Thiết lập qui trình southern blot 1

1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1ĐẶT VẤN ĐỀ
Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên
thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự
chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21. Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và
ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các
loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Đây là một hướng nghiên cứu mới
có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được
đầu tư phát triển sản xuất.
Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về
sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase
Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP
(Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP
(Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng
nghiên cứu về acid nucleic. Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen.
Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính
xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng quan
trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di
truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen.
Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự
Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát
triển và hoàn thiện phương pháp. Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm
Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Thiết lập qui trình Southern blot ”.

1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas

fluorescens trong điều kiện phòng thí nghiệm.
2
1.2.2 Yêu cầu
- Tạo được mẫu lai từ sản phẩm cắt genomic DNA bằng các enzyme giới hạn.
- Tạo được phân tử probe đánh dấu từ sản phẩm PCR.
- Thiết lập được phản ứng lai và phát hiện sản phẩm lai trên phim X – ray.

3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Southern blot, một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được
phát triển vào giữa thập niên 1970 do Ed Southern ở MRC một bộ phận của genome
động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975). Đã gần 30 năm trôi qua, kĩ thuật lai
Southern đã được cải tiến đi rất mhiều, chủ yếu bao gồm:
- Tăng độ nhạy
- Giảm một số bước trong quá trình lai
- Giảm thời gian thực hiện
- Về kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn trước nhiều.
Theo đó, một số phương pháp chuyển lên màng cũng đã được mô tả bởi các tác giả
sau: Southern (1979); Maniatis và ctv (1982); Meinkoth và Wahl (1984); Vandenplas
và ctv (1984); Jeffreys và ctv (1985) nhưng đều dựa trên một nền tảng chung:
- DNA được giữ trong một hệ thống gel thích hợp
- DNA được vận chuyển lên một giá thể rắn
- Probe đánh dấu được lai với DNA được giữ trên một vật thể và probe có
thể được loại bỏ sau quá trình lai
- Sản phẩm lai được phát hiện dựa trên một hệ thống phát hiện thích hợp.
Song song đó, nhiều phương pháp chuyển DNA từ gel lên màng cũng được thực
hiện như: blot mao dẫn hướng xuống (Lichtenstein và ctv, 1990; Chomozynki, 1992),
blot chân không (Medveczky và ctv,1987; Olszewska và Jone, 1988; Trnovsky, 1992),
blot hai chiều (Sambrook và Russell, 1999), và blot với đệm alkaline (Reed và Mann,
1985).
Bên cạnh đó, vật liệu làm màng cũng đã được cải tiến đi rất nhiều. Phương pháp
Southern blot đầu tiên được mô tả bởi Southern sử dụng màng nitrocellulose để

chuyển DNA. Trong vài năm lại đây, vật liệu màng mới được phát triển và bao gồm
giấy DBM, DPT và cả hai loại màng nylon tích điện và không tích điện, với mục đích
tăng độ liên kết, có thể vận chuyển những phân tử nhỏ, và màng có thể sử dụng lại cho
việc lai sau khi đã loại bỏ probe.
4
Cùng với sự phát triển đó, các phương pháp đánh dấu probe không dùng phóng xạ
đã ra đời và đang được thương mại hóa trên thị trường. Bằng việc sử dụng các tiểu
phần của biotin (Langer và ctv, 1981) và dùng enzyme gắn kết với DNA probe (Renz
và Kurz, 1984). Năm 1990, Ishii thuộc Viện Lúa Quốc tế đề nghị cải tiến phương pháp
Southern blot không dùng đồng vị phóng xạ, bằng cách sử dụng digoxigenin. Các phân
tử lai được phát hiện bằng kháng thể của digoxigenin có gắn với enzym photphatase
kiềm. Probe sử dụng có thể là DNA, RNA, cDNA.

