kết hợp phương pháp pcr và reverse dot blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con người

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

----------------

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN
THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT
BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI
KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO
CON NGƢỜI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2014


TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CỦA SINH VIÊN
THAM GIA XÉT GIẢI THƢỞNG CẤP TRƢỜNG

Tên đề tài:

KẾT HỢP PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ REVERSE DOT

BLOT PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI CÁC TÁC NHÂN VI
KHUẨN TỪ CÁC MẪU BỆNH PHẨM GÂY BỆNH CHO
CON NGƢỜI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CHUYÊN NGÀNH:VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA
Nam, Nữ:
Dân tộc:
KINH
Lớp, khoa: SH10A3 – Khoa công nghệ sinh học
Năm thứ: 4
Số năm đào tạo: 4
Ngành học: Công nghệ sinh học vi sinh – sinh học phân tử
Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 4/2014


MỤC LỤC
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .......................................................... v
THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI ........ ix
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ ........................................................... x
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ............................................................................................... xi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................................... xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................................ 1
PHẦN I.
I.1.

TỔNG QUAN ..................................................................................................... 3

SƠ LƢỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP ................... 3

I.1.1.

Bacillus cereus ........................................................................................................ 3

I.1.1.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 3

I.1.1.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 3

I.1.1.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 3

I.1.2.

Brucella spp. ........................................................................................................... 3

I.1.2.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 3

I.1.2.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 4

I.1.2.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 4

I.1.3.

Clostridium botulinum ............................................................................................ 4

I.1.3.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 4

I.1.3.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 4

I.1.3.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 5

I.1.4.

Clostridium perfringens .......................................................................................... 5

I.1.4.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 5

I.1.4.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 5

I.1.4.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 6

I.1.5.

Escherichia coli ....................................................................................................... 6

I.1.5.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 6

I.1.5.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 6

I.1.5.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 7

I.1.5.4.

Phân loại ........................................................................................................... 7

I.1.6.

Listeria monocytogenes ........................................................................................... 8

I.1.6.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 8
Trang i


I.1.6.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 8

I.1.6.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................... 8

I.1.7.

Staphylococcus aureus ............................................................................................ 9

I.1.7.1.

Đặc điểm hình thái ............................................................................................ 9

I.1.7.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ........................................................................ 9

I.1.7.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 10

I.1.8.

Salmonella spp. ..................................................................................................... 10

I.1.8.1.

Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 10

I.1.8.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ...................................................................... 10

I.1.8.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 11

I.1.9.

Shigella spp. .......................................................................................................... 11

I.1.9.1.

Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 11

I.1.9.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ...................................................................... 11

I.1.9.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 12

I.1.10. Vibrio cholerae ...................................................................................................... 12
I.1.10.1.

Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 12

I.1.10.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ...................................................................... 12

I.1.10.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 13

I.1.11. Vibrio parahaemolyticus ....................................................................................... 13
I.1.11.1.

Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 13

I.1.11.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ...................................................................... 13

I.1.11.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 14

I.1.12. Yersinia enterocolitica .......................................................................................... 14

I.2.

I.1.12.1.

Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 14

I.1.12.2.

Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng ...................................................................... 14

I.1.12.3.

Thơng tin bộ gen ............................................................................................. 15

THƠNG TIN VÙNG GEN 16S VÀ 23S rDNA ......................................................... 15

I.2.1.

Gen 16S rDNA ...................................................................................................... 15

I.2.2.

Gen 23S rDNA ...................................................................................................... 16

I.3.

CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH CHO CON NGƢỜI ..
....................................................................................................................................... 17

I.3.1.

Kỹ thuật định danh truyền thống [27] ............................................................... 17

I.3.2.

Kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại .................................................................... 19

I.3.2.1.

Kỹ thuật PCR[2][14]....................................................................................... 19
Trang ii


I.3.2.2.

Multiplex PCR[14] ......................................................................................... 24

I.3.2.3.

Phƣơng pháp microarray [66][61] [14] .......................................................... 24

I.3.2.4.

Phƣơng pháp Reverse dot blot [14] ............................................................. 25

I.4. CÁC CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN NHANH CHÓNG VÀ ĐỒNG
THỜI TÁC NHÂN VI SINH VẬT GÂY BỆNH ................................................................. 26
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 29

PHẦN II.

II.1. VẬT LIỆU .................................................................................................................... 29
II.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................................. 29
II.2.1.

Thu thập dữ liệu và khảo sát in silico................................................................. 29

II.2.2.

Thu thập dữ liệu ................................................................................................... 29

II.2.3.

Khảo sát in silico .................................................................................................. 29

II.2.3.1.

Thu thập tr nh tự gen mục tiêu 16S – 23S rRNA ........................................... 29

II.2.3.2.

Thu thập các cặp mồi ...................................................................................... 29

II.2.3.3.

Phƣơng pháp khảo sát các cặp mồi, thiết kế mồi............................................ 30

II.2.4.

Khảo sát thực nghiệm .......................................................................................... 30

II.2.4.1.

Tách chiết DNA .............................................................................................. 30

II.2.4.2.

Kiểm tra chất lƣợng DNA thu nhận bằng phƣơng pháp đo quang phổ .......... 31

II.2.4.3.

Phản ứng PCR: ............................................................................................... 32

II.2.4.4.

Phƣơng pháp điện di: ...................................................................................... 33

II.2.4.5.

