Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã táo


KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG



NGUYỄN THỊ KIM NGÂN




NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ASPERGILLUS
NIGER PECTIN METHYLESTERASE TRÊN
CƠ CHẤT BÃ TÁO




Luận văn tốt nghiệp
Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM






Cần Thơ, 2009

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang i
Aspergillus
niger  











Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa

̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ii
LỜI CAM ĐOAN


 




 




Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iii
LƠ
̀
I CẢM TẠ



qu



   

y, CNT 
 

     
 
















Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa

̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang iv
TÓM TẮT


Đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã
táo”, được thực hiện nhằm khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến sự phát
triển của nấm mốc Aspergillus niger trên cơ chất bã táo để thu được PME có hoạt tính
cao. Trong đó, các điều kiện môi trường như độ ẩm (dựa trên tỉ lệ pha loãng giữa cơ chất
bã táo và nước), pH môi trường, thành phần đạm bổ sung và thời gian ủ thích hợp cho quá
trình sinh tổng hợp PME hoạt tính cao được khảo sát.
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 1:3, pH = 4,0, nuôi cấy nấm mốc trong 96
giờ và bổ sung thêm 0,2% (NH
4
)
2
SO
4
là các điều kiện môi trường tối ưu để nấm mốc phát

triển và sinh tổng hợp PME có hoạt tính cao nhất. Hoạt tính PME đạt 383,20 (U/mL).













Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣

c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang v
MỤC LỤC

 .................................................................................................................. ii


 ....................................................................................................................... iii
 ............................................................................................................................. iv
 ............................................................................................................................. v


 .......................................................................................... vii


 .......................................................................................................... viii
 ........................................................................................................... ix
  ................................................................................................... 1
1.1  ........................................................................................................ 1
1.2  .................................................................................. 2
 







 .................................................................................. 3
2.1  ...................................................... 3

2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa .............................................................................. 3
2.1.2 Kiểu phản ứng ................................................................................................ 4
2.1.3 Nguồn tổng hợp PME .................................................................................... 5
2.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME ..................... 6
2.2  ..................................................................... 10
2.3 PECTIN ............................................................................................................... 11
2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin ......................................................................... 11
2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin ........................................................................ 12
2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật ......... 13
2.4 A. NIGER 
 .............................................................................................................. 14
2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo ....................................................................... 14
2.4.2 Giống vi sinh vật .......................................................................................... 15
2.4.3 Môi trường nuôi cấy .................................................................................... 17
2.4.4 Thu nhận enzyme ......................................................................................... 18
2.4.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp PME ................................... 18
Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣

i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vi
2.5  ........................................................... 19
  .................................. 21
3.1  .......................................................................... 21
3.1.1 Thời gian địa điểm ....................................................................................... 21
3.1.2 Dụng cụ - hóa chất ....................................................................................... 21
3.1.3 Nguyên liệu táo ............................................................................................ 21
3.2  ....................................................................... 22
3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu ......................................................................... 22
3.2.2 Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................... 22
3.3  ........................................................................................ 22
3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng giữa tỉ lệ pha loãng của cơ chất và nước đến khả
năng tổng hợp PME của A.niger ................................................................................. 22
3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ đến khả năng tổng hợp PME của
nấm mốc Aspergillus niger .......................................................................................... 23
3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng tổng hợp PME
của nấm mốc ............................................................................................................... 25
3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tỉ lệ amonium sulfate (NH
4
)
2
SO
4
bổ sung đến
khả năng sinh PME từ nấm mốc A.niger .................................................................... 26
   ................................................................................ 28
4.1  ........ 28

4.2 
 A. NIGER ............................................................................................................... 30
4.3 
ASPERGILLUS NIGER ......................................................................... 31
4.4 
4
)
2
SO
4

A. NIGER PME ......................................................................................... 33
 - ................................................................................ 35
5.1  .......................................................................................................... 35
5.2  ......................................................................................................... 35
 ................................................................................................... 36
 .............................................................................................................................. x


Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ

̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang vii
DANH SA
́
CH CHỮ VIẾT TẮT


--galactosidase
DE: degree of esterification
DP: degree of polymerization
FDA: food and drug administration
GalA: acid polygalacturonic
HG: homogalacturonan
PE: pectinesterase
PG: polygalacturonase
PGL: exopolygalacturonate lyase
PI: pink
PL: pectate lyase
PME: pectin methyl esterase
PMEI: pectin methyl esterase inhibitor
PVP: polyvinylpyrrolidone
RG: rhamnose
RGI: rhamnogalacturonan I
RGII: rhamnogalacturonan II
VI: vacuum infusion

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang viii
DANH SA
́
CH HÌNH


 ......................................... 5
nh h c n  c  cht n  nh enzyme .......................................... 7
nh hng c nhit  n n t    c enzyme ............................. 7
nh h c pH n   c enzyme ....................................................... 8
 ............................................................................................ 12
............................................................................... 13
  .............................................................................. 15
Aspergillus niger ................................................................... 16

