NGUYỄN THỊ MINH HỒNG NGHIÊN cứu đặc điểm THỰC vật, THÀNH PHẦN hóa học và tác DỤNG KHÁNG VI SINH vật của cây lở LEO THU hái tại hòa BÌNH KHOÁ LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ bộ y tế TRƯỜNG đại học dược hà nội

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT
CỦA CÂY LỞ LEO
THU HÁI TẠI HỊA BÌNH
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
HÀ NỘI – 2020


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ MINH HỒNG
Mã sinh viên: 1501191

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT,
THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ TÁC DỤNG KHÁNG VI SINH VẬT
CỦA CÂY LỞ LEO
THU HÁI TẠI HỊA BÌNH
KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Hoàng Quỳnh Hoa

2. Ths. Phạm Thị Linh Giang
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Thực vật –
Trường Đại học Dược Hà Nội
2. Bộ môn Vi Sinh & Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2020


Lời cảm ơn
Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn quý thầy
cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy cơ bộ mơn Thực Vật- Trường
Đại học Dược Hà Nội nói riêng đã giảng dạy, truyền đạt cho em những kiến
thức, kinh nghiệm trong suốt 5 năm học qua, đồng thời luôn giúp đỡ, tạo mọi
điều kiện để em có thể hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Quỳnh Hoa và ThS. Phạm
Thị Linh Giang, những người đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, góp ý, hết
lịng hỗ trợ em trong suốt q trình làm khóa luận tại bộ mơn. Em xin gửi lời
cảm ơn tới TS. Đỗ Ngọc Quang - Bộ môn Vi sinh & Sinh học - Đại học Dược
Hà Nội đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ em hồn thành khóa luận. Em cũng xin
chân thành cảm ơn chị Phạm Mỹ Hạnh - kĩ thuật viên bộ môn Thực Vật Trường Đại học Dược Hà Nội đã hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ em trong suốt quá trình
nghiên cứu. Nhân dịp này, em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới toàn thể các
cán bộ bộ môn Thực Vật - Trường Đại học Dược Hà Nội đã luôn giúp đỡ, chỉ
bảo và tạo điều kiện tốt nhất về phịng thí nghiệm cũng như dụng cụ, thiết bị để
em hoàn thành tốt việc nghiên cứu, thực nghiệm tại bộ mơn. Cuối cùng, em xin
bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè và các bạn sinh viên K70 cùng nghiên
cứu tại bộ môn Thực Vật đã luôn giúp đỡ, động viên và cổ vũ em trong suốt thời
gian qua.
Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức cịn hạn chế nên em khơng tránh
khỏi việc mắc thiếu sót trong q trình thực hiện khóa luận. Em kính mong nhận

được ý kiến góp ý q báu của q thầy cơ để đề tài khóa luận được hồn thiện
hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020
Sinh viên

Nguyễn Thị Minh Hồng


MỤC LỤC
Lời cảm ơn
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN............................................................................. 1
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................... 1
1.1.1. Đặc điểm thực vật họ Dây khế (Connaraceae) ................................ 1
1.1.2. Vị trí phân loại chi Cnestis................................................................ 1
1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Cnestis .................................................... 1
1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Cnestic Jussieu ................. 2
1.2.1. Hợp chất phenolic ............................................................................. 2
1.2.2. Sterol .................................................................................................. 3
1.2.3. Dẫn chất glucosid .............................................................................. 4
1.2.4. Acid béo và dẫn chất ........................................................................ 4
1.2.5. Ancol .................................................................................................. 5
1.2.6. Coumarin ........................................................................................... 5
1.2.7. Acid amin ........................................................................................... 5
1.3. Tác dụng sinh học của chi Cnestis ............................................................ 6

1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn ..................................................................... 6
1.3.2. Chống co giật .................................................................................... 7
1.3.3. Hoạt động chống oxy hóa ................................................................. 7
1.3.4. Chống tế bào ung thư ........................................................................ 7
1.3.5. Tác dụng an thần, giải tỏa căng thẳng ............................................ 8
1.3.6. Giảm đau chống viêm........................................................................ 8
1.3.7. Hạ đường huyết ................................................................................. 9
1.3.8. Tác dụng chống trầm cảm ................................................................ 9
1.3.9. Tác dụng bảo vệ gan ......................................................................... 9


1.3.10. Tác dụng nhuận tràng .................................................................. 10
1.3.11. Một số độc tính của chi Cnestis .................................................... 10
1.4. Kinh nghiệm sử dụng các loài thuộc chi Cnestis trong kinh nghiệm dân
gian của các nước trên thế giới ...................................................................... 11
1.4.1. Trên thế giới ................................................................................... 10
1.4.2. Tại Việt Nam................................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 12
2.1. Nguyên liệu nghiên cứu ........................................................................... 12
2.2. Phương tiện nghiên cứu ........................................................................... 12
2.2.1. Hóa chất – Thuốc thử ..................................................................... 12
2.2.2. Máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu .................................. 12
2.2.3. Chủng vi khuẩn kiểm định ............................................................. 13
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 13
2.4. Phương pháp nghiên cứu......................................................................... 13
2.4.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật ................................................... 13
2.4.2. Nghiên cứu về hóa học ................................................................... 14
2.4.3. Nghiên cứu về tác dụng kháng vi sinh vật, nấm ........................... 19
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .................... 24
3.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật................................................................. 24

3.1.1. Đặc điểm hình thái cây Lở leo ........................................................ 24
3.1.2. Đặc điểm vi phẫu ............................................................................. 25
3.1.3. Đặc điểm soi bột............................................................................... 29
3.2. Định tính thành phần hóa học của thân và lá Lở leo ............................ 30
3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học ................................................. 30
3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng ..................................................... 36
3.3. Tác dụng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết thân Lở leo ............. 37
BÀN LUẬN ...................................................................................................... 40
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ABTS

2, 2-azino-bis (3- ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)

C.

