(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của triterpenoit khung lupan ’’ thành nghiên cứu tổng hợp thuốc chữa bệnh tiểu đường glibenclamide và metformin hydrochloride

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
́ C GIAHỌ
TRƢỜNG
I HỌ
C KHOA
TƢ̣I NHIÊN
ĐẠĐẠ
I HỌ
C QUÔ
HÀCNỘ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN
--------

--------

ĐINH THỊ CÚC
NGUYỄN HOÀNG MINH HUỆ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC CHỮA BỆNH TIỂU

NGHIÊN
CỨU
TỔNG HỢP VÀ
VÀMETFORMIN
CHUYỂN HÓA
ĐƢỜNG
GLIBENCLAMIDE
HYDROCHLORIDE
MỘT SỐ 4-FORMYLSYDNONE
TETRA-O-

ACETYL-β-D-GALACTOPYRANOSYL
THIOSEMICARBAZON THẾ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2012

Hà Nội – 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN
--------

ĐINH THỊ CÚC

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP THUỐC CHỮA BỆNH TIỂU
ĐƢỜNG GLIBENCLAMIDE VÀ METFORMIN
HYDROCHLORIDE

Chun ngành : Hố Hữu cơ
Mã sớ
: 60 44 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
GS. TS. Nguyễn Văn Tuyến

Hà Nội-2014


LỜI CẢM ƠN
Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn
GS.TS. Nguyễn Văn Tuyến và T.S Đặng Thị Tuyết Anh đã giao đề tài và tận
tình hƣớng dẫn em trong śt thời gian thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cảm ơn các cán bợ phịng Hóa Dƣợc, cử nhân
Nguyễn Bích Thuận, Nguyễn Thị Hạnh, Hoàng Thị Phƣơng đã giúp đỡ em rất
nhiều trong q trình thực nghiệm và hoàn thành luận văn.
Tơi xin cảm ơn các anh chị, các bạn học viên, các em sinh viên phịng
Hóa Dƣợc, các bạn học viên lớp K22- lớp Cao học Hóa đã trao đổi và giúp đỡ
tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình tơi, bạn bè tơi những ngƣời đã ln bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
học tập và thực hiện luận văn này.
Hà nội,ngày 12 tháng 8 năm 2014.
Học viên

Đinh Thị Cúc.


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................
MỤC LỤC ........................................................................................................................
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT.......................................... DM1
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ................................................................. DM2
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ .................................................................................... DM3
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1
CHƢƠNG I. TỔNG QUAN ........................................................................................ 3
1.1.Khái quát về bệnh tiểu đƣờng................................................................................. 3

1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đƣờng. ................................................................................... 3
1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết .......................................................... 3
1.1.2.1.Insulin và các th́c kích thích bài tiết insulin:................................................. 3
1.1.2.2.Các th́c làm tăng nhạy cảm insulin ............................................................... 4
1.1.2.3.Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym -glucosidase)4
1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng........................................... 5
1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng......................................................... 5
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Glibenclamide. ....................................................... 5
1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride. ...................................... 7
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. ....................................................................... 7
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. ...................................................................... 8
CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM ................................................................................11
2.1.Hóa chất và thiết bị. ................................................................................................11
2.1.1.Hóa chất và dung môi. ........................................................................................11
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc...................................................................................11
2.1.3. Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra đợ tinh khiết của các sản
phẩm tổng hợp đƣợc. ....................................................................................................12
2.2.Tổng hợp Glibenclamide . .....................................................................................12
2.2.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride. .............................................12


2.2.2. Tổng hợp chất trung gian (4). ............................................................................13
2.2.3. Tổng hợp Glibenclamide (5). ............................................................................14
2.2.4. Phân tích hàm lƣợng sản phẩm glibenclamide (5) theo tiêu chuẩn dƣợc điển
châu Âu 2002. ...............................................................................................................15
2.3.Tổng hợp Metformin hydrochloride. ....................................................................15
2.3.1. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride. ................................................16
2.3.1.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi Aceton. ........................16
2.3.1.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung môi MeOH..........................17
2.3.1.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung mơi EtOH............................17

2.3.2.Nghiên cứu xác định đợc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride. .....17
2.3.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .....................................................................................18
2.3.2.2. Phƣơng pháp nghiên ứ
c u ................................................................................18
2.3.2.3. Kết quả nghiên cứu. ........................................................................................18
2.3.3.Nghiên cứu hàm lƣợng metformine hydrochloride theo phƣơng pháp HPLCMS) ................................................................................................................................19
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................22
3.1. Tổng hợp Glibenclamid. .......................................................................................22
3.2. Tổng hợp metformine hydrochloride. ..................................................................28
3.2.1. Nghiên cứu kết tinh metformine hydrochloride ...............................................29
3.2.2. Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine hydrochloride .....30
3.2.3. Hàm lƣợng metformin hydrochloride theo phƣơng pháp HPLC ...................31
KẾT LUẬN ..................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................34
PHỤ LỤC......................................................................................................................38


