ỨNG DỤNG kỹ THUẬT sắp xếp dãy mô TRONG NGHIÊN cứu các dấu ấn ER, PR, HER2, KI67 ở BỆNH NHÂN UNG THƯ vú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
.....***.....

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮP XẾP DÃY MÔ TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC DẤU ẤN ER, PR, HER2, KI67
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2019
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

BỘ Y TẾ


.....***.....

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SẮP XẾP DÃY MÔ TRONG
NGHIÊN CỨU CÁC DẤU ẤN ER, PR, HER2, KI67
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ
Chuyên ngành: Xét nghiệm y học
Mã số: 8720601

LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS Tạ Văn Tờ

HÀ NỘI – 2019

LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới:


PGS.TS. Tạ Văn Tờ, người Thầy đã tận tình hướng dẫn, cung cấp cho
tôi những kiến thức, phương pháp luận quý báu, tạo mọi điều kiện thuận lợi,
động viên tôi trong quá trình học tập, triển khai nghiên cứu và hồn thành
luận văn.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu, Phòng Quản lý và
Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Giải phẫu bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội đã
tạo mọi điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin được cảm ơn tập thể Trung tâm Giải phẫu bệnh – Sinh học phân
tử Bệnh viện K đã cho phép, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong q
trình triển khai nghiên cứu và thu thập số liệu.
Cuối cùng, tôi xin gửi lịng biết ơn và tình cảm u q nhất đến Bố mẹ,
gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã hết lịng ủng hộ, động viên tơi trong suốt
q trình học tập và là động lực giúp tôi vượt qua những khó khăn để hồn
thành khóa học.
Tơi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2019

Học viên
Nguyễn Thị Thu Hương


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Thu Hương, học viên Cao học khóa 26, chuyên ngành
Xét nghiệm y học, Trường Đại học Y Hà Nội, xin cam đoan:
1. Đây là luận văn do tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của
PGS. TS Tạ Văn Tờ.
2. Cơng trình nghiên cứu này khơng trùng lặp với bất kỳ cơng trình
nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác,
trung thực và khách quan.
Tơi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này
Hà Nội, ngày tháng năm 2019
Học viên
Nguyễn Thị Thu Hương


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
HMMD
KHV
KN
KT
LS
MBH
TMA

TTNT
UTBM
UTV

Hóa mơ miễn dịch
Kính hiển vi
Kháng nguyên
Kháng thể
Lâm sàng
Mô bệnh học
Kỹ thuật sắp xếp dãy mô vi thể
Thụ thể nội tiết
Ung thư biểu mô
Ung thư vú


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1. Đại cương về ung thư vú........................................................................3
1.1.1. Giải phẫu tuyến vú..........................................................................3
1.1.2. Sinh lý tuyến vú..............................................................................3
1.1.3. Đặc điểm một số dấu ấn sinh học trong ung thư vú........................4
1.2. Đại cương về hóa mơ miễn dịch............................................................8
1.2.1. Khái niệm hóa mơ miễn dịch..........................................................8
1.2.2. Lịch sử hình thành và phát triển kỹ thuật nhuộm HMMD..............8
1.2.3. Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm HMMD.......................................10
1.2.4. Quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch.............................................16
1.3. Đại cương về kỹ thuật sắp xếp dãy mô................................................23
1.3.1. Khái niệm về kỹ thuật sắp xếp dãy mô.........................................23

1.3.2. Lịch sử phát triển của kỹ thuật sắp xếp dãy mô............................24
1.3.3. Kỹ thuật sắp xếp dãy mô...............................................................26
1.4. Một số nghiên cứu xác định dấu ấn ung thư vú thông qua kỹ thuật sắp
xếp dãy mô..................................................................................................30
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........33
2.1. Đối tượng và thời gian nghiên cứu.......................................................33
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................33
2.1.2. Thời gian nghiên cứu....................................................................33
2.2. Phương pháp nghiên cứu......................................................................33
2.2.1. Thiết kế nghiên cứu.......................................................................33
2.2.2. Cỡ mẫu và kỹ thuật chọn mẫu.......................................................33
2.2.3. Các chỉ số/biến số nghiên cứu.......................................................34


2.2.4. Phương pháp thu thập số liệu.......................................................34
2.2.5. Quy trình thu thập số liệu..............................................................34
2.2.6. Quản lý và phân tích số liệu..........................................................39
2.2.7. Đạo đức nghiên cứu......................................................................39
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU....................................................40
3.1. Quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô.....40
3.1.1. Về mặt kỹ thuật.............................................................................40
3.1.2. Nhược điểm và một số lỗi khi thực hiện kỹ thuật sắp xếp dãy mơ
trong q trình phân tích nghiên cứu......................................................43
3.2. So sánh tỷ lệ bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong ung thư vú bằng kỹ
thuật sắp xếp dãy mô miễn dịch với kỹ thuật truyền thống........................45
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN............................................................................52
4.1. Quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch bằng máy cho mẫu bệnh phẩm ung
thư vú sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô.....................................................52
4.2. So sánh tỷ lệ bộc lộ một số dấu ấn miễn dịch trong ung thư vú bằng kỹ
thuật sắp xếp dãy mô miễn dịch với kỹ thuật truyền thống........................57

KẾT LUẬN....................................................................................................66
KHUYẾN NGHỊ............................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1.