 ................................................................................................ 23

 ........................................................................................................................ 24
 25

4
)
2
SO
4

 ....................................................................................... 27
 ............ 29
 ........................................ 30
 ........................... 32

4
)
2
SO
4

 ......................... 34






Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang ix
DANH SÁCH BẢNG


 ............... 10
 .................... 12

 ................................................. 15
 ...... 28
A. niger ................ 30
A.
niger ..................................................................................................................................... 32

4
)
2
SO
4
A. niger
............................................................................................................................................. 33

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 1
CHƢƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 TỔNG QUAN
       
cho 

Enzyme pectinmethylesterase (        
               



   

( 

 
              

 



 

Pectinase              
Aspergillus Polizeli et al., 1991
Aspergillus niger Aspergillus niger 

Aspergillus niger  
  
Aspergillus niger  nhanh
 

a 


Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho

̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 2
,
 
 

pectinmethylesterase
Nghiên cứu khả năng sinh Aspergillus niger pectinmethylesterase trên cơ chất bã
táo .
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Aspergillus niger.


Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho

̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 3
CHƢƠNG 2 LƢƠ
̣
C KHA
̉
O TA
̀
I LIÊ
̣
U

2.1 GIỚI THIỆU PECTIN METHYLESTERASE
        
       PME th     

  OCH
3
          
 
n PME


  
 (, 2004).
2.1.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa


(Bordenave et al., 1996).
 
 
(Benen et al., 2003). Tuy
 
nhau.


(Bordenave, 1996)

Aspergillus PME (Duvetter, 2006). 
Ca
2+

2+
.

 
(Bordenave, 1996).

Aspergillus aculeatus, Aspergillus niger
Erwinia chrysanthemi
nh(Benen et al., 2003).
Luâ

̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 4
2.1.2 Kiểu phản ứng
              
          (RexovaBenkova et al.,
2004).              


 
s  i c   

-
 
(Sajjaanantakul and Pitifer, 1991
            


2+
. PME acid 
ester 
2+
.


 

(Sajjaanantakul and Pitifer, 1991).
             
n hay methyl alginate. PE ng  n 
glycerin ester, ethyl acetate.           
polygalacturonase (1  6%   galacturonase).   allyl, propyl,
propargyl ester   c  (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991)
methylester a acid polymanuronic   h  

esogalacturonan) (Benen et al., 2003).



         (Markovic and
Janecek, 2004).

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa

̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 5















Hình 1: Mô tả vị trí thủy phân của PME đối với nhóm methoxyl
Thủy phân ở vị trí gần nhóm carboxyl tự do

PME nấm mốc: pH tối thích 4,5; thủy phân ở vị trí bất kỳ
PME thực vật: pH tối thích > 7; thủy phân ở vị trí đã được định trước
Nguồn: Reinikainen, 2004
2.1.3 Nguồn tổng hợp PME

2.1.3.1 Thực vật
                


(Bordenave, 1996) 
               
(Bordenave and Goldberg, 1993


(, 2004)      
 

, 2004).

       
2+
        
PME
2H
2
O
Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣

p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 6

2+

+

Bordenave, 1996).
 

 , 2004).


 (Verlent et al., 2004).
2.1.3.2 Vi sinh vật
­ 
­  Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus terrus,
Aspergillus saitoi, Penicillium glaucum, Penicillium chrysogenum, Penicillium

expanam, Penicillium Cilrimim, Fusarium monniliforme,…
­ N men: Saccharomyces fragilis,…
­   Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes, Erwinia,…
­                
 
Ly Nguyen, 2004).
2.1.4 Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme PME
2.1.4.1 Các cation
Ho  ca PME tng khi c sdc tr mng
h nh ng ca anion (Linewaver and Balou, 1945). Tuy nhin nng
 mui cao   gim ho  ca PME. PME  b  ho  ng 
MgCl
2
ln hn 0,1M  NaCl 1M t pH = 7,0 (Sajjaanantakul and Pitifer, 1991).
2.1.4.2 Nồng độ c ơ chất

­ 
 
  
E + S

E S
­ 

­ Giai o 3: enzyme s     ho   do. H t n
em    s ph n  m c  ch duy t.
Luâ
̣
n văn tốt nghiê

̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 7







Hình 2: Ảnh hƣởng của nồng độ c ơ chất đến hoạt tính enzyme
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
2.1.4.3 Nhiệt độ

 

 
 

  


  50             
nhau t  C,

   4555  (, 2004).

               C


          








Hình 3: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến đến tốc độ phản ứng của enzyme
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
2
1
V
max

0

K

m

V
n ng (V)
Tn ng (V)
0

0
C
Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 8
2.1.4.4 pH

 

                 

               
 
   
Aspergillus trong
 = . Khi pH > 7,

 5 (
 et al.,2004).







