Các phương pháp chuyển gene ở động vật

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN
GENE Ở ĐỘNG VẬT
GVHD:
TS. NGUYỄN VĂN DUY
THÀNH VIÊN NHÓM 7:
1. THÁI MINH TÂM
2. THÁI VIẾT HIẾU
3. DƯƠNG THỊ THANH BÌNH
4. PHẠM ĐÌNH THẢO


I. KHÁI QUÁT CHUNG:
1. KHÁI NIỆM:
- Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều
gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế
bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở
dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào
chủ. Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp
nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các
đặc tính mới của cơ thể chuyển gen.
- Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen
được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp
vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp
được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu.


2. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN:
- 1977 Gurdon chuyển mRNA và DNA vào phôi Xenopus
(ếch) và quan sát thấy biểu hiện chức năng của chúng
- 1980 Brinster và cộng sự nhận được kết quả tương tự

ở chuột
- 1981 Wagner và cộng sự đã cấy chuyển thành công gen
β-globulin của thỏ vào phôi chuột
- Từ năm 1985 nhiều tác giả thành công trong tạo
thỏ,cừu, lợn, bị...chuyển gen và các vật ni tăng
trưởng nhanh được
- Ngày nay, động vật chuyển gene đã được ứng dụng rất
nhiều trong các lĩnh vực khác nhau như y học, dược
phẩm, nông nghiệp,…


3. MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE:
- Chuyển gen vào các dịng tế bào động vật nuôi để sản
xuất protein tái tổ hợp.
- Tạo vật ni chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về
các sản phẩm sữa, thịt, lông…
- Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ
hợp.
- Tạo vật ni chuyển gen “knock out” làm mơ hình ngun
cứu về y sinh học các bệnh di truyền.
- Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền
(của người).


4. ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE:
- Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát
triển trên mơ hình chuột và sau đó chúng được ứng dụng
trên gia súc, gia cầm.
- Việc chuyển gen thường được thao tác trên:
+ Tế bào trứng đã thụ tinh.

+ Tế bào tinh trùng.
+ Mô phôi ở giai đoạn sớm.
+ Tế bào gốc phôi.


II. CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE:
Gồm các bước cơ bản sau:
-Tách chiết, phân lập gene mong muốn.
-Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật.
-Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene.
-Biến nạp gene tạo phôi đông vật.
-Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao).
-Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene
lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gene gốc một cách liên
tục.
-Sản xuất động vật chuyển gene.


Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn:
-Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào
vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập
và tinh chế(tạo dịng).
-Cơng cụ sử dụng để tạo dòng:
+ Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase).
+ Các mẫu dò (probe).
+ Vector.
+ Tế bào vật chủ( thường là E.coli).


QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT,

PHÂN LẬP :
-Cắt DNA mẫu và plasmid
được cắt bởi cùng một
enzyme hạn chế.
-Chèn gene mong muốn vào
plasmid. Tạo plasmid tái
tổ hợp.
-Biến nạp plasmid tái tổ
hợp vào tế bào vật chủ.
-Tạo điều kiện thuận lợi
cho vật chủ sinh trưởng
phát triển.


Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ
sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein.
+ Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ
tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand
complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch
kép (double strand complement DNA- ds cDNA. DNA bổ sung
(complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa
các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2).
+ Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình tự
nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit
amin trong phân tử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi
(primer) để dị tìm đoạn gen mong muốn.


Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển
Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon

xuất hiện một cách tự nhiên. Các đoạn intron
đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen.
là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã
protein của gen.

và intron
liên quan
Dạng cDNA
hoá


Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật:
-Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các
lồi khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống
nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase.
-Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận
biết các enzyme hạn chế khác nhau
-Gen chuyển được đi kèm với các trình tự khơng mã hố có
vai trị điều hồ sự biểu hiện của gen. Các yếu tố điều
hồ cũng có thể nằm ở trong đoạn intron. Yếu tố điều hoà
ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trị quyết định
trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen.


Promoter ở tế bào động vật có nguồn gốc hoặc từ động
vật như methallothionein (MT), thymidine kinase, ß-actin,
amylase, insulin, ß-lactoglobulin, adiposite P2...hoặc từ
virus động vật như Simian virus(SV40),Rous sarcoma virus
(RSV)...