So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết ER qua phương pháp nhuộm
HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống...45

Bảng 3.2.

So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết PR qua phương pháp nhuộm
HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống...47

Bảng 3.3.

So sánh tỷ lệ bộc lộ thụ thể nội tiết Her2 qua phương pháp nhuộm
HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống........48

Bảng 3.4.

So sánh nhóm kết quả nhuộm hóa mơ miễn dịch các dấu ấn qua
phương pháp nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với
kỹ thuật truyền thống...................................................................50

Bảng 3.5.

So sánh tỷ lệ bộc lộ Ki67 trong ung thư vú qua phương pháp
nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô miễn với kỹ thuật
truyền thống.................................................................................51


DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn ER qua qua phương pháp
nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật
truyền thống..............................................................................46
Biểu đồ 3.2. Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn PR qua qua phương pháp
nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật
truyền thống..............................................................................47
Biểu đồ 3.3. Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn Her2 qua qua phương pháp
nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật
truyền thống..............................................................................49
Biểu đồ 3.4. Sự đồng nhất kết quả bộc lộc dấu ấn Ki67 qua qua phương pháp
nhuộm HMMD bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật
truyền thống..............................................................................51


DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1.

113 mẫu lấy bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô được đúc trong 6
khối nến, cắt nhuộm tiêu bản HE...............................................40

Hình 3.2.

113 mẫu lấy bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô được nhuộm các dấu

ấn ER, PR, Her2, Ki67...............................................................40

Hình 3.3.

Hình ảnh PR(+) độ phóng đại x100...........................................42

Hình 3.4.

Hình ảnh ER (+) độ phóng đại x100..........................................42

Hình 3.5.

Hình ảnh Her2 (3+) độ phóng đại x100.....................................43

Hình 3.6.

Hình ảnh Ki67 độ phóng đại x100.............................................43

Hình 3.7.

Các lõi mơ bị lệch vị trí trong q trình đúc khối nến...............44

Hình 3.8.

Khối nến ban đầu bị vỡ do lấy mẫu q mạnh...........................44

Hình 3.9.

Mẫu mơ nhuộm Her2 nền vùng có chất hoại tử........................44

Hình 3.10.

Hình ảnh Ki67 bong...................................................................44

Hình 3.11.

Hình ảnh khơng trình diện hết lõi mơ trên tiêu bản nhuộm ER độ
phóng đại x40.............................................................................45


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vú (UTV) là loại ung thư phổ biến nhất và cũng là nguyên nhân
chính gây tử vong do ung thư đối với phụ nữ trên toàn thế giới. Bệnh có tỷ lệ
mắc cao nhất ở các nước phát triển như ở Bắc Mỹ, Asutralia, Châu Âu và
chiếm 25% tỷ lệ tử vong do ung thư ở các nước này , . Theo số liệu của
GLOBOCAN vào năm 2012, thế giới có 1.671.149 ca mới mắc, số ca tử vong
là 521.907. Tại Việt Nam, số ca mới mắc là 11.000 và số ca tử vong là gần
5.000 ca .
Mặc dù UTV đứng hàng đầu trong các bệnh ung thư ở phụ nữ nhưng tỷ
lệ tử vong do bệnh đang được giảm dần nhờ sự tiến bộ trong phòng bệnh,
sàng lọc phát hiện sớm và điều trị, đặc biệt là điều trị bằng hóa chất, nội tiết
và sinh học , .
Một số yếu tố tiên lượng đã được xác định như giai đoạn bệnh, độ mô
học, loại mô học, tình trạng thụ thể nội tiết (TTNT), tình trạng bộ lộ yếu tố
tăng trưởng biểu mô, Ki-67. Thụ thể hormon Estrogen Receptor (ER),
Progesterol Receptor (PR) và bộc lộ yếu tố tăng trưởng biểu mô (Her2), Ki-67
nằm trong tế bào đã được xác định là những yếu tố tiên lượng liên quan đến
điều trị. Hiện nay, xác định bộc lộ 4 dấu ấn này đối với ung thư vú được thực

hiện thường quy bằng xét nghiệm hóa mơ miễn dịch (HMMD). Tuy nhiên hóa
chất sử dụng cho kỹ thuật HMMD khá đắt, vì vậy vấn đề đặt ra là làm thế nào
để làm xét nghiệm cho một số lượng lớn bệnh nhân ung thư vú với giá thành
thấp nhất mà vẫn đảm bảo đưa ra được kết quả chính xác để phục vụ cho công
tác điều trị. Kỹ thuật sắp xếp dãy mô đã được một số nước trên thế giới như
Mỹ, Australia,… sử dụng từ nhiều năm trước trong nghiên cứu , , . Ở Việt
Nam, một số cơ sở giải phẫu bệnh tại Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh đã
sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu HMMD nhưng chưa có nghiên cứu


2

nào đánh giá đầy đủ về các yếu tố liên quan và chất lượng của xét nghiệm khi
sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô trong xét nghiệm đánh giá tình trạng thụ thể
nội tiết, yếu tố phát triển biểu mô và Ki-67 trong ung thư biểu mô tuyến vú so
với xét nghiệm HMMD truyền thống. Để giải đáp những câu hỏi này, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu: “Ứng dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô trong nghiên
cứu các dấu ấn ER, PR, Her2, Ki67 ở bệnh nhân ung thư vú” với hai mục
tiêu:
1.

