(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm linh chi ganoderma lucidum (leyss ex fr ) karst

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH
HỌC CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM
(LEYSS EX. FR.) KARST

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

PHẠM THANH BÌNH

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM
(LEYSS EX. FR.) KARST
Chuyên ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 60440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN: 1. TS. NGUYỄN TIẾN ĐẠT
2. TS. TRẦN MẠNH TRÍ

Hà nội – Năm 2018

1


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân,
tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất nhiều từ gia đình, cá nhân và tập thể.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Tiến Đạt – Trung
tâm Nghiên cứu và Chuyển giao công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, TS. Trần Mạnh Trí – giảng viên trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã chỉ ra
hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực
hiện luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong Khoa Hóa học và Phòng sau
đại học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã đào tạo và giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã cổ vũ
động viên tơi hồn thành tốt luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn!

2


LỜI CAM ĐOAN
Tơi là: Phạm Thanh Bình
Học viên cao học: Chun ngành Hóa hữu cơ – K26
Tơi xin cam đoan luận văn thạc sĩ này là một cơng trình nghiên cứu này là trung
thực và chưa từng được sử dụng trong bất kì cơng trình nào khác.
Các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được chính bản thân tơi tiến
hành thí nghiệm tại phịng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam với sự đồng ý hướng dẫn của TS. Nguyễn Tiến Đạt và TS.
Trần Mạnh Trí.
Các số liệu phục vụ cho phân tích, nhận xét đánh giá được tơi thu thập từ các
nguồn có ghi rõ trong tài liệu tham khảo.

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phạm Thanh Bình

3


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................. 2
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................... 3
MỤC LỤC ....................................................................................................................... 4
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................................... 6
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................................ 6
DANH MỤC VIẾT TẮT ............................................................................................... 8
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 9
Chương 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 10
1.1.
Đặc điểm thực vật .......................................................................................... 10
1.2.
Giới thiệu về nấm Linh chi ............................................................................ 10
1.2.1. Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi ........................................................ 13
1.2.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi ........................................................ 13
1.2.3. Tác dụng dược lý.......................................................................................... 20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 23
2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................... 23

2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 23
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc ........................................................................... 23
2.4. Phương pháp thử hoạt tính .................................................................................. 24
2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase ............................... 24
2.4.2. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ........................... 26
2.4.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm ....................................................... 28
Chương 3. THỰC NGHIỆM ....................................................................................... 30
3.1. Xử lý mẫu nghiên cứu: ........................................................................................ 30
3.2. Quy trình phân lập các chất sạch ........................................................................ 30
3.3. Thơng số hóa lý các hợp chất phân lập được ...................................................... 32
3.3.1. Hợp chất 1 (GL-1): ergosterol...................................................................... 32
3.3.2. Hợp chất 2 (GL-2): ergosterol peroxide ...................................................... 32
3.3.3. Hợp chất 3 (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one ........... 33
3.3.4. Hợp chất 4 (GL-4): ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) .............................................................................................................. 33
3.3.5. Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one .. 34

4


3.3.6. Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo
5α-lannost-8-en-26-oic acid) .................................................................................. 34
3.3.7. Hợp chất 7 (GL-7): ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid). .................................................................... 35
3.3.8. Hợp chất 8 (GL-8): ganoderic acid C .......................................................... 35
3.3.9. Hợp chất 9 (GL-9): ganodermadiol (lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) .. 36
3.3.10. Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate ........................................................................... 36
3.4. Thử hoạt tính sinh học của 10 hợp chất sạch phân lập được từ nấm Linh chi (G.
lucidum). ..................................................................................................................... 37
3.4.1. Thử hoạt tính ức chế enzyme α-amylase ..................................................... 37
3.4.2. Thử hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ................................................ 37
3.4.3. Thử hoạt kháng viêm ................................................................................... 37

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 39
4.1. Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ nấm Linh chi. .......................................... 39
4.1.1. Hợp chất 1: (GL-1): ergosterol ................................................................... 39
4.1.2. Hợp chất 2: (GL-2): ergosterol peroxide ..................................................... 43
4.1.3. Hợp chất 3: (GL-3): 3β,26-dihydroxy-5α-lanosta-8,24-dien-11-one .......... 47
4.1.4. Hợp chất 4 (GL-4): Ganoderic aldehyde A (3-hydroxy-11-oxolanosta-8,24dien-26-al) .............................................................................................................. 50
4.1.5. Hợp chất 5 (GL-5): 3β,24S,25S,26-tetrahydroxy-5α-lanosta-8-en-11-one .. 53
4.1.6. Hợp chất 6 (GL-6): ganoderma acid AM1 (3β-hdroxy-7,11,15,23-tetraoxo
5α-lannost-8-en-26-oic acid) .................................................................................. 60
4.1.7. Hợp chất 7 (GL-7): Ganoderic acid C6 (3β,12β-dihydroxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanost-8-en-26-oic acid). .................................................................... 63
4.1.8. Hợp chất 8 (GL-8): ganoderic acid C .......................................................... 67
4.1.9. Hợp chất 9 (GL-9): Ganodermadiol (Lanosta-7,9(11),24-triene-3,26-diol) 70
4.1.10. Hợp chất 10 (GL-10): methyl 3β-hydroxy-12β-acetoxy-7,11,15,23tetraoxo-5α-lanosta-8-en-26-oate ........................................................................... 73
4.2. Hoạt tính sinh học các chất phân lập được từ nấm Linh chi G. lucidum ............ 77
4.2.1. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase ............................................................ 77
4.2.2. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase ....................................................... 78
4.2.3. Hoạt tính kháng viêm ................................................................................... 79
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 80
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 81
CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ ................................................................................... 85
5


