Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của gối hạc leea rubra b

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN TRỌNG TRIỀU

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ HUYẾT
ÁP CỦA GỐI HẠC Leea rubra B.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

TRẦN TRỌNG TRIỀU
MÃ SINH VIÊN: 1501517

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ HUYẾT
ÁP CỦA GỐI HẠC Leea rubra B.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. TS. Hà Vân Oanh
2. TS. Lê Thị Xoan
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dược học cổ truyền

2. Khoa Dược lý - Viện Dược liệu

HÀ NỘI – 2020

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Hà Vân Oanh, TS. Lê Thị
Xoan, ThS. Phí Thị Xuyến – những người đã ln quan tâm, giúp đỡ và hướng
dẫn tơi tận tình trong suốt q trình thực hiện đề tài này.
Tơi xin cảm ơn các thầy cô, anh chị Bộ môn Dược học cổ truyền đã hỗ trợ, động
viên tơi trong q trình nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Phạm Thị Nguyệt Hằng cùng các anh chị trong khoa
Dược lý – Hóa sinh, Viện Dược Liệu đã luôn tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong q
trình thực hiện đề tài tại khoa; cảm ơn khoa Tài nguyên đã cung cấp mẫu dược
liệu cho đề tài, cảm ơn anh chị khoa Hóa thực vật đã giúp đỡ chuẩn bị mẫu nghiên
cứu.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, phịng Đào tạo cùng tồn thể thầy cô giáo,
cán bộ trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và
rèn luyện trong suốt 5 năm học vừa qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, thầy cơ đã
ln giúp đỡ, động viên tơi hồn thành khóa luận này.
Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020.

Sinh viên
Trần Trọng Triều


Bảng chữ viết tắt
ABTS

2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline6-sulfonic acid)

ACE

Angiotensin converting enzyme

Ang I

Angiotensin I

Ang II

Angiotensin II

BSC

Benzenesulfonyl chloride

COX

Cyclooxygenase

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl

FRAP

Ferric reducing antioxidant power

GAE

Gallic acid equivalent

HA

Acid hippuric

HHL

N-Hippuryl-His-Leu hydrate

5-LOX

Lipoxygenase

TEAC

Trolox equivalent antioxidant capacity

RAA

Renin-angiotensin-aldosterone


Danh mục bảng
STT

Nội dung

Trang

Bảng 3.1 Hoạt tính ức chế enzyme ACE của cao chiết Gối hạc

24

Bảng 3.2 Hoạt tính ức chế enzyme ACE của captopril

24

Bảng 3.3 Tác dụng của cao chiết Gối hạc lên huyết áp tối đa

26

(HATĐ) của chuột gây tăng huyết áp 2K1C
Bảng 3.4 Tác dụng của cao chiết Gối hạc lên huyết áp tối thiểu

27

(HATT) của chuột gây tăng huyết áp 2K1C
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của Gối hạc lên nhịp tim của chuột 2K1C

29


Danh mục hình
STT

Nội dung

Trang

Hình 1.1

Dược liệu Gối hạc

3

Hình 1.2

Cơ chế bệnh sinh trong tăng huyết áp

9

Hình 1.3

Cơ chế điều hóa huyết áp của ACE

15

Hình 2.1

Phản ứng phân cắt HHL của ACE

20

Hình 2.2

Phẫu thuật gây hẹp động mạch thận ở chuột cống

22

Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế ACE ở các nồng

25

độ của cao chiết Gối hạc và captopril
Hình 3.2

Kết quả HATĐ sau 4 tuần điều trị

26

Hình 3.3

Kết quả HATT sau 4 tuần điều trị

28

Hình 3.4

Kết quả nhịp tim sau 4 tuần điều trị

29


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 9
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU GỐI HẠC VÀ BỆNH TĂNG
HUYẾT ÁP ........................................................................................................ 11
1.1. Tổng quan về dược liệu Gối hạc .......................................................... 11
1.1.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................... 11
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến .......................................................... 11
1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Gối hạc ................................. 12
1.1.4. Thành phần hóa học. ...................................................................... 15
1.2. Tăng huyết áp và vai trò hệ renin-angiotensin (RAA) ...................... 16
1.2.1. Tăng huyết áp .................................................................................. 16
1.2.3. Mơ hình gây tăng huyết áp bằng hẹp động mạch thận ................. 20
1.3. Enzyme chuyển angiotensin ACE ....................................................... 21
1.3.1. Phân loại ACE ................................................................................. 21
1.3.2. Cấu trúc vùng hoạt động của ACE ................................................ 22
1.3.3. Đặc tính của ACE............................................................................ 23
1.3.4. Cơ chế hoạt động của ACE trong điều hòa huyết áp. ................... 23
1.4. Một số phương pháp phổ biến để xác định tác dụng ức chế enzyme
chuyển angiotensin. ........................................................................................ 24
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 27
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị ................................................................... 27
2.1.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu .............................................................. 27
2.1.2. Động vật thí nghiệm ........................................................................ 27
2.1.3. Hóa chất, thiết bị, dụng cụ .............................................................. 27
2.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................. 28


2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 28
2.3.1. Đánh giá tác dụng ức chế ACE trên in vitro ................................. 28
2.3.2. Đánh giá tác dụng hạ huyết áp của Gối hạc trên mơ hình chuột
tăng huyết áp 2K1C ...................................................................................... 30