2.2 NGUYÊN TẮC CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Đầu tiên cần tách chiết DNA bộ gen của tế bào, sử dụng các enzyme giới hạn cắt
phân tử DNA thành các đoạn nhỏ, điện di trên gel agarose để tách các đoạn DNA theo
kích thước. Gây biến tính DNA trên gel bằng dung dịch kiềm (thường dùng NaOH 0,5
M; NaCl 1,5 M), sau đó chuyển các đoạn DNA từ bản gel lên màng lai bằng lực mao
dẫn (màng lai thường sử dụng là màng nitrocellulose). Vị trí của các đoạn DNA trên
gel, được giữ yên khi chuyển lên màng lai.
Sử dụng các phân tử probe có đánh dấu phóng xạ lai với các đoạn DNA trên màng
lai, tạo nên các phân tử DNA lai. Tiến hành lai phân tử bằng cách cho vào hộp lai
chuyên dụng một lớp khoảng 0,2 – 0,4 cm dịch lai, chứa mồi có đánh dấu phóng xạ.
Đặt màng lai vào hộp lai ở nhiệt độ 65
o
C trong 3 – 8 giờ, sau đó thêm dịch lai với chế
độ nhiệt 65
o
C, lắc nhẹ để tăng tốc độ phản ứng. Rửa màng lai bằng dung dịch SSC
(NaCl, natri citrat, và nước) ở nhiệt độ 65

o
C hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc
hoặc sấy khô ở 65
o
C.
Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20
o
C, xử lý dưới
ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai.

2.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp
Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử
và tái tổ hợp DNA. Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những
vấn đề cơ bản như sự hiểu biết về cấu trúc gen, biểu hiện của gen và các genome.
Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong
genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA
5
lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các
intron, exon của một gen …. Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker DNA) khác nhau
làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài. Phương pháp
Southern blot càng có vai trò trong chẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám
phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2001).

2.4 SỰ KHÁC NHAU GIỮA SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT VÀ
WESTERN BLOT
Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot,
Northern blot và Western blot
Southern blot Northern blot Western blot

1) Chiết xuất DNA từ tế bào
2) Cắt với enzyme giới hạn
3) Chạy điện di trên gel
agarose
4) Thường chuyển lên màng
bằng phương pháp mao dẫn
5) Lượng sản phẩm thừa là
DNA
6) Lai với probe DNA
7) Rửa bỏ probe thừa làm
tăng độ chính xác ở bước
phát hiện
8) Phóng xạ tự ghi
(autoradiograph)
1) Chiết xuất RNA từ tế bào
2) Biến tính với formaldehyde
3) Chạy điện di trên gel agarose

4) Thường chuyển lên màng
bằng phương pháp mao dẫn
5) Lượng sản phẩm thừa là
RNA
6) Lai với probe DNA
7) Rửa bỏ probe thừa làm tăng
độ chính xác ở bước phát hiện

8) Phóng xạ tự ghi
(autoradiograph)
1) Chiết xuất protein từ tế bào
2) Biến tính với SDS

3) Chạy điện di trên gel
polyacryamide - SDSPAGE
4) Thường chuyển lên màng
bằng phương pháp điện di
5) Lượng sản phẩm thừa là
protein
6) Lai với probe kháng thể
7) Rửa bỏ probe thừa


8) Phóng xạ tự ghi
(autoradiograph) hoặc phát
triển với cơ chất chromogenic

2.5 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VI KHUẨN
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một
lượng nucleic acid đủ lớn và đủ sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan
tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này
6
ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học.
Thông thường các phương pháp tách chiết đều phải qua các bước sau.
- Bước 1: Phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA.
- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein mà chúng thường được làm biến tính trong phenol và chloroform.
- Bước 3: Tủa nucleic acid nhằm thu nhận chúng ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo
vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong
dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Mục đích của các phương pháp tách chiết nucleic acid là có thể thu được phần lớn
các nucleic acid có trong mẫu ở dạng nguyên vẹn và đủ sạch để tiến hành các phân
tích phân tử kế tiếp. Trong nghiên cứu này, việc chuẩn bị genomic DNA có vai trò rất