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Bảng số liệu 13C NMR của các hợp chất sạch từ nấm Linh chi (G. lucidum) 42
Bảng 2. Số liệu phổ hợp chất GL-5 ................................................................................ 54
Bảng 3. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase. ................................................................ 77
Bảng 4. Kết quả thử hoạt tính enzyme α-glucosidase. ................................................... 78
Bảng 5. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm .................................................................... 79
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Một số lồi nấm thuộc chi Ganoderma ............................................................. 11
Hình 2. Mẫu nấm linh chi (G. lucidum Karst) ............................................................... 30
Hình 3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm Linh chi (G. lucidum) ............................. 31
Hình 4. Cấu trúc hợp chất GL-1 ..................................................................................... 39
Hình 5. Phổ 1H của hợp chất GL-1 ................................................................................ 39
Hình 6. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-1 ..................................................................... 40
Hình 7. Phổ DEPT của hợp chất GL-1 .......................................................................... 41
Hình 8. Phổ MS của hợp chất GL-1 ............................................................................... 41
Hình 9. Cấu trúc hợp chất GL-2 ..................................................................................... 43
Hình 10. Phổ 1H NMR của hợp chất GL-2 .................................................................... 44
Hình 11. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-2 ................................................................... 44
Hình 12. Phổ DEPT của hợp chất GL-2 ........................................................................ 45
Hình 13. Phổ HSQC của hợp chất GL-2 ........................................................................ 45
Hình 14. Phổ HMBC của hợp chất GL-2 ....................................................................... 46
Hình 15. Phổ MS hợp chất GL-2 ................................................................................... 46
Hình 16. Cấu trúc hợp chất GL-3 ................................................................................... 47
Hình 17. Phổ 1H NMR của hợp chất GL-3 .................................................................... 48
Hình 18. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-3 ................................................................... 48
Hình 19. Phổ DEPT của hợp chất GL-3 ........................................................................ 49
Hình 20. Phổ MS của hợp chất GL-3 ............................................................................. 49
Hình 21. Cấu trúc hợp chất GL-4 ................................................................................... 50
Hình 22. Phổ 1HNMR của hợp chất GL-4 ..................................................................... 51
Hình 23. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-4 ................................................................... 51
6


Hình 24. Phổ DEPT của hợp chất GL-4 ........................................................................ 52
Hình 25. Phổ MS của hợp chất GL-4 ............................................................................. 52
Hình 26. Cấu trúc hợp chất GL-5 ................................................................................... 56
Hình 27. Phổ 1H của hợp chất GL-5 .............................................................................. 56

Hình 28. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-5 ................................................................... 57
Hình 29. Phổ DEPT của hợp chất GL-5 ........................................................................ 57
Hình 30. Phổ HSQC của hợp chất GL-5 ........................................................................ 58
Hình 31. Phổ HMBC của hợp chất GL-5 ....................................................................... 58
Hình 32. Phổ COSY của hợp chất GL-5 ........................................................................ 59
Hình 33. Phổ NOESY của hợp chất GL-5 ..................................................................... 59
Hình 40. Cấu trúc của hợp chất GL-7 ............................................................................ 63
Hình 41. Phổ 1H của hợp chất GL-7 .............................................................................. 64
Hình 42. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-7 ................................................................... 65
Hình 43. Phổ DEPT của hợp chất GL-7 ........................................................................ 65
Hình 44. Phổ HSQC của hợp chất GL-7 ........................................................................ 66
Hình 45. Phổ HMBC của hợp chất GL-7 ....................................................................... 66
Hình 46. Phổ MS của hợp chất GL-7 ............................................................................. 67
Hình 47. Cấu trúc của hợp chất GL-8 ............................................................................ 67
Hình 48. Phổ 1H của hợp chất GL-8 .............................................................................. 68
Hình 49. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-8 ................................................................... 69
Hình 50. Phổ DEPT của hợp chất GL-8 ........................................................................ 69
Hình 51. Phổ MS của hợp chất GL-8 ............................................................................. 70
Hình 52. Cấu trúc hợp chất GL-9 ................................................................................... 70
Hình 53. Phổ 1H của hợp chất GL-9 .............................................................................. 71
Hình 54. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-9 ................................................................... 72
Hình 55. Phổ DEPT của hợp chất GL-9 ........................................................................ 72
Hình 56. Phổ MS của hợp chất GL-9 ............................................................................. 73
Hình 57. Cấu trúc của hợp chất GL-10 .......................................................................... 73
Hình 58. Phổ 1H của hợp chất GL-10 ............................................................................ 75
Hình 59. Phổ 13C NMR của hợp chất GL-10 ................................................................. 75
Hình 60. Phổ DEPT của hợp chất GL-10 ...................................................................... 76
Hình 61. Phổ MS của hợp chất GL-10 ........................................................................... 76
7