Mơ tả quy trình nhuộm hóa mơ miễn dịch bằng máy cho mẫu bệnh
phẩm ung thư vú sử dụng kỹ thuật sắp xếp dãy mô.

2.

So sánh kết quả nhuộm hóa mơ miễn dịch các dấu ấn ER, PR, Her2,
Ki-67 bằng kỹ thuật sắp xếp dãy mô với kỹ thuật truyền thống.

3

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về ung thư vú
1.1.1. Giải phẫu tuyến vú
Tuyến vú của phụ nữ trưởng thành nằm theo trục dọc từ xương sườn II
đến xương sườn VI, trục ngang nằm từ bờ bên xương ức cho đến đường nách
giữa, kích thước 10 - 12 cm, dày 5 - 7 cm. Hình dạng tuyến vú thường hình
chóp nhưng khác nhau theo từng cá thể, theo thời gian và sau khi sinh con.
Cấu trúc tuyến vú gồm 3 phần: da, mô dưới da và mô vú. Phần mô tuyến
vú gồm nhiều thùy (có thể từ 12 - 20 thùy). Giữa các thùy ngăn cách nhau bởi
các vách liên kết, mỗi thùy chia ra nhiều tiểu thùy, mỗi tiểu thùy tạo nên từ
các nang tuyến dài hoặc tròn, đứng riêng rẽ hoặc đứng tập trung thành đám
hoặc riêng rẽ. Các túi 2 - 3 nang đổ chung vào nhánh cuối cùng của ống bài
xuất trong tiểu thùy. Các ống này sẽ đổi vào các nhánh gian tiểu thùy và hợp
lại thành ống lớn hơn, cuối cùng tất cả các ống của một tiểu thùy đều đổ vào
một ống duy nhất đưa đến núm vú và mở ra bề mặt núm vú , .
1.1.2. Sinh lý tuyến vú
Tuyến vú phát triển từ tuổi dậy thì dưới tác dụng của estrogen và
progesterol, hai hormone này kích thích tuyến vú phát triển và chịu sự điều
hòa của FSH và LH từ tuyến yên , .
Estrogen làm tăng sinh biểu mô vú trong pha noãn của chu kỳ kinh
nguyệt. Trong pha này, biểu mô dài ra, tăng tổng hợp RNA, tăng tỷ trọng
nhân, nở to các hạt nhân và những thay đổi các thành phần khác trong tế bào.
Trong pha nang , ở thời điểm giữa chu kỳ, ở thời điểm estrogen được tổng
hợp và tiết ra nhiều nhất thì sẽ xảy ra rụng trứng.


4

Progesterol làm thay đổi biểu mô tuyến vú trong pha hoàng thể của chu
kỳ rụng trứng. Các ống tuyến vú giãn ra, các tế bào viểu mô nang sẽ hoạt hóa
thành các tế bào chế tiết , .
1.1.3. Đặc điểm một số dấu ấn sinh học trong ung thư vú

1.1.3.1. Thụ thể nội tiết
Những thay đổi biểu mô vú do các hormone điều chỉnh qua các thụ thể
steroid trong tế bào hoặc thụ thể peptid gắn với màng tế bào. Người ta đã tìm
thấy các thụ thể của ER và PR trong dịch bào tương của biểu mơ vú bình
thường. Khoảng 66% các bệnh nhân ung thư vú có ER và/hoặc PR dương tính
ở các tế bào u xâm nhập. Chỉ có một số ít bệnh nhân có ER âm tính đáp ứng
với liệu pháp nội tiết. UTV có thụ thể nội tiết dương tính thường đáp ứng tốt
với điều trị bằng hormon do đó tỷ lệ tái phát thấp hơn, thời gian sống thêm lâu
hơn so với bệnh nhân thụ thể nội tiết âm tính. Sự hiện diện của cả 2 thụ thể
ER và PR có tiên lượng tốt hơn so với hiện diện của một loại hormon. Những
bệnh nhân có cả thụ thể ER và PR có khoảng thời gian ổn định dài hơn, thời
gian sống thêm sau chẩn đoán tái phát cùng dài hơn , .
Các thụ thể nội tiết này được xác định và định lượng bằng kỹ thuật
HMMD. HMMD là kỹ thuật xác định sự hiện diện và vị trí của kháng nguyên
trong các thành phần tế bào như bào tương, màng tế bào, nhân bằng các phản
ứng miễn dịch và hóa học thơng qua việc xác định phức hợp kháng nguyên
(KN) - kháng thể(KT) nhờ một kháng thể đặc hiệu. Sau đó, nhờ hệ trống
khuếch đại bằng chất phát huỳnh quang (miễn dịch huỳnh quang) hoặc một
loại men (miễn dịch men) để phóng đại hệ thống nhận biết, tăng độ nhạy và
độ đặc hiệu của phương pháp.
1.1.3.2. Yếu tố phát triển biểu mô
Một số nghiên cứu cho thấy khoảng 15-20% UTV có sự bộc lộ quá mức
thụ thể yếu tố phát triển biểu mô Her2, điều này gây ra tình trạng tăng sinh tế
bào biểu mô vô hạn độ.