Phƣơng pháp lai RDB ..................................................................................... 34

II.2.4.6.

Khảo sát độ nhạy của phƣơng pháp PCR-RDB .............................................. 34

II.2.4.7.
cùng lúc

Khảo sát khả năng phát hiện đồng thời nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh
........................................................................................................................ 35

PHẦN III.
III.1.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................... 36

Kết quả thu thập dữ liệu và khảo sát in silico ....................................................... 36

III.1.1.

Thu thập dữ liệu ............................................................................................... 36

III.1.2.

Kết quả khảo sát in silico ................................................................................. 37

III.1.2.1.

Thu thập và đánh giá hệ cặp mồi, mẫu dò .................................................. 37

III.1.2.2.

Khảo sát hệ cặp mồi .................................................................................... 39

III.1.2.3.

Khảo sát bộ mẫu dò ..................................................................................... 47

III.2.

Kết quả thực nghiệm ............................................................................................... 69

III.2.1.

Tách chiết DNA ................................................................................................ 69

III.2.2.

Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 16S rDNA .......................................... 71

Trang iii


III.2.3.
Kết quả khuếch đại của cặp mồi 16S_F – 16S_R trên các chủng vi khuẩn
đối chứng ............................................................................................................................ 72
III.2.4.

Kết quả lai RDB trên các chủng vi khuẩn đối chứng.................................... 73

III.2.5.

Kết quả thực nghiệm trên mẫu bệnh phẩm ................................................... 75

III.2.6.

Khảo sát độ nhạy của phƣơng pháp PCR-RDB ............................................ 77

III.2.7.

Kết quả phát hiện đồng thời các chủng vi khuẩn gây bệnh ......................... 78

PHẦN IV.

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 80

IV.1.

KẾT LUẬN .............................................................................................................. 80

IV.2.

ĐỀ NGHỊ .................................................................................................................. 80

TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 81
PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 91

Trang iv


1

THƠNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

1. Thơng tin chung:
- Tên đề tài: “Kết

hợp phƣơng pháp PCR và Reverse Dot Blot

phát hiện đồng thời các tác nhân vi khuẩn từ các mẫu

bệnh phẩm gây bệnh cho con ngƣời”.
- Sinh viên thực hiện 1 (Nhóm trƣởng): NGUYỄN TRỌNG NGHĨA
- Lớp:

SH10A3

Khoa: CNSH

Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 2: DƢƠNG NGỌC HUỲNH
- Lớp:

DH11SH02 Khoa: CNSH

Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 3: NGUYỄN HOÀNG ANH TUẤN
- Lớp:

DH11SH01 Khoa: CNSH

Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 4: VÕ THẮNG THƢỞNG
- Lớp:

DH11SH02 Khoa: CNSH

Năm thứ: 3 Số năm đào tạo: 4

- Sinh viên thực hiện 5: LÊ THỊ TỐ QUYÊN
- Lớp:

SH10A3

Khoa: CNSH

Năm thứ: 4 Số năm đào tạo: 4

- Ngƣời hƣớng dẫn: ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG
2. Mục tiêu đề tài:
Xây dựng quy trình phát hiện 12 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột bằng kỹ
thuật PCR kết hợp lai phân tử (Reverse dot blot) sử dụng vùng trình tự 16 -23S rDNA,
nhằm t m ra phƣơng pháp chẩn đốn nhanh, chính xác các tác nhân vi khuẩn gây bệnh
thƣờng gặp trong các mẫu bệnh phẩm.

3. Tính mới và sáng tạo:
Chúng tôi kết hợp phƣơng pháp PCR và lai ngƣợc dòng (PCR-Reverse Dot
Blot) để phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Cho đến nay có rất ít
các cơng bố khoa học trong nƣớc ứng dụng những kỹ thuật này trong việc phát hiện
Trang v


các tác nhân vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm nói chung, nhóm vi khuẩn gây bệnh
đƣờng ruột nói riêng. Phƣơng pháp mới này khắc phục những hạn chế của những
phƣơng pháp phân tích truyền thống (tiêu tốn thời gian, độ chính xác, khó phát hiện
đồng thời trong cùng một thời gian,...).

4. Kết quả nghiên cứu:

Nhóm sinh viên chúng tơi đã khảo sát thông số vật lý, độ đặc hiệu, độ nhạy của
2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dị chun biệt nhằm phát hiện 12 lồi
vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đồng thời nhóm sinh viên đã đạt đƣợc một số kết quả
đáng ghi nhận:
− Thực hiện phản ứng PCR – RDB trên các mẫu DNA của vi khuẩn đối chứng.
Chúng tôi đã thực hiện thành công trên 7 chủng vi khuẩn đối chứng: Bacillus
cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria
monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica.
− Áp dụng quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu đã
đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phƣơng pháp vi sinh thƣờng
quy ở bệnh viện). Chúng tôi ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát hiện nhiễm chủng vi
khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn tồn trùng khớp với kết quả xét
nghiệm truyền thống.

5. Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc
phòng và khả năng áp dụng của đề tài:
− Đề tài nghiên cứu đã hoàn thiện việc xây dựng quy trình phát hiện nhanh, nhạy
và xác định chính xác các vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đề tài có ý nghĩa
trong cơng tác xét nghiệm, kiểm nghiệm các bệnh truyền nhiễm do tác nhân vi
khuẩn gây nên cũng nhƣ trong cơng tác phịng chống ngộ độc thực phẩm.
− Áp dụng quy trình trên mẫu bệnh phẩm trong thực tế, ghi nhận tính đặc hiệu, độ
nhạy và độ chính xác của quy trình PCR-Reverse dot blot với 2 bộ mồi và 12
mẫu dò chuyên biệt của 12 vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột.