DANH MỤC VIẾT TẮT
Kí hiệu
13
C-NMR

Tiếng Anh

Diễn giải

Carbon-13 nuclear magnetic
resonance spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
cacbon 13

1

Proton Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân proton
Resonance
human lung adenocarcinoma Tế bào ung thư phổi ở người
cell
Column chromatography
Sắc kí cột

H-NMR

A-549
CC
DEPT

Distortionless enhancement
by polarisation transfer

Phổ DEPT

DMSO

Dimethylsulfoxide

(CH3)2SO

HMBC

Heteronuclear mutiple Bond Tương tác dị hạt nhân qua nhiều
Connectivity
liên kết

HSQC

Heteronuclear
quantum coherence

single-

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1
liên kết

IC50

Inhibitory concentration at
50%

Nồng độ ức chế 50% đối tượng
thử nghiệm

RP-18
SRB
TMS

Reserve phase C-18
Sulforhodamine B
Tetramethylsilane

Chất hấp phụ pha đảo C-18
Sulforhodamine B
Tetramethylsilane

8


ĐẶT VẤN ĐỀ
Hóa học các hợp chất thiên nhiên, một bộ phận của chuyên ngành hóa hữu cơ,
đang có xu hướng phát triển mạnh mẽ. Thế giới thực vật là nguồn tài nguyên vô cùng
phong phú và quý giá về những hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học. Xu hướng đi
sâu nghiên cứu và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài
thực vật làm dược phẩm chữa bệnh đang ngày càng thu hút được sự quan tâm của các
nhà khoa học bởi ưu điểm của chúng là độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ
thể hơn so với các dược phẩm tổng hợp.
Việt Nam có hệ thực vật đa dạng và phong phú do nằm trong vùng khí hậu nhiệt

đới gió mùa. Theo ước tính, nước ta có khoảng gần 13.000 lồi thực vật bậc cao trong
đó có khoảng hơn 5.000 lồi được sử dụng làm thuốc. Nhân dân ta từ lâu đã biết sử dụng
các loại cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh. Bắt nguồn từ kinh nghiệm dân
gian, cùng với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, đến nay rất nhiều dược
liệu đã được nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trong cuốc sống và khoa học.
Nấm Linh chi là một trong những dược liệu quý, cây thuốc quan trọng tại các
nước Đông Nam Á. Trong những năm gần đây, các nhóm nghiên cứu trong và ngồi
nước quan tâm thực hiện và bước đầu đã thu được nhiều kết quả khả quan. Các công bố
trong nước cũng như quốc tế chỉ ra rằng, thành phần hóa học chính trong nấm Linh chi
có phổ hoạt tính sinh học rộng phải kể đến như: điều hòa hệ miễn dịch, kháng khuẩn,
kháng viêm, giảm mỡ máu, hạ huyết áp, hoạt tính chống oxy hóa, chống ung thư… Xuất
phát từ những lợi ích của nấm Linh chi, các hoạt tính sinh học của nó mang lại cho con
người, cũng như để hiểu sâu hơn và thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm
Linh chi, đã thúc đẩy tác giả tiến hành nghiên cứu đề tài này, nhằm góp phần nhỏ của
mình vào việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây nấm Linh
chi nhằm mục đích phát hiện các dược tố mới, phục vụ công cuộc bảo vệ sức khỏe cộng
đồng, chúng tôi lựa chọn đề tài:
“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của nấm Linh chi
Ganoderma lucidum (Leyss ex. Fr.) Karst”.
Mục tiêu của đề tài là thực hiện các nội dung sau:
1. Phân lập các hợp chất từ cây nấm Linh chi (G. lucidum);
2. Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây nấm Linh chi (G. lucidum);
3. Đánh giá một số hoạt tính các hợp chất phân lập được.
9


Chương 1: TỔNG QUAN

1.1.

Đặc điểm thực vật
Theo hệ thống phân loại thực vật Donk. (1948), cây nấm Linh chi (Ganoderma

lucidum (Leyss ex. Fr.) Kars), họ Nấm lim (Ganodermataceae) có vị trí phân loại như
sau:
Giới: Nấm (Fungi)
Ngành: Nấm đảm (Basidiomycota)
Lớp: Nấm đảm (Agaricoycetes)
Bộ: Nấm đa tầng (Polyporales)
Họ: Nấm lim (Ganodermataceae)
Chi: Ganoderma
Loài: G. lucidum (Leyss ex. Fr.) Kars [7].

