CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH và bảo QUẢN tế bào xơ PHÔI gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ
MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN
TẾ BÀO XƠ PHƠI GÀ

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2017 – 2020
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC THANH THẢO

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2020


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC
NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN
CƠNG NGHỆ SINH HỌC
**************************

CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN
TẾ BÀO XƠ PHƠI GÀ

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRẦN THỊ BÍCH LIÊN

NGUYỄN NGỌC THANH THẢO

BSTY. HOÀNG THANH HẢI
BSTY. LÊ HỒNG PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2020


LỜI CẢM ƠN


Với tất cả lịng kính trọng và u thương, con xin cảm ơn Ba Mẹ, Người đã cho
con có ngày hơm nay.



Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường đại học Nơng Lâm thành phố Hồ
Chí Minh, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, quý thầy cô các Khoa, Bộ mơn đã tận
tình dạy bảo tơi trong suốt 4 năm học qua.



Xin chân thành cảm ơn ThS. Trần Thị Bích Liên đã tận tình dạy bảo, động
viên, giúp đỡ em trong thời gian học tập cũng như trong việc thực hiện và hồn
thành khóa luận tốt nghiệp.



Em xin chân thành cảm ơn BSTY Hoàng Thanh Hải, người đã luôn bên cạnh,

động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện và hồn thành khóa luận.



Xin chân thành cảm ơn BSTY Lê Hồng Phong đã hỗ trợ, giúp đỡ em trong thời
gian thực hiện khóa luận.



Xin chân thành cảm ơn cô Lê Thị Hà đã tạo mọi điều kiện để em hồn thành tốt
khóa luận.



Xin cảm ơn các bạn, những người đã chia sẽ mọi buồn vui với Thảo trong suốt 4
năm qua.



Em cảm ơn Anh…!
Tp Hồ Chí Minh, ngày 5 tháng 9 năm 2020
Nguyễn Ngọc Thanh Thảo

iii


TĨM TẮT
Đề tài: “CẢI THIỆN QUY TRÌNH THU HOẠCH VÀ BẢO QUẢN TẾ
BÀO XƠ PHÔI GÀ”, được thực hiện tại Bộ môn Vi Sinh – Truyền Nhiễm, Khoa
Chăn Nuôi – Thú Y, Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4/2020

đến tháng 8/2020.
Nội dung:
Thực hiện 2 quy trình trypsin để tách tế bào từ phơi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi và
xác định tuổi phơi, quy trình tách tế bào thích hợp nhất.
Ni cấy, cấy chuyển và theo dõi sự phát triển của tế bào sơ cấp, tế bào thứ
cấp.
Thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phôi gà trong Nitơ lỏng.
Hồi phục và khảo sát khả năng sống của tế bào sau bảo quản.
Các kết quả thu được:
Số lượng tế bào tách được từ phôi 9 và 10 ngày tuổi tương đương nhau và cao
hơn số tế bào tách được từ phôi 8 ngày tuổi.
6

Số tế bào tách được bằng quy trình trypsin lạnh (49,73 x 10 ) cao hơn số tế
6

bào tách được bằng quy trình trypsin ấm (25,51 x 10 ).
Độ tuổi phơi và quy trình tách tế bào khơng ảnh hưởng đến sự phát triển của
tế bào in vitro.
Tế bào xơ phôi gà thứ cấp có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro cao
hơn tế bào sơ cấp.
Tế bào xơ phôi gà thứ cấp sau khi bảo quản trong Nitơ lỏng 5 ngày có khả
năng bám và phát triển trên bề mặt bình ni cấy.

iv


SUMMARY
Graduating

thesis

topic:

“IMPROVE

THE

PROCEDURE

OF

HARVESTING AND FREEZING CEF CELLS”. The thesis was carried out at
Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal Science and
Veterinary, Nong Lam university Ho Chi Minh city from 4/2020 to 8/2020.
Contents of research:
Trying 2 trypsin process for the culture of primary cells from embryonated
th th
th
eggs at 8 , 9 , 10 day then define a trypsin process and an age of embryo for
primary culture.
Culture, subculture and observe the growth of the primary cells, the secondary
cells.
Harvesting and freezing CEF cells in liquid nitrogen.
Reviving and surveying the survival of cells after cryoprotected.
Result:
th

The number of CEF cells were removed from 9 day embryo tantamount to
th

th

those from 10 day embryo and more than those from 8 day embryo .
6

The number of CEF cells were removed by cool trypsin process (49,73x10 )
6

more than those by warm trypsin process (25,51 x 10 ).
The age of embryo and the trypsin process don’t affect the growth of in vitro
cells.
The secondary CEF cells can grow better than the primary CEF cells in in
vitro.
th