6. Công bố khoa học của sinh viên từ kết quả nghiên cứu của đề tài:

Trang vi


Ngày 7 tháng 4 năm 2014

Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài

Nguyễn Trọng Nghĩa
 Nhận xét của ngƣời hƣớng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh
viên thực hiện đề tài:
Nhóm sinh viên thực hiện đề tài, do sinh viên Nguyễn Trọng Nghĩa làm trƣởng
nhóm đã hồn thành tốt nội dung nghiên cứu do giảng viên hƣớng dẫn đề nghị trong
giai đoạn kế thừa những kết quả nghiên cứu tiền đề của các sinh viên cùng nhóm năm
2013. Kết thúc giai đoạn này, các sinh viên đã thực hiện việc xác định thông số vật lý,
độ đặc hiệu, độ nhạy của 2 bộ mồi chung (universal primer) và 12 mẫu dị chun biệt
nhằm phát hiện 12 lồi vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột. Đồng thời nhóm sinh viên đã
đạt đƣợc một số kết quả đáng ghi nhận:
- Xác định tính đặc hiệu của 2 bộ mồi và 12 mẫu dò trên 7 chủng vi khuẩn:
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria
monocytogenes, Vibrio parahaelyticus, Yersinia enterocolitica.
- Xác định độ nhạy của quy trình PCR-Reverse dot blot trên mẫu bệnh phẩm.
− Áp dụng thành cơng quy trình PCR-Reverse dot blot trên 15 mẫu bệnh phẩm
(chai cấy máu) thu thập đƣợc tại thành phố Hồ Chí Minh. Nhóm sinh viên thực
hiện quy trình PCR – RDB trên 15 mẫu bệnh phẩm máu (chai cấy máu) đã
đƣợc xác định tác nhân vi khuẩn gây nhiễm bằng phƣơng pháp vi sinh thƣờng
quy ở bệnh viện. Kết quả ghi nhận 6/15 mẫu đƣợc phát hiện nhiễm chủng vi
khuẩn Staphylococcus aureus, kết quả này hoàn toàn trùng khớp với kết quả xét
nghiệm truyền thống.

Trang vii


Ngày 07 tháng 4 năm 2014
Ngƣời hƣớng dẫn

Xác nhận của đơn vị

ThS. TRƢƠNG KIM PHƢỢNG

Trang viii


1

THƠNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC
HIỆN ĐỀ TÀI

I. SƠ LƢỢC VỀ SINH VIÊN:

Họ và tên: NGUYỄN TRỌNG NGHĨA
Sinh ngày: 26 tháng 12 năm 1992
Nơi sinh: Xã Mỹ Cát, Huyện Phù Mỹ, Tỉnh B nh Định
Lớp: SH10A3
Khóa: 2010 - 2014
Khoa: Công Nghệ Sinh Học
Địa chỉ liên hệ: 40/1 Đƣờng Số 7 Khu phố 4, Phƣờng Linh Xuân, Quận Thủ
Đức, TP. HCM.
Điện thoại: 0937216635
Email:
II. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP

Năm thứ 1:
Ngành học: Công nghệ sinh học
Khoa: Công nghệ sinh học

Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá
Sơ lƣợc thành tích:
* Năm thứ 2:
Ngành học: Cơng nghệ sinh học
Khoa: Công nghệ sinh học
Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá
Sơ lƣợc thành tích:
Năm thứ 3:
Ngành học: Cơng nghệ sinh học
Khoa: Công nghệ sinh học
Kết quả xếp loại học tập: Trung Bình Khá
Sơ lƣợc thành tích:

Xác nhận của đơn vị

Ngày 07 tháng 4 năm 2014
Sinh viên chịu trách nhiệm chính
thực hiện đề tài

Nguyễn Trọng Nghĩa
Trang ix


1

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ

Bảng I.1. Bảng thử nghiệm sinh hóa phân biệt nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng
ruột[27] ............................................................................................................................ 19
Bảng II.1. – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S F – 16S_R. ..................... 32

Bảng II.2. – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S F – 16S_R. ............ 32
Bảng II.3 – Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi

S F – 23S_R. ..................... 33

Bảng II.4 – Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR với cặp mồi

S F – 23S_R .............. 33

Bảng III.1 – Các vùng gen sử dụng trong phát hiện vi sinh vật gây bệnh ............... 36
Bảng III.2 – Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong xác định nhanh các vi
khuẩn gây bệnh ............................................................................................................... 37
Bảng III. 3 – Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu ................................................. 37
Bảng III.4 – Bảng thống kê các mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu mẫu dò ............ 39
Bảng III.5. – Bảng thơng số vật lí của mồi dựa vào phân tích IDT ........................... 46
Bảng III.6. – Bảng chỉ số OD của 7 mẫu DNA tách chiết từ vi khuẩn đối chứng sử
dụng trong nghiên cứu. .................................................................................................. 70
Bảng III.7. – Bảng chỉ số OD của 20 mẫu DNA tách chiết sử dụng trong nghiên
cứu .................................................................................................................................... 70
Bảng III.8. – Vị trí chấm mẫu dị trên màng lai .......................................................... 73