5

Họ Her gồm có 4 thụ thể là EGFR (erbB1 hay Her1), Her2 (erbB2 hoặc
p185, neu hay còn được gọi cách khác là Her2/neu), Her3 (erbB3) và Her4
(erbB4). Chúng là các thụ thể tyrosine kinase xuyên màng có liên quan chặt
chẽ với nhau , .
Cấu trúc của các thành viên họ Her rất giống nhau gồm một vùng ngoại
bào để gắn với phối tử, tiếp đó là vùng xuyên bào xoắn ốc và một vùng nội
bào có hoạt tính men tyrosine kinase, nhưng phối tử gắn vào chúng khác nhau
nên chức năng của mỗi loại trong tế bào là khác nhau. Hiện nay có ít nhất 11
phối tử liên quan với q trình dẫn truyền tín hiệu tế bào của họ Her. Mỗi loại
thụ thể thuộc họ Her đều tồn tại ở dạng đơn trùng (monomer) khi bất hoạt. Khi
gắn với các phối tử, chúng chuyển thành các đồng nhị trùng (homodinomer, như
Her1/Her1) hoặc dị nhị trùng (heterodinomer, như Her1/Her2) có hoạt tính, và
từ đó hoạt hóa men tyrosine kinase. Men tyrosine kinase là men xúc tác sự
vận chuyển phosphate từ ATP đến tyrosine trong các polypeptide (q trình
phosphoryl hóa). Chính sự phosphoryl hóa là hoạt động sống của tế bào.
Trong tế bào ung thư, sự phosphoryl hóa kích thích một loạt các con đường
đãn truyền tín hiệu, từ đó ảnh hưởng đến sự tăng sinh, tân tạo mạch máu và
ngăn cản quá trình chết theo chương trình .
EGFR là thụ thể đầu tiên trong họ Her được phát hiện vào năm 1978 .
Her2 là thụ thể thứ hai trong họ Her người được phát hiện vào năm 1984.
Her2 mã hóa một thụ thể tyrosine kinase xuyên màng, tương đồng với EGFR.
Cho đến nay, Her2 là thành viên duy nhất thuộc họ Her mà khơng có phối tử
nào trong họ này có thể hoạt hóa sự đồng nhị trùng hóa của nó. Thay vào đó,
Her2 giữ chức năng đầu tiên như là một đối tác dị nhị trùng hóa đối với các
thành viên khác trong họ Her như EGFR, Her3 hoặc Her4. Her2 thường bộc
lộ quá mức trong UTV, buồng trứng, phổi và dạ dày. Do vậy, Her2 là một dấu

ấn phân tử thường được dùng làm chỉ số tiên lượng cùng với EGFR trong


6

nhiều loại ung thư . Trên cơ sở hiểu biết về con đường dẫn truyền tín hiệu này
và vai trị của thụ thể thuộc họ Her trong ung thư, người ta đã nghiên cứu và
phát triển các loại thuốc ức chế một hoặc nhiều trong số các con đường này
14.
Các phương pháp đánh giá Her2:
Ngày nay, Her2 đã trở thành một yếu tố tiên lượng quan trọng trong
UTV. Có nhiều kỹ thuật đánh giá sự bộ lộ của Her2 được sử dụng:
Kỹ thuật hóa mơ miễn dịch – IHC:
Là phương pháp đã mô tả trong phần đánh giá ER và PR.
Ưu điểm: có độ chính xác và độ nhạy cao. Đây được coi là một xét
nghiệm tiêu chuẩn và thường quy được áp dụng để phát hiện sự khuếch đại
bất thường của gen Her2.
Nhược điểm: giá thành cao, thiết bị đắt tiền.
Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)
Đây là phương pháp đánh giá mức độ khuếch đại của gen.
Ưu điểm: đánh giá khách quan hơn, có độ nhạy và độ chính xác cao. FISH
có độ tương hợp khá tốt về kết quả so với HMMD với các trường hợp Her2 3+
nhưng chính xác hơn trong trường hợp Her2 2+ do đó giúp cho sự tiên lượng và
điều trị tốt hơn.
Nhược điểm: giá thành cao, thiết bị đắt tiền, việc đọc kết quả khó khăn
hơn, mất nhiều thời gian hơn, phải quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang và
không bảo quản được lâu , .
Kỹ thuật lai tại chỗ cố định màu CISH (Chromogenic In Situ Hybridization)
Đây cũng là phương pháp đo mức độ khuếch đại gen, được coi là một
phương pháp chọn lựa thay thế cho FISH. Phương pháp này kết hợp ưu điểm