5 day after cryoprotection, the secondary CEF cells can attach to the
substrate and grow.

v


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang bìa 1...................................................................................................................................... i
Trang bìa 2..................................................................................................................................... ii
Lời cảm ơn................................................................................................................................... iii

Tóm tắt tiếng Việt...................................................................................................................... iv
Tóm tắt tiếng Anh........................................................................................................................ v
Mục lục.......................................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt...................................................................................................... ix
Danh sách các hình..................................................................................................................... x
Danh sách các bảng................................................................................................................... xi
Danh sách các biểu đồ.............................................................................................................. xi
Danh sách các sơ đồ.................................................................................................................. xi
1. MỞ ĐẦU................................................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề....................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích......................................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu............................................................................................................................ 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................................... 3
2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật.........3
2.2. Đặc điểm tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào........5
2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất................................................................................ 6
2.2.2. Tính chất cơ học yếu........................................................................................ 7
2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm...........................7
2.2.4. Cần giá đỡ trong q trình phát triển và nhân đơi................................ 8
2.2.5. Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của
chúng 8
2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ........................................................................... 8
2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo......................................... 8
2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật................................................................ 9

vi


2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp................................................................................................. 9
2.3.2. Sự cấy chuyển.................................................................................................... 9

2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào............................................................................. 10
2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn 10
2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù

10

2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật................................... 11
2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy................................ 12
2.3.6. Điều kiện thích hợp cho ni cấy tế bào động vật............................. 13
2.3.7. Vấn đề cần lưu ý khi nuôi cấy tế bào động vật................................... 19
2.3.8. Các pha của sự nuôi cấy tế bào động vật.............................................. 19
2.3.8.1. Pha ức chế 19
2.3.8.2. Pha phát triển

19

2.3.8.3. Pha ổn định 20
2.3.8.4. Pha suy giảm

20

2.4. Bảo quản lạnh tế bào nuôi cấy............................................................................... 20
2.4.1. Những ưu điểm của việc đông lạnh tế bào nuôi cấy......................... 20
2.4.2. Tiến trình bảo quản lạnh tế bào................................................................. 21
2.4.3. Một số vấn đề có thể ảnh hưởng đến kết quả bảo quản...................22
2.5. Ứng dụng của nuôi cấy tế bào động vật............................................................. 22
2.5.1. Thiết lập hệ thống mơ hình......................................................................... 23
2.5.2. Xét nghiệm độc tế bào.................................................................................. 23
2.5.3. Nghiên cứu ung thư....................................................................................... 23
2.5.4. Virus học............................................................................................................ 23

2.5.5. Sản xuất các chất thứ cấp từ tế bào......................................................... 23
2.5.6. Chẩn đoán di truyền...................................................................................... 24
2.5.7. Kỹ thuật di truyền.......................................................................................... 24
2.5.8. Liệu pháp gene................................................................................................ 25
2.5.9. Phát triển và chọn lọc thuốc....................................................................... 25
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................... 26

vii


3.1. Thời gian và địa điểm............................................................................................... 26
3.1.1. Thời gian............................................................................................................ 26
3.1.2. Địa điểm............................................................................................................. 26
3.2. Vật liệu và hóa chất................................................................................................... 26
3.2.1. Đối tượng........................................................................................................... 26
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm................................................................. 26
3.2.3. Các hóa chất và mơi trường........................................................................ 27
3.3. Nội dung nghiên cứu................................................................................................. 27
3.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 28
3.4.1. Kỹ thuật lấy phôi và tách mô ở phôi gà................................................. 28
3.4.2. Phương pháp tạo tế bào sơ cấp.................................................................. 28
3.4.3. Phương pháp đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer......................29
3.4.4. Phương pháp cấy chuyền tế bào............................................................... 30
3.4.5. Phương pháp bảo quản tế bào.................................................................... 31
3.4.6. Phương pháp hồi phục tế bào.................................................................... 31
3.5. Chỉ tiêu theo dõi.......................................................................................................... 31
3.6. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................................... 31
3.7. Quy trình tiến hành thí nghiệm............................................................................. 32
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................................ 33
4.1. Xác định tuổi phôi và phương pháp tách tế bào thích hợp........................ 33

4.2.Thời gian tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp............................................... 35
4.3. Cấy chuyển, thu hoạch, bảo quản tế bào và khảo sát khả năng sống
của tế bào sau bảo quản............................................................................................ 37
4.3.1. Thời gian phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp.........................37
4.3.2.Xác định khả năng sống của tế bào sau bảo quản............................... 39
4.4. Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà trong điều kiện Việt Nam.............41
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.............................................................................................. 43
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 44
7. PHỤ LỤC............................................................................................................................... 46

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CEF:

Chicken Embryo Fibroblast.