Trang x


1

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Hình I.1 – Hình thái tế bào Bacillus cereus .................................................................... 3
Hình I.2 – Hình thái tế bào Brucella ............................................................................... 4

Hình I.3 – Hình thái tế bào C. botulinum ....................................................................... 4
Hình I.4 – Hình thái tế bào C. perfringenes ................................................................... 5
Hình I.5 – Hình thái tế bào E.coli ................................................................................... 6
Hình I.6 – Hình thái tế bào L. monocytogenes ............................................................... 8
Hình I.7. Hình thái tế bào Staphylococcus aureus ......................................................... 9
Hình I.8. Hình thái tế bào Salmonella .......................................................................... 10
Hình I.9. Hình thái tế bào Shigella ............................................................................... 11
Hình I.10. Hình thái tế bào Vibrio cholera ................................................................... 12
Hình I.11. Hình thái tế bào V. parahaelyticus .............................................................. 13
Hình I.12. Hình thái tế bào Y. enterocolitica ................................................................ 14
Hình II.1. Các bƣớc trong một chu kỳ PCR. ................................................................. 2
Hình II.2. Minh họa phƣơng pháp RDB ...................................................................... 26
Hình III.1 – Kết quả Blast mồi 16S_F .......................................................................... 41
Hình III.2 – Kết quả Blast mồi 16S_R .......................................................................... 42
Hình III.3 – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R bằng
công cụ Annhyb. ............................................................................................................. 43
Hình III.4 – Kết quả Blast mồi 23S_R .......................................................................... 44
Hình III.5. – Kết quả Blast mồi 23S_R ......................................................................... 44
Hình III.6. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của cặp mồi 16S_F – 16S_R
bằng công cụ Annhyb ..................................................................................................... 46
Hình III.7. – Kết quả Blast mẫu dị BAC ..................................................................... 47
Hình III.8. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị BAC bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 48
Hình III.9. – Kết quả Blast mẫu dị BRU ..................................................................... 49
Hình III.10. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị BAC bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 50
Hình III.11. – Kết quả Blast mẫu dò CBO ................................................................... 51
Trang xi

Hình III.12. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị CBO bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 52
Hình III.13. – Kết quả Blast mẫu dị CPF .................................................................... 53
Hình III.14. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị CPF bằng cơng cụ
Annhyb ............................................................................................................................ 54
Hình III.15. – Kết quả Blast mẫu dị LIS ..................................................................... 55
Hình III.16. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị LIS bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 56
Hình III.17. – Kết quả Blast mẫu dị SAL .................................................................... 57
Hình III.18. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị SAL bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 57
Hình III.19. – Kết quả Blast mẫu dị SHI..................................................................... 58
Hình III.20. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SHI bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 59
Hình III.21. – Kết quả Blast mẫu dị SAU ................................................................... 60
Hình III.22. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dò SAU bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 61
Hình III.23. – Kết quả Blast mẫu dị VPA ................................................................... 62
Hình III.24. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị VPA bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 63
Hình III.25. – Kết quả Blast mẫu dị VCH................................................................... 64
Hình III.26. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị VCH bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 65
Hình III.27. – Kết quả Blast mẫu dị YER ................................................................... 66
Hình III.28. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị YER bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 67
Hình III.29. – Kết quả Blast mẫu dị ECO ................................................................... 68
Hình III.30. – Kết quả khảo sát khả năng bắt cặp của mẫu dị ECO bằng cơng cụ
Annhyb. ........................................................................................................................... 69
Hình III.31. – Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của cặp mồi 16S_F – 16S_R ... 71

Hình III.32. – Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu vi khuẩn đại diện .............. 72
Trang xii


Hình III.33. – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Staphylococcus aureus ............... 74
Hình III.34. – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Bacillus cereus và Shigella spp . 74
Hình III.35. – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Vibrio parahaemoliticus và
Yersinia Enterocolitica .................................................................................................... 74
Hình III.36. – Kết quả lai RDB trên chủng chuẩn Salmonella spp. và Listeria
monocytogenes ................................................................................................................. 75
Hình III.37. – Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu bệnh phẩm đại diện .......... 76
Hình III.38. Kết quả minh họa lai RDB trên mẫu bệnh phẩm .................................. 77
Hình III.39. Kết quả minh họa ngƣỡng lai RDB trên mẫu bệnh phẩm nhiễm
Staphylococcus aureus .................................................................................................... 78
Hình III.40. – Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu hỗn hợp 4 lồi vi khuẩn
khác nhau. ....................................................................................................................... 79
Hình III.41. Kết quả lai RDB trên mẫu hỗn hợp 4 loài vi khuẩn khác nhau ........... 79