1.2.

Giới thiệu về nấm Linh chi
Các nhóm nấm có tính chất dược lý q được xác định là thuộc họ

Ganodermataceae. Họ Ganodermataceae (1948) có khoảng 171 loài với các chi như:
Amauroderma M., Elfvingia K., Ganoderma K., Haddowia S., Huhreya S. và
Magoderma S., trong đó nổi bật là 2 chi Ganoderma và Amauroderma [8, 9].
- Chi Ganoderma P, Karst. (1881): anamorph Thermophymatospora, có khoảng
80 lồi, được phân bố rộng đặc biệt là ở vùng nhiệt đới.
+ G. australe: sống trên các thân gỗ mục, nấm dược liệu.
+ G. applanatum: làm mục cây gỗ, nấm dược liệu.
+ G. lucidum: gây mục cây, nấm dược liệu.
+ G. philipii (G. pseudoferreum): kí sinh trên dễ của ca cao, cà phê, cao su…
+ G. orbiformum (G.boniense): kí sinh trên rễ của các cây họ cau dừa.
- Chi Amauroderma Murrill (1905): có khoảng 30 lồi, phân bố rộng đặc biệt là
ở vùng nhiệt đới. Tuy nhiên nấm Linh chi (G. lucidum) được nghiên cứu nhiều nhất bởi

đặc tính dược lý và lợi ích kinh tế mà chúng đem lại.
Nấm Linh chi có tên khoa học là Ganoderma lucidum (Leyss. Ex. Fr) Karst. Trên
thế giới có khoảng 80 lồi khác nhau và phân bố rộng ở các vùng nhiệt đới, cận nhiệt
đới và ơn đới. Nấm Linh chi có nhiều tên gọi khác nhau như Bất lão, Chi linh, Đoạn
10


G. tornatum (Pers.) Bres

G. steyaertanum B.J. Sm. & Sivasith

G. amboinense (Lam.) Pat.

G. australe (Fr.) Pat.

G. sinense J.D. Zhao
G. lobatum (Schwein.) G.F. Atk
Hình 1. Một số lồi nấm thuộc chi Ganoderma
11


thảo, Nấm lim… Nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khống vi lượng, trong đó có một
số khống tố như: selenium, germanium… Nấm Linh chi được chứng minh là một loại
thảo dược để chống ung thư, lão hóa, xơ vữa thành mạch, viêm gan, bảo vệ cấu trúc nhân
tế bào.
- Đặc điểm hình thái: Quả thể có cuống dài, ngắn hoặc hầu như khơng cuống và
mũ đính lệch hay đính bên màu nâu đỏ, bóng nhống. Mũ nấm mới hình thành có dạng
cục lồi, trịn; sau khi phát triển thành dạng thận, dạng bán cầu, dạng quạt, có khi trịn.
Mặt mũ nấm có vân trịn đồng tâm, lượn sóng nhiều hay ít, mép nấm mỏng hoặc hơi tù
lượn sóng. Mũ nấm sinh ra có màu trắng có sắc thái vàng lưu huỳnh sau chuyển sang

vàng rỉ sắt, nâu, nâu đỏ, nâu hồng tím… tạo nên một lớp vỏ bóng nhống như quét sơn
hoặc vecni. Kích thước mũ nấm 2- 2,5  3- 30 cm; dày 0,5- 1,5 cm. Thịt nấm bằng chất
lie cứng, khi non màu trắng, sau đó chuyển sang màu vàng nhạt, màu nâu vàng. Mô đồng
nhất, không phan tầng. Hệ sợi dimitric gồm sợi không vách ngang và sợi bện, kích thước
từ 2 - 7μm, màng dày, nội chất hầu như không màu, trong suốt. Bào tầng dạng ống nhỏ,
mỗi milimet có 4 -5 (6) ống, miệng ống nấm tròn đều, ống nấm sâu 0,2 – 0,7 cm. Miệng
ống nấm khi non màu trắng, khi già chuyển sang màu vàng nhạt. Bào tử hình trứng nhọn
một đầu, kích thước 5 – 11,5 μm



8,5 – 11,5 μm, màng hai lớp (lớp ngồi nhẵn, khơng

màu, lớp trong có gai nhẹ), có màu nâu gỉ sắt. Đảm đơn bào, hình chùy ngắn, kích thước
7 - 10 μm



12 -14 μm, màng là một lớp mỏng, nội chất không màu trong suốt. Cuống

nấm ngắn, thường đính bên phần lõm của mũ nấm. Cuống nấm có màu sắc như màu mũ
nấm và có lớp vỏ bóng lống, thường có hình trụ trịn hay hơi dẹt, kích thước 0,5 – 1,5
(2) cm



3 – 17 cm. Mô của cuống nấm và mũ đồng nhất [6].