SƠ ĐỒ CẤU TRÚC BIỂU HIỆN GENE
Enhancer: gen tăng cường
SIG: trình tự tín hiệu

ATG: vị trí khởi đầu phiên mã
AAA: đi polyA


Bước 3:Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gen
- Ở động vật có vú thì giai đoạn biến nạp gen thích
hợp nhất là trứng ở giai đoạn tiền nhân (pronucleus).
- Trứng chín được thu nhận bằng phương pháp sử dụng
kích dục tố theo chương trình đã được xây dựng cho mỗi
lồi hoặc bằng phương pháp ni cấy trứng trong ống
nghiệm.
Sau đó thụ tinh nhân tạo để tạo ra trứng tiền
nhân.


Bước 4: Chuyển gen vào động vật :
-Phương pháp chuyển gene trực tiếp:
. Chuyển gene nhờ calcium phosphate
. Chuyển gene nhờ xung điện
. Chuyển gene nhờ vi tiêm
. Chuyển gene nhờ liposome,…
-Phương pháp chuyển gene gián tiếp:
Chuyển gene nhờ virus:
+ vector retrovirus ( RNA )
+ vector adenovirus ( DNA sợi kép )
+ vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn )

+ vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép )
+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),….


a. Phương pháp vi tiêm:
Nguyên tắc:
- Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ
dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh.
- Phương pháp này cho kết quả rất cao nhưng số lượng tế
bào được xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào.
- Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế
bào phôi sớm.
- Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh
nhưng chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội.
- Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di
truyền cho các thế hệ sau.


Qui trình:
- Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dịng.
- Thu nhận trứng đã thu tinh
- Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml
- Chuẩn bị tế bào hợp tử
- Vi tiêm DNA vào tiền nhân
- Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận
- Kiểm tra gene chuyển ở con non. Lai tạo để củng cố di truyền.



b. Chuyển gene nhờ xung điện:

Nguyên tắc:
- Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện ( điện
cao thế trong một thời gian rất ngắn) lúc đó trên tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ.
- Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có
thể tương tác với genome của tế bào  tế bào chuyển gene.
- Máy tạo xung điện có cơng suất ổn định,điện thế từ 500-1500 v/cm
- Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào cịn sống.


Chú ý:
- Các DNA duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gene cao hơn, do khả năng dung hợp
với genome của tế bào đích.
- Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung dịch huyền phù đơn
- Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn
- Các tế bào khác nhau thì các thơng số sử dụng khác nhau.

Máy xung điện ( hãng biorad )


Chuyển gene nhờ vector retrovirus:
1. Đặc điểm cấu tạo và di truyền
của retrovirus:
-

Là loại virus RNA, có khả năng
xâm nhiễm vào tế bào vật chủ và
gắn bộ gene virus vào genome tế
bào chủ.

-

Cấu trúc gồm :

+ Có cấu tạo vỏ gồm: vỏ ngoài cùng
glycoprotein, vỏ trong là lipide
kép, vỏ trong cùng là capside.
+ Phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng
dạng và các enzyme.
+ Enzyme phiên mã ngược ( reverse
Transcriptase ), enzyme cài xen
( integrase ) giúp cho quá trình
cài xen bộ gene của virus với
genome tế bào vật chủ ở những
điểm tương đồng.



2. Cơ chế hoạt động của vector:
- RNA của virus được loại bỏ các gene gag, pol,
env và thay vào đó là gene cần chuyển.
- Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ
bằng nhiều phương pháp khác nhau.
- Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của
vector bị phân hủy, giải phóng RNA.
- Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA 
cDNA  vào trong nhân tế bào  enzyme cài
xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ
 các sản phẩm protein của gene mục tiêu
trong tế bào đích.

Bước 5: nuôi cấy phôi trong ống nghiệm
Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) hoặc túi phôi ( blastocyst )  cấy
chuyền vào con nhận được gây chữa giả.

Bước 6: Các phương pháp đánh giá động vật sau khi
sinh ra từ phôi chuyển gene:
-

Southern blot
Northern blot
Western blot.
PCR
RT-PCR
Miễn dịch Elisa.

Bước 7: tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên tục.


Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay )
1. Nguyên tắc:
-

Thông qua sự kết hợp của kháng thể và kháng nguyên trong huyết thanh.

-

Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rữa trôi.

-

Nhận biết sự gắn này bằng một cơ chất đặc biệt làm thay đổi màu

Đĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm
ELISA