Ứng dụng liệu pháp gene trong điều trị HIV

Liệu pháp gene trong điều trị HIV
Nguyễn Xuân Hưng
3. Ứng dụng liệu pháp gen trong điều trị bệnh AIDS

3.1. GIỚI THIỆU CHUNG
Sự tái phát khi điều trị HIV dùng thuốc thường xảy ra sau những thành công điều trị đầu
tiên. Hơn nữa, dùng thuốc để điều trị rất tốn kém và thường mang lại hiệu ứng phụ đáng kể. Tần
số đột biến của các virus do sự phát triển của các virus kháng lại thuốc dùng trong điều trị là một
rủi ro lớn, có thể làm virus ngày càng khó điều trị hơn. Điểm cuối cùng là các chế độ điều trị hiện
nay dường như không điều trị tận gốc được các virus trong người bệnh, những người yên tâm
dùng thuốc cho cuộc sống của họ. Một lí do của vấn đề này là virus HIV có thể sống âm ỷ trong
các tế bào bị nhiễm và ở các điểm bí mật (privileged sites) trong cơ thể, nơi mà các loại thuốc và
hệ thống miễn dịch không thể vươn tới chúng. Cần phải có một phương thức điều trị mới ngoài
phương pháp dùng thuốc truyền thống. Điều này tạo nên tiềm năng phát triển mạnh mẽ của các
liệu pháp gen chống lại HIV.
3.2. CÁC CHIẾN LƯỢC ĐIỀU TRỊ HIV
Các chiến lược liệu pháp gen dựa trên những tiến bộ của chúng ta trong hiểu biết về di
truyền của virus HIV (sinh học phân tử và sinh bệnh học của HIV) trong những năm gần đây.
Cấu trúc của virus HIV và sự nhân lên của HIV trong tế bào chủ đã được trình bày ở phần trên.
Theo lí thuyết, chu trình sống và tái bản của virus có thể bị kìm hãm bởi sự kìm hãm chức năng
của một hay nhiều gen và các protein thích hợp của chúng. Mẫu động vật là không tốt cho các
nghiên cứu HIV; rất nhiều nghiên cứu liệu pháp gen y học ban đầu có cơ sở là các kinh nghiệm
trong nuôi cấy tế bào in vitro. Trên cơ sở các kinh nghiệm đầu tiên này, một số chiến lược được
cố gắng thử nghiệm trên pha I (trong một số trường hợp trên các thử nghiệm pha II) với các cá
nhân nhiễm HIV. (bảng 4)
Tất cả các thử nghiệm khoa học đòi hỏi các phác thảo thử nghiệm công phu, nó mô tả chi
tiết chế độ điều trị, tiêu chuẩn đáp ứng miễn dịch với việc phát triển sổ theo dõi thông tin chi tiết
người bệnh (người bệnh thu được lợi ích gì từ điều trị, mô tả các phản ứng phụ…). Trên thực tế,
người bệnh hoàn toàn tự nguyện và có thể lút lui khỏi thử nghiệm bất cứ lúc nào.
 Các thử nghiệm pha I: nhằm xác định hiệu ứng phụ, đánh giá liều lượng điều trị lớn
nhất cho phép ở người và tìm các dấu hiệu phản ứng. Người bệnh đầu tiên nhận được