DMSO:

dimethyl sulfoxide.

EMEM:

Eagle’s minimum essential medium.

FBS:

Fetal bovine serum.

HEPES:

N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulphonic acid.

MEM:

Minimum essential medium.

PBSA:

Phosphate bufferd saline solution A.

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Mơ hình một tế bào động vật điển hình.......................................................... 5
Hình 2.2: Các dụng cụ ni cấy tế bào lớp đơn............................................................ 10
Hình 2.3: Các dụng cụ ni cấy huyền phù tế bào...................................................... 11
Hình 2.4: Ống bảo quản tế bào............................................................................................ 21
Hình 2.5: Bình Nitơ lỏng bảo quản tế bào...................................................................... 22
Hình 3.1: Buồng đếm Neubauer......................................................................................... 29
Hình 3.2: Tế bào CEF trong buồng đếm.......................................................................... 30
Hình 4.1: Tế bào sơ cấp sau 15 giờ ni cấy................................................................. 36
Hình 4.2: Tế bào sơ cấp phát triển đầy một lớp............................................................ 36
Hình 4.3: Tế bào thứ cấp phát triển đầy một lớp.......................................................... 38

Hình 4.4: Tế bào xơ phôi gà sơ cấp sau khi hồi phục................................................. 40
Hình 4.5: Tế bào xơ phơi gà thứ cấp sau khi hồi phục............................................... 40

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 4.1: Số tế bào sống trung bình thu được từ các tuổi phơi và các
phương pháp tách tế bào

34

Bảng 4.2: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào sơ cấp
(giờ) 35
Bảng 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào thứ cấp
(giờ) 37
Bảng 4.4: Tỷ lệ tế bào sống sau khi phục hồi................................................................ 37

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1: Số lượng tế bào thu được từ các độ tuổi phôi và các
phương pháp tách tế bào

33

Biểu đồ 4.2: Thời gian trung bình làm đầy một lớp của tế bào sơ cấp.................35
Biểu đồ 4.3: Thời gian trung bình phát triển đầy một lớp của tế bào
thứ cấp

38

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 3: Quy trình thực hiện thí nghiệm......................................................................... 32
Sơ đồ 4: Quy trình điều chế tế bào xơ phôi gà.............................................................. 42

xi


1

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Động vật cũng như nhiều loại sinh vật đa bào khác được cấu tạo từ các loại mô
khác nhau. Các mô được cấu tạo từ những tế bào cùng loại. Như vậy, tế bào là đơn
vị cấu trúc nhỏ nhất của một cơ thể, là đơn vị chức năng cơ bản của sự sống.
Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan đã mở ra khả năng nuôi cấy tế bào ở
thực vật và động vật. Từ đó, nhiều nhà khoa học đã có những nghiên cứu sâu về khả
năng phát triển tế bào từ một tế bào gốc với mục đích cung cấp nguyên liệu cho các

nghiên cứu sinh học, y học như: nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, con đường
trao đổi chất, kiểm tra ảnh hưởng của các chất lên từng tế bào riêng biệt, nghiên cứu
sản xuất mô nhân tạo, tổng hợp các chất sinh học như vaccine, hormone…
Trên thế giới, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất
dài tìm hướng đi về kỹ thuật, tìm mơi trường tương ứng và đang bước vào giai đoạn
sản xuất theo quy mô công nghiệp ở giai đoạn vừa và nhỏ. Tuy nhiên, ở Việt Nam,
kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật vẫn chưa phát triển, đa số tế bào ni cấy được
nhập khẩu từ nước ngồi.
Tế bào phơi gà là loại tế bào có khả năng phát triển và sinh sản rất cao, dễ
dàng bám vào bề mặt bình ni cấy và mơi trường ni khơng cần nồng độ huyết
thanh cao như các dòng tế bào khác (ví dụ các tế bào tách từ phơi chuột, các dòng tế
bào ung thư…) (Phan Kim Ngọc, 2002). Do đó, việc sản xuất tế bào xơ phơi gà
trong điều kiện ở Việt Nam là hồn tồn có khả năng thực hiện được nhằm phục vụ
cho chẩn đoán, sản xuất vaccine gia cầm trong tình hình hiện nay, cũng như làm nền
tảng cho những nghiên cứu sau này.