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................... 33
3.1. KẾT QUẢ .............................................................................................. 33
3.1.1. Tác dụng ức chế ACE in vitro của dịch chiết Gối hạc ................ 33
3.1.2. Tác dụng hạ huyết áp trên mơ hình 2K1C .................................. 35
3.2. BÀN LUẬN............................................................................................ 40
3.2.1. Về phương pháp và quy trình thí nghiệm ...................................... 40
3.2.2. Về kết quả nghiên cứu .................................................................... 42
KẾT LUẬN ........................................................................................................ 46
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 47
DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................... 48


ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh tăng huyết áp hiện đang là một trong những nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên thế giới cũng như tại Việt Nam. Theo kết quả một nghiên cứu về
dịch tễ ở nước ta, hiện nay có 21,1% bệnh nhân mắc tăng huyết áp trong đó, tỷ lệ
bệnh nhân được phát hiện là 9,3% và bệnh nhân được điều trị là 4,7%. Tăng huyết
áp đóng vai trị như yếu tố nguy cơ chính của một số bệnh nguy hiểm như suy tim,
rung nhĩ, bệnh thận mạn, bệnh mạch máu ngoại vi, đột quỵ hoặc bệnh tim thiếu
máu cục bộ [29].
Trong các phác đồ điều trị tăng huyết áp hiện nay, nhóm thuốc ức chế ACE
vẫn ln là lựa chọn đầu tay cho bệnh nhân. Tuy nhiên, khi điều trị bằng các thuốc
nhóm này, bệnh nhân hay gặp phải một số tác dụng không mong muồn như ho
khan, mất vị giác, phát ban. Do đó, để tìm ra các thuốc an toàn hơn, một số nhà
khoa học trên thế giới đã tập trung hướng nghiên cứu tìm kiếm các chất ức chế
ACE từ tự nhiên. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, mưa nhiều,
độ ẩm cao và đặc điểm thổ nhưỡng đa dạng, tất cả tạo nên một nguồn tài nguyên
thực vật vô cùng phong phú. Do đó, chúng ta có tiềm năng lớn về nguồn nguyên
liệu để có thể phát hiện và khai thác các hợp chất mới có tác dụng ức chế ACE.
Dược liệu Gối hạc đã được đưa vào danh mục các vị thuốc cổ truyền thiết yếu

thuộc nhóm thuốc khu phong trừ thấp. Tuy nhiên, thông qua một số nghiên cứu
đã được thực hiện trước đây, cho thấy tiềm năng lớn về các tác dụng điều trị khác
của Gối hạc. Riêng về tác dụng hạ huyết áp, cho đến nay khả năng ức chế ACE
của Gối hạc mới chỉ được đánh giá trong một nghiên cứu sàng lọc tại Brazil, và
kết quả cho thấy Gối hạc có tác dụng ức chế ACE khá mạnh [11]. Ngoài ra, một
số loài cùng chi với Gối hạc cũng đã được nghiên cứu hoặc thường dùng điều trị
trong các bài thuốc hạ huyết áp [18].
Từ cơ sở đó, chúng tơi quyết định thực hiện một nghiên cứu toàn diện và đầy
đủ về tác dụng ức chế ACE của Gối hạc trên in vitro cũng như tác dụng hạ huyết
áp trên in vivo. Nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của Gối hạc Leea rubra B. được
tiến hành với mục tiêu sau:
9


1. Đánh giá tác dụng ức chế ACE trên in vitro của Gối hạc Leea rubra.
2. Đánh giá tác dụng hạ huyết áp của Gối hạc Leea rubra trên mô hình gây
hẹp động mạch thận một bên trên chuột cống trắng.

10


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU GỐI HẠC VÀ BỆNH TĂNG
HUYẾT ÁP
1.1.

Tổng quan về dược liệu Gối hạc

1.1.1. Đặc điểm hình thái
Dược liệu Gối hạc tên khoa học là Leea rubra Blume, thuộc họ Gối hạc
Leeaceae.

Cây thường mọc thành bụi dày, cao từ 1 – 1,5 m. Thân có rãnh dọc và
phình lên ở những mấu giống như gối con chim hạc (do đó có tên gọi Gối hạc).
Rễ củ màu hồng, trắng và vàng. Lá kép lông chim ba lần, phía trên hai lần,
phiến lá chét có răng cưa to, dài 5 – 11 cm, rộng 25 – 60 mm, gần như không
cuống. Hoa nhỏ màu hồng, mọc thành ngù ở đầu cành. Đường kính quả khoảng
6 – 7 mm, hạt 4 – 6 mm, dài 4 mm. Quả khi chín có màu đen, mùa hoa quả từ
tháng 5 – 10 [1],[3],[13].

Hình 1.1: Dược liệu Gối hạc (nguồn Monaco Nature Encyclopedia và
Territory Native Plants)
1.1.2. Phân bố, thu hái và chế biến
Dược liệu Gối hạc khá phổ biến với một số nước như Ấn Độ, Campuchia,
Malaysia, Indonesia, Thái Lan và Việt Nam. Ở nước ta, cây mọc nhiều vùng
đồi núi các tỉnh như Thái Ngun, Hịa Bình, Vĩnh Phúc... được gọi với các
11


tên khác như kim lê, bí đại, phì tử. Thường người ta đào lấy rễ vào mùa đông,
mang về rửa sạch, thái mỏng, phơi hay sấy khô [1],[3].
1.1.3. Công dụng và tác dụng dược lý của Gối hạc
Rễ Gối hạc vị đắng ngọt, tính mát, có tác dụng giảm đau, giảm nhức mỏi
thường dùng chữa các bệnh đau nhức xương khớp, tê thấp, đau bụng, rong
kinh [1],[3]. Những bài thuốc giảm đau có chứa Gối hạc được sử dụng phổ
biến ở một số nước châu Á như Việt Nam, Thái Lan, Trung Quốc...
Ngoài tác dụng giảm đau chống viêm, các nghiên cứu trên thế giới cũng
như ở Việt Nam đã tiếp cận Gối hạc về một số hoạt tính dược lý như khả năng
chống oxi hóa, kháng khuẩn và ức chế enzym chuyển angiotensin.
1.1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới
 Tác dụng chống oxi hóa
Năm 2013, nhóm nghiên cứu trường đại học Phetchaburi Rajabhat, Thái

