(Luận văn thạc sĩ) sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN

-----------------------

DƢƠNG THU HƢƠNG

SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN KỊ KHÍ
Ở CÁC BỆNH NHÂN BỊ CHẢY MÁU DẠ DÀY
Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN

----------------------

DƢƠNG THU HƢƠNG

SỰ HIỆN DIỆN CỦA CÁC VI KHUẨN KỊ KHÍ Ở CÁC
BỆNH NHÂN BỊ CHẢY MÁU DẠ DÀY Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ HỒNG HẠNH

Hà Nội - 2014


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành chƣơng trình cao học và viết luận văn này, ngoài nỗ lực học tập,
nghiên cứu, tìm tịi của bản thân, tơi đã nhận đƣợc sự hƣớng dẫn, góp ý nhiệt tình của
các Q thầy cơ, những ngƣời làm công tác khoa học, cũng nhƣ của bạn bè, đồng
nghiệp, ngƣời thân.
Trƣớc tiên, tôi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS.
Nguyễn Thị Hồng Hạnh – ngƣời thầy đã tận tâm, dành rất nhiều thời gian và tâm huyết
nhiệt tình chỉ bảo, hƣớng dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn thạc sĩ này.
Qua đây, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Guillermo I. Perez-Perez, trƣờng Đại
học Tổng hợp New York vì những nhiệt tình hỗ trợ của ơng trong suốt thời gian tôi
thực hiện nghiên cứu tại Mỹ.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trƣờng Đại học Khoa học tự nhiên, Phòng
Sau đại học, cùng các thầy cơ trong Khoa Sinh học đã tận tình truyền dạy cho tôi suốt
thời gian học tập tại trƣờng.
Xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ, tạo điều
kiện để tơi hồn thành tốt khóa học.
Xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè và những ngƣời thân u đã ln động viên,
khích lệ, giúp đỡ tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Luận văn này đánh dấu một bƣớc trƣởng thành mới của riêng bản thân tơi. Mặc dù
tơi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình và năng lực của mình,
tuy nhiên khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận đƣợc những đóng góp
q báu của q thầy cơ và các bạn.
Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2014
Học viên
Dương Thu Hương

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan rằng tồn bộ những nội dung và số liệu trong luận văn này do
tôi tự nghiên cứu, khảo sát và thực hiện, bên cạnh sự giúp đỡ, hỗ trợ của các thành viên
trong nhóm nghiên cứu thuộc đề tài Nghị định thƣ hợp tác với Mỹ, và đã nhận đƣợc sự
đồng ý cho phép sử dụng những số liệu chung của nhóm nghiên cứu.
Học viên thực hiện Luận văn
Dương Thu Hương


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------ 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------------------- 3
1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI ----------------------------------- 4
1.1.1. Các Microbiota bản địa ---------------------------------------------------------- 5
1.1.2. Các Microbiota bệnh ------------------------------------------------------------- 6
1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA -------------------------- 7
1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển ----------------------------------------------------------------- 7
1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử -------------------------------------------------- 7
1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển và phƣơng pháp hiện đại --------- 9
1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI --------------------------------------------------- 9
1.3.1. Microbiota bản địa dạ dày ngƣời khỏe mạnh -------------------------------- 10
1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh -------------------------------------------- 11
1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY ---------------------------------------------- 12
1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày ------------------------------------- 12
1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày ---------------- 13
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ------------------------------------ 15
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU -------------------------------------------------------- 16
2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ---------------------------------------------------- 16

2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc ----------------------------------------------------- 16
2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ------------------------------------------------ 17
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU---------------------------------------------------- 18
2.3.1. Khám lâm sàng ------------------------------------------------------------------- 19
2.3.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm ------------------------------------------------------- 19
2.3.3. Đo pH dịch vị dạ dày ------------------------------------------------------------ 19