Cnestis

DĐVN-V

Dược điển Việt Nam 5

DMSO

Dimethyl sulfoxit

DPPH

1, 1- diphenyl-2-picryl hydrazyl

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

EPM

Elevated plus maze

FBG

Fasting blood glucose

FST

Forced swimming test

HPTLC

High-performance thin-layer chromatography

HTC

Hepatoma tissue culture

IC50

Half maximal inhibitory concentration

LDB

Light/dark box

MBC

Minimum bactericidal concentration

MES

Maximal electroshock seizure

MIC

Minimal inhibitory concentration

Rf

Radio frequency

RRL

Rabbit reticulocyte lysate

TLC

Thin-layer chromatography

TTC

Triphenyl tetrazolium Chloride

VSV

Vi sinh vật


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các chủng VSV dùng để thử nghiệm và kháng sinh sử dụng làm
chứng dương .................................................................................................... 21
Bảng 3.1. Kết quả định tính nhóm chất bằng phản ứng hóa học ............... 31
Bảng 3.2. Giá trị Rf và màu sắc các vết trên sắc ký đồ ............................... 37
Bảng 3.3. Khối lượng cắn thu được của mẫu nghiên cứu ........................... 37
Bảng 3.4. Kết quả thử tác dụng kháng vi sinh vật ....................................... 38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình

1.1.

Một

số

hợp

chất

phenolic

trong

chi

Cnestis

............................................................................................................................. 3
Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học β-sitosterol........................................................... 3
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học β-sitosterol-glucosid ........................................... 4
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học afrormosin-7-O-betasD-galactosid ................... 4
Hình 1.5. Một số acid béo và dẫn chất acid béo trong chi Cnestis ............... 4
Hình 1.6. Cấu trúc hóa học triacontanol ......................................................... 5
Hình 1.7. Một số hợp chất coumarin trong chi Cnestis ................................. 5
Hình 1.8. Cấu trúc hóa học methionin sulfoximin ......................................... 6
Hình 3.1. Hình thái Lở leo .............................................................................. 24
Hình 3.2. Hình thái hoa cây Lở leo ................................................................ 25
Hình 3.3. Đặc điểm vi phẫu thân Lở leo........................................................ 26
Hình 3.4. Đặc điểm vi phẫu lá Lở leo ............................................................ 28
Hình 3.5. Đặc điểm bột thân Lở leo ............................................................... 29
Hình 3.6. Đặc điểm bột lá Lở leo.................................................................... 30
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu thử thân, lá hiện màu bằng thuốc thử vanilin H2SO4 ở ánh sáng thường ............................................................................... 37
Hình 3.8. Tác dụng kháng khuẩn của dịch chiết Lở leo trên các chủng
Staphylococcus aureus và Bacillus subtilis .................................................... 39


ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là một nước nhiệt đới, khí hậu nóng ẩm quanh năm, với địa hình
phức tạp, hệ thực vật đa dạng với khoảng hơn 10000 loài thực vật bậc cao, 600
loài nấm và 800 loài rêu [7]. Với tài nguyên thực vật và kho tàng tri thức sử dụng
cây cỏ làm thuốc đa dạng, nước ta được biết đến là nước có nền y học cổ truyền
phong phú và đặc sắc.
Người Mường là một trong những dân tộc thiểu số ở nước ta, nổi tiếng với
nhiều bài thuốc nam độc đáo. Văn hóa và xã hội của cộng đồng người Mường
luôn gắn liền với cây thuốc và bài thuốc. Họ sử dụng cây cỏ để chữa trị nhiều
bệnh thơng thường trong đó có các bệnh ngồi da. Bên cạnh một số cây thuốc
có tác dụng chữa bệnh ngoài da đã được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học
và tác dụng sinh học, Lở leo là một cây thuốc được sử dụng lâu đời tại Hịa Bình
với tác dụng kháng khuẩn. Theo kết quả điều tra sơ bộ về các cây thuốc của
người Mường ở Hồ Bình, Lở leo có thể được xác định là một lồi thuộc chi
Cnestis tuy nhiên các thông tin về điểm thực vật, thành phần hoá học và tác dụng
sinh học của cây thuốc này vẫn còn chưa được đầy đủ. [11]
Để góp phần nâng cao giá trị khoa học của một cây thuốc đã được sử dụng
theo kinh nghiệm dân gian, đồng thời giúp cho việc sử dụng cây Lở leo hiệu quả
hơn, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và tác dụng
kháng vi sinh vật của cây Lở leo thu hái ở Hịa Bình” được thực hiện với các
mục tiêu như sau:
1. Hồn thiện mơ tả đặc điểm thực vật và giám định tên khoa học của mẫu
nghiên cứu.
2. Định tính thành phần hóa học của mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa
học và sắc kí lớp mỏng.
3. Thử tác dụng kháng vi khuẩn và nấm của dịch chiết toàn phần mẫu
nghiên cứu.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