Lan đã chứng minh được khả năng chống oxy hóa của lá Gối hạc. Mẫu dược
liệu được chiết với 2 dung môi là ethanol 95% và ethyl acetate. Quy trình thử
xây dựng dựa trên phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH và ABTS. Kết quả
nghiên cứu, dịch chiết ethanol thể hiện khả năng trung hòa gốc tự do DPPH và
ABTS mạnh (giá trị IC50 lần lượt là 0,031 ± 0,01 mg/ml và 0,913 ± 0,03 mg/ml)
trong khi đó dịch chiết ethyl acetate của Gối hạc thể hiện hoạt tính yếu (IC50 =
1,353 ± 0.09 mg/ml và 33,762 ± 0,76 mg/ml) [13].
Đến năm 2014, một trường đại học khác của Thái Lan, đại học Chiang
Mai, cũng đã cơng bố nghiên cứu đánh giá về hoạt tính chống oxy hóa của rễ
và thân Gối hạc bằng các phương pháp DPPH, ABTS và FRAP. Mẫu thử là
dịch chiết hexane, ethyl acetate và ethanol của dược liệu. Kết quả, dịch chiết
ethanol của rễ Gối hạc có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất trong cả 3
phương pháp đánh giá ABTS, DPPH và FRAP (TEAC lần lượt là 0,888 ±
0,001, 0,849 ± 0,02 và 0,733 ± 0,037) [26].
 Hoạt tính kháng khuẩn

12


Tác dụng kháng khuẩn của Gối hạc được đánh giá bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch và phương pháp pha lỗng dung mơi với 4 đại diện
gồm 2 vi khuẩn gram (+) là B. subtilis, S. aureus và 2 vi khuẩn gram (-) E. coli
và P. aeruginosa. Kết quả cho thấy, dịch chiết ethyl acetate của rễ Gối hạc là
mẫu có hoạt tính ức chế vi khuẩn mạnh nhất đối với vi khuẩn gram (+) (IZD =
15,5 ± 0,5 – 17,5 ± 0,5 mm, MIC = 0,098 – 1,562 mg/ml) [26].
 Tác dụng ức chế enzyme chuyển ACE
Năm 2007, nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế enzyme chuyển
angiotensin (ACE) trên in vitro của một số dược liệu tại Brazil đã được thực
hiện, trong đó bao gồm cả Gối hạc. Đây là nghiên cứu đầu tiên được công bố
trên thế giới phát hiện tác dụng liên quan đến ức chế ACE của loài này. Mẫu

Gối hạc sử dụng trong nghiên cứu là phần trên mặt đất chiết với ethanol, nồng
độ dịch chiết đạt 0.1 mg/ml. Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp
quang phổ hấp thụ khả kiến, với chất nền hippuryl-glycyl-glycine và chất tạo
phản ứng màu 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic. Kết quả cho thấy Gối hạc là một
trong 5 dược liệu có tác dụng ức chế ACE mạnh nhất với phần trăm ức chế là
57,0 ± 12,5% [11].
1.1.3.2. Nghiên cứu tại Việt Nam
Năm 2017, trong luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học và tác
dụng sinh học của cây Gối hạc (Leea rubra Blume ex spreng, họ Leeaceae)”,
tác giả Nguyễn Thị Phương đã trình bày kết quả về thử một số tác dụng sinh
lý liên quan đến hoạt tính chống viêm, giảm đau của cây Gối hạc. Mẫu nghiên
cứu là dịch chiết ethanol 96% từ rễ, thân, lá cây Gối hạc (GHR, GHT, GHL).
Tác dụng chống oxy hóa được đánh giá thông qua khả năng dọn gốc tự do
DPPH và superoxide. Kết quả chỉ ra đối với khả năng dọn gốc tự do DPPH, cả
3 mẫu GHR, GHT, GHL đều có tác dụng từ trung bình đến mạnh ( IC50 lần
lượt là 8,72; 19,71 và 25,94 μg/ml); tuy nhiên trong thử nghiệm dọn gốc
superoxide chỉ có mẫu GHR cho tác dụng với IC50 là 28,05 μg/ml.

13


Tác dụng chống viêm của Gối hạc được nghiên cứu trên cả in vitro thông
qua khả năng ức chế hoạt động của các enzyme quan trọng trong cơ chế của
quá trình viêm là lipoxygenase (5-LOX) và cyclooxygenase (COX-1, COX2); và in vivo thử với cao GHR và GHL ở 2 mức liều 100 và 200 mg/kg trên
cả mơ hình viêm cấp gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, và viêm mạn
trên mơ hình gây u hạt thực nghiệm bằng bơng. Kết quả: trên in vitro các mẫu
GHR, GHT, GHL cho tác dụng ức chế enzyme LOX và COX ở mức trung
bình; trên in vivo, trong mơ hình viêm cấp, mẫu GHR và GHL ở 2 mức liều
đều cho tác dụng ức chế phù tại các thời điểm 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ sau gây
viêm, cịn ở mơ hình viêm mạn, chỉ có duy nhất GHR liều 100 mg/kg không