2.3.4. Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn ----------------------------------------- 20
2.3.5. Nhuộm Gram và quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng ------------------------ 21
2.3.6. Test Helicotest -------------------------------------------------------------------- 21
2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết --------------------------------- 21
2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân ---------------------------------------- 21
2.3.9. PCR nhân gen 23S rARN của H. pylori --------------------------------------- 22
2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn -------------------------------------- 23
2.3.11. Giải trình tự --------------------------------------------------------------------- 23
2.3.12. Định tên vi khuẩn--------------------------------------------------------------- 24
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ------------------------------------------------------------------ 25
3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN ---------------------------------------------------- 26
3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày --------------------------------------------- 26
3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân ---------------------------------- 27
3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN ----------------------------- 28
3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ -------------------------- 31
3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN --------------------------------------------------- 35
3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập -------------------------------------- 35
3.4.2. Định tên vi khuẩn ---------------------------------------------------------------- 35
KẾT LUẬN -------------------------------------------------------------------------------------- 44
KIẾN NGHỊ ------------------------------------------------------------------------------------- 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO -------------------------------------------------------------------- 46

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính ……………….. 26
Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh
nhân ………………………………………………….................................................. 30
Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn …………………………………………… 31
Bảng 4. Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm …………………………….....39
Bảng 5. Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ
dày của ngƣời bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu ……………………………... 42


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ và ngƣời già ……………….. 5
Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN ……………………………………………… 8
Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời ……………………………………… 10
Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết …………………………........ 13
Hình 5. Đĩa mơi trƣờng thạch máu dùng để ni cấy vi khuẩn ……………………... 17
Hình 6. Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ) ………………………………………….. 19
Hình 7. Hệ thống bình ni cấy kị khí …………………………………………….... 20
Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ……….. 27
Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân …………………………….. 28
Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh
nhân……………………………………………………………………………………31
Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định ban đầu giống với H. pylori ….......32
Hình 12. H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học ………………33
Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest ……………………………...33
Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori ……………..33
Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí …………………………...34
Hình 16. Một số chủng vi khuẩn đƣợc phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí ….….34
Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia ……………...35

Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN ………………………………36


MỞ ĐẦU
Biến đổi khí hậu Tồn cầu đi kèm với suy thối tài ngun, ơ nhiễm mơi trƣờng
làm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều
bệnh đã biết cũng nhƣ sự xuất hiện của nhiều bệnh mới. Đây là những thách thức lớn
nhất của nhân loại trong thế kỷ 21.
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở ngƣời trƣởng thành
- lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội và gia đình cũng nhƣ dễ
nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe nhƣ hút thuốc lá, nhậu nhẹt và
rƣợu chè. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những ngƣời 20 tuổi cũng bị chảy
máu dạ dày. Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chƣa đƣợc xác
định.
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn
tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hƣởng nặng nề đến khả năng lao động cũng
nhƣ chất lƣợng cuộc sống của ngƣời bệnh. Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều
trị. Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn là vấn đề
tranh cãi [6], [30].
Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày
với vi khuẩn Helicobacter pylori đã đƣợc thừa nhận. Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp
tính chảy máu đƣợc điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh. Tuy nhiên thực tế y học
lâm sàng đã xác nhận, có nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy
máu khơng nhiễm H. pylori, nhƣng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết
quả tốt. Vấn đề đặt ra là, ngoài H. pylori trong dạ dày ngƣời cịn có thể có các loài vi
khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chƣa biết?
Hiện tại, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có nhiều cơng trình nghiên
cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần

1

Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh. Sự hạn chế này có thể ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu
quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân. Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và
phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tơi
tiến hành đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân
bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi
khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này.
Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm:
1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí.
2. Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori của các bệnh nhân.
3. Định tên các vi khuẩn bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN.
4. Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn đƣợc phân lập qua các dữ liệu trên
Internet.

2


CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3


1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI
Microbiota đƣợc định nghĩa là quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh
thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt. Trong cơ thể ngƣời, các Microbiota gồm
khoảng 1000 loài khác nhau. Số lƣợng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng
1014 tế bào vi khuẩn, có khối lƣợng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bào cơ thể

ngƣời.
Microbiota đƣợc hình thành trong quá trình phát triển của con ngƣời, đạt cao
điểm ở tuổi trƣởng thành và thối hóa ở tuổi già. Nhƣ đã biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh
gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa với số lƣợng
lên tới 1011 vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn
nhƣ Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium
và Staphylococcus đã xuất hiện trong phân của trẻ. Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của
các Microbiota ở ngƣời trẻ và ngƣời già trên 100 tuổi [24].
Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh
tật [24]. Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đƣờng tp 2 có Microbiota đƣờng ruột bị
thối hóa. Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trị quan trọng trong cung cấp năng
lƣợng cho các tế bào biểu mô và điều khiển các đáp ứng của tế bào chủ giảm đáng kể,
trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress
oxy hóa lại tăng [54].
Cịn rất nhiều điều chƣa biết về thành phần các Microbiota của ngƣời, do
khoảng 99% các loài vi khuẩn khơng thể ni cấy đƣợc trong các phịng thí nghiệm
[12]. Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic,
Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Metagenomics cho phép xác định các lồi
vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng.
Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành
phần do các chế độ ăn uống, nhƣng mỗi ngƣời đều mang một số vi khuẩn đặc trƣng và
không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở ngƣời khỏe mạnh [36].