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

13

C- NMR

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon-13 (13C Nuclear Magnetic
Resonance)

DMSO

Dimethyl sulfoxide

1

Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H Nuclear Magnetic
Resonance)

H- NMR

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy)

MS

Phổ khối lƣợng va chạm điện tử ( Electron Impact-Mass
Spectrometry)

H, C

Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon

ppm

Phần triệu ( parts per million )

s

singlet

dd

Double doulet

CHCl3

Clorofoc

EtOH

Etanol

MW

Microwave

MeOH

Metanol

OMe

Methoxy

SOCl2

Sulfonylchlorua

DM 1


DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Bảng 2.1. Kế t quả thƣ̉ đô ̣c tiń h cấ p của metformine hydrochloride............. 19
Hình 2. 1. Biể u đờ về mớ i tƣơng quan giƣ̃a liề u dùng và số chuô ̣t chế......
t 19
Hình 3.1: Phổ 1H-NMR của chất trung gian (4). ...................................... 23
Hình 3.2: : Phổ 13C-NMR của chất trung gian (4) .................................... 24
Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của chất glibenclamide (5). ................................ 25
Hình 3.4: : Phổ 13C-NMR của chất glibencalmide (5) ............................. 26
Hình 3.6: Phổ 1H-NMR của chất metformin hydrochloride. .................... 28
Hình 3.7: : Phổ 13C-NMR của chất metformin hydrochloride. ................ 29
Hình 3.9: Sắc kí đồ HPLC của metformin hydrochloride ........................ 32

DM 2


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamide ................................................ 7
Sơ đồ 1.2: Quá trình tổng hợp 1-cyanoguanidin ............................................... 8
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride ................................. 8
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro ............ 9
Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi........ 9
Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin .......................................... 9
Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin .......................................... 10
Sơ đồ 3.1. Tổng hợp glibenclamide. ............................................................... 22
Sơ đồ 3.2: Tổng hợp trực tiếp metformin hydrochloride…………………...27

DM 3

MỞ ĐẦU
Tiểu đƣờng là căn bệnh nguy hiểm thuộc hệ nội tiết, đe doạ nghiêm
trọng sức khoẻ con ngƣời và gây nhiều biến chứng nguy hiểm, đặc biệt là tiểu
đƣờng tuýp II (chiếm tới 90-95%). Theo Hiệp hội thế giới về tiểu đƣờng, tử
vong của bệnh này đứng hàng thứ tƣ ở các nƣớc phát triển, bệnh có thể gây
nhiều tai biến nguy hiểm nhƣ: mù loà và giảm thị lực ở ngƣời trƣởng thành;
đoạn chi không do tai nạn nhiều hơn ngƣời bình thƣờng từ 15-40 lần; suy thận
giai đoạn cuối nên cần phải chạy thận hoặc thay thận nhân tạo; gây ra những
biến chứng tim mạch nguy hiểm. Theo ƣớc tính, hiện thế giới có 194 triệu
ngƣời mắc bệnh tiểu đƣờng chiếm tới 5,1% dân số thế giới, ƣớc tính đến năm
2025 sớ ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng sẽ là 333 triệu ngƣời. Theo thống kê năm
2008, tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đƣờng ở Việt Nam là 5% dân số (khoảng 4,5
triệu ngƣời) và 7,2% tại các thành phớ lớn. TP. Hồ Chí Minh có hơn 800.000
ngƣời mắc bệnh. Trong danh sách thuốc thiết yếu của WHO 2007 và trong
danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y tế, glibenclamide và metformin là một
trong hai thuốc tiểu đƣờng duy nhất sử dụng theo đƣờng uống chữa bệnh tiểu
đƣờng tuýp II. Glibenclamide và metformin đƣợc dùng riêng rẽ hoặc dùng tổ
hợp với nhau. Glucovance (thuốc tổ hợp của glibenclamide và metformin)
dùng để chữa bệnh tiểu đƣờng có đƣờng huyết cao. Glibenclamide kích thích
tuyến tụy tiết insulin cịn metformin làm chậm hấp thụ đƣờng trong ruột non;
ngăn cản gan chuyển đƣờng dự trữ vào trong máu và giúp cơ thể sử dụng
insulin tự nhiên hiệu quả hơn. Vì vậy, sử dụng glucovance rất hiệu quả và ít
gây phản ứng phụ.Nhƣ vậy nếu tổng hợp đƣợc glienclamide và metformin thì
chúng ta có thể chủ đợng sản xuất đƣợc hai loại th́c thiết yếu nhất để chữa
bệnh tiểu đƣờng túyp II, làm tăng thêm sự lựa chọn, tăng tính hiệu quả của
việc chữa bệnh tiểu đƣờng và chủ động sản xuất thuốc generic chữa bệnh tiểu
đƣờng giá rẻ ở Việt nam.

1


Vì vậy,chúng tơi đã tiến hành lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp
thuốc chữa bệnh tiểu đường glibenclamide và metformin hydrochloride” có
ý nghĩa rất lớn về khoa học và thực tiễn.