thể hiện được tác dụng.
Tác dụng giảm đau của Gối hạc cũng được thử cả tác dụng giảm đau trung
ương và giảm đau ngoại vi, thơng qua các mơ hình mâm nóng và mơ hình gây
đau quặn bằng acid acetic. GHL và GHR được thử với 3 mức liều là 100, 200
và 400 mg/kg. Trong mơ hình gây đau quặn bằng acid acetic, GHL và GHR
đều thể hiện tác dụng giảm số cơn đau quặn, chủ yếu ở thời điểm 20 phút đầu
sau khi gây đau. Tuy nhiên, ở mô hình mâm nóng để thử tác dụng giảm đau
trung ương, các mẫu GHR và GHL đều không thể hiện được tác dụng.
Ngồi ra, nghiên cứu cịn đánh giá cả hoạt tính ức chế enzym protease
HIV-1 của cao ethanol tồn phần và các phân đoạn của Gối hạc bằng phương
pháp đo quang. Các mẫu cao ethanol toàn phần của GHL và GHT có tác dụng
ức chế protease HIV-1; và khi thử với các cao phân đoạn thì phân đoạn ethyl
acetat của lá và thân, cũng như phân đoạn n-hexan của lá Gối hạc đều có tác
dụng tốt. Đồng thời, một số hợp chất đã được phân lập từ Gối hạc cũng đã
được thử, và chỉ có hai hợp chất triterpene là acid maslinic và acid ursolic là
cho tác dụng mạnh [6].
Như vậy, trong khả năng hiểu biết của chúng tôi, trên thế giới chưa từng
có một nghiên cứu nào được cơng bố về đánh giá toàn diện tác dụng ức chế
ACE trên in vitro và tác dụng hạ huyết áp trên in vivo của dược liệu Gối hạc.
14


1.1.3.3. Một số nghiên cứu về tác dụng hạ huyết áp của các loài cùng chi
Leea
Cho đến nay, mới chỉ có duy nhất một nghiên cứu sàng lọc về tác dụng ức
chế ACE của một số dược liệu Brazil trong đó có Gối hạc. Cịn đối với các lồi
cùng chi Leea, cũng đã có những phát hiện về hoạt tính hạ huyết áp của một
số loài như Leea guineensis, Leea indica, bắt nguồn từ việc chúng được sử
dụng trong các bài thuốc cổ truyền.
Leea guineensis là một loài từ lâu đã được mơ tả có tác dụng lợi tiểu, cũng

như thường sử dụng trong một số bài thuốc về các bệnh tim mạch [18]. Năm
1997, lần đầu tiên nó được nghiên cứu về tác dụng ức chế ACE trong một
nghiên cứu sàng lọc. Phương pháp đánh giá trong nghiên cứu này dựa trên
phản ứng ACE cắt chất nền dansyl triglycine tạo thành dansyl glycine và
diglycine; sau đó định lượng dansyl glycine tạo thành bằng HPLC pha đảo.
Kết quả, dịch chiết aceton và ethanol từ lá của Leea guineensis đều cho tác
dụng ức chế ACE rất mạnh (lần lượt là 67% và 90%) [8].
Leea indica là một loài cùng chi với Gối hạc, tên Việt Nam là củ rối Ấn.
Đây là một dược liệu được sử dụng phổ biến ở Ấn Độ để điều trị các triệu
chứng đau đầu, đau nhức xương khớp, cơ bắp; lá và rễ dùng cho bệnh nhân đái
tháo đường, bệnh tim mạch... [9]. Trong một nghiên cứu sàng lọc hoạt tính ức
chế phosphodiesterase của các vị dược liệu thường dùng tại Thái Lan, dịch
chiết ethanol từ rễ của Leea indica cho thấy giá trị IC50 đạt 0,68 ± 0,13 μg/ml,
là một trong số 7 dược liệu có tác dụng mạnh nhất, trong tổng số 19 vị dược
liệu được sàng lọc. Hiện nay trong điều trị, các chất ức chế phosphodiesterase
thường được sử dụng trong một số bệnh tim mạch, ví dụ như tăng huyết áp
động mạch phổi [35].
1.1.4. Thành phần hóa học
Một số nghiên cứu tại Việt Nam và trên thế giới đã được thực hiện nhằm
xác định thành phần hóa học trong các bộ phận của cây thuốc Gối hạc. Những
nhóm hợp chất chính được xác định từ dịch chiết các bộ phận của Gối hạc bao
15


gồm các hợp chất phenolic, flavonoid, nhóm triterpenoid, sterol, carbohydrat
và acid hữu cơ [6],[13]. Hợp chất phenolic toàn phần định lượng được trong
lá Gối hạc lần lượt là 257,61 ± 12,97 mg GAE/g dịch chiết ethanol và 193,45
± 2,57 mg GAE/g dịch chiết ethyl acetate. Cùng với đó, xác định được trong
lá Gối hạc tổng lượng flavonoid là 663,59 ± 3,62 mg QE/g dịch chiết ethanol
và 347,34 ± 2,09 mg QE/g dịch chiết ethyl acetate [13].