1.1.1. Đặc điểm thực vật họ Dây khế (Connaraceae)
Cây gỗ nhỏ, cây bụi hoặc dây leo. Lá mọc so le, khơng lá kèm, có cuống lá;
phiến lá lơng chim lẻ, kép 3 lá hoặc 1 lá; các lá chét mọc gần đối hoặc so le. Cụm
hoa đầu cành, giả đầu cành, hoặc ở nách lá. Hoa lưỡng tính hoặc đơn tính, đối
xứng tỏa tia, hoặc đối xứng hai bên. Đài hoa gồm 5 lá đài, rời hoặc chỉ hợp nhất
ở rất gần gốc, xếp lợp hoặc xếp rời. Tràng hoa gồm 5 cánh hoa xếp lợp hoặc rời.
Bộ nhị gồm 5-10, các bao phấn mở dọc. Lá noãn (1-)5(-8), rời, 1 ngăn, rậm lơng.
Vịi nhụy hình dùi hoặc hình chỉ; đầu nhụy gần giống hình đầu, đơn hoặc 2 thùy.
Nỗn 2 trong mỗi lá noãn, ở bên, thẳng đứng. Quả thường là quả đại đơn độc [23]
[49].
Họ Dây khế có 19 chi gồm: Agelaea, Burttia, Cnestidium, Cnestis,
Connarus, Ellipanthus, Hemandradenia, Jaundea, Jollydora, Manotes, Paxia,
Pseudoconnarus, Rourea, Roureopsis, Santalodes, Santaloides, Spiropetalum,
Taeniochlaena, Vismianthus và gồm khoảng 350 lồi [51].
1.1.2. Vị trí phân loại chi Cnestis Jussieu
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [45], vị trí phân loại của chi Cnestis
như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoa hồng (Rosidae)
Bộ Chua me đất (Oxalidales)
Họ Dây khế (Connaraceae)
Chi Cnestis Jussieu.
1.1.3. Đặc điểm thực vật của chi Cnestis
Dây leo hay cây nhỡ có cành leo, có khi mọc đứng lúc đầu. Lá kép lông chim
lẻ với lá chét nguyên. Cụm hoa ở nách hoặc ở ngọn, đơn độc hoặc thành bó. Hoa
mẫu 5, lưỡng tính, lá đài hơi bị dính ở gốc. Cánh hoa ngắn và dài hơn lá đài. Nhị
1

10 rời hoặc hơi dính ở gốc, 5 cái đối diện với đài hơi dài hơn 5 cái đối diện với
cánh hoa. Lá nỗn 5, bầu có lơng nhung; vịi nhụy dài nhiều hay ít. Quả gồm 1-5
quả tại mỗi hoa, dạng quả lê nhiều hay ít và có sừng nhiều hay ít, mở dọc trong,
có lơng mềm ở ngồi, có lơng áp sát ở trong; đài tồn tại, khơng đồng trưởng. [6]
Trên thế giới, chi Cnestis có 13 lồi gồm: Cnestis bomiensis Lemmens,
Cnestis corniculata Lam.,
Cnestis macrantha Baill.,
Cnestis mannii Schellenb.,
Merr.,

Cnestis ferruginea Vahl
Cnestis macrophylla Gilg
Cnestis mildbraedii Gilg,

Cnestis polyphylla Lam.,

ex
ex

DC.,
Schellenb.,

Cnestis palala (Lour.)

Cnestis racemosa G.Don,

Cnestis uncata Lemmens, Cnestis urens Gilg và Cnestis yangambiensis Louis ex
Troupin [51]. Tại Việt Nam, chi Cnestis có 1 loài là Cnestis palala (Lour.) Merr.
[7]

1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Cnestis Jussieu
Các nghiên cứu đã phân lập được các chất chính trong lá, quả và thân các
loài trong chi Cnestis gồm: coumarin, flavonoid, saponin, glycosid, sterol, tanin
và acid amin [46] [22] [41].
1.2.1. Flavonoid
Theo nghiên cứu của Ismail O.I và cộng sự, chiết xuất từ rễ C. ferruginea có
chứa hợp chất amentoflavon với nhiều tác dụng dược lý [37] [29].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học amentoflavon

2


1.2.2. Ester của acid hydroxycinnamic
Năm 2011, trong một nghiên cứu về thành phần hóa học của C. ferruginea,
Adisa và cộng sự đã phân lập được chất robustasid B (6'-3",4"dihydroxycinnamoyl) từ dịch chiết lá C. ferruginea [16]. Năm 2015, một ester của
acid hydroxycinnamic khác được phân lập từ dịch chiết lá C. palala có cấu trúc
được xác định là: ethyl caffeate [21].

Robustasid B

Ethyl caffeate
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học một số ester của acid hydroxycinnamic
1.2.3. Hydroxyquinon
Kết quả của một số nghiên cứu trên thế giới cho thấy, hydroxyquinon được
phát hiện ở hai loài trong chi Cnestic: C. ferruginea [15] và C. palala [21].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học hydroxyquinon
1.2.4. Sterol
Năm 1982, Olugbade và cộng sự đã phân lập thành công β-sitosterol từ dịch

chiết ether lá cây C. ferruginea bằng bằng sắc ký kết hợp khối phổ [43]. Năm
2015, hợp chất này cũng được tìm thấy trong dịch chiết ethanol lá C. palala [21].