2


CHƢƠNG I. TỔNG QUAN

1.1.Khái quát về bệnh tiểu đƣờng.
1.1.1.Phân loại bệnh tiểu đƣờng.
Bệnh tiểu đƣờng đƣợc chia thành hai loại nhƣ sau:
Tiểu đƣờng tuýp 1: Tiểu đƣờng túyp 1 là mợt bệnh tự miễn trong đó hệ
thớng miễn dịch của cơ thể phản ứng lại và phá huỷ tế bào  sản xuất insulin
của đảo tuỵ. Sự thiếu hụt insulin dẫn đến tăng glucose máu và thƣờng dẫn
đến các biến chứng mãn tính
Tiểu đƣờng túyp 2: Bệnh tiểu đƣờng túyp 2 đƣợc đặc trƣng bởi kháng
insulin và giảm tiết chế insulin dẫn đến mất khả năng duy trì mức glucose
máu bình thƣờng.
Các túyp tăng đƣờng huyết đặc hiệu khác:
- Đái tháo đƣờng thai kỳ.
- Thiếu hụt di truyền chức năng tế bào .
- Thiếu hụt di truyền về tác động của insulin.
- Bệnh tuyến tụy ngoại tiết ....
1.1.2. Các thuốc điều trị bệnh tăng đƣờng huyết
Dựa vào tác dụng và cơ chế tác dụng, các thuốc điều trị bệnh tiểu đƣờng
đƣợc chia thành 3 nhóm chính nhƣ sau:

- Insulin và các th́c kích thích bài tiết insulin.
- Các th́c làm tăng nhạy cảm insulin.
- Các thuốc chống tăng đƣờng huyết sau bữa ăn
1.1.2.1.Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin:
+ Insulin:
Insulin là hormon do tế bào  của tuyến tuỵ tiết xuất, đóng vai trị chủ
yếu trong cơ chế điều hoà đƣờng huyết của cơ thể. Insulin là một trong những
hormon quan trọng của cơ thể, không chỉ tác dụng trên chuyển hoá năng
3


lƣợng và phát triển cơ thể, mà còn là chất cần thiết cho sự sống. Tác dụng của
insulin bao gồm các đáp ứng phức tạp mà ảnh hƣởng cuối cùng là trên chuyển
hố glucid, lipid và protid.
+ Thuốc kích thích bài tiết insulin
Các sulfonylurea.
Năm 1942, Janbon đã tình cờ phát hiện tác dụng hạ đƣờng huyết của dẫn
suất sulfonamid (1154RP) ở những bệnh nhân điều trị sốt thƣơng hàn. Từ
phát hiện này, nhiều nghiên cứu về tác dụng hạ đƣờng huyết của các
sulfonylurea đã đƣợc tiến hành. Các nghiên cứu ngày càng làm sáng tỏ cơ chế
tác dụng của thuốc. Nhiều th́c tḥc nhóm sulfonylurea đã ra đời, bao gồm
các thuốc thế hệ I (tolbutamide, chlorpropamide) và các thuốc thế hệ II
(Glyburide, Glypizide). Các thuốc này đang đƣợc sử dụng rộng rãi trên lâm
sàng, đem lại nhiều kết quả khả quan cho ngƣời bệnh.
1.1.2.2.Các thuốc làm tăng nhạy cảm insulin
Các biguanide:
Năm 1926, Frank và cộng sự đã tổng hợp synthalin từ nhân guanidin.
Chính các synthalin là tiền thân của các biguanid sau này.
Cơng thức chung:
R-NH-C-NH-C-NH2

NH

NH

Các th́c tḥc nhóm biguanide bao gồm: metformin, phenformin và
buformin. Hiện nay metformin là thuốc đang đƣợc sử dụng phổ biến nhất, vì
ít gây tăng axit lactic trong máu hơn. Các biguanide là thuốc chống tăng
đƣờng huyết, không gây hạ đƣờng huyết. Thuốc tác dụng chủ yếu ngoài tuỵ,
khơng có tác dụng kích thích tế bào  tuyến tuỵ bài tiết insulin.
1.1.2.3.Thuốc chống tăng đƣờng huyết sau ăn (thuốc ức chế enzym glucosidase)
Acarbose:

4


Acarbose là thuốc ức chế enzym glucosidase của tế bào niêm mạc ruột.
Do tác dụng ức chế enzym này, thuốc làm giảm hoặc chậm q trình hấp thụ
tinh bợt, dextran và các disaccharide ở ṛt non, tránh đƣợc tình trạng tăng
đƣờng huyết sau ăn. Th́c có tác dụng tớt cho cả 2 tuýp bệnh.
1.1.3.Quan niệm của y học cổ truyền về bệnh tiểu đƣờng.
Theo quan niệm của Đông y, bệnh thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba
triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều.
1.1.4.Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Các thuốc Đông y điều trị bệnh tiểu đƣờng chủ yếu là các thuốc có
nguồn gớc từ dƣợc liệu nhƣ sinh địa (Rehmania glutinosa Libosch,
Scrophulariaceae), cỏ ngọt (Stevia rebaudiana, Asteraceae), mƣớp đắng
(Momordica