Các hợp chất đã được phân lập từ lá Gối hạc: kaempferol, quercetin,
myricitrin,

europetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid,

rhamnetin-3-O-α-L-

rhamnopyranosid, juglanin, artabotrysid B, acid gallic, acid protocatechuic,
acid p-hydroxybenzoic, arctiin, β-sitosterol, daucosterol, acid ursolic, acid
oleanolic, acid maslinic, β-amyrin, huzhangosid D [2],[6],[32].
Các hợp chất được biết có trong rễ bao gồm acid gallic, β-sitosterol,
daucosterol. Hợp chất đã được phát hiện có trong thân Gối hạc gồm: acid gallic,
acid protocatechuic, stigmast-4-en-3,6-dion, daucosterol, lup-20(29)-en3β,6α-diol, β-sitosterol, goniothalamin [6].
Định lượng acid gallic trong Gối hạc cho kết quả rễ có hàm lượng cao nhất
là 0,236%, tiếp theo là lá và thân lần lượt là 0,142% và 0,116%. Cùng với đó,
hàm lượng europetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid trong lá Gối hạc đạt 0,097%
[6].
Như vậy, những hợp chất hóa học đã được biết đến có trong Gối hạc thuộc
2 nhóm chính là triterpenoid và flavonoid. Những flavonoid có thể có vai trị
quan trọng trong tác dụng hạ huyết áp dựa vào những nghiên cứu trước đây về
tác dụng hạ huyết áp của nhóm hợp chất này [22].
1.2.

Tăng huyết áp và vai trò hệ renin-angiotensin-aldosteron (RAA)

1.2.1. Tăng huyết áp
Tăng huyết áp là bệnh mạn tính phổ biến, một trong những nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu hiện nay. Theo kết quả một nghiên cứu về dịch tễ tăng
huyết áp tại Việt Nam, tỷ lệ mắc tăng huyết áp ở nước ta là 21,1% dựa trên 10

16


nghiên cứu, và 18,4% dựa trên 3 khảo sát quốc gia. Tỷ lệ bệnh nhân phát hiện
tăng huyết áp là 9,3% và bệnh nhân được điều trị là 4,7% [29].
1.2.2. Cơ chế bệnh sinh
Có rất nhiều yếu tố liên quan đến cơ chế gây tăng huyết áp ở bệnh nhân và
vai trị tương đối của những yếu tố này có thể khác nhau giữa các cá thể. Trong
đó, các yếu tố chính đã được khẳng định có vai trị quan trọng là hệ RAA và
hệ thống thần kinh giao cảm. Ngồi ra, cịn có một số yếu tố mơi trường như
lượng muối hàng ngày, béo phì và kháng insulin, liên quan di truyền và rối
loạn chức năng nội mô... [21].
Co mạch thận
Tái hấp thu muối nước
Giải phóng renin

Thần kinh giao cảm

Hệ RAA
Angiotensin II

Giải phóng
norepinephrine
Co mạch
Nhịp tim, co bóp tim

Tái hấp thu muối nước

Co mạch

Có thể gây phì đại, xơ
hóa mạch máu

Tăng huyết áp

Chế độ ăn nhiều
muối

Béo phì và
kháng insulin

Di truyền

Hình 1.2: Cơ chế bệnh sinh trong tăng huyết áp [36],[43].
17


 Hệ thần kinh giao cảm
Hơn 50 năm trước khi có thuốc hạ huyết áp, việc phẫu thuật cắt hạch giao
cảm cục bộ để điều trị tăng huyết áp đã được sử dụng, đó là một dấu hiệu sớm
chứng minh cho vai trò của thần kinh giao cảm với tăng huyết áp. Đối với bệnh
nhân tăng huyết áp, tăng hoạt động thần kinh giao cảm và giảm hoạt động phó
giao cảm trên tim đều có liên quan đến việc huyết áp cao kéo dài. Việc tăng
hoạt động giao cảm đã được chứng minh ở cả những người gia đình có tiền sử
tăng huyết áp, những người tăng huyết áp giai đoạn đầu [21],[28].
Hệ thống thần kinh giao cảm điều chỉnh cân bằng nội môi tim mạch bằng
cách ảnh hưởng đến huyết áp thông qua sức cản mạch máu, nhịp tim và sự co
bóp của tim. Ngồi ra, nó cũng điều chỉnh chức năng thận bằng cách điều chỉnh
sự tái hấp thu natri và nước. Hơn nữa, khi hoạt hóa giao cảm quá mức có thể
liên quan đến các thể lâm sàng như tăng huyết áp áo choàng trắng hoặc rung

nhĩ, góp phần làm tăng huyết áp mãn tính, nếu khơng được điều trị, và có thể
dẫn đến tổn thương tạng như nhồi máu cơ tim, đột quỵ, bệnh cơ tim và suy
thận. Các cơ chế mà hệ thống thần kinh giao cảm gây tăng huyết áp kéo dài là
phức tạp [20],[19].
Trung tâm điều hòa tim mạch nằm ở vùng dưới đồi, nhận tín hiệu từ truyền
về dây thần kinh hướng tâm. Tín hiệu có thể từ các thụ thể cảm áp nằm ở quai
động mạch chủ và xoang động mạch cảnh, hoặc từ việc hoạt hóa Ang II... sau
đó các tín hiệu đáp ứng được truyền đến hệ giao cảm hoặc phó giao cảm để
đưa ra các điều chỉnh ở tim, mạch máu hoặc thận, có thể tác động đến việc giải
phóng renin và vasopressin làm ảnh hưởng đến tái hấp thu nước và muối. Hai
con đường chính điều chỉnh huyết áp của hệ thần kinh giao cảm là thông qua
hệ thống thụ thể áp lực động mạch và hệ thần kinh giao cảm thận [19].
 Hệ RAA
Hệ RAA bao gồm các thành phần: renin là một protease; angiotensin I
(Ang I) là cơ chất của enzyme ACE trong phản ứng cắt 2 peptide tạo thành
angiotensin II (Ang II) , sau đó Ang II sẽ thể hiện tác dụng thơng qua việc gắn
18