của cả hai phương pháp HMMD và FISH. Với kỹ thuật này, gen Her2 được


7

phát hiện bằng phản ứng peroxidase quan sát dưới kính hiển vi quang học
thường .
Các kỹ thuật khác
+ Kỹ thuật khuếch đại gen RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction): là kỹ thuật phát hiện RNA thông tin của gen HER-2/neu
trong máu ngoại vi và trong tủy xương, cho thấy mức tương ứng với sự
khuếch đại gen cao hơn khi so với kỹ thuật nhuộm miễn dịch huỳnh quang.
Kỹ thuật này rất hữu ích trong việc đánh giá mức độ biểu hiện gen.
+ Kỹ thuật ELISA (Enzym Link Immuno Sorbent Assays): thực hiện
trên dịch bào tương lấy từ bệnh phẩm tươi, tránh được những nguy cơ của
việc tổn hại đến các kháng nguyên của quá trình xử lý và cố định bệnh phẩm.
Tuy nhiên, ngày nay khi u được phát hiện ở giai đoạn càng ngày càng sớm
hơn, kích thước u nhỏ hơn nên việc chiết xuất được dịch tế bào của u ngày
càng khó khăn hơn.
1.1.3.3. Ki-67
Sự biểu hiện protein Ki-67 có liên quan chặt chẽ với sự tăng sinh tế bào.
Ki-67 có mặt trong tất cả các pha hoạt động của chu trình tế bào (G1, S, G2
và phân bào), nhưng khơng có trong tế bào nghỉ (G0), làm cho nó trở thành
một dấu hiệu tuyệt vời để xác định sự tăng sinh và phân chia của tế bào. Chỉ
số Ki-67 rất cần thiết để phân biệt typ phân tử của UTV, giữa typ lòng ống A
và typ lòng ống B, phục vụ cho tiên lượng và xác định hướng điều trị cho
bệnh nhân .
Ki-67 còn được sử dụng là yếu tố tiên lượng trong UTV sớm được minh
chứng bằng một nghiên cứu trên 12.155 bệnh nhân cho thấy Ki-67 dương tính
có liên quan đến xác suất tái phát cao hơn ở tất cả bệnh nhân (HR = 1,93

(khoảng tin cậy 95% (CI): 1,74–2,14); P <0,001), ở bệnh nhân hạch âm (HR =
2,31) (KTC 95%: 1,83-22,92), P <0,001) và ở bệnh nhân dương tính nút (HR


8

= 1,59 (KTC 95%: 1,35–1,87); P <0,001). Hơn nữa, Ki-67 có liên quan đến tỷ
lệ sống kém hơn ở tất cả các bệnh nhân (HR = 1,95 (KTC 95%: 1,70-2,24; P
<0,001)), bệnh nhân hạch âm (HR = 2,54 (KTC 95%: 1,65–3,91), P <0,001)
và bệnh nhân dương tính nút (HR = 2,33 (KTC 95%: 1,83–2,95); P <0,001).
Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng dương tính Ki-67 có nguy cơ tái phát cao
hơn và tỷ lệ sống sót thấp hơn ở những bệnh nhân có UTV sớm .
1.2. Đại cương về hóa mơ miễn dịch

1.2.1. Khái niệm hóa mơ miễn dịch (HMMD)
Hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry, viết tắt là HMMD) là
phương pháp xác định vị trí kháng nguyên (KN) đặc hiệu hiện diện trong mô
hoặc tế bào (bào tương, màng tế bào, nhân) dựa trên phản ứng miễn dịch
(kháng nguyên - kháng thể) kết hợp với hóa chất .
Vì KN khơng thể quan sát hình thái được nên người ta phải xác định sự
có mặt của nó trên tế bào bằng các phản ứng miễn dịch và hóa học. Các vị trí
gắn kháng thể (KT) được xác định bằng cách đánh dấu trực tiếp lên chính KT,
hoặc bằng cách sử dụng một phương pháp đánh dấu phụ .
1.2.2. Lịch sử hình thành và phát triển kỹ thuật nhuộm HMMD
Với lịch sử hơn 70 năm, HMMD đã có một ảnh hưởng to lớn trong chẩn
đoán Giải phẫu bệnh (GPB), là một trong những kỹ thuật đang được phát triển
trở thành thường quy trong đa số phòng xét nghiệm GPB ở các nước phát
triển hiện nay.
Năm 1966, Graham và Karnosky phát triển phương pháp
Horseradish peroxidase. Năm 1967, Nakane và Pierce đã báo cáo về việc

sử dụng KT được gắn enzyme peroxidase cùng với chất nền như DAB
(3,3-diaminobenziden tetrahydrochlorid). Khi phương pháp enzyme ra
đời, rất nhiều nhược điểm của kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang đã được
khắc phục .