2

Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, được sự phân công của bộ môn Vi sinhTruyền nhiễm, khoa Chăn nuôi - Thú y, dưới sự hướng dẫn của ThS. Trần Thị Bích
Liên, BSTY Hồng Thanh Hải, BSTY Lê Hồng Phong, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài:

“Cải thiện quy trình thu hoạch và bảo quản tế bào xơ phơi gà”.
1.2. Mục đích
Xây dựng quy trình ni cấy tế bào xơ phôi gà phù hợp với điều kiện tại Việt
Nam, từ đó mở rộng khả năng ứng dụng tế bào xơ phơi gà trong nghiên cứu, chẩn
đốn bệnh, sản xuất vaccine cho gia cầm.
1.3. Yêu cầu
- Tiến hành tách tế bào từ phôi trứng 8, 9, 10 ngày tuổi bằng cách sử dụng hai quy

trình trypsin ấm và trypsin lạnh. Thí nghiệm được lặp lại 6 lần.
- Khảo sát số lượng tế bào thu được, thời gian tạo một lớp tế bào và khả năng sống
của tế bào sau thời gian bảo quản tronng Nitơ lỏng.


3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Thuyết tế bào của Schleiden và Schwan (1838) là nền tảng cho nhiều nhà
khoa học về thực vật và động vật bắt đầu nghiên cứu sâu về khả năng phát triển tế
bào từ một tế bào gốc (tế bào mầm).
Mặt khác, thực tế cuộc sống địi hỏi vấn đề ni tế bào động vật ngày càng
trở nên cấp bách. Trước đây, người ta nuôi cấy virus trong cơ thể một sinh vật chủ.
Từ đó, người ta thu nhận virus và dùng nó để sản xuất vaccine. Việc sản xuất
vaccine theo phương pháp này đã có những kết quả rất tốt và đóng vai trị rất quan
trọng trong phịng và chữa bệnh hàng chục năm qua. Hiện nay, người ta vẫn áp
dụng có hiệu quả phương pháp này để sản xuất vaccine cho người và gia súc.
Tuy nhiên, việc sản xuất vaccine theo phương pháp này vẫn có những hạn
chế cần khắc phục. Trong đó, khó khăn nhất là phải sử dụng một số lượng lớn động
vật cho q trình ni virus. Điều đó khơng chỉ khó khăn về mặt kỹ thuật mà cịn
khó khăn về tài chính.
Việc ni cấy tế bào động vật đặt ra cho các nhà khoa học những thách thức
không nhỏ. Bởi lẽ, nuôi cấy tế bào động vật khó hơn nhiều so với ni cấy vi sinh
vật và nuôi cấy tế bào thực vật.
Kiến thức tổng quát cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật được đưa ra từ thế
kỷ 19. Năm 1855, Roux chứng minh được khả năng giữ tồn vẹn đặc tính sinh học
của tế bào phôi gà trong dung dịch nước muối sinh lý. Điều này có ý nghĩa rất lớn
trong nhận thức về sự sống của tế bào ngồi cơ thể, nó mở ra khả năng phát triển sự

sống bên ngoài cơ thể đa bào.


4

Đến năm 1907, Ross Harrison đã tách thành công tế bào thần kinh ếch để
làm thí nghiệm thử ni chúng ngoài cơ thể. Nhưng cho đến đầu những năm 1950,
chỉ có vài cơng trình nhằm tăng cường khả năng ni cấy tế bào được nghiên cứu.
Đầu tiên là sự phát triển của thuốc kháng sinh để tránh các tác nhân gây nhiễm trong
giai đoạn đầu nuôi cấy tế bào. Thứ hai là sự phát triển các kỹ thuật, như dùng
trypsin để tách tế bào từ bình ni cấy. Kỹ thuật này rất quan trọng khi cần thu
hoạch các dòng tế bào đang phát triển liên tục. Thứ ba là thông qua việc nuôi cấy tế
bào với các loại môi trường khác nhau để tìm ra thành phần mơi trường thích hợp
nhất cho dịng tế bào đó.
Một đột phá có tính chất làm nền tảng cho công nghệ nuôi cấy tế bào động
vật thuộc về những nghiên cứu của Carrel (1913). Ơng đã làm rất nhiều thí nghiệm
và cuối cùng ơng đã đưa ra một kết luận có tính chất mở đường cho những thí
nghiệm tiếp theo của rất nhiều tác giả đương thời: tế bào động vật hồn tồn có thể
sống trong một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro nếu ta thường xuyên
cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết.
Đến năm 1948, bằng những kỹ thuật mới, Earle đã tiến hành phân lập các tế
bào và nuôi chúng trong những điều kiện môi trường đặc biệt, tác giả đã thu nhận
được những dòng tế bào biệt lập. Kỹ thuật này mở ra khả năng tách tế bào của từng
loại mô và phát triển chúng trong những môi trường nhân tạo.
Năm 1952, Gey đã tách tế bào ung thư ở người và nuôi chúng thành công.
Sau đó hai năm (1954), Levi – Moutalcini đã đi xa hơn trong nghiên cứu bằng cách
tìm hiểu ảnh hưởng của những chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của tế bào
trong ni cấy in vitro. Ơng dùng yếu tố tăng trưởng thần kinh (NGE – Nerve
Growth Factor) để kích thích sự tăng trưởng của tế bào thần kinh khi nuôi chúng in
vitro.