với các thụ thể tại nhiều vị trí khác nhau, một trong số đó là tại tuyến thượng
thận để kích thích tiết aldosterone [5],[10].
Thành phần khởi đầu cho hệ RAA là renin – một loại protease do bộ máy
cận cầu thận sản xuất. Tiền chất của renin là prorenin thường tồn tại trong
huyết tương với nồng độ gấp 5-10 lần renin hoạt hóa. Nguồn gốc của prorenin
khơng chỉ có ở thận mà có thể ở nhiều vị trí khác tiết ra. Prorenin sẽ được
chuyển hóa thành renin nhờ các lysosome trong tế bào cận cầu thận, sau đó
renin tạo ra sẽ được dự trữ ở các tế bào này. Khi renin được tiết ra, nó sẽ có
tác dụng chuyển hóa tiền chất angiotensinogen trong huyết tương để tạo thành
angiotensin I [5],[33].
Ang I là một decapeptid nội sinh, hoạt động với vai trị tiền chất của chất

co mạch angiotensin II thơng qua phản ứng phân cắt của ACE. Cấu trúc cơ bản
của nó là: H2N-Asp–Arg–Val–Tyr–Ile–His–Pro–Phe–His–Leu-COOH. Phản
ứng phân cắt của ACE sẽ cắt dipeptide His-Leu ra khỏi Ang I tạo thành Ang
II [5],[33].
Ang II được biết đến như là tác nhân chính của hệ RAA, và thể hiện các
tác động liên quan đến con đường endocrine, paracrine và autocrine. Cụ thể,
Ang II có hai tác dụng chính làm tăng huyết áp: (1) thứ nhất là gây co mạch
nhanh chóng và mạnh mẽ các tiểu động mạch, và co tĩnh mạch có mức độ; (2)
thứ hai là gây giữ muối nước ở thận bằng cách trực tiếp gây co mạch thận do
đó giảm lưu lượng máu qua thận hoặc gián tiếp thông qua kích thích bài tiết
aldosteron làm tăng tái hấp thu muối nước ở ống thận, trong đó tác động trực
tiếp có lẽ mạnh hơn 3-4 lần [5],[33].
Một trong những yếu tố kích hoạt hệ RAA là lưu lượng dịng máu đến thận
bị giảm xuống, khi đó renin sẽ được giải phóng từ bộ máy cận cầu thận và lần
lượt tạo ra Ang I và Ang II [5]. Do đó, trên nghiên cứu thực nghiệm, để đánh
giá những tác động lên huyết áp thông qua hệ RAA của một thuốc, các nhà
khoa học đã ứng dụng việc gây hẹp động mạch thận để xây dựng mơ hình tăng
huyết áp cho động vật thí nghiệm.
19


1.2.3. Mơ hình gây tăng huyết áp bằng hẹp động mạch thận
Dựa trên nguyên lý hoạt hóa hệ RAA được xây dựng từ mơ hình ban đầu
của Goldblatt, các mơ hình gây tăng huyết áp trên động vật đã được phát triển
và cải tiến, nhằm cung cấp các công cụ cho việc nghiên cứu cơ chế bệnh sinh
của tăng huyết áp hoặc một số bệnh là hậu quả của tăng huyết áp, cũng như
thử nghiệm hiệu quả điều trị của các thuốc.
 Mơ hình one kidney one clip (1K1C)
Trong mơ hình 1K1C, một bên thận của động vật thí nghiệm bị cắt bỏ,
trong khi bên thận còn lại sẽ bị thắt hẹp động mạch thận bằng một dụng cụ kẹp.

Giai đoạn tăng huyết áp ban đầu đặc trưng bởi nồng độ renin gia tăng nhanh
chóng để đáp ứng với việc giảm lưu lượng máu thận, và do đó angiotensin II
tăng cao trong máu. Tuy nhiên rất nhanh sau đó, thể tích tuần hồn tăng sẽ tạo
áp lực làm tăng lưu lượng máu đến thận cịn lại, renin khi đó sẽ khơng được
giải phóng. Lúc này, tăng huyết áp phụ thuộc vào thể tích tuần hồn. Do đó,
tăng huyết áp trong mơ hình 1K1C phụ thuộc vào thể tích tuần hồn nhiều hơn
là hệ RAA. Mơ hình này thường được dùng trong các nghiên cứu đánh giá tác
dụng lợi tiểu và tỷ lệ suy thận cao hơn so với các mô hình khác [7],[38].
 Mơ hình two kidney one clip (2K1C)
Khác với 1K1C, trong mơ hình này, một bên thận sẽ bị gây hẹp bởi dụng
cụ kẹp, bên thận còn lại sẽ được giữ nguyên. Do còn một thận hoạt động bình
thường nên ở giai đoạn đầu, cơ chế gây tăng huyết áp chủ yếu phụ thuộc vào
angiotensin II có nồng độ cao trong máu, gây co mạch tăng sức cản ngoại vi
đồng thời, tác động lên hệ thần kinh giao cảm làm tăng dần hoạt tính giao cảm.
Tuy nhiên, ở khoảng thứ 6, angiotensin II tăng cao kéo dài làm aldosterone
theo đó cũng giải phóng liên tục gây giữ muối nước làm thể tích tuần hồn
tăng dần. Lúc này, lưu lượng máu đến thận bị hẹp tăng ức chế tiết renin do đó,
huyết áp sẽ phụ thuộc vào hoạt tính giao cảm và thể tích tuần hồn. Mơ hình
2K1C cho kết quả chuột tăng huyết áp chậm hơn và thấp hơn so với mơ hình
1K1C [7],[38].
20