charantia

L.Cucurbitaceae),

hoàng

kỳ

(Astragalus

membranaceus, Fabaceae), Huyền sâm (Scrophularia ningpoensis Hemsl,
Scrophulariaceae)...
1.2. Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Glibenclamide.
Glibenclamide là th́c chữa bệnh tiểu đƣờng tḥc vào nhóm
sulphonylure. Các hợp chất thuốc thế hệ một của loại thuốc này đƣợc phát
hiện từ những năm 1950 nhƣ: tolbutamide (1956), acetohexamide (1964),
tolazamide (1961), chlopropamide (1959). Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai
phải kể đến nhƣ: glibenclamide (1971), glipizide, glimepiride(1999).
Các thuốc thuộc thế hệ thứ hai có hiệu quả ở liều thấp nhờ sự tăng sự hấp
thụ qua màng tế bào beta. Sulphonylure đƣợc liên kết với thụ thể của nó trong
tế bào beta của tuyến tuỵ. Hoạt tính chớng bệnh tiểu đƣờng của các chất này
phụ thuộc vào ái lực của các th́c sulphonylure với thụ thể của nó. Cơ chế
hoạt đợng của lớp th́c này chủ yếu đƣợc giải thích bới sự kìm hãm của các
kênh KATP khởi xƣớng sự tiết insulin. Sự thành công của việc phát hiện ra
những chất sulphonylure có ái lực cao và chọn lọc vào thụ thể của
sulphonylure nhƣ là glibenclamide mất 27 năm sau khi phát hiện ra chất đầu

5


tiên có hoạt tính hạ đƣờng huyết và phải tổng hợp khoảng 12000 dẫn chất của
nó để sàng lọc, nghiên cứu mới quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc.

Ngoài glibenclamide, một số thuốc thế hệ thứ hai nhƣ đã đề cập ở trên
cũng đƣợc phát hiện . Tiếp đó đã có mợt sớ nhóm nghiên cứu tổng hơp các
chất trên cơ sở khung sulphonylure để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh
học. Mợt sớ dẫn của nhóm diarylylsulphonylure có hoạt tính chớng ung rất
mạnh. Có rất nhiều nghiên cứu về quan hệ hoạt tính chớng ung thƣ và cấu trúc
của lớp chất này. Tuy nhiên, hoạt tính chớng bệnh đái tháo đƣờng của lớp
chất diarylylsulphonylure không thể hiện rõ. Ngoài việc nghiên cứu về cấu
trúc và hoạt tính của các dẫn chất glibenclamide thì những nghiên cứu về cơ
chế và tìm hiểu sâu sắc về bản chất của thụ thể của nó cũng đƣợc nghiên cứu
nhiều.
Năm 1995, 26 năm sau khi phát hiện glibenclamide có ái lực cao với thụ
thể của nó ở tuyến tuỵ ngƣời ta đã nhân dịng và phát hiện ra thụ thể của nó là
thành phần của protein ABC vận chuyển liên họ. Gần đây ngƣời ta đã phát
hiện rằng thụ thể của nhóm sylphonylure điều tiết hoạt động của protein 38KDa (Kir 6.2) mà thụ thể đó cùng với protein đƣợc tách ra và cùng có chức
năng nhƣ kênh KATP.

6


Thuốc glibenclamide hầu nhƣ chủ yếu đƣợc nhập ngoại. Việc nghiên cứu
tổng hợp thuốc này ở Việt Nam chƣa thấy đề cập trong tài liệu.Vì vậy, chúng
tơi đã tiến hành đề tài nghiên cứu tổng hợp glibenclamide để làm thuốc chữa
bệnh tiểu đƣờng với hi vọng kết quả này sẽ đƣợc đƣa vào áp dụng trong thực
tiễn sản xuất thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng để đƣa vào sử dụng trong điều trị
bệnh tiểu đƣờng ở Việt Nam.
1.3.Thuốc chữa bệnh tiểu đƣờng Metformin hydrochloride.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc.
Cho đến nay, ở trong nƣớc có duy nhất mợt cơng trình nghiên cứu tổng
hợp metformin từ CaO, ure và dimethylamin. Quá trình tổng hợp đƣợc đƣợc

tiến hành qua 3 bƣớc [5]:
* Bƣớc 1: Tổng hợp calci cyanamide:

Sơ đồ 1.1: Quá trình tổng hợp calci cyanamid
Calci cyanamide đƣợc tạo thành phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ phản
ứng. Theo tác giả Ngô Q́c Huy, q trình phản ứng thực hiện theo 2 giai
đoạn:
- Giai đoạn 1: Nung CaO và ure ở nhiệt độ 180-300oC
- Giai đoạn 2: Tiếp tục nung hỗn hợp trên ở nhiệt độ 750oC
*Bƣớc 2: Tổng hợp 1-cyanoguanidine :
7