Trang xiii


1

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Kí hiệu viết tắt

Diễn giải

A

Adenine

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

BP

Baird Parker

Bp

Base Pair

C

Cytosine

cAMP

Cyclic Andenosine monophosphate

cDNA

complementary DNA

CFU

Colony Forming Unit

DNA

Deoxyribonucleic acid

EIEC

Enteroinvasive E.coli

EPEC

Enteropathogenic E.coli

ETEC

Enterotoxigenic E.coli

G

Guanidine

IDT

Integrated DNA technologies

IMViC

Indole, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate

ISA

Iso-sensitest agar

ITS

Internal Transcribed Spacer

LB

Labile heat

MR

Methyl Red

mRNA

messenger RNA

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Optical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

pH

Potential Hydrogen

RDB

Reverse dot blot

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

RNA

Ribonucleic acid
Trang xiv


rRNA

ribosomal Ribonucleic Acid

S

Semi-conserved

SNP

Single nucleotide polymorphism

ST

Stable heat

T

Thymin

Ta

Temperature annealing

TLTK

Tài liệu tham khảo

Tm

Temperature melting

TMB

3,3,5,5- tetramethylbenzidine

tRNA

Transfer Ribonucleic Acid

U

Universal

UV

Ultraviolet, tia tử ngoại

V

Variable

VP

Voges Proskauer

VTEC

Verotoxigenic E.coli

Trang xv


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nhóm vi khuẩn gây bệnh truyền nhiễm bao gồm những nhóm vi khuẩn gây
nhiễm trùng đƣờng ruột, gây nhiễm trùng đƣờng hơ hấp,...Trong đó, nhóm vi khuẩn
phổ biến gây bệnh đƣờng ruột và gây ngộ độc thực phẩm: Bacillus cereus, Clostridium
botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Vibrio
parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella spp. ... Các loài vi khuẩn này
gây ảnh hƣởng nghiêm trọng cho sức khỏe con ngƣời với các loại bệnh: tiêu chảy,
nhiễm trùng đƣờng ruột, nhiễm trùng huyết, rối loạn thần kinh, viêm màng não,...
Hiện nay, tại các phòng xét nghiệm tại các bệnh viện ở Việt Nam, phƣơng pháp
truyền thống đƣợc sử dụng rất phổ biến nhƣ “tiêu chuẩn vàng” với ƣu điểm là dễ thực
hiện và chi phí thấp, tuy nhiên cịn nhiều hạn chế nhƣ tốn nhiều thời gian thực hiện, độ
chính xác chƣa cao do dễ bị ngoại nhiễm trong q trình ni cấy, gây khó khăn cho
việc điều trị. Vì vậy, việc phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh nhiễm trùng là điều
cần thiết, giúp hạn chế đƣợc sự lây lan của chúng và hỗ trợ đắc lực cho các bác sĩ t m
ra hƣớng điều trị đúng đắn cho bệnh nhân. Hiện nay, nhiều phƣơng pháp phát hiện
nhanh vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng đã đƣợc đƣa vào sử dụng nhƣ PCR - điện di,
Real time PCR, Multiplex PCR, PCR kết hợp giải trình tự… nhƣng phƣơng pháp
PCR kết hợp lai Reverse Dot Blot (PCR - RDB) đã cho thấy những ƣu điểm vƣợt trội
về thời gian, sự chính xác và phát hiện đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh nhiễm trùng
cùng lúc (Fiss et al; 1992, Xing et al; 2009), điều này giúp các bác sĩ có phƣơng pháp
điều trị đúng đắn và kịp thời cho bệnh nhân, do đó làm giảm đáng kể chi phí điều trị
cho bệnh nhân.
Vì vậy, sự tìm hiểu và thiết lập quy trình phát hiện đồng thời 12 chủng vi khuẩn
gây bệnh đƣờng ruột: Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium
perfringens, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli
O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,
Yersinia enterocolitica và Brucella spp. là cấp thiết. Dựa trên những kết quả đạt đƣợc
của nhóm nghiên cứu “Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột bằng phƣơng
pháp PCR – Reverse Dot Blot”, chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học: “ Kết
Trang 1


hợp phƣơng pháp PCR và Reverse dot blot phát hiện đồng thời các tác nhân vi
khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm gây bệnh cho con ngƣời” nhằm tiếp tục triển khai

việc ứng dụng kỹ thuật PCR – Reverse dot blot nhằm phát hiện đồng thời 12 chủng vi
khuẩn gây bệnh đƣờng ruột nêu trên với ƣu điểm: khắc phục đƣợc những khuyết điểm
của phƣơng pháp truyền thống, rút ngắn thời gian phân tích, độ nhạy và độ chính xác
cao.
Nội dung thực hiện:
 Trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu khoa học sinh viên, chúng tôi kế thừa và
đánh giá lại hệ mồi và mẫu dò dựa trên vùng gen mục tiêu 16S - 23S rDNA từ nhóm
nghiên cứu “Xác định nhóm vi khuẩn gây bệnh đƣờng ruột bằng phƣơng pháp PCRRDB” (Trần Thị Phúc) đã thiết kế nhằm chọn ra bộ mồi và mẫu dò để phát hiện cùng
lúc nhiều tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng. Nhóm tác nhân gây bệnh gồm:
Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella
spp., Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocolitica và Brucella
spp., ...
 Xác định độ nhạy của quy trình PCR – RDB thơng qua khảo sát ngƣỡng mật
độ tối thiểu của tế bào vi khuẩn hiện diện trong mẫu bệnh phẩm.
 Thực hiện phản ứng PCR kết hợp phƣơng pháp lai Reverse Dot Blot (PCRRDB) phát hiện các tác nhân vi khuẩn gây bệnh nhiễm trùng trên những mẫu bệnh
phẩm nhƣ mẫu máu, mẫu phân…

Trang 2


PHẦN I.

TỔNG QUAN

I.1. SƠ LƢỢC VỀ CÁC NHÓM VI KHẨN GÂY BỆNH THƢỜNG GẶP
I.1.1.