Những nghiên cứu sau này của Eagle (1955), Puck (1956), Temin và Rubin
(1958), Hayflick (1961), Littlefield (1964), Ham (1965), Kohler (1975), Sato
(1976), Wigler (1977) rất thành công trong những lĩnh vực cơ bản sau:


5

-

Tìm ra được nhiều loại mơi trường thích hợp cho sự phát triển in vitro của

nhiều loại mô khác nhau của người và động vật.
-

Hồn thiện quy trình ni cấy mơ động vật.

-

Tạo ra được một số đột biến có ích.
Những nghiên cứu liên tục từ năm 1950 đến nay đã có ý nghĩa thực tế rất lớn

trong kỹ thuật sản xuất vaccine cho người và gia súc.
Như vậy, công nghệ nuôi cấy tế bào động vật đã trải qua một giai đoạn rất
dài tìm hướng đi về kỹ thuật, tìm mơi trường tương ứng và đang bước vào giai đoạn
sản xuất theo quy mô công nghiệp ở dạng vừa và nhỏ.
Tương lai, hướng nghiên cứu này sẽ đem lại những thành tựu khoa học cũng
như lợi ích kinh tế rất lớn. Trước mắt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật sẽ phục vụ
cho hai ngành: ngành y và ngành chăn nuôi. Hai ngành này đang cần những kỹ thuật
hiện đại để phát triển.
2.2. Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào

Hình 2.1. Mơ hình một tế bào động vật điển hình
Các bào quan gồm: (1)hạch nhân, (2) nhân, (3) ribosome, 4) túi tiết,(5) mạng lưới nội
chất (ER) hạt, (6) bộ máy Golgi, (7) khung xương tế bào, (8) ER trơn, (9) ty thể,
(10) không bào, (11) tế bào chất, (12) lysosome, (13) trung thể.
(Nguồn: />
2.2.1. Sự điều hòa trao đổi chất
Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào.

Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn
tại của cơ thể sống.


6

Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là q trình xảy ra giữa tế bào và mơi
trường sống. Do đó, ngồi các yếu tố ảnh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng
độ các chất dinh dưỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các
hoạt động của enzyme.
Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, q trình trao đổi chất cịn
chịu tác động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào.
Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào như ở
thực vật, chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận
những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài
hòa tồn bộ q trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế
bào có liên quan rất chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều
khiển trao đổi chất của tế bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp.
Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác
quá trình dinh dưỡng tế bào trong cơ thể. Khi ni cấy tế bào in vitro, các quá trình
trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập,

không tuân theo quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động
vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt
động của enzyme, đây cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào,
khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân
chia tế bào.
Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định
đến kết quả:
-

Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào.

-

Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào.
Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự
hiểu biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng
đó được biểu hiện ra trong q trình ni cấy.
Trong ni cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát

triển của chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in


7

vitro là những tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này
không chỉ chịu tác động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi
tác động của mơi trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần
tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được ni cấy.
2.2.2. Tính chất cơ học yếu
Ở tế bào vi sinh vật, tế bào được bao bọc bởi thành tế bào – được cấu tạo từ

những hợp chất hữu cơ khá bền, khó bị phân hủy khi tế bào cịn đang phát triển. Ở
tế bào thực vật, thành tế bào còn được cấu tạo bởi hợp chất lignocellulose hay
pectinocellulose, các hợp chất này tạo ra tính chất cơ học, hóa học, vật lý khó bị
phân hủy hơn rất nhiều so với cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật.
Tế bào động vật hồn tồn khơng có thành tế bào, mà chúng chỉ được bao
bọc bởi một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào
khác trong mơ. Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình
khoảng 10 μm, lại khơng có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu. Do
đó, khi ni cấy cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào, trong trường hợp việc nuôi
cấy tế bào cần khuấy hay quay thì tốc độ khơng được q 100rpm (vịng/phút)
(Phan Kim Ngọc, 2002).
2.2.3. Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm
Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất
nhanh, khoảng 20-50 phút. Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo
dài 20-70 giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nếu trong một điều
kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất
thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý.
2.2.4. Cần giá đỡ trong q trình phát triển, nhân đơi
Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế
bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân
chia khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy,
một số dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dịng tế bào kiên tục từ mơ bình


8

thường (sau khi được thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ
lửng, không cần bám vào giá đỡ (Phan Kim Ngọc, 2002).
2.2.5. Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng
Đây là cơ chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed – back).