4


Ngƣời trẻ
24-40 tuổi

Ngƣời

Ngƣời trăm
trăm
tuổi
tuổi 99-104
99-104
tuổi
tuổi

Một số
số vi
vi
Một
khuẩn tạo
tạo
khuẩn
butyrate và
và
butyrate
loại gây
gây
loại
bệnh
bệnh

Nhiều vi
khuẩn
tạo
butyrate

Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ và ngƣời già [24]

Các Microbiota đƣợc chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại
hay không đối với con ngƣời:
- Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cƣ trú thƣờng xuyên ở mắt
và da, đƣờng hô hấp trên, đƣờng tiêu hóa trên và dƣới, đƣờng tiết niệu và sinh sản của
phụ nữ và nam giới, dịch cơ thể và máu.
- Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho ngƣời.
Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể là loài cƣ trú thƣờng xuyên,
loài vãng lai và loài đi ngang qua ổ sinh thái. Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi
sinh vật cơ hội có thể xuất hiện.
1.1.1. Các Microbiota bản địa
Microbiota của ngƣời khỏe mạnh hay còn đƣợc gọi là bản địa bao gồm các vi

5


sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở
khoang miệng, thực quản, đƣờng tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt. Các
loài vi sinh vật này giúp đỡ bảo vệ cơ thể ngƣời chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh
do:
i. ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của ngƣời.
ii. tranh giành vị trí sinh thái.
iii. tranh giành thức ăn để sống.
iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh.
Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các lồi vi sinh vật
cƣ trú thƣờng xun khơng gây hại và có mối quan hệ tƣơng hỗ với ngƣời; (ii) các vi
sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vài ngày
đến vài tuần trong cơ thể ngƣời do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cƣ trú thƣờng
xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn cơng và các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát
triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota
khác.

1.1.2. Các Microbiota bệnh
Trong điều kiện bình thƣờng, các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh
vật vãng lai cũng nhƣ các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác
hại cho con ngƣời. Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do nhƣ bị tổn
thƣơng trong các trƣờng hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét
ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đƣờng loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì...), một vài
trong số các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vãng lai và ngay đến các vi
sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thành vi sinh vật cơ hội gây bệnh.
Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh
mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng:
1. Hệ miễn dịch của con ngƣời làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển
vƣợt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể. Ví dụ Escherichia coli thƣờng sống

6


trong ruột non, một khi đi vào bàng quang sẽ gây các bệnh đƣờng tiết niệu.
2. Sự mất cân bằng của các vi sinh vật bản địa xảy ra khi các bệnh nhân dùng kháng
sinh phổ rộng.
3. Các vi sinh vật bản địa di dời vào vùng trƣớc kia chúng không ở nhƣ trƣờng trong
các vết thƣơng phẫu thuật.

1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA
1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển
Để nghiên cứu một hệ vi sinh vật, phƣơng pháp tiếp cận đầu tiên thƣờng đƣợc
sử dụng là nuôi cấy và phân lập các vi sinh vật, sau đó dựa trên các đặc điểm kiểu hình
cũng nhƣ đặc điểm hình thái, các đặc tính sinh lý, sinh hóa… mà định tên và sắp xếp
chúng vào các nhóm [38].
Trong y học, ni cấy thành công đƣợc coi là tiêu chuẩn vàng để xác định sự
có mặt của một lồi vi khuẩn nào đó trong bệnh phẩm. Mặt khác, qua ni cấy có thể