9

Từ đó, nhiều kỹ thuật gắn enzyme đã được phát triển như kỹ thuật men
chống men (PAP-Peroxidase-anti-peroxidase) được mô tả bởi Sterberger và
cộng sự (1970) , kỹ thuật sử dụng alkaline phosphatase của Engvall và
Perlman (1971), kỹ thuật cầu nối avidin-biotin (ABC) do Heitzman &
Richards (1974).
Năm 1977, Ness và Ash đề xuất việc sử dụng avidin-biotin cho miễn
dịch huỳnh quang. Kỹ thuật này đã bị biến đổi bởi Guesden (1979) và Hsu
(1981), sử dụng đánh dấu peroxidase cải ngựa 33. Đánh dấu avidin-biotin
đã được thay thế bởi đánh dấu steptavidin-biotin, là kỹ thuật được sử dụng
phổ biến trong các phòng thí nghiệm chẩn đốn 29. Hiện nay, hệ thống
polymer có đánh dấu được lựa chọn phổ biến cho hầu hết các phịng thí
nghiệm chẩn đốn.
Năm 1975, Kohler và Milstein đã mô tả KT u lai - một phương pháp cải
tiến lớn trong sản xuất KT đơn dòng. Trong những năm gần đây, khả năng sản
xuất peptid tổng hợp cả KT đơn dòng và KT đa dòng đã được nâng cao nhờ
sự phát triển mạnh mẽ trong lĩnh vực sinh học phân tử.
Năm 1970, Huang và cộng sự đã mô tả việc sử dụng enzyme trypsin trên
mảnh cắt paraffin để bộc lộ một số KN đã bị che lấp trong quá trình cố định và
chuyển đúc do quá trình cố định, chuyển đúc thông thường đã che lấp một số
epitope, phương pháp bộc lộ KN trên mơ vùi nến có những bước tiến quan
trọng . Năm 1991, Shi lần đầu tiên mơ tả về q trình tiền xử lý nhiệt bằng lị vi
sóng để xử lý mảnh cắt đã khử paraffin trong một dung dịch kim loại nặng 36.

Năm 1993, Cattoretti đã đề nghị thay thế dung dịch kim loại nặng thành dung
dịch Citrate buffer pH 6. Năm 1994, Norton cho rằng việc sử dụng nồi áp suất
hiệu quả hơn lò vi sóng trong việc bộc lộ một số KN. Sau đó, một vài tác giả đã
đưa ra một vài phương pháp bộc lộ khác như: để tủ ấm qua đêm ở 70 – 80 0C
trong Citrat, trong Tris EDTA hay trong acid boric,… .


10

Hiện nay, nhiều phương pháp nhuộm HMMD đã được thương mại hóa bởi
nhiều hãng như Dako, Leica, Thermo, Invitrogen, Cell Marque, Ventana,...
1.2.3. Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm HMMD
Là sự kết hợp đặc hiệu giữa KN và KT đặc hiệu. Phức hợp KN - KT này
được gắn với hệ thống nhận biết một cách trực tiếp hoặc gián tiếp để có thể
quan sát được trên kính hiển vi.
Miễn dịch huỳnh quang: Cho KT đặc hiệu gắn với chất phát huỳnh
quang và quan sát dưới kính hiển vi (KHV) huỳnh quang.
Miễn dịch enzyme: Cho KT đặc hiệu gắn với một loại enzyme
(Peroxidase hoặc Alkaline phosphatase) và chất gắn màu (Chromogen), quan
sát dưới KHV quang học , .
Ba thành phần chính tham gia vào HMMD là Kháng nguyên (Mô học),
Kháng thể (Miễn dịch học), hệ thống nhận biết (Hóa học).
1.2.3.1. Kháng nguyên

Kháng nguyên (KN) là một phân tử protein hay một polysaccharide,
nhưng nó cũng có thể là bất cứ loại phân tử nào, mang một hoặc nhiều vị trí
để gắn với kháng thể (KT). Những vị trí này được gọi là epitope – vị trí quyết
định KN, nó là vùng có tính đặc hiệu cao gồm một số ít các acid amin hoặc
các đơn vị monosacarid, chúng được nhận biết bởi một KT riêng biệt.
Cần bộc lộ epitope trước khi cho tiếp xúc với KT do những vùng có tính

đặc hiệu cao với từng loại KT này có thể bị che lấp trong quá trình cố định bằng
formol và chuyển đúc paraffin , .
1.2.3.2. Kháng thể
Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (bản chất là glycoprotein) của
cơ thể tạo ra để đáp ứng với sự hiện diện của các phân tử, sinh vật hoặc các


11

tác nhân khác.Kháng thể được sản xuất bởi các tế bào Lympho B cũng như
các tương bào (biệt hóa từ lympho B). Một KT miễn dịch là một phân tử
protein hình chữ Y bao gồm chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Mỗi loại kháng thể đều
khác nhau về cấu trúc và chức năng. Một KT chỉ có thể nhận diện một epitope
KN duy nhất. Vị trí gắn với epitope của KN gọi là paratope. IgG là kháng thể
được dùng phổ biến nhất trong HMMD .
1.2.3.3. Sự kết hợp KN – KT