- Chi nấm Linh chi (Ganodermataceae) được đặt tên khoa học bởi Karsten vào
năm 1881. Hiện nay, nhờ hệ thống phân tích sinh hóa bằng cách sử dụng trình tự thơng

tin DNA có nguồn gốc rDNA, ty thể SSU đã làm rõ mối quan hệ giữa các loài nấm Linh
chi và chia thành 6 nhóm đơn ngành [3]:
+ Nhóm nấm Linh chi G. applanatum
+ Nhóm nấm Linh chi G. tsugae
+ Nhóm nấm Linh chi Châu Á G. lucidum
12


+ Nhóm nấm Linh chi G. merrdithiae
+ Nhóm nấm Linh chi G. resinaceum.
Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh Linh chi có tác dụng điều trị bệnh như: rối
loạn tiền đình, tăng huyết áp, viêm phổi, tiểu đường, tăng hàm lượng cholesterol trong
máu [7, 29].
1.2.1. Phân bố và sinh thái của nấm Linh chi
Nấm Linh chi phân bố đa dạng và phong phú nhất ở các khu rừng nhiệt đới và
cận nhiệt đới. Ngồi ra chúng cịn sinh trưởng và phát triển ở khu vực Bắc Mỹ. Ở Việt
Nam, nấm Linh chi có thể tìm thấy ở hầu hết các tỉnh vùng núi từ Lào Cai (Sa Pa) đến
Lâm Đồng (Lang Biang). Ở các vùng rừng trước kia có nhiều cây lim khác đã bị khai
thác, trên gốc hoặc phần thân cành cịn lại đều có thể thấy nấm này mọc, như vùng thuộc
lâm trường Hương Sơn (Hà Tĩnh), tỉnh Thanh Hoá, Tam Đảo (Vĩnh Phúc)…
Nấm Linh chi thường hoại sinh trên gỗ mục hoặc trên đất ngay ở nơi có gốc cây
gỗ đã mục, thuộc đại diện của các họ Caesalpiniaceae (Lim, Lim xẹt, Muồng đen, Me…)
và Fagaceae (một số lồi thuộc các chi Quercus, Lythocarpus, Castanopsis…). Mơi
trường sống của nấm thường ở rừng kín thường xanh ẩm, độ cao từ vài chục mét đến
nghìn mét [2].
1.2.2. Thành phần hóa học của nấm Linh chi
Nấm Linh chi đã được dùng làm thuốc từ lâu và đã có nhiều cơng bố về thành
phân hóa học và hoạt tính sinh học. Trong nấm Linh chi chứa nhiều thành phần khác
nhau, nhưng thành phân hóa học chủ yếu trong cây chứa hàm lượng lớn lớp chất
triterpenoid, sau đó là polysaccharide, hợp chất phenolic, peptid và protein.



Triterpenoid
Terpenoid là nhóm chất tự nhiên, có độ dài mạch carbon là bội số của 5 như:

menthol (monoterpene) và β-caroten (tetraterpene). Phần lớn các terpenoid có cấu trúc
mạch vòng. Triterpenoid là một phân lớp của terpenoid và có cơng thức tổng qt C 30H48,
cấu trúc hố học của các triterpenoid có thể là mạch hở, 3, 4, hoặc 5 vòng với 33 khung
carbon cơ bản. Trong nấm Linh chi, cấu trúc hố học của các triterpene có dạng
lanostane, tham gia vào quá trình tổng hợp nên lanosterol (1), quá trình sinh tổng hợp
13


giúp hình thành nên các squalen mạch vịng. Những triterpenoid đầu tiên được Kubota
T. và cộng sự đã phân tách từ nấm Linh chi là acid ganoderic A (2) và acid ganoderic B
(3) [20].

Những nghiên cứu sau đó cũng đã phân lập được các hợp chất có khung lanostane
như: n-butyl ganoderate H (n-butyl 12β-aceroxy-3β-hydroxy-7,11,15,23-tetraoxo-5αlanost-8-en-26-oate) (4) [21], ganolucidic acid A (5), methyl ganolucidate A (methyl
15α-hydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8-en-26-oate)
3,7,11,15,23-pentaoxo-5α-lanost-8-en-26-oate (7) [11].

14

(6)

và

ethyl

12β-acetoxy-


Acid ganoderic δ ((23S)-7α,15α,23β-trihydroxy-3,11-dioxo-5α-lanost-8,24(E)dien-26-oic acid) (8), acid ganoderic ε ((23S)-3β,7β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5αlanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (9), acid ganoderic ζ ((23S)-3β,23β-trihydroxy7,11,15-trioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (10) và acid ganoderic η ((23S)3β,7β,12β,23β-trihydroxy-11,15-dioxo-5α-lanost-8,24(E)-dien-26-oic acid) (11) [24].

Komoda Y. và cộng sự đã phân lập được các hợp chất từ nấm Linh chi vào năm
1985: (20E)-7β,15α-dihydroxy-3,11,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (12),
(20E)-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (13), (20E)3β,7β,15α-trihydroxy-11,23-dioxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (14), (20E)-7βhydroxy-3,11,15,23-tetraoxo-5α-lanost-8,20-dien-26-oic acid (15) [18].