thu đƣợc các chủng vi khuẩn dùng cho các nghiên cứu hệ gen vi khuẩn, xác định tính
kháng thuốc của vi khuẩn...
1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử
Vào những năm 1960, các nhà khoa học chú ý đến gen 16S rARN vì chúng bảo
tồn cao ở các lồi vi khuẩn và cổ khuẩn [20]. Các nghiên cứu cho thấy, đột biến của
gen 16S rARN xảy ra với tần số thấp [57]. Ngồi ra, các nhà khoa học cịn phát hiện
trên gen 16S rARN có một vùng riêng đặc thù cho vi khuẩn và một vùng chung đặc
trƣng cho tất cả các sinh vật sống. Gen 16SrARN còn chứa 9 vùng siêu biến, ký hiệu
V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7, V8 và V9 cung cấp các tín hiệu để định danh vi khuẩn.
Vùng siêu biến VI có nghĩa trong phân loại.
Dựa trên tính chất này, ngƣời ta thiết kế một vài cặp mồi để khuếch đại gen 16S
rARN từ bất cứ loài vi khuẩn nào [19]. Sản phẩm PCR là một đoạn ADN có phân tử
lƣợng khoảng 1,5 kb. Phân tích, so sánh trình tự của gen 16S rARN của một chủng vi

7


khuẩn các gen đã biết trên Genbank cung cấp là cơ sở để xác định tên của chủng cũng
nhƣ xác định quan hệ phát sinh chủng loại của các taxon bậc trên lồi [39].

Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN
Giám định gen 16S rARN nhằm định tên vi khuẩn là một phƣơng pháp tốt và
hữu ích, nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định. Đơi khi, các loài vi khuẩn khác
nhau có cùng một trình tự gen 16S rARN. Do vậy, khi quyết định tên vi khuẩn cần cân
nhắc cẩn thận các kết quả nhận đƣợc sau khi giải trình tự gen. Trong các trƣờng hợp
chƣa rõ ràng, để định tên chủng vi sinh vật có trình tự gen 16S rARN tƣơng tự 100%
với gen tƣơng ứng của các loài khác, các nghiên cứu thêm bao gồm các đặc điểm hình

8

thái, các đặc điểm sinh lý sinh hóa, giải trình tự toàn bộ một phần hoặc toàn bộ genome
của vi khuẩn cần đƣợc tiến hành bổ sung nếu thấy cần thiết.
Theo các nhà khoa học: hơn 99% các loài vi khuẩn trong môi trƣờng tự nhiên
chƣa đƣợc định tên do không thể nuôi cấy đƣợc bằng các phƣơng pháp cổ điển trong
phịng thí nghiệm [12]. Hiện nay, kỹ thuật Metagenomic kết hợp Genomic, Tin sinh
học đang đƣợc sử dụng để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Đây là kỹ thuật mới và mạnh
nhất cho phép giải mã thông tin di truyền các quần thể vi sinh vật phức tạp không cần
thông qua nuôi cấy và phân lập từng sinh vật đơn lẻ.
1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển và phƣơng pháp hiện đại
Định tên vi sinh vật bằng phƣơng pháp sinh học phân tử có nhiều ƣu điểm
nhƣng vẫn có những nhƣợc điểm nhất định do khó phân biệt các ADN có nguồn gốc từ
các vi sinh vật sống hay chết. Các nhà khoa học đánh giá cao việc phối hợp sử dụng cả
hai phƣơng pháp truyền thống (nuôi cấy) lẫn hiện đại (Metagenomic) để định tên các vi
sinh vật, qua đó nghiên cứu thành phần của Microbiota [19].
Tác giả Clarridge J. (2004) lƣu ý một số điểm sau khi định tên vi sinh vật [19]:
-

Khi đối tƣợng định tên là các vi sinh vật mới tìm thấy, cần thiết giải tồn bộ trình
tự gen 16S rRNA của vi khuẩn và trình tự khơng chứa hơn 1% các base khơng xác
định.

-

Trình tự 16S rRNA quyết định chủ yếu tên của chủng vi khuẩn. Đối với một chủng
chƣa biết, khi mối tƣơng quan giữa trình tự gen 16S rRNA và các đặc điểm kiểu
hình (đặc tính sinh hóa, hình thái vi khuẩn…) khơng thống nhất, trình tự gen quyết
định tên và vị trí phân loại của chủng xem xét.