Sự kết hợp KN - KT có ba đặc điểm là: thuận nghịch, đặc hiệu và tỏa
nhiệt. Sự kết hợp thuận nghịch khơng phải phản ứng hóa học, do vậy sau khi
kết hợp và phân ly thì cấu trúc hóa học của KN hoặc KT hầu như khơng thay
đổi. Tính đặc hiệu được hiểu là KT do KN nào tạo ra chỉ kết hợp đặc hiệu với
KN ấy. Dựa vào sự tỏa nhiệt trong phản ứng có thể chia KT thành 2 loại KT
“nóng” và KT “lạnh”. Các lực liên kết giữa một paratope với một epitope bao
gồm: lực hút tĩnh điện, lực liên kết yếu hydro, lực liên kết kỵ nước, lực Van de
Walls. Các lực này phải kết hợp với nhau thì liên kết KN - KT mới hình thành.
Như vậy, cấu hình của paratope phải phù hợp cao độ với epitope sao cho các lực
này đồng thời xuất hiện và đủ giá trị kết hợp .
Có hai loại kháng thể là KT đơn dòng (monoclonal antibody) và KT đa
dòng (polyclonal antibody). KT đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu.
KT đa dòng là tập hợp các KT đặc hiệu với các epitope khác nhau trên cùng

một KN.


12

Kháng thể đơn dịng

Kháng thể đa dịng

(Monoclonal)

(Polyclonal)

Hình 1.1: Kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng
KT đơn dòng được tạo ra từ một dòng tế bào plasma nên chúng giống hệt
nhau, đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng chỉ nhận biết một epitope của KN.
Các KT đơn dòng được biết đến từ năm 1975 khi Cesar Milstein và Georges
Kohle khám phá ra một kỹ thuật tạo ra một số lượng lớn các tế bào bạch
huyết, có khả năng sản xuất một dạng KT duy nhất bằng kỹ thuật u lai 40.
Loại KT này chỉ đáp ứng với một loại KN chuyên biệt, vì thế chúng được
đặt tên là KT đơn dòng. Để sản xuất KT đơn dòng, các tế bào bạch cầu
lymphocyte được kích thích đáp ứng miễn dịch sản sinh KT đặc hiệu. Các tế
bào lymphocyte sản sinh KT được lai với các tế bào ung thư có khả năng
phân chia vĩnh viễn tạo ra các dòng tế bào lai gọi là hybridoma. Dịng tế bào
lai hybridoma có điểm đặc biệt là khả năng tăng sinh vĩnh viễn và sản sinh
cùng loại KT trong môi trường nuôi cấy . Ưu điểm của loại KT này là không
cần một lượng lớn động vật mà vẫn thu được lượng KT nhiều bằng ni cấy
invitro, KT thu được tinh khiết, có tính đặc hiệu cao .

13

Kháng thể đa dòng được sản xuất bằng cách gây miễn dịch trên động vật
thường là thỏ, chuột lang, dê, bò, lợn với KN đặc hiệu cần quan tâm. Động
vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra nhiều loại KT khác nhau gồm cả KT đặc hiệu
và không đặc hiệu trong huyết thanh của chúng. Trong suốt thời kỳ đáp ứng
miễn dịch, động vật ln được duy trì miễn dịch bằng cách tiêm chất KN, sau
đó, thu thập máu để chắt lấy huyết thanh loại bỏ một số protein không cần
thiết bằng cách kết tủa với amonisulfat, sắc ký miễn dịch,… So với KT đơn
dịng thì KT đa dịng dễ sản xuất hơn và nhạy hơn .
1.2.3.4. Hệ thống nhận biết
Phức hợp KN - KT không thể quan sát được bằng KHV quang học nên
cần có một hệ thống tín hiệu để nhận biết vị trí xảy ra phản ứng KN - KT. Hệ
thống này có thể gắn trực tiếp vào KT1 (kỹ thuật trực tiếp) hay thông qua một
hoặc nhiều hệ thống KT phụ (kỹ thuật gián tiếp).
a. Nhận biết bằng enzyme
Trong HMMD, enzyme là chất nhận biết được dùng phổ biến nhất. Bằng
phản ứng enzyme - cơ chất sẽ tạo ra một sản phẩm màu ổn định và có thể
quan sát dưới kính hiển vi quang học. Trong kỹ thuật HMMD, enzyme được
sử dụng cần phải đảm bảo tạo ra một sản phẩm phản ứng khơng thể hịa tan,
màu rõ ràng, kết tủa trực tiếp tại sản phẩm đó đồng thời phải bền vững ở nhiệt
độ phịng, có thể sản xuất được nhiều và có thể duy trì hầu hết các hoạt động
của nó sau khi đã kết nối 42. Có nhiều loại enzyme và chất màu thích hợp để
người dùng lựa chọn màu sản phẩm phản ứng cuối cùng sao cho tạo ra sự
tương phản nhất. Hai loại enzyme được sử dụng rộng rãi do dễ sản xuất và giá
thành thấp là Peroxidase và Alkaline phosphatase.
Horseradish peroxidase (HRP) được phân lập từ rễ cây cải ngựa: là loại
enzyme được sử dụng rộng rãi nhất và kết hợp với chất màu thích hợp nhất là
DAB. HRP được dùng nhiều do kích thước nhỏ nên nó sẽ khơng gây cản trở