Hình 4: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt động của enzyme
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
2.1.4.5 Các chất kìm hãm

 enzyme. Ch th   hai    dng ln PME bao
m ch   ngun c protein (proteinaceous PMEIs)    
ngun g   protein (nonproteinaceous PMEIs).
       ho 
n  


E+ I


EI


0
pH
n ng (V)
K
1

K
2

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 9


E: enzyme

K
1
, K
2

(i) 
                 


  b ho
ny hong   c   PME t  khc nhau (Camardella
et al., 2000)   nhn kiwi PMEI c pI = 3,5    t khi ong
16,3 kDa. PMEIs khp bot PME theo t  1: 1 (Giovane et al., 1995).
(ii)  

enzyme, k
ng  mt ch c ch  c tranh (noncompetitive) i i PME. 
n cao, ng c ch h h  PE thc v Nng  sucrose 15%  th
b ho  40% ho  PME.  ch   t ng th kh h
polyol (glycerol, glucose, maltose)  kh  c ch hot ng ca PME chui
(Brady, 1976n bi Sajjaanantakul and Pitifer, 1991).
2.1.4.6 Chất hoạt hoá
   g ho e    enzyme.
 


­ 

­             

­ Nhng    vms k trong  yme lm
  m v o peptid, t  ki cho  nhm chc ch g nhau
 h trung  
.

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 10
2.2 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PME
 





 
               




Bảng 1: Hiệu quả xử lý nƣớc táo và nƣớc vải bằng chế phẩm enzyme pectinase





(%)




(%)

acid

(%)

(%)
Pectin
(%)





quan

a- 
b- 

71,2
78,8

10,2
11,5

0,53
0,62

6,7
8,0

0,33
0,15

4,5
4,8

a- 
b- 

49,2
72,4

8,5
10,2

0,91
1,16

5,62
7,4

0,26
0,12

3,8
4,3
Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2004
 
 
           
           on Ca
2+
   




ion Ca
2+

elimination (Sajjaanatukal and Van Buren, 1989).



Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 11
               





.






CaCl
2

(1996), 

2


 

 
 .
 

2.3 PECTIN
2.3.1 Cấu tạo hóa học của pectin
             
           1,4 glycoside. Trong


(  , 2004).        
            (Ly Nguyen, 2004).
tan trong


().


        


  
Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 12
 et
al., 2001).

Hình 5: Cấu tạo phân tử pectin
Nguồn: Brent L. Ridley et al., 2000
 

2.3.2 Mức độ ester hóa của pectin

of esterification).  
­ 
­ 
­ 
                

Bảng 2: Hàm lƣợng pectin và mức độ ester hóa pectin ở một số loại trái cây
 ng pectin % 

Nho
cam

Khm












65




Nguồn: Wolfgang Aehle, 2004

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 13





2+


Liners et al., 1992).
2.3.3 Vai trò chuyển hóa pectic trong sự thay đổi cấu trúc tế bào thực vật

 (Brett
and Waldron, 1996). 
 calci
6).

Hình 6: Cấu tạo phức chất calci pectate
Nguồn: Buchanan et al., 2000; trích dẫn bởi Kalamaki et al., 2006



tt and Waldron, 1996). 

­ 

           
             
Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣

p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́
a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 14

 
­ 

­ 

tan.


galactosidase.
Khi x   protopectin s b thy phn  pectin  tan m k qu 
m rau  Trong c bin nhi  thi  ph ng gia pectin  tan
vi ion calci  t phc calcipectate.   dng mc
 l  cho c sh trn chhn.
2.4 QUÁ TRÌNH TRÍCH LY ENZYME PME TỪ NẤM MỐC A. NIGER
TRÊN CƠ CHẤT BÃ TÁO

2.4.1 Khái quát về nguyên liệu táo
 Ziziphus nummularia  Rhamnaceae
 







dinh dvitamin C.

 

                

 .

            

Luâ
̣
n văn tốt nghiê
̣
p Đa
̣
i ho
̣
c kho
́

a 31 Trươ
̀
ng Đa
̣
i ho
̣
c Cần Thơ
Ngành Công nghệ thực phẩm Trang 15










Hình 7: Trái táo (Ziziphus nummularia)

(Joshi, 2006)
Bảng 3: Thành phần pectin của táo và một số loại trái cây
 Pectin (% w/w)  pH



Cam
0,7  0,8
0,5  0,6
0,2  0,3

0,6  0,9
PE  PG
PE  PG
PE
PE
3,5
3,2
3,0
2,2
Nguồn: Bollag, 1991
2.4.2 Giống vi sinh vật
          


  Aspergillus
niger (Schmitz, 2002).
Aspergillus niger thu  nang Ascomycetes, b   Plectascales,
h Aspergillaceae             



 
e 
Aspergillus niger 