Năm 2017, mơ hình này lần đầu được thử nghiệm ở Việt Nam trong một
nghiên cứu xây dựng mơ hình tăng huyết áp trên chuột cống đăng trên tạp chí
Y Dược học quân sự. Trong nghiên cứu này, động mạch thận được gây hẹp
bằng cách đặt một nòng kim luồn đường kính 400 µm song song và áp sát động
mạch thận. Sau đó, dùng sợi chỉ thắt chặt động mạch thận và nịng kim ln
rồi rút nhẹ nhàng nịng kim luồn ra khỏi mối buộc. Nghiên cứu này cho kết
quả thành cơng trong xây dựng mơ hình tăng huyết áp chuột khi gây tăng cả

huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương ở nhóm chuột phẫu thuật [4].
 Mơ hình two kidney two clip (2K2C)
Mơ hình này có cơ chế gây tăng huyết áp tương tự như mơ hình 2K1C.
Gây hẹp cả 2 thận có thể làm huyết áp tăng nhanh hơn so với gây hẹp 1 bên
thận. Tuy nhiên, thận bị tổn thương nhiều hơn so với quan sát ở mơ hình 2K1C,
gây ra tỉ lệ đột quỵ cao hơn đáng kể so với cả hai mơ hình 1K1C và 2K1C
[7],[39].
1.3.

Enzyme chuyển angiotensin (ACE)

Enzym chuyển angiotensin (ACE) là thành phần quan trọng trong hệ RAA,
có tác dụng gây tăng huyết áp theo 2 cơ chế là tạo ra chất co mạch mạnh
angiotensin II và thoái giáng chất giãn mạch bradykinin. Do đó, đây là một
trong những đích tác dụng lý tưởng cho các thuốc điều trị hạ huyết áp, cụ thể
là nhóm ức chế men chuyển. Việc nghiên cứu sâu về cơ chế phân tử của ACE
có thể mở ra con đường tìm kiếm các chất ức chế men chuyển có tác dụng
mạnh và ít tác dụng khơng mong muốn trên bệnh nhân.
1.3.1. Phân loại ACE
ACE là một dipeptide thuộc siêu họ metallopeptidases zinc, được phát hiện
năm 1954 bởi Skeggs và cộng sự, và được Das và Soffer phân loại năm 1975.
Cơ thể người tồn tại 2 dạng chủ yếu của ACE là sACE (trọng lượng phân
tử 180 kDa) và tACE (trọng lượng phân tử 110 kDa) được phiên mã bởi cùng
một gen nhưng lại khác nhau về cấu trúc (kích thước phân tử và số lượng vị trí
hoạt động) và hoạt tính sinh lý.
21


sACE là một glycoprotein bề mặt, cấu tạo từ 1306 amino acid, chủ yếu
nằm ở bề mặt trong của phổi, thận, ruột, nhau thai, ngồi ra có một phần nhỏ

tồn tại ở dạng hịa tan trong huyết tương. Trình tự chuỗi acid amin của sACE
được chia thành nhiều vùng đặc trưng: 1 peptid tín hiệu (giữa Met1 và Ala29);
các miền chức năng (giữa Leu30 và Arg1256); một vùng xuyên màng (giữa
Val1257 và Ser1277); và đuôi tế bào chất (giữa Gln1278 và Ser1306). Về cấu
trúc, sACE được cấu tạo từ 2 miền có đặc tính lý hóa và chức năng riêng biệt
là miền N (vùng giữa Leu30 và Pro630) và miền C (vùng giữa Pro631 và
Arg1232). Hai miền này có thể dễ dàng phân biệt dựa vào độ dài chuỗi, trình
tự amino acid đơn, tính ổn định nhiệt, dễ bị phân giải và biến tính protein, ái
lực với cơ chất và chất ức chế và phụ thuộc vao ion Cl- [33],[40].
tACE cũng tồn tại dưới dạng protein màng, chỉ có trong tinh hồn, đóng
vai trị trong việc thụ tinh. Về mặt cấu trúc, tACE tương đồng với miền C của
sACE ngoại trừ chuỗi O-glycosylate. Nó rất kỵ nước, do đó, gắn được với
màng plasma [33],[40].
1.3.2. Cấu trúc vùng hoạt động của ACE
ACE thuộc vào siêu họ gluzincin, nhóm enzyme phụ thuộc kẽm. Vùng
hoạt động của nhóm này có trình tự thơng thường như sau: His-Glu-X-XHis...Glu-X-X-X-X. Cụ thể đối với ACE, trình tự vùng hoạt động là His–Glu–
Met–Gly–His. . .Glu–Ala–Ile–Gly–Asp với khoảng giữa là 23 acid amin.
Vùng hoạt động này có ở cấu trúc của cả 2 miền: miền N, kẽm sẽ gắn với
His390, His394 và Glu418; trong khi ở miền C, His988, His992 và Glu1016
sẽ cung cấp liên kết với kẽm. Tuy cùng có vùng hoạt động nhưng chắc năng
của 2 miền này là khác nhau [41].
Việc hiểu rõ cấu trúc và chức năng vùng hoạt động của từng miền chính là
cơ sở cho hướng nghiên cứu các hợp ức chế men chuyển chọn lọc có thể làm
giảm một số tác dụng không mong muốn khi dùng lâu dài trên bệnh nhân.