Hình 1.4. Cấu trúc hóa học β-sitosterol
3


1.2.5. Dẫn chất glucosid
Năm 2015, một sterol glucosid được phân lập từ lá C. palala, có cấu trúc
được xác định là β-sitosterol-glucosid (daucosterin) [21].

Hình 1.5. Cấu trúc hóa học β-sitosterol-glucosid
Trong nghiên cứu của Parvez và cộng sự, một isoflavon glycosid với cấu trúc
afrormosin-7-O-betasD-galactosid được phân lập từ quả C. ferruginea [44].

Hình 1.6. Cấu trúc hóa học afrormosin-7-O-betasD-galactosid
1.2.6. Acid béo và dẫn chất
Hỗn hợp acid béo bão hòa với hai thành phần chính là acid hexadecanoic,
acid octadecanoic được phân lập từ C. palala [21]. Bên cạnh đó, hợp chất
octacosanyl stearat cũng được phân lập từ dịch chiết ether quả C. ferruginea. [40]

Acid hexadecanoic

Acid octadecanoic

Octacosanyl stearat
Hình 1.7. Một số acid béo và dẫn chất acid béo trong chi Cnestis
4

1.2.7. Alcol
Nghiên cứu của Olugbade và cộng sự đã phân lập thành cơng alcol có trong
dịch chiết lá cây C. ferruginea với cấu trúc được xác định là: triacontanol. [43]

Hình 1.8. Cấu trúc hóa học triacontanol
1.2.8. Coumarin
Năm 1980, nghiên cứu về một số loài trong họ Connaraceae được thực hiện,
nghiên cứu này đã xác định được hai chất: Dicoumarol and 4-hydroxycoumarin
có trong hai lồi C. corniculatac, C. ferruginea. Năm 2015, một hợp chất nhóm
courmarin khác: scopoletin (7-(hydroxy-6-methoxycoumarin) được phân lập từ
dịch chiết thân của C. palala bằng sắc kí khí khối phổ [21].

Dicoumarol

4-hydroxycoumarin

7-(hydroxy-6-methoxycoumarin
Hình 1.9. Một số hợp chất coumarin trong chi Cnestis
1.2.9. Acid amin
Năm 1984, Jeannoda và cộng sự đã phân lập được methionin sulfoximin
(acid 2(S) -methionine S (S) -sulfoximine [(2S, SS) -2-amino-4- (Smethylsulfonimidoyl) từ dịch chiết vỏ của C. glabra [32] bằng sắc kí kết hợp khối
phổ [33].
5


Dẫn chất acid amin này sau đó được tìm thấy ở một số loại khác thuộc chi
Cnestis như C. palala [30], C. polyphylla [34], C. ferruginea [25].

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học methionin sulfoximin
1.3. Tác dụng sinh học của chi Cnestis

Tác dụng sinh học của chi Cnestis chỉ mới được nghiên cứu chủ yếu trên hai
loài C. ferruginea và C. palala.
1.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn
Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết ethanol thân C. ferruginea đã được thử
nghiệm trên vi khuẩn đa kháng thuốc phân lập từ thịt sống. Nghiên cứu sử dụng
phương pháp khuếch tán trên thạch và phương pháp vi định lượng trong vi môi
trường lỏng với ba chủng Escherichia Coli, Staphylococcus aureus và Salmonella
spp phân lập từ thịt sống. Hoạt tính kháng khuẩn được đánh giá qua một số chỉ
tiêu: đường kính vịng vơ khuẩn (IZD), nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng
độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC). Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết ethanol
thân

C.

ferruginea

có

tác

dụng

kháng

khuẩn

trên

cả

3

chủng

Staphylococcus aureus (MIC, MBC khoảng 3.2-6.3 mg/ml), Escherichia Coli
(MIC, MBC khoảng 150 mg/mL) và Salmonella spp (MIC, MBC khoảng 6.2
mg/mL) với IZD trong khoảng 13-18 mm [22].
Một nghiên cứu khác cũng đã chứng minh dịch chiết C. ferruginea nồng độ
cao ức chế tốt các chủng Staphylococcus aureus, Escherichia Coli và Candida
albicans (ức chế từ 40% đến 75% đối với nồng độ dao động từ 1 đến 5 mg/mL).
[44]
Một nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn của C. palala của Dej-adisai và
cộng sự cho thấy: bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch, các dịch chiết
ethanol lá, thân và vỏ thân cây C. palala có tác dụng kháng khuẩn đối với các
chủng Staphylococcus aureus (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 7,96±0,70
6


mm; 7,05±0,43 mm; 10,9±0,60 mm) và Staphylococcus epidermidis (kích thước
vịng vô khuẩn lần lượt là: 13,83±0,90 mm; 7,00±0,21 mm; 13,42±0,67 mm) [21].
Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Lar MSM, khi sử dụng phương pháp khuếch
tán trên đĩa thạch; các dịch chiết cloroform, ethyl acetate và ethanol rễ cây C.
palala có tác dụng kháng khuẩn đối với sáu chủng VSV bao gồm Bacillus subtilis
(kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 17 mm; 13 mm; 13 mm), Staphylococcus
aureus (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 18 mm; 12 mm; 16 mm),
Pseudomonas aeruglnosa (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 20 mm; 15 mm;
15 mm) , Bacillus pumalis (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 18 mm; 14 mm;
17 mm), Candida albicans (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 18 mm; 14 mm;
16 mm) và Escherichia coli (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 18 mm; 11
mm; 13 mm). Mặt khác, dịch chiết methanol và aceton chỉ có tác dụng trên ba