lớn trong quá trình tạo mẫu lai. Đầu tiên, chúng được cắt với một hoặc nhiều enzyme
để tạo ra những phân đoạn nhỏ và được phân biệt nhau theo kích thước khi chạy điện
di. Những đoạn DNA này được làm biến tính in situ và vận chuyển từ gel lên một vật
thể rắn (thường là một màng nylon hoặc nitrocellulose). Vị trí của những đoạn DNA
phân biệt theo kích thước được giữ trong suốt quá trình chuyến đến màng. Sau đó,
DNA sẽ được cố định trên màng và chuẩn bị cho việc lai.
Thông thường để có được một qui trình ly trích DNA ổn định, đủ lượng và đủ tinh
khiết để thực hiện các phân tích kế tiếp, cần phải trải qua các quá trình thử nghiệm; từ
đó đưa ra qui trình thích hợp trên đối tượng nghiên cứu. Sau đây là các phương pháp ly
trích DNA từ vi khuẩn.

2.5.1 Phƣơng pháp sử dụng SDS (Sambrook và ctv, 2001)
1. Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng qua đêm.
2. Thu sinh khối bằng ly tâm và rửa trong 5 ml Tris 50 mM (pH 8,0),
EDTA 50 mM.
3. Đông huyền phù ở - 20
o
C.
4. Thêm 0,5 ml Tris 250 mM (pH 8,0), lysozyme 10 mg / ml để giảm xóc. Đem
đông đá và làm tan ở nhiệt độ phòng. Khi đã tan, để trên đá 45 phút.
5. Thêm 1ml SDS 0,5 %, Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 0,4 M, proteinase K
1 mg / ml. Đem ủ ở bồn ủ nhiệt ở 50
o
C trong 60 phút.
7
6. Đem ly trích với 6 ml Tris được cân bằng phenol và ly tâm 10000 vòng/15
phút. Chuyển phần dịch nổi bên trên cho vào một tube mới (có thể thực hiện lại
bước này khi cần thiết).
7. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ. Sau đó thêm vào 2 thể tích
95 % ethanol, lắc đều.

8. Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50mM (pH 7,5), EDTA 1mM, RNAse
200 mg / ml, để qua đêm ở 4
o
C.
9. Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng/5phút.
Chuyển phần dịch bên trên vào một tube mới.
10. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ; cho vào 2 thể tích ethanol
95 %, lắc đều.
11. Làm tủa và hòa tan DNA trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM.
12. Kiểm tra sản phẩm ly trích bằng điện di và phân tích.

2.5.2 Phƣơng pháp sử dụng CTAB (Sambrook và ctv, 2001)
1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng LB, thu sinh khối vi
khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4
o
C.
2. Rửa sinh khối thu được với 1ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng
vortex .
3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE 1X và đánh
tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau
đó ủ ở 37
o
C khoảng 1 - 2 giờ.
4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5 M, hòa tan thật kỹ bằng voltex.
5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn
(đánh tan bằng vortex), ủ ở 65
o
C trong 10 phút.
6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), hòa
lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/10phút, ở 4

o
C.
7. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới (nếu không thể phân biệt
bề mặt chung giữa các dung dịch, có thể ly tâm lần nữa ở tốc độ lớn hơn).
8. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol(25:24:1)
với sự ngang bằng về thể tích. Hòa lẫn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14000
vòng/10phút/4
o
C.
8
9. Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với 0,6 thể
tích isopropanol, ủ ở - 20
o
C / 30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/10phút/4
o
C, lấy
kết tủa sau khi ly tâm.
10. Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20
o
C, nghiêng nhẹ qua lại,
ly tâm 13000 vòng/10phút/4
o
C. Thu kết tủa và làm khô ở nhiệt độ phòng.
11. Hòa tan hoàn toàn DNA kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X. Cho thêm vào
1µl RNAse, ủ phản ứng ở 37
o
C, trong 2 giờ .
12. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24:
1). Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/5 - 10 phút/4
o

C.
13. Thu phần dung dịch bên trên và chiết xuất với chloroform / isoamyl alcohol
(24:1). Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng / 5 - 10 phút / 4
o
C.
14.Thu phần dung dịch DNA bên trên. Thêm 2 µl dung dịch natri acetate 3 M
(pH 5,0), isopropanol. Rửa kết tủa với 70% ethanol. Thu kết tủa làm khô.
15. Hòa tan kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X, đem mẫu giữ ở tủ 4
o
C.