Bất kỳ tế bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào
động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thường thì các sản
phẩm trao đổi chất thoát ra khỏi tế bào rất chậm.
2.2.6. Khả năng tiếp nhận gene lạ
Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự
nhiên. Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng
tồn tại ở trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dịng thơng tin di truyền lạ (từ
virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thơng tin di truyền khác nhau ở gần
nhau, sẽ xảy ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai.
2.2.7. Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo
Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được
bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc
tính riêng của nó.
0

Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-196 C), tế bào động vật vẫn duy trì được
đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Phương pháp này được áp dụng nhiều ở
các ngân hàng giống động vật trên thế giới.
Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để
phục hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản.
Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện mơi trường, rất
nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng
rất cần huyết thanh, hormone.
2.3. Tổng quan về nuôi cấy tế bào động vật
2.3.1. Nuôi cấy sơ cấp
Định nghĩa: nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên những tế bào vừa
được tách ra từ mô hay cơ quan (Phan Kim Ngọc, 2002).


9

Việc nuôi cấy được bắt đầu tiến hành khi các tế bào được tách ra từ mô bằng
phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng
trong mơi trường thích hợp.
Có nhiều loại enzyme để tách tế bào như collagenase, elastase, hyaluronidase,
pronase… nhưng trypsin được dùng nhiều nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá
thành rẻ. Trypsin (và pronase) có thể tách hồn tồn tế bào từ mơ bằng cách thủy
phân các protein liên kết các tế bào với nhau (Phan Kim Ngọc, 2002).
Dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ phương pháp nào thì đây vẫn là giai đoạn
chọn lọc đầu tiên của q trình ni cấy để cuối cùng có thể thu các dịng tế bào
tương đối đồng dạng.
Trong giai đoạn nuôi cấy sơ cấp, sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như
dễ tách rời nhau, sống và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại được
trong dịch huyền phù. Những tế bào đó là đối tượng cơ bản của q trình ni cấy
sơ cấp. Các tế bào nuôi cấy sơ cấp không đồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ
con của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế bào ni cấy có
hình thái gần với mô cha mẹ nhất.
2.3.2. Sự cấy chuyển
Khi những tế bào trong bình ni cấy sơ khởi phát triển và làm đầy bề mặt
bình ni cấy, chúng cần được cấy chuyền để có bề mặt cho sự phát triển. Qua mỗi
lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu
thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ chết dưới tác động của
trypsin và thao tác cấy chuyền. Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và tiến triển về hình thái,
nhưng từ lần cấy chuyển thứ ba, tế bào trở nên ổn định hơn, có khả năng tăng sinh
nhanh chóng và mạnh mẽ.
Tiến hành cấy chuyền bằng cách tách rời các tế bào từ bình ni cấy bằng
enzyme (tương tự enzyme đã dung khi tách tế bào để nuôi cấy sơ khởi), enzyme này
phá hủy cấu trúc protein gắn kết tế bào với bề mặt cơ chất. Ngay sau khi tế bào
được tách rời, enzyme được bất hoạt nhờ mơi trường ni cấy (có chứa huyết
thanh), huyền phù tế bào được chia nhỏ ra và cho vào bình nuôi cấy mới.

10

2.3.3. Hệ thống nuôi cấy tế bào
2.3.3.1. Nuôi cấy lớp đơn
Thường sử dụng các dụng cụ như đĩa, bình T – flask, hệ thống trục xoay hay
vĩ nhiều giếng được xử lý cho nuôi cấy mô. Các dụng cụ này được chọn tùy vào số
lượng tế bào, bản chất môi trường ni cấy, giá thành và thói quen của người sử
dụng.

Đĩa

Trục xoay

Bình T - flask

Vĩ nhiều giếng

Hình 2.2. Các dụng cụ nuôi cấy tế bào lớp đơn
(Nguồn:
www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_
culture.pdf)
2.3.3.2. Nuôi cấy huyền phù
Thường được tiến hành trong:
-

Bình có cánh quạt xoay từ hoặc bình lắc Erlenmeyer. Trong đó, tế bào được

giữ ở trạng thái huyền phù trong môi trường.