1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI

Hệ tiêu hóa của ngƣời bao gồm nhiều ngăn với các hệ vi sinh vật Microbiota
khác nhau. Số lƣợng và chủng loại các vi sinh vật trong Microbiota hệ tiêu hóa tăng
dần khi đi xuống phần dƣới, với số lƣợng nhiều nhất ở manh tràng, trực tràng và ít nhất

9


ở dạ dày-nơi có độ pH khoảng 1-2 do dịch dạ dày tiết ra [47], [48] (Hình 3).

Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời [47]
Microbiota dạ dày đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con ngƣời nhƣ hỗ
trợ tiêu hóa, khử độc, đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh… Tuy nhiên, sự thành phần
của Microbiota bản địa dạ dày có thể bị biến đổi do nhiều nguyên nhân nhƣ ngoại cảnh,
điều kiện môi trƣờng, tuổi tác, chế độ ăn uống, các yếu tố miễn dịch, việc sử dụng
kháng sinh, thuốc điều trị... [33].
1.3.1. Microbiota bản địa dạ dày ngƣời khỏe mạnh
Môi trƣờng dạ dày đƣợc coi là quá khắc nghiệt đối với các loài vi sinh vật do
dịch vị dạ dày (pH 1-2) quá axit, các lồi vi sinh vật trơi rửa từ phía trên thực quản và
khoang miệng cũng nhƣ từ phía dƣới ở tá tràng không thể xâm nhập và tồn tại trong dạ
dày. Trƣớc kia dạ dày đƣợc coi là vô khuẩn, nhƣng năm 1984, Helicobacter pylori
đƣợc chứng minh là loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota bản địa dạ dày
[45]. Ngồi ra, Microbiota bản địa dạ dày cịn chứa các vi sinh vật khác nhƣ Veillonella
sp., Lactobacillus sp., và Clostridium sp. [68], [13].

10


Bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN, một tập hợp các loài vi khuẩn
phong phú đa dạng hơn đƣợc tìm thấy trong dạ dày. Các chi vi khuẩn khác không phải
là Helicobacter pylori bao gồm các chi Lactobacillus, Streptococcus, Prevotella,

Veillonella, Stomatococcus [50] và Rothia [14], [43]. Lactobacilli và streptococci là hai
trong những loài đƣợc nuôi cấy từ dạ dày và cả hai chi này đều bao gồm các loài chịu
đƣợc pH thấp [55], [56], [43].
Tóm lại, ở ngƣời trƣởng thành có chế độ tiết dịch axit bình thƣờng, ngồi H.
pylori cịn có vơ số các loại vi khuẩn khác sống trong Microbiota bản địa dạ dày [64],
trong đó chủ yếu là các vi khuẩn sinh axit lactic chịu axit.
1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh
Lớp chất nhày (mucus) trong dạ dày là hàng rào bảo vệ ngăn chặn vi khuẩn
làm tổ ở lớp biểu mô cũng nhƣ ngăn chặn sự khuếch tán của các hóa chất độc và axit
dạ dày đến bề mặt biểu mơ. Do đó, một khi vi khuẩn xâm nhập vào lớp chất nhày hoặc
lớp chất nhày bị phân hủy thì viêm nhiễm của đƣờng tiêu hóa xẩy ra [60]. Tính di động
và khả năng xâm nhập vào lớp chất nhày phụ thuộc rất cao vào sự vận động và hình
dạng của vi khuẩn [61] và khả năng phân hủy chất nhày của chúng [22].
Nhiễm H. pylori thời gian dài dẫn đến thay đổi cấu trúc niêm mạc dạ dày, làm
giảm tiết axit, tạo ra môi trƣờng kiềm , dẫn đến sự xâm nhập và phát triển vƣợt trội của
các vi sinh vật khác trong dạ dày. Khi pH dạ dày trở nên kiềm, độ nhớt của lớp chất
nhầy giảm, dễ dàng để các vi sinh vật thâm nhập [32].
Theo Giáo sƣ Zboril (2002), Microbiota dạ dày bản địa của ngƣời bình
thƣờng khỏe mạnh khơng chứa vi khuẩn kị khí [67]. Từ dạ dày của các bệnh nhân
nhiễm H. pylori lâu ngày và bị viêm, loét, ung thƣ dạ dày, các loại vi sinh vật nhƣ nấm,
vi khuẩn đã đƣợc phân lập [51], [14], [23]. Năm 1990-1991, vi khuẩn Gastrospirillum
hominibee đƣợc phát hiện trong dạ dày ngƣời bệnh viêm dạ dày mạn tính [44], [65].
Ở Việt Nam, năm 2004, GS. Giao và cộng sự đã công bố một số vi khuẩn phân lập ở
điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày của ngƣời bệnh Việt Nam [5]. Nấm Candida

11


krusei, trƣớc kia đƣợc cho là chỉ có ở các bệnh nhân bị HIV/AIDS đã đƣợc tìm thấy trong
thƣợng và hạ vị của các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày [29]. Nấm Candida parapsilosis

cũng đã đƣợc tìm thấy trong Microbiota dạ dày của các bệnh nhân bị viêm dạ dày mãn
tính [10].