2.5.3 Phƣơng pháp sử dụng Phase Lock Gel
TM
(Jones và Bartlet, 1990)
1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng, thu sinh khối vào
eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm.
2. Làm tan sinh khối trong 467 µl TE 1X. Thêm vào 30 µl SDS 10% và 3 µl
Proteinase K (20 mg / ml), trộn đều và ủ 1 giờ ở nhiệt độ 37
o
C.
3. Thêm vào phenol / chloroform, lắc đều cho đến khi có sự hòa lẫn hoàn toàn.
Cẩn thận chuyển hỗn dịch DNA phenol vào một tube Phase Lock Gel
TM
và ly
tâm 2 phút.
4. Lấy phần dịch bên trên cho vào một eppendorf mới và thêm vào đó một lượng
ngang bằng phenol / chloroform. Trộn đều và chuyển cẩn thận phần hỗn hợp đó
vào một tube Phase Lock Gel
TM
mới, ly tâm 5 phút. Chuyển phần bên trên vào

một eppendorf mới.
5. Thêm 1/10 thể tích natri acetate, trộn đều.
6. Thêm 0,6 thể tích isopropanol, trộn nhẹ cho đến DNA tạo kết tủa, ly tâm, bỏ
phần dịch .
7. Rửa DNA trong 1 ml ethanol 70% trong 30 giây.
9
8. Làm tan DNA trong 100 – 200 µl đệm TE 1X. Có thể để vài ngày để DNA tan
hoàn toàn.
9. Nếu giữ trong thời gian ngắn thì trữ ở 4
o
C; còn nếu giữ trong thời gian dài thì
nên giữ trong tủ -20
o
C hoặc -80
o
C .
10. Sau khi DNA đã tan hoàn toàn trong TE, tiến hành xác định nồng độ DNA.
2.6 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƢỢNG DNA
Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, người ta có thể tiến hành phân tích định
tính và định lượng chúng bằng một số phương pháp như phương pháp đo mật độ
quang, điện di, siêu ly tâm, sắc kí (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998)

2.6.1 Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế
Phương pháp này không thật chính xác nhưng cho phép ước lượng tương đối nồng
độ nucleic acid có trong mẫu, và thường điều này cũng đáp ứng đủ yêu cầu nghiên
cứu.
Nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bước
sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang ở bước sóng
260 nm (OD
260nm

- Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ
nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau đây.
- Một đơn vị OD
260nm
tương ứng với một nồng độ là:
+ 50 µg / ml cho một dung dịch DNA sợi đôi
+ 40 µg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
- Ví dụ: một giá trị OD
260nm
= 0,9 sẽ tương đương với:
+ Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg / ml
+ Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 3,6 µg / ml
Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch. Để kiểm tra
độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD
280nm
). 280 nm là
bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ
ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật
của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp
nhiễm protein) khi tỉ số OD
260nm
/ OD
280nm
nằm trong khoảng 1,8 - 2.


10

2.6.2 Điện di (Electrophoresis)
Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó

là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa
trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các
nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có
nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dương khi đặt chúng vào điện trường. Kỹ thuật
này được tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử
nucleic acid theo kích thước.
Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách
các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại
gel được sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid.
Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường
dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel được đổ
trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các
nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có
tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid
nucleic và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang.
Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thước nhỏ, tức là dưới 1000 cặp
base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này
chỉ được sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel
này là:
- Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp
- Xác định trình tự DNA
- Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dưới 500 cặp base.
Gel được đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phương của điện di là phương thẳng đứng.
Thực hiện nạp mẫu điện di
Điện di được thực hiện bằng cách đưa các mẫu nucleic acid đã được trộn đều với
loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc
TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó được duy trì cho đến khi vạch cuối
của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel được nhuộm trong dung
dịch ethidium bromide và xem dưới UV.
11

2.6.3 Định lƣợng DNA bằng phân tử Mass
Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của phân
tử Mass. Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần.
Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử
Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của
mẫu pha loãng với band của Mass. Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng,
đồng thời ta có hệ số pha loãng so với mẫu gốc tính được nồng độ của mẫu gốc.

Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass
Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng)

10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp
7 µg 700 bp 70 ng 700 bp
5 µg 500 bp 50 ng 500 bp
2 µg 200 bp 20 ng 200 bp
1 µg 100 bp 10 ng 100 bp












Một số điểm chú ý khi sử dụng phân tử Mass.
Mỗi tube phân tử Mass chuẩn chứa thể tích là 250 µl nên có thể được sử dụng cho

100 giếng khi sử dụng thể tích là 2,5 µl / giếng. Nồng độ của dung dịch chuẩn là 100
µg / ml trong đệm TE.
Hình 2.1 Thang chuẩn về nồng đô của phân tử
Mass (Bio- Rad)
2,5 µl mẫu chuẩn được pha loãng với 10 µl
loading buffer và TE được bơm vào gel agarose
1,8 %. Gel này được đặt ở hiệu điện thế 70 V
trong 75 phút trong đệm TAE 1X. Gel được ngâm
trong 300 ml ethidium bromide (0,5 µg / ml EtBr)
trong 15 phút và được giữ trong nước 30 phút.
12
Phân tử Mass chuẩn có thể được giữ ở nhiệt độ phòng, nhưng nên giữ ở nhiệt độ
4
o
C là tốt nhất (ở nhiệt độ này nó có thể được dùng ổn định trong 1 năm). Tuy nhiên,
nó có thể được giữ trong thời gian dài trong tủ - 20
o
C.
Phân tử Mass được điện di với gel agarose có nồng độ 1,8 % và gel
polyacryamide với nồng độ 8 %. Nồng độ của Mass được xác định dựa vào sự hấp
thu bước sóng 260 nm của phân tử Mass, với mức độ sai số là 1 %.

2.7 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME)
Tế bào vi khuẩn bị nhiễm thực khuẩn thể (phage) thường bị phage phá huỷ. Có
một số chủng vi khuẩn bị nhiễm phage không bị phage tiêu diệt, do DNA của phage bị
cắt thành từng đoạn nhỏ nhờ một số loại enzyme trong tế bào. Những enzyme đó được
gọi là enzyme giới hạn có khả năng cắt DNA của phage ở những vị trí nhất định thành
những đoạn ngắn (Khuất Hữu Thanh, 2001).
Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên
(1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae. Chủng R

d
đặt tên là Hind II. Enzyme giới
hạn (Restriction Enzyme - RE) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết
trong phân tử DNA.
Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi
khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới
hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số
lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới
hạn gọi là bản đồ giới hạn.
Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về
nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn
cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất.

2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn
Qui ước quốc tế các enzyme giới hạn kí hiệu như sau: chữ đầu viết chữ in hoa chỉ
tên chi hoặc loài vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được tách chiết; hai chữ tiếp
theo viết chữ in thường chỉ giống của vi khuẩn; tiếp đến là một chữ viết hoa chỉ chủng
vi khuẩn, cuối cùng là chữ số la mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn có enzyme giới hạn
được phát hiện.
13

Ví dụ:
Chi, loài Giống Chủng Thứ tự dòng
Escherichia Coli Ry13
Eco RI E co R I
Eco RV E co R V

2.7.2 Các loại enzyme giới hạn
Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa
vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người

ta chia enzyme giới hạn làm ba loại (Khuất Hữu Thanh, 2001).
Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới
hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide
cắt tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide.
Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại
này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và công nghệ DNA tái tổ hợp.
Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn và cắt ở vị trí cách
đó khoảng 20 nucleotide về phía trước.