chủng vi sinh vật là Pseudomonas aeruglnosa (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt
là: 16 mm; 17 mm), Bacillus pumalis (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 15
mm; 18 mm) và Candida albicans (kích thước vịng vơ khuẩn lần lượt là: 15 mm;
16 mm) [35].
1.3.2. Chống co giật
Tác giả Ismail và cộng sự đã điều tra tác dụng chống co giật củaC.
ferruginea bằng mơ hình gây co giật trên chuột bạch với các tác nhân: tác nhân
sốc điện tối đa (MES), strychnin (4 mg/kg, tiêm màng bụng), picrotoxin (7,5
mg/kg, tiêm màng bụng), bicucullin (2,7 mg/kg, tiêm màng bụng), isoniazid (250
mg/kg, tiêm màng bụng) và yohimbin (45 mg/kg, tiêm dưới da). Kết quả nghiên
cứu cho thấy dịch chiết ethanol rễ cây C. ferruginea (200 mg/kg) có tác dụng
chống co giật với mơ hình sử dụng các tác nhân strychnin và isoniazid (p < 0,05),
đặc biệt trong mơ hình sử dụng tác nhân bicucullin và MES, dịch chiết có tác
dụng tương đương của thuốc chống động kinh tiêu chuẩn (clonazepam - 0,5
mg/kg, uống) [27].
1.3.3. Hoạt động chống oxy hóa
Basil N Ita và cộng sự đã chứng minh tác dụng chống oxy hóa của dịch chiết
ethanol hạt C. ferruginea bằng phương pháp sử dụng các gốc tự do DPPH và
7


ABTS. Trong thí nghiệm với DPPH và ABTS, dịch chiết ethanol hạt C. ferruginea
(100 μg/ml) thể hiện rõ khả năng dọn gốc tự do. Đặc biệt, trong thí nghiệm với
ABTS, dịch chiết thể hiện tác dụng dọn gốc tự do ngay ở nồng độ 10 μg/mL và
tác dụng tăng đáng kể ở nồng độ 100 μg/mL [18].
Trong một nghiên cứu khác, Adisa và cộng sự đã được phân lập thành cơng
các chất chống oxy hóa tiềm năng robasid B và para-hydroxyphenol từ lá C.
ferruginea. Kết quả cho thấy, robasid B và para-hydroxyphenol làm giảm đáng
kể (p < 0,05) lượng acid thiobarbituric tạo ra từ hỗn hợp Fe2+/ascorbat, điều này
đã khẳng định hoạt động chống oxy hóa của C. ferruginea [15].

1.3.4. Chống tế bào ung thư
Nghiên cứu của Dej-adisai và cộng sự đã chứng minh C. palala có tác dụng
ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) và dòng tế bào ung thư đại tràng (HT29). Kết quả nghiên cứu cho thấy: các loại dịch chiết n-hexan của lá và hạt, dịch
chiết ether dầu hoả của vỏ thân và rễ C. palala có tác dụng ức chế mạnh đối với
dịng tế bào MCF-7 với khả năng ức chế lần lượt là : 79,97 ± 6,09 %, 83,91 ±
13,74%, 93,58 ± 1,87% và 83,36 ± 7,44%; dịch chiết ether dầu hoả thân C. palala
có tác dụng ức chế 92,16 ± 2,38% đối với HT-29 [21].
1.3.5. Tác dụng an thần, giải tỏa căng thẳng
Năm 1984, một nghiên cứu của Jeannoda V. L và cộng sự đã đánh giá tác
dụng chống căng thẳng của dịch chiết nước rễ C. ferruginea qua một số mơ hình
động vật trên chuột như: thử nghiệm bơi cưỡng bức, thử nghiệm giới hạn anoxic
và thử nghiệm căng thẳng bất động gây loét dạ dày. Trong thử nghiệm bơi cưỡng
bức, C. ferruginea (300-500 mg/kg, uống) làm giảm đáng kể (p < 0,05) thời gian
bất động, tác dụng này phụ thuộc liều. Trong thử nghiệm giới hạn anoxic, dịch
chiết làm tăng thời gian trung bình (phút) (p <0,05) trước khi co giật ở chuột [31].
1.3.6. Giảm đau chống viêm
Những phát hiện trong nghiên cứu của Ishola IO và cộng sự cho thấy dịch
chiết methanol rễ C. ferruginea có tác dụng giảm đau và chống viêm với cơ chế
liên quan đến ức chế giải phóng và ức chế hoạt động của các chất trung gian hóa
học (histamin, serotonin và kinin). [30]
8