15


3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (16), 3β,7βdihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid methyl ester (17), 12βacetoxy-3β,7β-dihydroxy-11,15,23-trioxo-5α-lanost-8,16-dien-26-oic acid (18) [12].

Lanosta-7,9(11),24-trien-15α-acetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic
lanosta-7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α-hydroxy-23-oxo-26-oic

acid
acid

(19),
(20),

lanosta-7,9(11),24-trien-3α-acetoxy-15α-hydroxy-23-oxo-26-oic acid (21), lanosta7,9(11),24-trien-3α,15α-diacetoxy-3α,22β-dihydroxy-23-oxo-26-oic acid (22) [31].

20hydroxy lucidelic acid D2 (23), 20-hydroxy lucidelic acid E2 (24), 20-hydroxy lucidelic
acid F (25) và 20-hydroxy lucidelic acid N (26) [8].
16

Nghiên cứu mới gần đây về cây G. lucidum của nhóm nghiên cứu người Trung
Quốc Chen B. và các cộng sự đã phân lập được 81 hợp chất sạch triterpenoid và
meroterpenoid, trong đó có 8 hợp chất mới và 73 hợp chất đã biết. Sau đây là một số hợp
chất có trong báo cáo: Ganolucinins A (27), ganomycin J (28), ganomycin I (29) và
ganoleuconin P(30) [10].

17


Ganomastenol A (31), ganomastenol B (32), ganomastenol C (33) và
ganomastenol D (34) [30].

Yoshiyuki Mizushin và các cộng sự đã phân lập từ quả thể nấm được các hợp chất
acid lucidenic O (35), lucidenic lacton (36) từ G. lucidum [25].
O

COOH
H

O

H

O

OH
HO

H
CH2OH

OH

O

HOH2C

OH
HO

H

35

OH

36

Với những nghiên cứu trên cho thấy tất cả chúng đều là dẫn xuất của lanosterol
như acid ganoderic, ganoderiol, ganolucidic, acid lucidenic...
 Polysaccharide
Nấm Linh chi có chứa rất nhiều polysaccharide có khối lượng phân tử lớn, các
hợp chất này mang hoạt tính sinh học và được tìm thấy trong tất cả các bộ phận của nấm
Linh chi. Hơn 200 loại polysaccharide được phân lập từ quả thể, bào tử của nấm Linh
chi [14]. Các polysaccharide có cấu tạo lập thể dạng xoắn ốc chủ yếu định vị cố định
bằng liên kết hydro, có khối lượng phân tử lớn từ vài trăm đến vài triệu. Trong quả thể
của nấm Linh chi cũng có heteropolisaccarit tan trong nước (β-glucan và glucurono-β18


glucan) được cấu tạo bởi đường D-glucose, D-galactose, D-mannose, D-xylose và Lfucose.

CH 2OH
O

CH 2
O

O

O

OH

OH
OH

OH

n

OH

n

β-1-6-ᴅ glucan
β-1-3-ᴅ glucan
 Các hợp chất phenolic
Ngoài 2 lớp hoạt chất sinh học chính của nấm Linh chi thì cịn có rất nhiều những
phân tử có hoạt tính sinh học như các terpenoid, steroid, nucleotide và phenolic. Các hợp
chất phenolic có hoạt tính sinh học và dược lý đặc biệt, hoạt tính sinh học của các hợp

chất phenolic liên quan đến khả năng tạo phức kim loại, ức chế lipoxygenase và khả
năng quét các gốc tự do. Flavonoid là một phân lớp của polyphenol có khả năng quét
gốc tự do, ức chế quá trình thuỷ phân và oxy hoá của enzyme, kháng viêm.
Trong nghiên cứu của Kim Min Young và các cộng sự đã xác định được 28 hợp
chất phenolic trong mẫu nấm bằng phương pháp HPLC, kết quả cho thấy hàm lượng
trung bình của các hợp chất phenolic là 326 µg/g, hàm lượng flavonoid là 76 µg/g [16].
 Peptid, protein
Năm 1997, Kawagishi H. và cộng sự đã phân lập được 2 protein từ các sợi nấm
(GLL-M) và quả thể (GLL-F) của nấm Linh chi. Năm 2002, nhóm nghiên cứu của Ye
đã tìm thấy ba loại protein có hoạt tính sinh học (LZP-1, LZP-2, LZP-3) từ quả thể và
bào tử của nấm Linh chi [14]. Cùng khoảng thời gian này, You và Lin đã phân lập GLPP
từ nấm Linh chi. GLPP là một phức hợp polysaccharide- protein, đã được cấu tạo từ 16
loại acid amin và 5 loại đường khác nhau (rhamnose, xylose, fructose, galactose,
glucose). Năm 2003, Sripuan T. và cộng sự đã phân lập enzyme α-glucosidase từ quả
thể nấm Linh chi. Enzyme này có khả năng thuỷ phân p–nitro-α-D-galactopyranosid,
cũng như melibiose, raffinose và stachyose [33].