Từ calci cyanamide đã đƣợc tổng hợp trong bƣớc 1, đem đun nóng trong
dung mơi H2O nhận đƣợc 1-cyanoguanidin đƣợc mơ tả trong sơ đồ sau:

1-cyanoguanidine
Sơ đồ 1.2: Q trình tổng hợp 1-cyanoguanidine
Điều kiện phản ứng thích hợp tổng hợp 1-cyanoguanidine là ở nhiệt độ
70 oC trong khoảng thời gian 30 phút. Phản ứng rất dễ bị polyme hóa nên khó
tinh chế, hiệu suất phản ứng phụ tḥc nhiều vào điều kiện phản ứng .1Cyanoguanidine đƣợc tổng hợp từ nguyên liệu rẻ nhƣ CaO và ure rất có ý
nghĩa, tuy nhiên q trình phản ứng phụ tḥc rất nhiều vào nhiệt độ, đặc biệt
cần phải thực hiện phản ứng ở nhiệt đợ 7500C nên khó kiểm sốt và ít có ý
nghĩa thực tiễn.
* Bƣớc 3: Tổng hợp metformin hydrochloride:
1-Cyanoguanidine đƣợc phản ứng với dimethylamin hydrochloride ở
nhiệt độ cao nhận đƣợc metformin hydrochloride. Q trình phản ứng đƣợc
mơ tả trong sơ đồ sau:
H2 N C NH CN
NH

+

t0 C

(CH 3 )2 NH.HCl

NH CH
3
H2N C NH CN
CH 3
NH

HCl

metformin hydrochloride
Sơ đồ 1.3: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride.
Mặc dù phƣơng pháp tổng hợp metformin từ những nguyên liệu rẻ tiền
nhƣ: CaO, ure và dimethylamin nhƣng do phản ứng cần tiến hành ở nhiệt độ
cao nên tạo ra sản phẩm polyme và khó tinh chế dẫn đến khó áp dụng ở quy
mơ lớn để tổng hợp 1-cyanoguianidine (tên khác là dicyano diamide).
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngồi nƣớc.
Metformin đƣợc mơ tả năm 1957 nhƣ chất có hoạt tính hạ đƣờng huyết
và năm 1979 đƣợc đƣa ra thị trƣờng ở Pháp nhƣng đến tận 1994 mới đƣợc
FDA cho phép lƣu hành để chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 ở Mỹ [19].
8


Metformin hydrochloride (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide
hydrochloride) đƣợc tổng hợp bởi Shapiro và các cộng sự [31] bằng cách

cho dimethylamine hydrochloride phản ứng với dicyano diamide ở nhiệt độ
140oC (sơ đồ 1.4). Bằng con đƣờng này Shapiro và cộng sự đã tổng hợp đƣợc
hàng trăm dẫn chất biguanid. Các dẫn chất này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính
hạ đƣờng huyết.
H 2N
H 2N

H3C
NH.HCl
H3C

C N C N

H3C
H3C

1400C

NH
NH
N C NH C NH2.HCl

metformin hydrochloride
Sơ đồ 1.4: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shapiro
Năm 2008, Anvar Shalmashi [32] đã đƣa ra phƣơng pháp mới để tổng
hợp metformin hydrochloride. Phản ứng điều chế metformin đƣợc thực hiện
trên bản mỏng điều chế và đƣợc đặt trong thiết bị microwave ở bƣớc sóng
540W trong 5 phút đạt hiệu suất 92%.
H 2N
H 2N

H3 C
NH.HCl
H3 C

C N C N

MW 5min, 540W

H3 C
H3 C

NH
NH
N C NH C NH2.HCl

Sơ đồ 1.5: Quá trình tổng hợp metformin hydrochloride theo Shalmashi
Gần đây đã có mợt sớ cơng trình nghiên cứu tạo các dẫn xuất của
metformin nhằm tăng hiệu quả sử dụng của nó trong điều trị bệnh tiểu đƣờng.
Kristiina và các cộng sự [22] đã tổng hợp đƣợc một số tiền chất của
metformin nhƣ mô tả trong sơ đồ 6 và sơ đồ 7. Các chất này có khả năng tan
tớt trong dầu và tăng khả năng hấp phụ trong ruột.
NH NH