Năm 2012, Ibironke và cộng sự đã điều tra tác dụng giảm đau và chống viêm
của dịch chiết methanol thân C. ferruginea trên chuột bạch. Nghiên cứu sử dụng
phương pháp vật lý - sử dụng nhiệt, phương pháp hóa học - sử dụng acid acetic
để đánh giá tác dụng giảm đau, và sử dụng mơ hình gây u hạt, mơ hình gây
phù bàn chân để đánh giá tác dụng chống viêm của dịch chiết methanol thân C.
ferruginea. Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết methanol thân C. ferruginea
(300-500 mg/kg, đường uống) có tác dụng kéo dài thời gian bắt đầu liếm chân của

chuột khi chuột được đặt trên một tấm nóng duy trì ở 55 ± 2oC. Bên cạnh dó, dịch
chiết cịn có tác dụng ức chế phù chân (p < 0,05) do carrageenan và giảm khối
lượng u hạt ở mơ hình gây u hạt [26].
1.3.7. Hạ đường huyết
Năm 2010, Adisa R. A và cộng sự đã nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết
của các dịch chiết methanol và ethylacetat lá cây C. ferruginea trên chuột bạch sử
dụng streptozotocin (STZ). Các dịch chiết được dùng bằng đường uống một liều
duy nhất (250 mg/kg) trong 10 ngày liên tiếp. Kết quả nghiên cứu cho thấy, FBG
ở nhóm thử đã giảm đáng kể (p < 0,005) sau 4 h từ khi sử dụng dịch chiết. Sau 10
ngày, nhóm thử sử dụng các dịch chiết methanol và ethylacetat lá C. ferruginea
có mức độ giảm FBG lần lượt là 74% và 68% trong khi nhóm chứng - nhóm chuột
sử dụng thuốc đái tháo đường tiêu chuẩn glibenclamid có kết quả giảm FBG là
60% [14].
1.3.8. Tác dụng chống trầm cảm
Năm 2007, Ishola IO và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động chống trầm cảm
của C. ferruginea. Nghiên cứu sử dụng các mơ hình bơi cưỡng bức (FST), thử
nghiệm treo đi (TST), mơ hình chữ thập nâng cao (EPM) và mơ hình 2 ngăn
sáng tối (LDB) để đánh giá hiệu quả giải lo âu. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều
trị bằng chiết xuất C. ferruginea làm giảm đáng kể (p > 0,001) thời gian bất động
trong hai mơ hình FST và TST. Tác dụng chống trầm cảm của C. ferruginea cao
hơn imipramin (p > 0,05) trong mơ hình FST và tương đương fluoxetin trong mơ
hình TST [31].
1.3.9. Tác dụng bảo vệ gan
9


Năm 2012, Akharaiyi và cộng sự đã báo cáo tác dụng bảo vệ gan của dịch
chiết ethanol lá C. ferruginea trên chuột bị tổn thương gan bởi paracetamon. Các
thông số đánh giá bao gồm: Aspartat Aminotransferase (AST), Alanin
Aminotransferase (ALT), Phosphatase kiềm (ALP) và mô bệnh học. Kết quả

nghiên cứu cho thấy sử dụng dịch chiết ethanol lá của C. ferruginea (liều 4002000 mg/kg, đường uống) có tác dụng cải thiện tình trạng tổn thương gan được
thể hiện qua hình ảnh mô bệnh học của lô chuột thử [17].
1.3.10. Tác dụng nhuận tràng
Nghiên cứu của Yakubu và cộng sự đã chứng minh dịch chiết nước rễ C.
ferruginea có hoạt tính nhuận tràng ở các liều khác nhau đối với chuột bị táo bón
do loperamid, tác dụng này cho hiệu quả tối ưu ở mức liều 100 mg/kg [49].
1.3.11. Một số nghiên cứu về độc tính của chi Cnestis
* Độc tính đối với chức năng sinh sản
Nghiên cứu của Olayemi và cộng sự đã báo cáo độc tính sinh sản trên chuột
đực của các quinolizidin alkaloid từ chiết xuất rễ của C. ferruginea. Nghiên cứu
cho thấy, dịch chiết rễ C. ferruginea làm giảm đáng kể (p < 0,05) số lượng, khả
năng vận động, khả năng sống, hình thái tinh trùng và nồng độ testosteron trong
huyết tương. Tuy nhiên, những tác dụng gây hại này sẽ biến mất sau 60 ngày
ngưng sử dụng dịch chiết [42].
* Độc thần kinh, ức chế tổng hợp protein trong nuôi cấy tế bào
Theo một số nghiên cứu trên thế giới, một số loài trong chi Cnestis như: C.
glabra [32], C. polyphylla [50], C. palala [39] và C. ferruginea [25] có chứa
methionin sulfoximin - một yếu tố độc hại do tác động của nitơ trichlorid.
Kết quả nghiên cứu của Jeannoda và cộng sự cho thấy với liều tương ứng 0,5
g hạt, dịch chiết nước hạt C. glabra gây chết trên chuột sau các cơn co giật. Bên
cạnh đó dịch chiết này gây ức chế tổng hợp protein trong các mơ hình RRL và
HTC [50].