19


1.2.3. Tác dụng dược lý
Từ ngày xưa, ở các nước như Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước châu Á khác
đã sử dụng nấm Linh chi để giúp tăng cường sức khoẻ và kéo dài tuổi thọ của con người.
Trong dược điển Trung Quốc xuất bản năm 2000 đã cơng bố nấm Linh chi có tác dụng
giảm căng thẳng, giảm ho và hen suyễn, được sử dụng để điều trị chóng mặt, mất ngủ…
Ngày nay nấm Linh chi cịn được biết đến với tác dụng phòng và chống ung thư, kháng
khuẩn, chống nấm, kháng virus, chống HIV, chống viêm, tăng cường khả năng miễn
dịch.
Trước những lợi ích mà nấm Linh chi đem lại thì đã có rất nhiều cơng trình nghiên
cứu về các hoạt chất của chúng, trong đó có những nhóm hoạt chất quan trọng như:

saponin triterpenoid, polysaccharide, steroid, acid amine…. Chúng có vai trị quyết định
trong điều trị các bệnh về tim mạch, gan mật, ung thư, chống oxy hoá và tăng khả năng
miễn dịch cho cơ thể.
 Phòng ngừa ung thư
Năm 2012, nghiên cứu của Teekachunhatean và các cộng sự đã chứng minh khả
năng gây độc đối với các tế bào ung thư qua các cơ chế hoạt động khác nhau như: kích
thích q trình tự chết của tế bào hay những tác động cản trở quá trình phát sinh, di
chuyển, xâm nhập và di căn của dịng tế bào ung thư biểu mơ. Vì vậy, các hoạt động
chống ung thư in vivo có thể được biểu hiện thông qua sự kết hợp giữa các triterpene với
các hợp chất có hoạt tính sinh học khác ví dụ như protein miễn dịch L.Zhi-8 [35].
 Tăng cường khả năng miễn dịch
Nhiều thành phần trong nấm Linh chi đã được chứng minh có tác dụng tăng cường
sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào lyho, các bạch cầu đơn nhân. Nghiên cứu của
Wang và các cộng sự đã chứng minh polysaccharide có trong nấm Linh chi có tác dụng
làm tăng khả năng hoạt động của các tế bào lyho T và các đại thực bào, bằng cách làm
tăng hàm lượng interleukin IL-1β, TNF-α và IL-6. Đây là những yếu tố tăng tiết
interferon α và γ, do đó chúng được cho là có tác dụng trên hệ miễn dịch [12].
 Khả năng kháng HIV
Năm 1998, Sahar và các cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính của nấm Linh chi.
Ban đầu nhóm nghiên cứu thử nghiệm cặn tổng methanol của nấm Linh chi với virut
20


HIV thấy có hoạt động trung bình để ức chế sự sản sinh HIV-1 gây ra trên dòng tế bào
MT-4 với giá trị 31.1 μg/mL và có khả năng ức chế enzyme protease của virut HIV-PR.
Sau đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập phân đoạn đó và tiến hành thử hoạt tính
với tế bào HIV-1 và enzyme của nó HIV-PR. Nhóm nghiên cứu đã phân lập được 13
hợp chất sạch. Các hợp chất đều là triterpnenoid và có tác dụng kháng virut HIV, trong
đó có 5 hợp chất thuộc họ acid ganoderic A, B, C 1, H và α [11].
 Tác dụng chống oxy hoá

Nấm Linh chi (G. lucidum) có tác dụng chống oxy hố, kích thích hoạt động của
hệ miễn dịch, làm giảm tác dụng phụ của thuốc hoá trị liệu ung thư. Năm 2005, Nguyễn
Thượng Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu tác dụng của nấm Linh chi trên chuột
nhắt trắng, nhận thấy cao nước và cao ethanol 80% chiết xuất từ nấm Linh chi có hoạt
tính chống oxy hố trên mơ hình gây viêm gan cấp bằng CCl 4 [4].
Nấm Linh chi đỏ thể hiện hoạt tính khử gốc superoxyd in vitro điển hình ở các
cao chiết EtOH và MeOH, cùng cao chiết phân đoạn n-butanol và diethyl ether. Theo
nhóm nghiên cứu của Trần Thị Văn Thi, cao triterpenoid tổng từ chiết xuất nấm Linh
chi có tác dụng chống oxy hố (ức chế 19,94 % sự tăng hàm lượng MDA so với liều 484
mg cao/ kg thể trọng chuột) [5].
 Tác dụng bảo vệ gan
Vào năm 2013, Ha và các cộng sự đã nghiên cứu cao chiết methanol và các phân
đoạn n-hexan, dichloromethane, dịch chiết methanol, cùng các hợp chất phân lập được
từ nấm Linh chi (ergosterol, ergosterol peroxyd và ganodermanontriol) có tác dụng bảo
vệ gan in vitro và vitro liên quan đến sự kích hoạt enzyme HO-1 và các yếu tố GDT kích
ứng tác dụng của protein HO-1 thơng qua sự kích hoạt yếu tố chuyển vị trong nhân tế
bào Nrf-2, trong các con đường tín hiệu PI3K/Akt và p38; làm tăng cường mức độ bảo
vệ các tế bào gan chống lại t-BHP [34].
Các polisaccarit trong nấm Linh chi có tác dụng tăng tích luỹ anbumin huyết
tương, có tác dụng bảo vệ gan và phục hồi chức năng gan, đặc biệt là điều trị viêm gan
B. Acid ganoderic R và S trong hệ sợi; acid ganoderic A trong bào tử của nấm Linh chi
có tác dụng bảo vệ gan gây ra bởi galactosamin [1].
21