NH NH2
N

N

N

H

S R

N

N
H

NH 2

Sơ đồ1.6: Chuyển hóa các tiền chất về metformin
9


O
R-S-S-R

+

NH NH 2

O

N-Br

N-S-R

O

O

N

N

N
H

S R

R=cyclohexan
R=Ph

Sơ đồ 1.7: Tổng hợp các dẫn xuất của metformin
Nhằm làm tăng hiệu quả sử dụng của metformin, Rao và các cộng sự
đã nghiên cứu tổng hợp các phức chất của metformin với Cu và Ni. Các phức
này đã đƣợc nghiên cứu hoạt tính hạ đƣờng huyết. Kết quả nghiên cứu cho
thấy các chất này có hoạt tính cao hơn nhiều so với metformin [30].
Kết quả nghiên cứu của Bentefrit và các cộng sự về tổng hợp phức chất
của metformin với platin cho thấy phức chất tetrachloro(metformin)platin
(IV) có hoạt tính kìm hãm sự tăng sinh của dịng tế bào ung thƣ P388 tƣơng
tự nhƣ Cis-platin [15].
Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của metformin cho thấy, hợp chất
metformin khơng chỉ có tác dụng chữa bệnh tiểu đƣờng tuýp 2 rất hiệu quả
mà cũng có khả năng chống ung thƣ tuyến tụy, ung thƣ vú
[12,20,21,26,27,33,34].
Từ các tƣ liệu đã có có thể thấy rằng con đƣờng tổng hợp metformin từ
dicyano diamide là khả thi. Tổng hợp theo con đƣờng này chỉ có mợt bƣớc
phản ứng khơng cần những hóa chất đắt tiền nên rất khả thi và có thể thực

hiện đƣợc ở quy mơ pilot.

10


CHƢƠNG II. THỰC NGHIỆM

2.1.Hóa chất và thiết bị.
2.1.1.Hóa chất và dung mơi.
Các hố chất dùng cho tổng hợp hữu cơ và dung môi đƣợc mua của
hãng Merck, hãng Sigma Aldrich và hãng Fluka và tḥc loại phân tích dùng
cho phân tích.
Bợt silica gel cho sắc ký cợt 100 – 200 mesh (Merck), bản mỏng sắc ký
silica gel đế nhôm Art. 5554 DC – Alufolien Kiesel 60 F254 (Merck).
2.1.2. Thiết bị xác định cấu trúc
Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp đƣợc, chúng tôi tiến hành
các phƣơng pháp sau:
- Xác định nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt đợ nóng chảy của các chất tổng hợp đƣợc đo trên máy đo trên máy
Gallenkeamp của Anh tại phịng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ – Viện hóa học
– Viện Hàn Lâm khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ hồng ngoại (IR)
Phổ IR của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên máy Impact 410 – Nicolet,
tại phịng thí nghiệm Phổ hồng ngoại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa
học & Công nghệ Việt Nam, đo ở dạng ép viên với KBr rắn.
- Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)
Phổ 1H-NMR (500MHz) và

13

C-NMR (125MHz) của các chất nghiên

cứu đƣợc đo trên máy Bruker XL-500 tần số 500MHz với dung môi DMSO
và TMS là chất chuẩn, tại phịng Phổ cợng hƣởng từ hạt nhân – Viện Hóa học
– Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lƣợng (MS)

11


Phổ khối của các chất nghiên cứu đƣợc ghi trên LC – MSD – Trap – SL
tại phòng Cấu trúc, Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Cơng nghệ
Việt Nam
2.1.3. Xác định cấu trúc,định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của
các sản phẩm tổng hợp đƣợc.
Cấu trúc của các sản phẩm phản ứng đƣợc xác định nhờ các phƣơng
pháp phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR,

13

C-

NMR,phổ hồng ngoại ( IR).
Các sản phẩm phản ứng đƣợc kiểm tra độ sạch bằng các phƣơng pháp
sắc kí lớp mỏng, sắc khí lỏng ghép nới khới phổ (LC/MS).
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc sử dụng để định tính chất đầu và sản
phẩm. Thơng thƣờng chất đầu và sản phẩm có giá trị Rf khác nhau, màu sắc
và sự phát quang khác nhau. Dùng sắc kí lớp mỏng để biết đƣợc phản ứng đã
xảy ra hay không xảy ra, phản ứng đã kết thúc hay chƣa kết thúc là dựa vào
các vết trên bản mỏng, cùng các giá trị Rf tƣơng ứng. Giá trị Rf của các chất

phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộc vào dung mơi làm pha đợng. Dựa trên
tính chất đó, chúng ta có thể tìm đƣợc dung mơi hay hỗn hợp dung môi để
tách các chất ra xa nhau (Rf khác xa nhau) hay tìm đƣợc hệ dung mơi cần thiết
để tinh chế các chất.
2.2.Tổng hợp Glibenclamide .
2.2.1. Tổng hợp 5-chloro-2-methoxybenzoyl chloride.

Hoà tan 10g (53,76mmol) 5-chloro-2-methoxybenzoic acid trong 200 ml
CHCl3. Hỗn hợp này đƣợc làm lạnh x́ng 00C, sau đó nhỏ giọt từ từ (12,69g,
107,52 mmol) SOCl2. Sau khi kết thúc nhỏ giọt, phản ứng đƣợc khuấy ở nhiệt
độ 250C, trong khoảng 8h. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp đƣợc làm nguội, cất
12


loại dung môi và SOCl2 rồi thêm dần 300ml nƣớc và chiết với CH2Cl2. Pha
hữu cơ đƣợc rửa với nƣớc cho đến mơi trƣờng trung tính, làm khan bằng
MgSO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm nhận đƣợc sản phẩm thô. Sản
phẩm thô đƣợc làm sạch bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải
Hexan:EtOAc (7:3) thu đƣợc 9,4g chất 2 với hiệu suất 85,71%, và làm ngay
bƣớc tiếp theo mà không cần phải tinh chế.
2.2.2. Tổng hợp chất trung gian (4).