10


1.4. Kinh nghiệm sử dụng các loài thuộc chi Cnestis trong kinh nghiệm dân
gian
1.4.1. Trên thế giới
Một số loài thuộc chi Cnestis được sử dụng làm theo kinh nghiệm dân gian

ở một số địa phương trên thế giới.
Tại Malaysia, vỏ rễ của loài C. palala (Lour.) Merr. được dùng đường uống
để trị bệnh đau dạ dày, rối loạn tiêu hoá và các bệnh đường tiết niệu [35]. Ngoài
ra, cây này còn được dùng như thuốc bổ cho phụ nữ sau sinh. Khi dùng ngoài, C.
palala được sử dụng để đắp chữa bong gân hoặc các chỗ bị sưng ngoài da [48].
Ở Lào, dịch chiết rễ C. palala được dùng trong để điều trị kiết lị, nước sắc
của lá được dùng ngoài để điều trị ghẻ và các vết thương ngoài da.
Trong y học cổ truyền châu Phi, rễ của C. ferruginea sử dụng trong việc quản
lý các rối loạn tâm thần [28], cây này cũng được sử dụng ở một số nước tây Phi
với tác dụng giảm đau, chữa bệnh ngoài da, cải thiện các triệu chứng suy nhược,
sử dụng làm thuốc xổ, thuốc an thần [19]. Bên cạnh đó, dịch chiết lá cây C.
corniculata được sử dụng như bài thuốc trị lậu hiệu quả [20].
Ngoài ra, dịch chiết hạt và rễ của cây C. glabra, C. polyphylla còn được sử
dụng bởi người bản địa châu Phi để đặt bẫy chuột và chó đi lạc [32].
1.4.2. Tại Việt Nam
Lở leo là tên địa phương của một loài thuộc chi Cnestis ở Việt Nam, được
người dân địa phương ở Hồ Bình sử dụng theo kinh nghiệm dân gian để chữa
các bệnh ngồi da hoặc chữa các chứng nóng trong người. Cây có thể được dùng
đơn lẻ hoặc phối hợp với các dược liệu khác, thường được dùng dưới dạng nước
sắc dùng đường uống hoặc dùng ngoài [11]. Mặc dù cây Lở leo đã được sử dụng
lâu đời tại địa phương nhưng vẫn cịn thiếu các thơng tin về thực vật, thành phần
hoá học và tác dụng sinh học của cây thuốc này. Các nghiên cứu về Lở leo hiện
đang là vấn đề mới, chưa từng có tài liệu nào cơng bố tại Việt Nam. Hơn nữa, cây
Lở leo vẫn được người dân sử dụng rộng rãi trong cộng đồng địa phương tại Hồ
Bình. Xuất phát từ thực tế đó, việc nghiên cứu của đề tài là rất cần thiết và có ý
nghĩa khoa học.
11


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu nghiên cứu
- Lở leo được thu hái tại xã Long Sơn - Huyện Lương Sơn - tỉnh Hịa Bình,
được giám định tên khoa học và lưu giữ mẫu tại bộ môn Thực vật - Trường Đại
học Dược Hà Nội.
- Mã số tiêu bản: HNIP/18618/20.
- Thời điểm thu mẫu tháng 10/2019.
- Mẫu để nghiên cứu đặc điểm hình thái và làm tiêu bản mẫu khô: Mẫu cành
mang hoa.
- Mẫu để nghiên cứu thành phần hóa học, tác dụng sinh học: Mẫu cành mang
lá.
2.2. Phương tiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất – Thuốc thử
- Dung môi: methanol, ethanol, acid formic, ethyl acetat, nước cất, toluen.
- Thuốc thử: vanilin - dung dịch acid sulfuric
Thử theo tiêu chuẩn DĐVN-V và các tài liệu phân tích quy định.
2.2.2. Máy móc và thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Tủ sấy Memmert
- Cân phân tích AC ADAPTER
- Kính hiển vi A. Kruss Optronic GmbH
- Bếp cách thủy WiseBathTủ ấm ni cấy VSV
- Tủ an tồn sinh học cấp II
- Nồi hấp tiệt trùng HIRAYAMA HV50
- Máy lắc votex
- Máy ly tâm Centrifuge 5415 R
- Máy ảnh kỹ thuật số Canon EOS 60D + Tamron 60mm f.2.8 Macro
- Bản mỏng tráng sẵn silica gel F254 (Merck)

12

- Hệ thống máy HPTLC - CAMAG gồm: máy chấm sắc ký Linomat 5, buồng
triển khai ADC2, máy nhúng thuốc thử CAMAG, buồng phát hiện TLC
Visualizer, phân mềm phân tính winCATS và VideoScan.
- Các dụng cụ thủy tinh: cốc có mỏ, bình định mức, ống nghiệm, pipet chính
xác các loại, đũa thủy tinh, phễu thủy tinh, giấy lọc, ống đong, đĩa petri, dụng cụ
đục thạch,…
- Các dụng cụ khác: micropipette, đầu cơn, ống eppendorf, kim mũi mác, quả
bóp, giá ống nghiệm,…
2.2.3. Chủng vi khuẩn kiểm định
Do Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Bộ môn Vi sinh & Sinh học Trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
- Vi khuẩn gram (+)
Bacillus subtilis

ATCC 6633

Staphylococcus aureus

ATCC 6538

- Vi khuẩn gram (-)
Escherichia coli

ATCC 8739

Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Shigella flexneri

DT112

- Nấm
Candida albicans

ATCC 10231

2.3. Nội dung nghiên cứu
- Thu mẫu và mô tả đặc điểm thực vật, vi phẫu, bột dược liệu và giám
định tên khoa học của mẫu Lở leo thu hái tại Hịa Bình.
- Định tính thành phần hóa học trong thân và lá cây Lở leo bằng phản
ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
- Thử tác dụng kháng khuẩn và nấm của dịch chiết thân cây Lở leo.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nghiên cứu về đặc điểm thực vật
* Thu mẫu:
- Thu mẫu Lở leo tại xã Long Sơn - Huyện Lương Sơn - tỉnh Hịa Bình.
13