 Tác dụng khác
- Tác dụng hạ huyết áp: Năm 1986, Morigiwa A. và cộng sự đã nghiên cứu dịch
chiết methanol từ quả thể của nấm Linh chi có tác dụng ức chế men chuyển có liên quan
trong việc kiểm soát tăng huyết áp. Một số acid ganoderic như acid ganoderic B, D, F,
H phân lập từ nấm Linh chi có tác dụng chống cao huyết áp, trong đó acid ganoderic F

có tác dụng mạnh nhất [26].
- Adenosin trong nấm Linh chi có tác dụng giảm kết tập tiểu cấu, phân giải
thrombin và ngăn ngừa huyết khối. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong và cộng
sự (2006) cho thấy cao EtOH nấm Linh chi ở cả 2 liều thử tương đương 10 và 20 g dược
liệu/ kg chuột có tác dụng cải thiện sự suy giảm khả năng học tập, nhận thức và sự suy
giảm khả năng ghi nhớ gây ra bởi scopolamin [4].
- Tác dụng hạ đường huyết: các glycan A, B và C phân lập từ nấm Linh chi có tác
dụng hạ đường máu rõ rệt ở chuột trắng bình thường và chuột gây đái tháo đường aloxan
[2].

22


Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu: Mẫu nấm Linh chi được thu hái tại vườn Quốc gia Chu Mom Ray
tỉnh Kontum.
Mẫu sau khi thu hái sẽ được làm mẫu tiêu bản và giám định tên khoa học bởi các
nhà thực vật học. Mẫu tươi được làm sạch, phơi khơ trong bóng râm, nghiền nhỏ và được
bảo quản cho tới khi nghiên cứu.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng
sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng tia
tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H 2SO4
10% được phun đều lên bản mỏng, rồi sấy khô từ từ bằng máy sấy nhiệt cho đến khi hiện
màu.
- Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng
tráng sẵn silica gel 60G F254 (Merck 1,05875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại hai
bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10%, sấy nóng để phát hiện vệt chất; ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng

chất; sau đó cạo lớp silica gel có chất, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh
trong dung mơi thích hợp.
- Sắc ký cột: Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là silica gel pha thường
và chất hấp phụ pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430
mesh). Chất hấp phụ pha đảo là octadecylsilyl (ODS) hoặc YMC (30-50 m, Fuji Silysia
Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.3. Phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp
xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Phổ NMR đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR
Spectrometer của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất
nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan). Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử
dụng bao gồm:
23


+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC và HMBC.
+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi: CD 3OD và CDCl3.
- Phổ khối lượng: có hai loại là phổ khối phun mù điện tử phân giải thường và phổ
khối phân giải cao:
+ Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS, LTQ Orbitrap XLTM Mass Spectrometer,
Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
+ Phổ khối phân giải thấp: máy Agilent 1260 Series Single Quadrupole LC/MS
Systems (Agilent Technologies, USA), Viện Hóa sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam.
- Ngồi ra cịn đo thêm góc quay cực và đo điểm nóng chảy:
+ Độ quay cực: Góc quay cực [α]D được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY
polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
+ Nhiệt độ nóng chảy: Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage

của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.4. Phương pháp thử hoạt tính
2.4.1. Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme α-Amylase
 Nguyên lý
Insoluble Starch Azure ⎯⎯⎯⎯⎯⎯

Soluble Coloned − Reaction Product

 Chuẩn bị
- Bước 1: Thiết bị, dụng cụ
Máy đo pH, máy khuấy từ, máy đọc Elisa phiến 96, ống Eppendoft loại 1,5 mL,
máy ủ 37oC, máy bình ổn nhiệt, máy ly tâm cho ống nghiệm nhỏ, pipet và đầu pipet các
loại.
- Bước 2: 200 mL đệm 0,05 M Tris HCl 0,01 M CaCl 2 pH 6,9.
+ Cân 1,34 g Tris và hịa tan hồn tồn vào 160 mL H 2O (được chưng cất 2 lần và
loại bỏ ion).
+ Thêm 0,22 g CaCl2 hoặc 0,3 g CaCl2.2H2O, hịa tan hồn tồn. Chuẩn bị pH 6,9
bằng 1M/2,5 M HCl. Thêm H2O cho đủ 200 mL.
24