22


1.3.3. Đặc tính của ACE
Đặc tính enzym của ACE đó là nó hoạt động với tư cách một dipeptyl

cacboxypeptidase có khả năng giải phóng dipeptit đầu C từ các cơ chất có một
nhóm -COOH tự do cuối cùng. ACE ưu tiên phân cắt những cơ chất có các
amino axit kị nước tại vị trí thứ 3 từ dưới lên và có ít ái lực với những cơ chất
có các amino axit dicacboxylic đầu C (Glu, Asp) hoặc với prolin ở vị trí cuối
cùng [16]. Chức năng sinh lý chính của ACE là tạo ra hormone co mạch 8
peptid với tên gọi angiotensin II đồng thời tham gia giáng hóa một chất nội
sinh khác là bradykinin. Ngồi ra, nó cũng thủy phân không đặc hiệu một số
peptid sinh lý quan trọng như cholecystokinin, luliberin và hợp chất P [33].
1.3.4. Cơ chế hoạt động của ACE trong điều hòa huyết áp
ACE tham gia điều hịa huyết áp chủ yếu thơng qua tác động lên 2 cơ chất
là angiotensin I và bradykinin.
 Hoạt động của ACE trong hệ renin-angiotensin
Khi có các tín hiệu kích thích, bộ máy cận cầu thận sẽ giải phóng renin để
đáp ứng với các tín hiệu hoạt hóa hệ giao cảm, huyết áp thấp, phong tỏa tín
hiệu hoặc sản xuất Ang II hoặc giảm nồng độ natri tại ống lượn xa. Sau đó,
Ang I sẽ được tạo ra nhờ renin phân cắt angiotensinogen. Lúc này, dưới tác
dụng của ACE, 2 acid amin từ Ang I sẽ bị phân cắt để tạo ra Ang II từ đó sẽ
gây ra các đáp ứng như co mạch hoặc kích thích sản xuất aldosterone [12],[41].
 Hoạt động của ACE trong hệ thống kallikrein-kinin.
Khi huyết áp trong cơ thể tăng lên, hệ thống này sẽ được hoạt hóa nhằm
mục đích tạo ra bradykinin là một chất giãn mạch mạnh thơng qua cơ chế giải
phóng NO. Dưới tác dụng của ACE, bradykinin sẽ bị bất hoạt, khơng gây ra
được tác dụng giãn mạch, do đó huyết áp vẫn tiếp tục duy trì mức cao [33].
Do ACE tham gia giáng hóa bradykinin nên sử dụng các thuốc nhóm ức
chế ACE có thể gây tích lũy bradykinin gây ra một số tác dụng phụ như ho kéo
dài hoặc nghiêm trọng hơn là phù mạch. Đã có những nghiên cứu chứng minh
23


tác dụng thủy phân của ACE đối với angiotensin II có sự tham gia của cả 2

miền C và N, tuy nhiên miền C đóng vai trị chính. Cịn đối với bradykinin, vai
trò cả 2 miền là tương đương nhau [33]. Do đó, một trong những giải pháp để
hạn chế việc tích lũy bradykinin khi dùng nhóm ức chế men chuyển là nghiên
cứu tìm kiếm các chất ức chế chọn lọc trên miền C của ACE.
Bradykinin

Angiotensin I

+

ACE

+
Giải phóng
NO
Dạng bất
hoạt

Angiotensin II

Giãn mạch
AT2

AT1

Hạ huyết áp
Tăng hoạt tính
giao cảm

Co mạch

Giữ muối nước

Tăng huyết áp
Hình 1.3: Cơ chế điều hịa huyết áp của ACE [12],[33],[36].
1.4.

Một số phương pháp phổ biến để xác định tác dụng ức chế ACE
Sau khi vai trò của ACE được phát hiện và nghiên cứu rõ, nó đã trở thành

đích tác dụng để tìm kiếm các nhóm thuốc điều trị mới cho bệnh nhân tăng
huyết áp. Và trong quá trình nghiên cứu, yêu cầu đặt ra là cần có những phương
24


pháp để thử hoạt tính ức chế enzyme trên in vitro trước khi được thử tiếp trên
in vivo. Do đó, các phương pháp mới đã được xây dựng và ngày càng được cải
tiến.
 Phương pháp quang phổ tử ngoại
Được xây dựng bởi Cushman and Cheung năm 1971. Trong phương pháp
này, cơ chất Hip-His-Leu (HHL) bị thủy phân bởi ACE tạo thành aicd hippuric
(HA). HA sẽ được chiết bởi ethyl acetate và được định lượng bằng phương
pháp đo quang ở bước sóng 228 nm.
Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là quy trình phức tạp, tốn
thời gian và khi chiết HA bằng ethyl acetate có thể lẫn cả HHL chưa bị thủy
phân. HHL cũng có độ hấp thụ đáng kể ở bước sóng 228 nm do đó kết quả có
thể định lượng quá mức HA [15],[17].
 Phương pháp quang phổ khả kiến.
Để khắc phục nhược điểm của phương pháp quang phổ tử ngoại, năm 2005,
một số nhà nghiên cứu khác đã thực hiện những cải tiến trong quy trình ban
đầu. HA không được chiết tách khỏi hỗn hợp phản ứng, thay vào đó, hợp chất

đo quang được tạo ra bởi phản ứng gắn đặc hiệu giữa HL và 2,4,6trinitrobenzen sulphonate hoặc phản ứng giữa HA và benzene sulphonyl
chloride (BSC) trong mơi trường có quinolone.
Phương pháp này có quy trình đơn giản hơn, độ nhạy cao và hiệu quả hơn
[15].
 Phương pháp quang phổ liên tục
Một quy trình khác, đó là sử dụng phản ứng ACE phân cắt N-(3-[2-furyl
acryloyl)-Phe-Gly-Gly, tạo ra 2-furylacryloyl-L-Phe và Gly–Gly. Phương
pháp quang phổ liên tục này dựa trên sự thay đổi màu xanh trong phổ hấp thụ
ở khoảng bước sóng 328 đến 352 nm do cơ chất bị phân cắt tạo thành
furanacryloyl và một dipeptide Gly-Gly [24].

25