liều lượng thấp, cho phép các hiệu ứng phụ nhỏ nhất trên cơ sở kinh nghiệm từ các
mẫu động vật. Mỗi cấp liều lượng thường có 3 người bệnh được điều trị. Mức độ liều
lượng không tăng lên ở mỗi cá nhân trong nhóm này nhưng tăng lên trong nhóm 3
người bệnh mới nếu các hiệu ứng phụ xảy ra một cách hợp lí. Số người bệnh lớn hơn
sau đó được điều trị với liều lượng này hoặc liều lượng thấp hơn khi các đánh giá về
liều lượng tối đa có thể chấp nhận được đã hoàn thành. Các hồ sơ đầy đủ về các hiệu
ứng phụ chủ quan hoặc khách quan được giữ lại. Liệu pháp gen đem lại một số hiệu
ứng phụ khách quan do đó liều lượng thích hợp tối đa thường khác nhau với mỗi điều
trị.
 Các thử nghiệm pha II: Nếu các điều trị mới không cho dấu hiệu rõ ràng về hiệu quả
của liệu pháp gen qua thử nghiệm pha I, cần tiến hành các thử nghiệm tiếp theo trên
các nhóm người bệnh không nhận được nhiều lợi ích từ điều trị. Mục đích của các
thử nghiệm pha II là để tìm ra thuốc có hiệu quả cho liệu pháp. Các thử nghiệm pha
II thường sử dụng một liều lượng không đáng kể so với liều lượng tối đa cho phép
trong pha I. Ghi chép cẩn thận về hiệu ứng phụ cũng được bảo tồn trong các thử
nghiệm pha II.
 Các thử nghiệm pha III: các thử nghiệm pha III là sự xác định phức tạp hơn các vấn
đề cho liệu pháp mới bên cạnh các phương thức liệu pháp trung gian. Sự điều trị phải
được kiểm tra đối chứng với các phương thức đã được thiết lập, thường trong các thử
nghiệm y học ngẫu nhiên. Điều này có nghĩa rằng những người bệnh ngẫu nhiên
được lựa chọn để điều trị với liệu pháp mới sau đó so sánh kết quả.
Sự trình bày quan trọng dưới đây sẽ là các nghiên cứu liệu pháp gen luôn có trong các thử
nghiệm. Hai chiến lược chính cho liệu pháp gen chống lại HIV đang được cố gắng tiến hành:
- Đưa các gen mới tới các tế bào đích nhiễm HIV nhằm chống lại quá trình tái bản của HIV.
- Biến đổi di truyền của các tế bào miễn dịch nhằm tăng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu chống
lại HIV.
Mỗi nguyên lí chính này có một số dạng chiến lược khác nhau được thể hiện trong (bảng 2)


3.3. SỰ KÌM HÃM HIV NỘI BÀO

Liệu pháp gen nhằm kìm hãm HIV nội bào có cơ sở không những trên các axit nucleic của
virus mà còn trên các protein của tế bào.
3.3.1. Liệu pháp có dựa trên các axit nucleic của virus
Liệu pháp dựa trên các axit nucleic của virus được chia thành hai nhóm chính:
- Các chiến lược RNA cơ sở dựa vào antisense, ribozymes, hoặc các bẫy (Decoys)
- Nhân tố ngoại sinh được đưa vào các DNA oligonucleotides với những tính chất của mạch
đối (antisense properties)
3.3.1.1 Antisense
Trong liệu pháp antisense, gen được đưa vào các tế bào đích (tế bào khởi sự biểu hiện của
các phân tử RNA), bổ sung đến RNA virus muốn tấn công. Trong tế bào, RNA liệu pháp sẽ gắn
đặc hiệu tới các phân tử virus đích, kìm hãm chức năng và phá vỡ phân tử. Chiến lược này cho
thấy có hiệu quả chắc chắn trên các dạng RNA virus trong các tế bào nuôi cấy. Các thử nghiệm
pha I trên người bệnh nhiễm HIV đang tiến hành với liệu pháp antisense nhằm vào các phân tử
virus đích quan trọng: gọi là chuỗi TAR, mRNA cho gen Rev, Pol gen và RNA của bộ gen virus.
Chuỗi TAR là điểm gắn của Tat, protein virus điều hoà cực kỳ quan trọng cho tốc độ tái bản của
virus trong tế bào. Protein Rev gắn với nhân tố RRE, nhân tố đại diện chung cho mRNA của virus
và có chức năng quyết định trong thông tin của các virus mới trong tế bào.
Có một số vấn đề với chiến lược antisense. Đầu tiên, hiệu quả kháng virus đòi hỏi sự kết
tụ nội bào cao của RNA mạch đối đã được biểu hiện. Vấn đề này có thể được giải quyết thông
qua sự tiến triển của công nghệ trong mối quan hệ với hiệu quả của sự biểu hiện gen. Một vấn đề
quan trọng khác là, sự phổ biến trong phương pháp thuốc kháng HIV truyền thống cũng như rủi
ro lớn của sự phát triển kháng thuốc của vật chất di truyền của virus sẽ làm giảm hoặc trung hoà
hiệu quả của RNA mạch đối (antisense RNA) được sử dụng. Rất có thể, chiến lược antisense sẽ
được sử dụng kết hợp với các liệu pháp khác để ngăn cản sự phát triển đối kháng.
3.3.1.2 Ribozymes
Ribozymes là các phân tử antisense có hoạt tính xúc tác. Sau khi gắn tới đích (các phân tử
RNA của virus), chúng gây ra sự phá huỷ. Ribozymes nhỏ đên mức mà một số ribozyme khác
nhau với các góc độ tấn công khác nhau có thể được xây dựng trong cùng một hệ thống vector;
tại cùng một thời điểm, điều này quan trọng để thiết kế các phân tử ribozyme đa đích
(multitargeted ribozyme) cùng tấn công các vùng khác nhau trong RNA của virus. Ribozyme cho