1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY
Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là hậu quả của các tổn thƣơng viêm lt dạ dày
cấp hoặc mãn tính khơng đƣợc điều trị triệt để. Y học hiện đại cho rằng, viêm dạ dày
cấp tính chảy máu khơng phải là một bệnh mà là một hội chứng. Chảy máu ở đây
thƣờng khởi phát đột ngột, ồ ạt, diễn biến nhanh, có thể nguy hiểm đe dọa tính mạng
ngƣời bệnh, do đó địi hịi phải theo dõi kỹ càng để xử trí kịp thời [16].
1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày [9], [16], [30]
* Triệu chứng lâm sàng
a, Xuất huyết tiêu hóa: Khi chảy máu dạ dày xảy ra, bệnh nhân có thể nơn ra máu đỏ hoặc
màu cà phê, đi ngoài phân đen.
b, Rối loạn tiêu hóa, chán ăn, buồn nôn, nôn.
c, Đau vùng thƣợng vị: Tùy trƣờng hợp mà bệnh nhân có thể bị đau tức, cồn cào nóng rát
đến đau bụng quặn thành cơn dữ dội.
d, Hiện tƣợng chóng mặt có thể xảy ra, bệnh nhân mệt mỏi và yếu, nhợt nhạt, thở ngắn,
mạch nhanh và huyết áp giảm.
* Triệu chứng cận lâm sàng
Dịch dạ dày đục, niêm mạc phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết. Xuất huyết có
thể là những nốt hoặc đốm xảy ra riêng lẻ hoặc tập trung tạo thành những đám, mảng
máu tụ đen hoặc hơi rỉ máu trên niêm mạc. Vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm
mạc hoặc phân bố khƣ trú ở thân vị và hang vị. Hình 4 giới thiệu hình ảnh nội soi một số
trƣờng hợp chảy máu dạ dày của một số bệnh nhân Việt Nam (a, b, c) và nƣớc ngoài (d,
e, f).

12


a

b

d

c

e

f

Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết
của các bệnh nhân Việt nam (a,b,c) và nƣớc ngoài (d,e,f)
1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày
Chảy máu dạ dày có nhiều nguyên nhân, trong thực tế thƣờng khó xác định chắc
chắn vì trên một bệnh nhân có thể có sự phối hợp của nhiều yếu tố. Đó là:
a) Loét và viêm dạ dày
Loét và viêm dạ dày thƣờng gặp ở các bệnh nhân nhiễm H. pylori. Chảy máu do
loét hoặc viêm dạ dày gây mất nhiều máu, có thể dẫn đến tình trạng thiếu máu trầm
trọng. Các bệnh nhân mang hội chứng di truyền Zollinger-Ellison tiết quá nhiều acid dạ
dày gây loét dẫn đến chảy máu dạ dày [30].
b) Ung thư dạ dày
Các bệnh nhân ung thƣ dạ dày có thể nơn máu đen, khối lƣợng máu ít nhƣng

13


nhiều lần. Chảy máu thƣờng tiềm tàng, phân đen hay gặp hơn là nôn ra máu [9].
c) Do dùng thuốc
Các loại thuốc giảm đau, chống viêm, hay gặp nhất là aspirin thƣờng gây chống