2.7.3 Các kiểu cắt của enzyme giới hạn
Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA từ 4 – 6 cặp
nucleotide (nếu 4 loại nucleotide của phân tử DNA sắp xếp ngẫu nhiên có bốn kiểu sắp
xếp khác nhau). Trường hợp enzyme giới hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu gồm
bốn cặp nucleotide, cứ 4
4
= 256 cặp nucleotide có một vị trí cắt. Khi các enzyme giới
hạn nhận biết trình tự DNA đặc hiệu có 6 cặp nucleotide, cứ 4
6
= 4096 cặp nucleotide
có một chỗ bị cắt. Mỗi enzyme giới hạn nhận biết và cắt đặc hiệu một đoạn DNA ở
những vị trí nhất định. Có theo hai kiểu cắt khác nhau là cắt tạo đầu bằng và cắt tạo
đầu so le (Khuất Hữu Thanh, 2001).
Enzyme giới hạn cắt cả 2 mạch DNA cùng một điểm tạo các đầu bằng (blunt ends).
Các đầu bằng bị cắt của phân tử DNA không có khả năng tự kết hợp lại với nhau. Để
nối các đoạn DNA với nhau cần sử dụng enzym nối – DNA ligase, hoặc các adaptor
chuyên dụng cho mỗi loại enzyme.
14

Ví dụ: Enzyme SmaI cắt tạo đầu bằng giữa các đoạn 6 bp

5’ … CCCGGG … 3’
3’ … GGGCCC … 5’

5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’
3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’


Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa
hai mạch đơn, tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo
nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA
ligase, nhờ đặc tính này enzyme giới hạn cắt đầu sole được sử dụng nhiều trong công
nghệ DNA tái tổ hợp.

Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Eco RI

5’ … GAATTC … 3’ 5’ … G ~OH + P ~ AATTC … 3’
3’ … CTTAAG … 5’ 3’ … CTTAA ~ P HO ~ G … 5’

2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng
Thường trong nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như trong một phòng thí nghiệm
về sinh học phân tử luôn luôn phải có một bộ enzyme thông dụng. Trong đó, enzyme
giới hạn đặc biệt không thể thiếu trong các phân tích về genome như nghiên cứu sự đa
dạng di truyền của quần thể, tạo dòng. Sau đây, liệt kê một số enzyme thường hay sử
dụng trong các thí nghiệm về phân tử (bảng 2.3).




EcoRI

15
Bảng 2.3 Một số enzyme thƣờng sử dụng và các trình tự đặc hiệu
Enzyme Trình tự đặc hiệu
Số vị trí cắt
Nguồn gốc (tên vi sinh
vật)
Ở thực
khuẩn
thể 1
Ở
pB 322
Alu I

Bam HI

Bst I

Eco RI

Hae I

Hind III

Hpa I

Pst I

Sac I

Sal I

Sau 3A

Sma I

Taq I
AG  CT

G  GATCC

G  GATCC

G  ATTC

(
A
T
) GG  CC (
A
T
)

A  AGCTT

GTT  AAC

CTGCA  G

GAGCT  C

G  TCGAC

 GATC

CCC  GGG

T  CGA
> 50

5

5

5

7

7

13

18

2

2

>50

3

>50
16

1

1

1

7

1

0

1

0

1

22

0

7
Arthrobacter luteus

Bacillus Amuloliquefaciens H

Bacillus Amyloliquefaciens

Escherichia coli RY13

Haemophilus aegyptius

Haemophilus influenzae R
d


Haemophilus parainfluenzae

Providencia Stuartii 164

Streptomyces achromogenes

Streptomyces Albus G

Staphylococcus aureus 3A

Serratia marcescens S
b


Thermus aquaticus YTI


2.8 PHƢƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
PCR là kỹ thuật khuếch đại một trình tự DNA xác định trong điều kiện in vitro do

Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985. Phản ứng PCR dựa vào đặc tính của enzyme
DNA polymerase. Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau.
Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước:
- Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mạch đôi được tách thành hai mạch đơn ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA đó. Nhiệt độ để biến tính hoàn
toàn DNA thường sử dụng là 94 – 95
o
C trong 30 – 60 giây.
- Giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung
với primer. Nhiệt độ này tùy thuộc vào mỗi loại primer được sử dụng.
16
- Giai đoạn tổng hợp kéo dài: Nhiệt độ tăng lên 72
o
C, nhiệt độ hoạt động tối ưu
của Taq DNA polymerase, trong khoảng 30 giây đến nhiều phút tùy theo kích thước
cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình
tự của mạch khuôn. Độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn. Taq
DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng PCR là một enzyme chịu nhiệt, không
bị mất hoạt tính trong bước biến tính DNA mạch khuôn (Nguyễn Cát Túc, 2003).
Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR sẽ được điện di trên gel agarose, nhuộm
trong ethidium bromide và quan sát bằng mắt thường dưới tia UV có bước sóng 312
nm hoặc xem qua máy chụp gel bằng phần mềm Quantity One 2000 (Bio - Rad) .
2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase

Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích hút / 50 µl phản ứng
DNA khuôn 10 pg - 1µg tùy phản ứng
10X PCR buffer 1X 5 µl
dNTP mix 2mM 0,2 mM/mỗi loại 5 µl

MgCl
2
25mM 1 – 4 mM tùy phản ứng
Primer 1 0.1 – 1 µM tùy phản ứng
Primer 2 0.1 – 1 µM tùy phản ứng
Taq DNA polymerase 1,25 UI / 50 µl tùy phản ứng
Nước cất vô trùng - tùy phản ứng
Công thức tính:
Nồng độ đầu x Thể tích cần hút = Nồng độ cuối x Thể tích phản ứng

2.8.2 Sử dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense
định cƣ trong đất và trong vùng rễ cây trồng
Để phát hiện Pseudomonas spp. định cư trong đất và ở vùng rễ cây trồng bằng
phương pháp PCR, trước tiên cần tìm một trình tự đặc hiệu của Pseudomonas spp..
Trình tự này phải hiện diện trên tất cả các Pseudomonas nhưng không có trên tất cả
các loài vi sinh vật khác. Từ trình tự này sẽ thiết lập một cặp primer đặc trưng cho
Pseudomonas spp. Qui trình phát hiện Pseudomonas spp. sẽ được xây dựng với cặp
primer được thiết kế.
17
Trong khoá luận này, hai cặp primer đặc hiệu được sử dụng để phát hiện
Pseudomonas fluorescens là phl - 2a, phl - 2b và B2BF, BRR4 được thiết kế dựa trên
trình tự của gen phlD có vai trò trong việc tổng hợp chất 2,4 – DAPG (2,4 -
Diacetylphloroglucinol). Đây là một chất kháng sinh sinh học, giúp cây trồng kháng
với một số nấm bệnh

2.9 PHƢƠNG PHÁP TINH SẠCH DNA
Trong dung dịch DNA còn chứa nhiều thành phần khác như protein, RNA. Vì vậy
cần thiết phải loại bỏ chúng nhằm thu được lượng DNA thuần nhất. Có nhiều phương
pháp tinh sạch DNA. Tùy vào mức độ tạp nhiễm của DNA mà chọn lựa phương pháp
thích hợp để tiến hành tinh sạch.

2.9.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng phenol (Sambrook, 1999)
1. Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5ml.
2. Dùng pipet hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1) cho
vào eppendorf chứa mẫu DNA.
3. Lắc nhẹ bằng tay 10 giây. Ly tâm 12000 vòng /1phút trong 20 phút ở nhiệt độ
phòng.
4. Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên trên bằng pipet cho vào eppendorf sạch.
5. Cho isopropanol vào eppendorf chứa DNA, ủ ở nhiệt độ - 20
o
C trong 20 phút.
6. Ly tâm tốc độ 12000 vòng / 1 phút, loại bỏ isopropanol, thu DNA kết tủa.
7. Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / 1phút trong 20 phút,
loại bỏ ethanol, thu lấy DNA kết tủa.
8. Làm khô và hòa tan DNA trong dung dịch TE.
Phenol hay phenol / chloroform có thể làm kết tủa protein trong dung dịch. Lượng
kết tủa này có thể loại bỏ bằng cách ly tâm, thu nhận dung dịch không có protein. Tuy
nhiên có thể thực hiện phản ứng tủa nhiều lần nếu lượng protein quá lớn. Khuyết điểm
của phương pháp này là có thể làm đứt gãy DNA, lượng DNA thu lại sau khi tinh sạch
khoảng 60% so với lượng DNA ban đầu.

2.9.2 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX (Amersham)
Phương pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch
DNA từ gel. Lượng DNA thu lại khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là