11

Bình Erlenmeyer

Bình có cánh quạt xoay

Hình 2.3. Các dụng cụ ni cấy huyền phù tế bào
(Nguồn:
www.corning.com/Lifesciences/technical_information/techDocs/intro_animal_cell_
culture.pdf)
-

Bình ni cấy tĩnh như bình T – flask hoặc chai, mặc dù tế bào không được

giữ ở trạng thái chuyển động nhưng chúng không thể nào bám vào bề mặt bình
ni cấy được.
Nhiều dịng tế bào, đặc biệt là những dịng từ mơ bình thường được xem là
dòng phụ thuộc chỗ bám (Anchorage – Dependent), chúng chỉ có thể phát triển khi
bám vào một chất nền thích hợp.
Vài dịng tế bào khơng được xem là tế bào bình thường (Transformed Cells)
có thể phát triển nhanh mà không cần bám vào bề mặt hoặc di chuyển tự do trong
dịch huyền phù (ví dụ: tế bào máu).
2.3.4. Các loại tế bào trong nuôi cấy tế bào động vật
Những tế bào nuôi cấy thường được mô tả dựa trên hình thái (hình dạng và
biểu hiện) hoặc đặc điểm chức năng của chúng. Có 5 dạng hình thái cơ bản:
-

Dạng biểu mô (Epithelial – like): những tế bào này bám trên bề mặt có dạng

đa giác và dát mỏng.
-

Lympho bào (Lymphoblast – like): là những dòng tế bào thường không bám

lên bề mặt nhưng tồn tại trong dịch huyền phù dưới dạng hình cầu.
-

Nguyên sợi bào (Fibroblast – like): những tế bào bám trên bề mặt và có biểu

hiện thon dài, có hai đầu, thường có dạng xốy khi nuôi cấy với mật độ dày đặc.


12

-

Tế bào thần kinh (Neuron): cấu tạo có mấu lồi và sợi trục đặc trưng, ít quan

sát được sự phân chia trong môi trường.
-

Tế bào cơ (Muscle – like): dạng ống nhỏ có nhiều nhân, biệt hóa thành dạng

ống trong q trình ni cấy.
Điều kiện ni cấy đóng vai trị quan trọng trong việc xác định hình dạng và
ni cấy nhiều tế bào có khả năng biểu hiện sự đa dạng về hình thái.
Sử dụng kỹ thuật đồng nhất tế bào cũng có thể lai các tế bào với nhau bằng
cách kết hợp những tế bào từ bố mẹ khác nhau, cho biểu hiện đặc điểm của cha

hoặc mẹ hoặc cả cha và mẹ. Kỹ thuật này được sử dụng để sản xuất kháng thể đơn
dòng theo mong muốn. Những tế bào lai này gọi là Hybridomas được kết hợp từ hai
tế bào khác nhau. Thứ nhất là một lympho bào lách (có khả năng sản xuất kháng thể
mong muốn). Thứ hai là một tế bào myeloma đang phân chia nhanh (một loại tế bào
ung thư). Kết quả, thể lai có thể sản xuất số lượng lớn kháng thể mong muốn.
Những kháng thể này gọi là kháng thể đơn dòng bởi sự tinh sạch của nó, ứng dụng
nhiều trong điều trị, chẩn đốn bệnh, và cơng nghiệp với giá trị hằng năm trên một tỉ
đô la.
2.3.5. Những đặc điểm chức năng của tế bào nuôi cấy
Đặc điểm của những tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào nguồn gốc (gan, tim…)
và khả năng thích nghi của chúng với điều kiện mơi trường. Những marker hóa sinh
được sử dụng để kiểm tra xem tế bào có mang những đặc điểm chức năng mà chúng
có trong cơ thể sống hay khơng (ví dụ: tế bào gan tiết albumin). Những dấu hiệu
hình thái học hay siêu cấu trúc cũng có thể được xác định (chẳng hạn sự đập của tế
bào tim). Thông thường, những đặc điểm này có thể thay đổi hoặc mất đi khi đặt tế
bào trong điều kiện nhân tạo.
Sau một số lần cấy chuyền nhất định, vài dòng tế bào sẽ ngừng phân chia và
biểu hiện sự hóa già. Những dịng tế bào này được gọi là “có hạn” (Finite); tế bào
CEF là một dịng tế bào có hạn và số lần phân chia của tế bào CEF là từ 16 – 18 lần
(Christman và ctv, 2006). Những dòng tế bào khác có thể phân chia khơng giới hạn
(hoặc trở thành bất tử) và được gọi là dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Line).


13

Khi một dịng tế bào “có hạn” bình thường trở thành bất tử, nó trải qua một sự thay
đổi khơng thể đảo ngược (Transformation). Nó có thể xảy ra tự phát hay do sử dụng
thuốc, bức xạ hay virus có chủ định. Những tế bào biến đổi thường phát triển dễ
hơn và nhanh hơn, thường có Chromosome lớn hoặc khơng bình thường và có thể
phát triển trong dịch huyền phù.