đau, nhất là, khi dùng aspirin với liều 1g/24 giờ, có tới 50% bệnh nhân bị tổn thƣơng
dạ dày. Các thuốc chống viêm không steroid cũng gây tổn thƣơng niêm mạc dạ dày và
tá tràng, theo cơ chế ức chế enzyme cylo-oxygenase và giảm sự tổng hợp prostaglandin
[7], [31]. Khi dùng thuốc chống viêm không steroid phối hợp với các loại thuốc
corticoid, thuốc chống đơng thì tỷ lệ nguy cơ chảy máu tiêu hóa càng tăng, có thể gấp
2-3 lần.
d) Do các chất ăn mòn niêm mạc dạ dày như rượu, axit hoặc kiềm
Có 20% ngƣời nghiện rƣợu xuất huyết tiêu hóa là do viêm dạ dày xuất huyết do
tăng thẩm thấu ở niêm mạc dạ dày [7]. Khi bệnh nhân uống phải dung dịch axit (nhƣ
HCl, H2SO4) hoặc dung dịch kiềm đặc (nhƣ xà phòng giặt) cũng gây tổn thƣơng dạ
dày, thực quản, thậm chí gây thủng thực quản.
e) Stress
Trạng thái stress trong một số bệnh nhƣ suy hô hấp, bỏng, chấn thƣơng sọ não,
nhiễm khuẩn huyết, trụy tim mạch, suy gan, suy thận...có thể gây viêm dạ dày xuất
huyết. Các stress tinh thần nhƣ lo âu, mất ngủ, làm việc căng thẳng, tình trạng trầm
cảm kéo dài cũng là nguyên nhân. Tổn thƣơng và xuất huyết dạ dày thƣờng xảy ra
trong vòng 18 giờ sau stress [6].
g) Viêm nhiễm
Nhiễm H. pylori hiện nay đƣợc coi là nguyên nhân chính gây ra các bệnh về dạ
dày, trong đó có chảy máu dạ dày [9].

14


CHƢƠNG II

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Hai mƣơi bảy bệnh nhân đƣợc chẩn đốn viêm dạ dày cấp tính chảy máu qua hình
ảnh nội soi tại khoa Nội tiêu hóa, bệnh viện Bƣu Điện và 10 ngƣời khỏe mạnh khơng
có bệnh gì về dạ dày đồng thuận đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu.
Tiêu chuẩn chọn lựa bệnh nhân nghiên cứu:
- Trƣớc nội soi một tháng không dùng các thuốc kháng sinh, thuốc ức chế tiết axit.
- Nội soi có hình ảnh chảy máu dạ dày.
- Không phân biệt tuổi tác, nghề nghiệp, nơi ở.
- Tự nguyện tham gia vào nghiên cứu.

2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc
a, Hóa chất

Các hóa chất dùng trong thí nghiệm mua của các hãng nƣớc ngoài (Amersham
Pharmacia Biotech; Amersham Life Science; Eurogen; Promega; Sigma…) có độ tinh
khiết cao.
b, Thiết bị máy móc
- Máy nội soi dạ dày video OLYMPUS Evis EXERA 160 và các dụng cụ kèm theo
- Máy lắc ổn nhiệt nuôi cấy tế bào (Multitron, Đức).
- Máy PCR 9700 (Applied Biosystems, Mỹ)
- Máy điện di và máy UV soi ADN (Mupid, Nhật Bản).
- Máy ly tâm lạnh bé
- Bể ổn nhiệt (Memmert, Đức).
- Máy giải trình tự gen tự động - ABI Prism 3100 Sequencer (Applied Biosytems, Mỹ).
- Máy đo quang phổ (Shimadzu, Nhật Bản)
- Máy NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Scientific, Mỹ).
c, Dung dịch và môi trường sử dụng

16


Mơi trường ni cấy vi khuẩn kị khí (1 lit)
- 39,5 g Campylobacter base
- 5%-10% máu ngựa
- Nystatin: 1 µg/ml
- Agar
- Nƣớc cất vừa đủ 1 lít, pH 7

Hình 5. Đĩa môi trƣờng thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn
Dung dịch để giữ chủng vi khuẩn
Dung dịch (1 lit) chứa 28 g Brucella Broth (BB), bổ sung thêm 30% glycerol
(v/v), bảo quản ở -80oC.
2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu
- Soi và sinh thiết dạ dày đƣợc thực hiện tại phòng Nội soi, bệnh viện Bƣu Điện.
- Các phân tích sau đƣợc thực hiện tại trƣờng Đại học tổng hợp New York, NY, Mỹ:
+ Nuôi cấy và phân lập các chủng vi khuẩn kị khí.
+ Xác định HP status của các bệnh nhân.
+ Giải trình tự gen 16S rARN để định tên các chủng vi khuẩn.

17