Bacillus cereus

I.1.1.1. Đặc điểm hình thái
Bacillus cereus thuộc họ Bacillaceae, là trực
khuẩn Gram dƣơng (+), tế bào hình que, có khả năng
di động, xếp thành từng đơi hoặc chuỗi ngắn, khơng
có vỏ và có khả năng h nh thành nha bào. Đây là vi
khuẩn hiếu khí tùy nghi.[15]

Hình I.1 – Hình thái tế bào Bacillus cereus [77]

I.1.1.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh
dƣỡng
Bacillus cereus phát triển đƣợc trong khoảng nhiêt độ 4oC – 50oC và pH trong
khoảng 4,9 – 9,3, tuy nhiên nhiệt độ tối ƣu trong khoảng 25oC – 37oC, pH 7 – 7,2.
Ngoài ra vi khuẩn cịn có thể sống trong mơi trƣờng có nồng độ muối NaCl 7.5%.
Bacillus cereus có đặc điểm sinh hóa: catalase dƣơng tính (+), ci01trate dƣơng
tính (+) VP dƣơng tính (+), …
Vi khuẩn sinh ra 4 loại hemolysin: Hemolysin I (cereolysin – O; CLO),
Hemolysin II, Hemolysin III, Hemolysin IV. Trong đó có 1 độc tố gây nơn (Emetic
toxin) là Cereulide và 3 loại độc tố ruột (Diarrhoed toxin): Hemolysin BL (HBL1và
HBL2), Nonhemolytic enterotoxin (NheA, NheB, và NheC), Cyto-toxin K (CytK).
Vi khuẩn B. cereus thƣờng nhiễm vào loại thực phẩm có nguồn gốc ngũ cốc và
sản phẩm của chúng nhƣ cơm, sữa trứng, nƣớc xốt, súp, xôi, kem bánh,…đƣợc bảo
quản ở nhiệt độ thƣờng.
Hossein Sanael – Zadeh (2012), đã phát hiện trong mì Ý có chứa Bacillus cereus
gây ngộ độc cho ngƣời.
I.1.1.3. Thơng tin bộ gen
Bộ gen của Bacillus cereus có kích thƣớc khoảng 5,55 Mb trong đó tỉ lệ %GC
khoảng 35,5%, vùng 16S rRNA có kích thƣớc khoảng 1451bp và vùng 23S rRNA
khoảng 2906bp. (Bacillus cereus ATCC 14579 ASM782v1)
I.1.2.

Brucella spp.

I.1.2.1. Đặc điểm hình thái
Trang 3


Brucella spp. thuộc họ α-proteobacteria, thuộc
nhóm vi khuẩn Gram âm, có kích thƣớc từ 0,5 – 1,7
µm, tế bào hình bầu dục, khơng di động. [30][12]
I.1.2.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng
Brucella spp. là nhóm vi khuẩn hiếu khí,

Hình I.2 – Hình thái tế bào Brucella[78]

chúng có khả năng sử dụng một số nguồn
carbohydrate nhƣ glucose, galactose… nhƣng không sinh ra acid, chúng có khả năng
tạo ra các enzyme nhƣ catalase, oxidase, urea….[29]
Brucella spp. thƣờng đƣợc tìm thấy ở một số lồi gia súc nhƣ lợn, bị, cừu… Khi
xâm nhập vào cơ thể ngƣời chúng thƣờng tồn tại trong máu và theo hệ tuần hoàn đi
khắp cơ thể và làm ảnh hƣởng đến quá trình thực bào của cơ thể.[30] [12]
I.1.2.3. Thơng tin bộ gen
Bộ gen của Brucella spp. có kích thƣớc khoảng 3,28 Mb, tỉ lệ GC% chiếm tỷ lệ
khoảng 57,2%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1485bp và 23S rRNA khoảng 2911bp
(Brucella melitensis bv. 1 str. 16M.)
I.1.3.

Clostridium botulinum

I.1.3.1. Đặc điểm hình thái

Clostridum botulinum là vi khuẩn Gram
dƣơng, hình que, có khả năng di động và có nha
bào. Chúng thuộc nhóm vi khuẩn kị khí bắt buột.
[12]

I.1.3.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng

Hình I.3 – Hình thái tế bào C.
botulinum[79]

C. botulinum tạo khóm khuẩn lạc màu đen trên mơi trƣờng ISA và SFP ở nhiệt
độ 37oC trong điều kiện kỵ khí. [12]
Nhiệt độ phát triển thuận lợi nhất là 26-28oC [12]. Nha bào có nhiều trong đất và
có sức đề kháng cao trên 100oC, nha bào bị diệt khi xử lý nhiệt ở 120oC/10 phút.
Vi khuẩn Clostridium botulinum có đặc điểm sinh hóa: H2S dƣơng tính (+),
gelatinase dƣơng tính (+), có khả năng lên men lactose, mantose,… [12]
Clostridium botulinum sinh độc tố gây ngộ độc: độc tố thần kinh botulinum
neurotoxin (BoNT) đƣợc phân loại thành các serotypes: A, B, C, D, E, F, G [23].
Trang 4