- Lấy mẫu cây thời kì ra hoa, có quả để quan sát đặc điểm thực vật.
- Lấy mẫu cây tươi sử dụng cắt vi phẫu thân, lá.
- Mẫu thân, lá khô được sấy ở 50-55°C, nghiền nhỏ để soi bột.
* Quan sát, mơ tả đặc điểm hình thái:
Tiến hành phân tích hình thái các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng và cơ quan
sinh sản theo phương pháp mô tả phân tích. [2]
* Nghiên cứu cấu tạo giải phẫu: Tiến hành theo các tài liệu [8] [9]
- Cấu tạo giải phẫu thân, lá:
Lá và cành ngâm trong cồn 70%, được làm theo phương pháp tiêu bản thực
vật thông thường, bao gồm: cắt, tẩy và nhuộm kép. Tiêu bản được soi và chụp ảnh

qua kính hiển vi Kruss ở các vật kính x4, x10, x40 sử dụng máy ảnh kỹ thuật số.
Các đặc điểm cấu tạo giải phẫu của thân và lá được mơ tả và phân tích theo ngun
tắc nghiên cứu tiêu bản vi phẫu.
- Vi học bột:
Dược liệu sấy khô, xay nhỏ, quan sát màu sắc, mùi vị bột. Soi tìm đặc điểm
bột bằng kính hiển vi.
*So sánh với các tài liệu tham khảo về khoá loại để giám định tên khoa học
cây thuốc.
2.4.2. Nghiên cứu về hóa học
- Chuẩn bị mẫu:
Dược liệu thân, cành và lá sau khi thu về được tách riêng, rửa sạch, cắt đoạn
3-5 cm và sấy khô ở nhiệt độ 55-60°C đến hàm ẩm dưới 12%. Dược liệu được
xay nhỏ thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, bảo quản chỗ thống mát khơ
ráo.
2.4.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học đặc trưng
Các phản ứng được thực hiện theo nhiều tài liệu tham khảo [1], [3], [10]:
a. Định tính các thành phần trong dịch chiết ether dầu hỏa
Cân khoảng 5 g bột dược liệu cho vào bình chiết Soxhlet. Chiết bằng 50 ml
ether dầu hỏa đến khi dung mơi trong bình chiết khơng màu. Dịch chiết đem cất
14


thu hồi bớt dung môi. Dịch chiết đậm đặc thu được dùng để làm các phản ứng
định tính chất béo, tinh dầu và sterol.
Định tính chất béo
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, hơ khô thấy để lại vết mờ trên giấy.
Định tính sterol (phản ứng Liebermann – Burchardt)
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết ether dầu hỏa. Bốc hơi dung môi đến
cắn. Thêm 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho cắn tan hết, nghiêng 45o. Cho từ từ
theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống. Ở mặt

tiếp xúc giữa hai lớp chất lỏng xuất hiện vịng màu tím đỏ, lớp dưới có màu hồng,
lớp trên màu xanh lá.
b. Định tính các thành phần có trong dịch chiết cồn
Cân khoảng 5 g dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 50 ml cồn
90%, đun sôi cách thủy vài phút. Dịch chiết được lọc và cơ cịn khoảng 10 ml để
làm các phản ứng định tính flavonoid, coumarin và acid amin.
Định tính coumarin
- Phản ứng mở đóng vịng lacton:
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết cồn:
Ống 1: Để nguyên.
Ống 2: Thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%
Đun 2 ống nghiệm đến sôi. Để nguội rồi quan sát:
Ống 1: Trong suốt.
Ống 2: Xuất hiện đục.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:
Ống 1: Xuất hiện tủa đục.
Ống 2: Trong suốt
Acid hóa ống 2 bằng vài giọt HCl đặc thì ống 1 trở lại đục.
Định tính flavonoid
- Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda):

15


Cho 1ml dịch chiết cồn vào ống nghiệm, thêm một ít bột magnesi kim loại,
nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5 giọt). Để yên một vài phút, dung dịch chuyển
màu đỏ/ đỏ hồng/ đỏ tím,…
- Phản ứng với kiềm:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10%,
thấy xuất hiện tủa vàng/ xanh hoặc đỏ.

- Phản ứng với FeCl3:
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết cồn, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%,
thấy xuất hiện tủa xanh đen.
Định tính acid amin
Cho vào ống nghiệm 1ml dịch chiết cồn, thêm vài tinh thể ninhydrin thấy
xuất hiện màu tím.
c. Định tính các thành phần trong dịch chiết nước
Lấy 1 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml nước cất,
đun sơi cách thủy trong vài phút, để nguội, lọc lấy dịch chiết để định tính nhóm
đường khử, acid hữu cơ và tanin.
Định tính đường khử
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm 0,5 ml thuốc thử Fehling A
và 0,5 ml thuốc thử Fehling B. Đun sôi cách thủy vài phút thấy xuất hiện tủa đỏ
gạch.
Định tính acid hữu cơ
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết nước, thêm vài tinh thể natri carbonat
thấy xuất hiện bọt khí.
Định tính tanin
Lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết nước để làm các phản ứng
sau:
- Ống 1: thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5%, thấy xuất hiện tủa màu hoặc tủa
màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt.
- Ống 2: thêm 2 giọt chì acetat 10%, thấy xuất hiện tủa bông.
- Ống 3: thêm 5 giọt gelatin 1%, thấy xuất hiện tủa bông trắng.
16