Hoà tan 10g (49,03mmol) chất 2 và (7,07ml) pyridin trong dung mơi
dichloromethan, sau đó làm lạnh đến 00C và cho (9,8g) 4-(2aminoethyl)benzenesulfonamide (3) vào hỗn hợp phản ứng. Phản ứng đƣợc
tiến hành khuấy ở nhiệt độ 600C, trong khoảng 8h. Khi kết thúc phản ứng,
hỗn hợp đƣợc thêm 500ml nƣớc rồi chiết với dichloroethan. Pha hữu cơ đƣợc
rửa bằng nƣớc, làm khan bằng MgSO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm
nhận đƣợc sản phẩm thô. Sản phẩm thô đƣợc làm sạch bằng sắc ký cột silica
gel với hệ dung môi rửa giải Hexan:EtOAc (6:4) thu đƣợc 16,2g chất 4 với
hiệu suất 90%.

1

H-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 8,25 (1H, m, N-H); 7,76 (2H, d,

J=8,5Hz, H-9 và H-13); 7,64 (1H, d, J=3Hz, H-18); 7,51-7,48 (1H, dd, J=3Hz
và 9Hz, H-20); 7,45 (2H, d, J=8,5Hz, H-10 và 12); 7,28 (2H, bs, NH2); 7,16
(1H, d, J=9Hz, H-21); 3,81 (3H, s, OMe); 3,55-3,51 (2H, m, H-15); 2,93-2,90
(2H, m, H-14).
13

C-NMR (500MHz, DMSO): δ (ppm) 163,56 (C-9); 155,65 (C-15);

143,58 (C-4); 142,09 (C-1); 131,45 (C-13); 129,45 (C-11); 129,12(C-3 và 5);

13


125,65 (C-2 và 6); 124,79 (C-12); 124,29 (C-10); 114,13 (C-14); 56,23
(OMe); 54,83 (C-8); 34,55 (C-7).
EI-MS m/z: [M ]+ 368
CTPT: C16H17ClN2O4S
2.2.3. Tổng hợp Glibenclamide (5).

Cho 100g (271,7mmol) chất 4 và (10,68g) Na2CO3 trong 1000 ml dung
môi aceton. (33,9g) cyclohexyl isocyanat đƣợc thêm vào ở 250C, sau đó, phản
ứng đƣợc khuấy ở nhiệt đợ phịng, trong 36h. Kết thúc phản ứng hỗn hợp
đƣợc thêm 5000ml nƣớc cất rồi chiết với CHCl3. Pha hữu cơ đƣợc làm khan
bằng MgSO4, cất loại dung môi dƣới áp suất giảm, nhận đƣợc sản phẩm thô 5
(110g) với hiệu suất 82,11%.
Sản phẩm là chất rắn màu trắng, điểm chảy: 169-1700C.

1

H-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 7,93 (2H, d, J=8,5Hz, H-9 và 13);

7,83 (1H, s, H-18); 7,52 (2H, d, J=8Hz, H-10 và 12); 7,47 (1H, d, J=9Hz, H20); 7,11 (1H, d, J=9Hz, H-21); 3,85 (3H, s, OMe); 3,73-3,70 (2H, m, H-15);
3,43-3,42 (1H, m, H-1); 3,066-3,038 (2H, t, J=7Hz, H-14); 1,78-1,17 (10H,
m, H-1, 2, 3, 4, 5, 6 vùng no).
13

C-NMR (500MHz, MeOD): δ (ppm) 166,6 (C-7); 159,9 (C-16); 157,7

(C-22); 144,1 (C-11); 133,4 (C-8); 131,5 (C-20); 129,9 (C-10 và 12); 128,1
(C-9, 13 và 18); 127,1 (C-19); 124,8 (C-17); 114,8 (C-21); 57,1 (OCH3); 41,8
(C-1); 36,0 (C-15); 34,7 (C-4); 26,7 (C-2); 26,7 (C-6); 26 (C-3); 25,9 (C-5).
EI-MS m/z: [M]+ 495
CTPT: C23H28ClN3O5S
14


2.2.4. Phân tích hàm lƣợng sản phẩm glibenclamide (5) theo tiêu chuẩn
dƣợc điển châu Âu 2002.
a.Phƣơng pháp thực hiện:
Hòa tan 0.400g Glibenclamide trong 100ml C2H5OH (gọi là dung dịch
R) ở nhiệt độ 40-500C. Thêm vài giọt phenolphthalein vào dung dịch R làm
chất hiển thị. Chuẩn độ bằng NaOH 0,1M cho đến khi màu đỏ xuất hiện.
1ml NaOH 0.1M tƣơng ứng với 49.40mg của Glibenclamide
b. Chuẩn bị mẫu phân tích:
P1 = 0.4092