Trong đó, độc tố A thƣờng thấy ở châu Mỹ; độc tố B thƣờng thấy ở châu Âu và độc tố
E thƣờng thấy ở Nhật Bản [46]. Bên cạnh đó, vi khuẩn còn chứa độc tố đƣờng ruột C2
và C3.
Đồ hộp, thịt, cá, rau quả có nồng độ acid thấp để lâu, một số thức ăn bằng thịt chế
biến, ăn nguội nhƣ dăm bơng, xúc xích… dễ bị nhiễm C. botulinum [46].
Henrique Lecour và cộng sự (1988), đã t m thấy trong thịt xơng khói, xúc xích
lồi vi khuẩn Clostridium botulinum gây ngộ độc thực phẩm ở ngƣời.
I.1.3.3. Thông tin bộ gen
Bộ gen của C. botulinum (Clostridium botulinum A str. ATCC 3502) có kích

thƣớc khoảng 3,9Mb trong đó tỉ lệ % GC khoảng 28.2%, vùng gen 16S rRNA khoảng
1524bp và 23S rRNA khoảng 2905bp.
I.1.4.

Clostridium perfringens

I.1.4.1. Đặc điểm hình thái
Clostridium perfringens là trực khuẩn Gram
dƣơng, sống kỵ khí, có nha bào. [12]
I.1.4.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng
C. perfringens phát triển thành các khuẩn lạc
có màu đen các trên mơi trƣờng SulfitePolymyxin-Sulfadiazine,
Sulfite-Neomycin,

Tryptose-

Hình I.4 – Hình thái tế bào C. perfringenes[80]

Shahidi-Ferguson

Perfringens, Tryptose-sulfite- cycloserine agar (TSC) [12].
Vi khuẩn Clostridium perfringens có nhiệt độ tăng trƣởng trong khoảng 33oC –
49oC, pH thích hợp khoảng 5 – 9. Vi khuẩn còn sinh trƣởng đƣợc trong mơi trƣờng
muối NaCl 4-6%.
Clostridium perfringens có khả năng phân giải nitrat, gelatin, có khả năng lên
men lactose, …[12]
Clostridium perfringens sinh ra 6 serotypes: A, B, C, D, E ,F trong đó serotype A
và F là độc tố chủ yếu gây ra ngộ độc thực phẩm. [39]
C. perfringens phân bố rộng rãi trong đất, nƣớc, phân ngƣời và động vật, sống ký
sinh trong ruột non động vật [12]. Clostridium perfringens ƣu nhiệt độ trung bình,

Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là 37 - 45oC. Nha bào thƣờng thấy nhiều ở các thực
Trang 5


phẩm tƣơi sống và có sức đề kháng cao với nhiệt độ, trong quá trình bảo quản thực
phẩm ở nhiệt độ thƣờng hoặc trong hâm nóng thực phẩm có thể không diệt đƣợc các
nha bào. [40]
I.1.4.3. Thông tin bộ gen
Bộ gen của C. perfringens có kích thƣớc khoảng 3,26 Mb trong đó tỉ lệ % GC
khoảng 28.4% (Clostridium perfringens ATCC 13124), vùng gen 16S rRNA khoảng
1522bp và 23S rRNA khoảng 2909bp.
I.1.5.

Escherichia coli

I.1.5.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn Escherichia coli

thuộc họ

Enterobateriaceae, E.coli là trực khuẩn ngắn từ 23µm, Gram âm, khơng tạo bào tử, có khả năng di
động nhờ tiên mao ở xung quanh. [12]
I.1.5.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng

Hình I.5 – Hình thái tế bào E.coli[81]

E.coli có khả năng sinh trƣởng trong khoảng 5- 40oC và tối ƣu ở 37oC pH trong
khoảng 5,5 – 8 và thích hợp nhất là 7,2 – 7,4. [12]
Chúng thuộc nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy ý, có khả năng lên men sinh hơi một số
loại đƣờng nhƣ glucose, lactose, xylose…



Lên men các đƣờng glucose, lactose, levulose, galactose, xylose, ramnose,

manit kèm theo sinh hơi. Không lên men đƣờng adonit và inozit.


Thử nghiệm IMViC dùng để phân biệt E.coli với các vi khuẩn đƣờng ruột

khác [12], gồm có các phản ứng:
o Phản ứng sinh indol (I): E. coli có indol (+).
o Phản ứng đỏ metyl (M): E. coli có phản ứng đỏ metyl (+).
o Phản ứng Voges Proskauer (V): E.coli có phản ứng Voges Proskauer (-).
o Phản ứng tìm khả năng sử dụng cacbon của citrat (C): E.coli cho phản ứng
citrat âm tính.
 Phản ứng kiểm tra lên men đƣờng inozitol (I): Trong thực tế không làm.
 E.coli không phân giải đƣợc ure, không sinh H2S sau 48 giờ.
Trẩn Thị Hƣơng và công sự (2012), đã phát hiện trong thịt (lợn, bò, gà) ở một số
huyện ngoại thành Hà Nội có chứa vi khuẩn E. coli ( bao gồm E.coli O157: H7), gây
Trang 6


ngộ độc thực phẩm, tiêu chảy [9]. Ngoài ra vi khuẩn này cịn đƣợc tìm thấy trong mẫu
phân của trâu bị,…
I.1.5.3. Thơng tin bộ gen
Bộ gen của Escherichia coli có kích thƣớc khoảng 5,59 Mb, tỉ lệ %GC chiếm
khoảng 50,4%, vùng gen 16S rRNA khoảng 1542bp, mã hóa cho 7 locus khác nhau:
rrsA, rrsB, rrsC, rrsD, rrsE, rrsG, rrsH và 23S rRNA khoảng 2903bp.
I.1.5.4. Phân loại
Vi khuẩn E. coli đƣợc chia làm các serotype khác nhau dựa trên cấu trúc kháng