2.3.6. Điều kiện thích hợp cho ni cấy tế bào động vật
Một điều kiện thích hợp (“happy”) là điều kiện tốt hơn so với điều kiện cho
phép tế bào tồn tại trong ni cấy. Thơng thường, nó là điều kiện cho phép những tế
bào - ở số lượng rất ít – tăng số lượng thông qua sự phân chia. Đúng hơn là, khi có
những điều kiện xác định, tế bào ni cấy sẽ biểu hiện sự thích hợp của chúng với
điều kiện sống, như mang các chức năng sinh lý, sinh hóa quan trọng như trong cơ
thể sống, chẳng hạn sự co cơ hay sự tiết hormone và enzyme. Để có điều kiện sống
này, cần cung cấp cho tế bào nhiệt độ thích hợp, chất bám tốt và mơi trường ni
cấy chuẩn xác.

 Nhiệt độ thường là tương tự nhiệt độ cơ thể vật chủ mà tế bào được tách ra.
0

Với sinh vật máu lạnh, nhiệt độ thường thay đổi từ 18 – 25 C, hầu hết động vật hữu
0
nhũ đòi hỏi nhiệt độ từ 36 – 37 C. Phạm vi nhiệt độ này được bảo đảm bằng nhiệt
kế và tủ ấm phải được kiểm tra thường xuyên.

 Những tế bào phụ thuộc chỗ bám cũng đòi hỏi một chất nền tốt để bám và
phát triển. Thủy tinh và plastic (được xử lý đặc biệt) thường được sử dụng nhất. Tuy
nhiên, những yếu tố bám như collagen, gelatin, fibronectin cũng có thể được sử
dụng như “áo khoác” cho bề mặt bám để cải tiến sự phát triển và chức năng của
những tế bào lấy từ não, máu, thận, gan, da… Thường thì những tế bào phụ thuộc
chỗ bám bình thường sẽ có chức năng tốt hơn nếu chúng được phát triển trên một
chất nền xốp hay có dạng tổ ong.
Tế bào cũng có thể phát triển trên các hạt trong huyền phù (hạt thủy tinh,
plastic, polyacrylamide và hệ thống các phân tử dextrin). Bằng cách này, các tế bào
phụ thuộc chỗ bám có thể phát triển trong hệ thống ni cấy huyền phù và làm tăng
khả năng sản xuất tế bào bằng phương pháp sinh học.

14

 Môi trường nuôi cấy là yếu tố phức tạp và quan trọng nhất để kiểm soát khả

năng làm tế bào phát triển tốt. Bên cạnh những đòi hỏi dinh dưỡng cơ bản của tế

bào, môi trường nuôi cấy phải có nhiều yếu tố phát triển cần thiết, điều chỉnh pH và
áp suất, cung cấp các khí thiết yếu (O 2 và CO2). Thành phần dinh dưỡng của môi
trường nuôi cấy gồm amino acid, vitamine, khoáng và carbohydrate. Chúng cho
phép tế bào tạo ra những protein mới và các thành phần thiết yếu khác cho sự phát
triển và các hoạt động chức năng – tương tự như sự cung cấp năng lượng cho trao
đổi chất.
Amino acid: các amino acid cần thiết là các amino acid không được tổng
hợp trong cơ thể nên cần phải được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Nhu cầu về
cysteine và tyrosine thay đổi khác nhau tùy theo dịng tế bào. Các amino acid khơng
cần thiết khác cũng được bổ sung vào môi trường để bù đắp cho những dịng tế bào
khơng có khả năng tổng hợp. Glutamine cần thiết cho hầu hết các dòng tế bào, hiện
nay, một số bằng chứng cho thấy glutamine được sử dụng trong môi trường nuôi
cấy tế bào như nguồn cung cấp năng lượng và carbon (trích dẫn bởi Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Vitamine: môi trường MEM của Eagle (EMEM) chỉ có các vitamine thuộc
nhóm B, các vitamine từ nhóm khác sẽ được bổ sung từ huyết thanh. Khi tăng thành
phần mơi trường lên (mục đích để giảm lượng huyết thanh xuống) thì danh sách các
vitamine trong môi trường cũng phải tăng theo. Khi giảm lượng huyết thanh trong mơi
trường thì việc bổ sung các vitamine khác ngồi những vitamine đã có sẳn trong mơi
trường là rất cần thiết. Khi mật độ tế bào trong môi trường ni cấy thấp (trong giai
đoạn nhân dịng tế bào) thì cần phải tăng lượng vitamine cho dù

trong mơi trường đã có sự hiện diện của huyết thanh. Sự hạn chế về vitamine có ảnh

hưởng rõ rệt trên sức sống và tốc độ tăng trưởng của tế bào hơn là trên mật độ tế
bào.
+

+

2+

2+

-

2-

3-

Muối: các loại muối chủ yếu như Na , K , Mg , Ca , Cl , SO3 , PO4 và
-

HCO3 là thành phần chính tạo ra áp suất thẩm thấu của môi trường. Trong huyền