P4 = 0.4052

P7 = 0.4021

P2 = 0.4003

P5 = 0.4013

P8 = 0.4030

P3 = 0.4005

P6 = 0.4007

P9 = 0.4015

Áp dụng công thức:
HL 

V  49.40  10 3
 100%
P

HL1 = 100.1

HL4 = 100.05 HL7 = 100.02

HL2 = 99.8

HL5 = 100

HL8 = 100.03

HL3 = 99.8

HL6 = 99.8

HL9 = 100

c.Kết quả trung bình sau khi phân tích.
HL = 99.95%
Nhƣ vậy sản phẩm glibenclamide đạt hàm lƣợng theo tiêu chuẩn dƣợc
điển châu Âu 2002.
2.3.Tổng hợp Metformin hydrochloride.

15


1
CH 3
1'
H3 C

N

H
N

2

NH

3

NH2

.HCl

NH

(8)
Hỗn hợp của dimethylamine hydrochloride (50g; 0,61mol) và dicyano
diamide (51,5g; 0,61mol) đƣợc đun trực tiếp ở nhiệt độ 140oC trong 6h nhận
đƣợc sản phẩm thô dạng đông đặc màu trắng.Hỗn hợp phản ứng đƣợc làm
lạnh bằng nƣớc đá đƣa về nhiệt đợ phịng.Sản phẩm thơ đƣợc tinh chế trong
dung mơi thích hợp thu đƣợc sản phẩm sạch metformin hydrochloride với
hiệu suất phản ứng là 70%.
Sản phẩm là tinh thể màu trắng, nhiệt đợ nóng chảy: 225-2260C.
1

H-NMR (500 MHz, DMSO), δ (ppm): 2,91 (6H, s, 2x CH3).

13

C-NMR (125MHz, DMSO), δ (ppm): 160,0 (C-3); 158,3 (C-2); 37,4

(2CH3).
EI-MS : m/z: [M-HCl]+ = 129
CTPT: C4H11N5.HCl
2.3.1. Nghiên cứu kết tinh metformin hydrochloride.
2.3.1.1. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung mơi Aceton.

Hịa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong aceton (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu nhƣng khó tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để loại bỏ
các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung môi. Dịch lọc đƣợc làm
nguội tại nhiệt độ phịng, sau đó làm lạnh tại nhiệt đợ âm (-10) † (-20oC)
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng
kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản
phẩm metformin hydrochloride 12g. Dịch lọc aceton tiếp tục đƣợc cô bớt
dung môi và kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 3g
sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 15g sản phẩm với hiệu suất kết
tinh là 30%.
16


2.3.1.2. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung mơi MeOH.
Hịa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong MeOH (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu đến tan, sản phẩm tan hoàn toàn trong dung mơi
MeOH. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ các tạp chất, dịch lọc đƣợc làm
nguội tại nhiệt đợ phịng, sau đó làm lạnh tại nhiệt đợ âm (-10) † (-20oC)
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng
kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc bằng phễu lọc thủy tinh,
hút khô sản phẩm thu đƣợc sản phẩm metformin hydrochloride 33g. Dịch lọc
MeOH đƣợc cô bớt dung môi tiếp tục đƣợc kết tinh lần thứ 2 lặp lại theo qui
trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 8g sản phẩm. Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là
41g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 82%.
2.3.1.3. Kết tinh metformin hydrochloride trong dung mơi EtOH.
Hịa tan sản phẩm metformin hydrochloride (50g) trong EtOH (500ml),
hỗn hợp đƣợc đun hồi lƣu cho đến tan. Dung dịch đƣợc lọc nóng để lọai bỏ
các tạp chất và sản phẩm chƣa tan hết trong dung mơi. Dịch lọc đƣợc làm
ng̣i tại nhiệt đợ phịng, sau đó làm lạnh tại nhiệt đợ âm (-10) † (-20oC)
trong 24h để kết tinh sản phẩm. Sau 24h, thấy sản phẩm tinh thể màu trắng

kết tinh xuất hiện trong dung dịch. Tinh thể đƣợc lọc và hút khô thu đƣợc sản
phẩm metformin hydrochloride 18g. Dịch lọc EtOH tiếp tục đƣợc kết tinh lại
sản phẩm lần thứ 2 lặp lại theo qui trình nhƣ trên thu thêm đƣợc 6g sản phẩm.
Tổng hai lần kết tinh thu đƣợc là 24g sản phẩm với hiệu suất kết tinh là 48%.
Nhƣ vậy, dung môi MeOH phù hợp để kết tinh sản phẩm metformin
hydrocholoride. Sản phẩm metformin hydrochloride đƣợc kết tinh lại trong
MeOH 3 lần nhận đƣợc sản phẩm có đợ sạch 99,8% ( đƣợc đánh giá bằng
phƣơng pháp HPLC-MS).
2.3.2.Nghiên cứu xác định độc tính cấp (LD50) của metformine
hydrochloride.
Liều độc LD50 đƣợc nghiên cứu tại Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học
Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
17