14

việc gắn của những vị trí kháng thể liền kề, dễ dàng trong việc tinh sạch do đó
hạn chế tối đa việc enzyme bị nhiễm, dễ dàng hạn chế sự hoạt động của
enzyme Peroxidase nội sinh 2943. Nó tạo ra sản phẩm phản ứng cuối cùng
màu nâu sẫm rõ nét, ổn định trong nhiều năm và không tan trong rượu và các
dung môi hữu cơ khác (Graham và Karnowky, 1966) . DAB là một chất độc
gây ung thư tiềm năng (Weisburger và cộng sự, 1978). Ngồi ra cịn một số
chất màu khác có thể thay thế DAB để thể hiện Peroxidase, bao gồm:
- AEC (3-amino-9-ethylcarbazole): tạo sản phẩm phản ứng màu đỏ hồng.
Màu đỏ do AEC tạo ra không bị nhầm với sắc tố melanin, vì vậy, AEC hay
dùng trong các bệnh của da. Nhưng AEC dễ bị hòa tan trong các dung môi
hữu cơ, không bền vững, dễ bị phai màu theo thời gian và cũng là một chất
gây ung thư nên AEC ít được sử dụng hơn DAB , ,
- CN (4-chloro-1-1naphthol): tạo sản phẩn phản ứng màu xanh 29, 46. , .
- Hanker - Yates reagent (Hanker và cs 1977): tạo sản phẩm phản ứng
màu xanh đậm .
- Alpha - naphthol pyronin: tạo sản phẩm phản ứng màu đỏ tím , .
Hoạt động của enzyme Peroxidase nội sinh cần được ngăn chặn đặc biệt
là ở các tế bào bạch cầu, hồng cầu, tủy xương, tế bào gan, cơ… Chất được
dùng phổ biến nhất để khử Peroxidase nội sinh là hydrogen peroxid methanol (H2O2) .
Alkaline phosphatase chiết xuất từ ruột bê: cũng được sử dụng làm
enzyme đánh dấu thay thế cho Peroxidase, đặc biệt là kể từ khi phương pháp
phức hợp APAAP được phát triển bởi Cordell và cộng sự (1984). Phương pháp
này sử dụng một số chất nền như: Naphthol AS - MX phosphat, naphthol AS BI phosphat, AS - TR phosphat, 5 - brom - 4 chloro - 3 - indoxyl phosphate
(BCIP) . Ưu điểm chính của phương pháp APAAP so với PAP (dùng enzyme
Peroxidase) là loại trừ được hoạt động của Peroxidase nội sinh do đó APAAP

15

khuyến khích sử dụng với máu và tủy xương ) . Một số chất màu sử dụng với
Alkaline phosphatase là: Đỏ TR, Xanh BB, Đỏ LB, GBC, Nitro Blue
Tetrazolium (NBT), Iodonitrotetrazolium (INT).
Hoạt động của Phosphatase nội sinh thường có ở xương, gan, thận và
một số bạch cầu được ngăn chặn bằng việc bổ sung Levamisol vào dung dịch
chất nền. Levamisol 1nM có tác dụng ức chế chọn lọc một số loại
phosphatase kiềm không phải nguồn gốc ruột hoặc rau thai.
b. Nhận biết bằng huỳnh quang
Miễn dịch huỳnh quang là KN được phát hiện bằng KT đã gắn sẵn một
chất màu huỳnh quang. Chất huỳnh quang được sử dụng nhiều nhất là
Flourescein. Flourescein hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 494nm và phát ra ánh
sang màu xanh nhạt đặc trưng ở 518nm, tetramethyl rhodamine isothiocyanate
hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 550nm và phát ra ánh sáng đỏ ở 580nm 48.
Rhodamine hấp thụ ánh sáng cực đại ở vùng ánh sáng xanh và phát ra ánh
sáng màu đỏ cam. Đỏ Texas và Phycoerythrin (PE) là hai màu huỳnh quang
khác ngày càng được sử dụng. Đỏ Texas hấp thụ và phát ra ánh sáng đặc
trưng tương tự Rhodamine, trong khi PE có phổ hấp thụ cực đại ở vùng ánh
sáng màu xanh và phát ra ánh sáng màu đỏ.
Đánh dấu bằng huỳnh quang có độ nhạy cao hơn, nhanh hơn, hạn chế
nhuộm nền và có thể định lượng so với đánh dấu bằng enzyme nhưng ta
không thể quan sát được cấu trúc mô trên tiêu bản nhuộm huỳnh quang cũng
như không quan sát được trên kính hiển vi quang học.
c. Nhận biết bằng kim loại gắn keo
Vàng keo là một dạng thủy dung thể của vàng, nghĩa là các hạt nano
của vàng sẽ nằm lơ lửng trong một loại dung dịch thường là nước. Nó có khả
năng gắn với protein rất nhanh và bền vững 4950. Do đó vàng keo là một kim
loại lý tưởng để gắn với KT, được dùng như một dấu ấn nhận biết. Nếu chỉ