nguyên thân O, kháng nguyên giáp mô K, kháng nguyên lơng H và kháng ngun bám
dính F. Bằng phản ứng ngƣng kết các nhà khoa học đã t m ra đƣợc 250 serotype O, 89
serotype K, 56 serotype H và một số serotype F. [61]
Những chủng E.coli gây bệnh đƣợc xếp vào những nhóm sau: [60]
- EPEC ( enteropathogenic E.coli ) nhóm này có vùng đảo “pathogenicity” locus
for enterocyte effacement (LEE) mang nhiều yếu tố độc lực, và có vùng gen eae
(attaching and effacing, A/E) và tir (translocated intimin receptor) mã hóa cho intimin
và thụ thể intimin giúp cho sự bám dính lên niêm mạc ruột.
- ETEC ( enterotoxigenic E.coli ) để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính
lên trên các tế bào biểu mô của ruột non. Hầu hết các chủng ETEC đều có mang 1
hoặc nhiều yếu tố bám dính nhƣ : F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P), F17, F18, F41, F42,
F165 và chúng tiết 2 loại độc tố LT (heat labile) và ST (heat stable). Những dòng này
tiết ra 1 hoặc 2 loại độc tố tùy thuộc vào plasmid của chúng.
- EIEC (enteroinvasive E.coli) gây bệnh chủ yếu do khả năng xâm nhập vào
niêm mạc đại tràng. Khả năng xâm nhập đƣợc mã hòa bởi gen trên plasmid 140 MDa.
Các gen trên plasmid này mã hóa cho các kháng nguyên xâm nhập (IpA ( invasion
plasmid antigen) đến IpD). EIEC cịn có khả năng xuất độc tố ruột giống Shigella
đƣợc mã hóa bởi gen sen.
- VTEC (verotoxigenic E.coli) sản xuất độc tố Shiaga-like toxin (Slt), còn gọi là
Shiga toxin hay Verotoxin (VT). Họ độc tố Stl gồm 2 nhóm chính là Stx1 và Stx2 một
dịng có thể có 1 hoặc 2 loại hoặc cả 2. Ngồi ra cịn có gen eae và tir. Trong nhóm
này serotype O157:H7 chiếm khoảng 75% các trƣờng hợp gây bệnh từ VTEC trên
toàn thế giới.
Trang 7


I.1.6.

Listeria monocytogenes

I.1.6.1. Đặc điểm hình thái
Listeria monocytogenes là trực khuẩn
Gram dƣơng, h nh que, không tạo bào tử.
Chiều dài 1-2 µm và có thể tồn tại dạng đơn
hoặc đơi, cũng có trƣờng hợp ở dạng chuỗi
dài. Là vi khẩn có khả năng phát triển trong tế
bào. [12]

Hình I.6 – Hình thái tế bào L.
monocytogenes[82]

I.1.6.2. Đặc điểm sinh hóa, sinh dƣỡng
L. monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ rộng 1oC-45oC, tốt nhất là
quanh 45oC và ở pH 6-8, do đó nó có thể tồn tại thời gian dài trong thực phẩm. Đa số
các nhóm vi khuẩn khác có thể phát triển chậm ở nhiệt độ xuống thấp dƣới 4oC, tuy
nhiên L. monocytogenes là vi khuẩn ƣa lạnh, vẫn có thể tồn tại ở nhiệt độ dƣới -7oC và
vẫn phát triển tốt từ -18oC đến 10oC, sống đƣợc ở nhiệt độ trong tủ lạnh. [12]
Listeria monocytogenes có đặc điểm sinh hóa: catalase dƣơng tính (+), oxidase
âm tính (-), urease âm tính (-), có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên mơi
trƣờng thạch máu, có phản ứng CAMP (+) với S. aureus và (-) với Rhodococcus equi.
[12]
Listeria monocytgenes có kháng nguyên O (O-antigenic) và kháng nguyên H, 2
loại kháng nguyên này là căn cứ để chia vi khuẩn thành 13 chủng huyết thanh
(serotypes) khác nhau: 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4ab, và 7. Trong
đó 98% trƣờng hợp gây bệnh cho ngƣời là serotype 1a, 1b và 4b. Trong ba nhóm vừa
kể, th 4b là serotype độc hại nhất. Vi khuẩn tiết ra nội độc tố gây hoại tử.[21]
Chính vì khả năng sống đƣợc ở mơi trƣờng khắc nghiệt nên vi khuẩn này có
mặt khắp nơi: trong đất, nƣớc, thảm thực vật, nƣớc thải công nghiệp, trong các động
vật hoang dã, phân súc vật và cả phân ngƣời. L. monocytogenes thƣờng hiện diện
trong phô mai, sữa, thịt, cá, rau quả, nƣớc và các loại thức ăn gia súc...

Nguyễn Minh Trực và cộng sự (2008), đã phát hiện Listeria monocytgenes
trong mẫu thực phẩm nhƣ thịt, sữa tại nhà máy hoặc cửa hàng ở Hà Nội. [5]
I.1.6.3. Thông tin bộ gen

Trang 8