trong đất xạ khuẩn chiếm từ 9% - 45% tổng số vi sinh vật, số lƣợng trung bình
khoảng 106 - 108 tế bào/ g đất. Số lƣợng xạ khuẩn trong đất không chỉ phụ thuộc
vào loại đất mà còn phụ thuộc vào mức độ canh tác của đất và khả năng bao phủ
của thực vật. Đất giàu chất dinh dƣỡng hữu cơ, khoáng và lớp đất trên bề mặt (đến
40 cm) thƣờng có số lƣợng xạ khuẩn lớn. Trong 1 g đất canh tác có thể có tới 5 x
106 tế bào xạ khuẩn, trong khi đó đất vùng sa mạc, nóng, khơ, độ ẩm thấp, nghèo
chất dinh dƣỡng, có số lƣợng xạ khuẩn thấp hơn 10 - 100 lần, dao động trong
khoảng 104 - 105 tế bào/ 1 g đất. Sự phân bố của xạ khuẩn trong đất còn phụ thuộc

nhiều vào độ pH của mơi trƣờng, thƣờng có nhiều trong lớp đất trung tính và kiềm
yếu hoặc axit yếu, trong khoảng pH 6,0 - 8,0. Xạ khuẩn khơng có nhiều trong lớp
đất kiềm hay axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm. Số lƣợng xạ khuẩn trong
đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm [4].

12


Khuẩn lạc của xạ khuẩn không trơn ƣớt nhƣ ở vi khuẩn và ở nấm men mà
thƣờng rắn chắc, thô ráp, dạng vôi, dạng nhung tơ, hay dạng mang dẻo, khơng trong
suốt. Kích thƣớc khuẩn lạc thay đổi tuỳ loại xạ khuẩn và tuỳ điều kiện ni cấy,
đƣờng kính khuẩn lạc trung bình 0,5 - 2 mm. Khuẩn lạc của xạ khuẩn có nhiều màu
sắc khác nhau nhƣ đỏ, da cam, vàng, lam, hồng, nâu, tím. Màu sắc của xạ khuẩn
cũng đƣợc coi là một trong những đặc điểm phân loại quan trọng [1].
Trên môi trƣờng đặc, đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh
(aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất (substrate mycelium). Nhiều loại chỉ có
khuẩn ty cơ chất nhƣng cũng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí
sinh. Giữa khuẩn lạc thƣờng thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần
(conidia hay conidiospores). Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì đƣợc
gọi là nang bào tử hay bào tử kín (sporangiospores). Bào tử ở xạ khuẩn đƣợc sinh ra
ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa). Các chuỗi bào tử
trần có thể chỉ là 1 bào tử (nhƣ ở Thermoactinomyces, Saccharomonospora,
Promicromonospora, Micromonospora và Thermomonosspora), có thể có 2 bào tử
(nhƣ ở Microbispora), có thể là chuỗi ngắn (nhƣ ở Nocardia, Pseudonocardia,
Streptoverticillium,

Sporichthya,

Actinomadura,

Microtetraspora,

Streptoalloteichus, Glycomyces, Amycolata, Amycolatopsis, Catellatospora,và
Microellobosporia), có thể là chuỗi dài (nhƣ ở Streptomyces, Saccharopolyspora,
Actinopolyspora, Kibdelosporangium, Kitasatosporia, Saccharothrix, nhiều loài ở
Nocardia, Nocardioides, Pseudonocardia, Amycolatopsis và Streptoverticillium), có
thể các bào tử trần nằm trên bó sợi (synnema), tƣơng tự bó sợi của nấm (nhƣ ở
Actinosynnema và Actinomadura). Các chuỗi bào tử có thể thẳng, xoắn hoặc lƣợn
sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng. Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống
sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể riêng rẽ hoặc phân nhánh. Các đặc điểm
hình thái này rất quan trọng khi tiến hành định tên xạ khuẩn. Tuy nhiên, xạ khuẩn
hoàn toàn khác biệt so với nấm ở những đặc điểm sau: Xạ khuẩn khơng có nhân
thật, đƣờng kính khuẩn ty và bào tử nhỏ hơn so với ở nấm, khuẩn ty khơng có vách

13