thấy khả năng tiềm tàng của liệu pháp kháng HIV, do các lí do đã đề cập ở trên, ribozyme có thể
tấn công RNA của virus cả trước và sau khi vật chất di truyền của virus được gắn vào DNA của
nhiễm sắc thể tế bào chủ.
Hơn nữa, có các kết quả ban đầu đầy hứa hẹn từ các cố gắng thao tác trên ribozyme nên
chúng có thể hướng trực tiếp tới các vùng trong tế bào bị nhiễm HIV, nơi có RNA của virus. Một
số nghiên cứu pha I của liệu pháp ribozyme hiện nay đang tiến triển. Vấn đề chủ yếu là các virus
có thể phát triển sự kháng đột biến với các ribozyme được sử dụng. Rất có thể liệu pháp này cũng
sẽ được sử dụng kết hợp với các phương thức khác.

Hình 19: sử dụng Ribozymes trong điều trị HIV

3.3.1.3 Các bẫy (Decoys)
Như đã đề cập ở trên, các vùng TAR và RRE trên RNA của virus là các vị trí gắn quan trọng
của Tat và Rev, các protein điều hoà chủ yếu. Sự kết gắn này có thể bị khoá bởi liệu pháp gen
thông qua phương pháp bẫy. Cơ sở của phương pháp là đưa vào trong các tế bào chủ gen biểu
hiện các phân tử RNA ngắn, cấu trúc giống TAR và RRE của virus. Các phân tử bẫy sẽ gắn với
các protein điều hoà của virus (Tat và Rev), làm chúng tách khỏi TAR và RRE. Nguyên tắc này
có giá trị hiệu quả kháng virus trong các tế bào nuôi cấy. Tuy nhiên, điều này gây ra các hiệu ứng
phụ nghiêm trọng. Công việc là phát triển phân tử bẫy không gắn với các protein này nữa.
3.3.1.4 DNA oligonucleotide
Gồm có các nguyên lí của mạch đối (antisense principles) ở đây, như các oligonucleotide
được sử dụng để thiết kế để chúng gắn đặc hiệu với mRNA của virus. Các khối mRNA này tương
ứng với protein của virus không được tổng hợp trong tế bào. Các dạng này của liệu pháp gen có
tiềm năng to lớn. Chúng có hiệu quả trong các thử nghiệm trên tế bào nuôi cấy và cũng xuất hiện
hiệu quả mở rộng in vitro trong các thuốc kháng HIV truyền thống.
Các thí nghiệm pha I mở đầu với oligonucleotide này (GEM 91) nhằm tới mRNA cho gen
gag trong bộ gen của virus đã được báo cáo và sự tiến triển của nó (GEM 92) sẽ sớm được sử
dụng trong các thử nghiệm y học.

3.3.2. Các phương pháp dựa vào protein nội bào với hiệu ứng kháng HIV
Các lựa chọn chiến lược khác nhau nhằm kìm hãm chức năng các protein của virus hay
protein của tế bào bị nhiễm HIV.

3.3.2.1 Dominant negative proteins
Cách tiếp cận ở đây là đưa các gen hay các đoạn gen (không có các thuộc tính thiết yếu của
protein virus tự nhiên) tổng hợp protein liên quan chặt chẽ với các protein quan trọng của virus.
Các protein đã bị biến đổi này sẽ có hiệu quả kháng virus, một phần do gắn cạnh tranh trên
mRNA với các protein virus tự nhiên, thứ hai do sự chiếm giữ (capturing) các nhân tố tế bào chứa
sự gắn tự nhiên giữa protein và RNA virus, và cuối cùng do gắn các phức hệ với protein virus tự
nhiên làm trung hoà nó. Chiến lược này tấn công một số protein của virus trong các kinh nghiệm
nuôi cấy tế bào. Trong hầu hết các thử nghiệm y học tiến bộ, gen mã hoá sự biến đổi protein Rev
(Rev M10) được đưa vào. Có ít nhất hai thử nghiệm pha I đang diễn ra. Điều này đang được quan
tâm để sản xuất protein bằng cách kết hợp các protein Tev và Tat đã bị biến đổi. Sự gắn chặt của
chuỗi vật chất di truyền với protein này trong các tế bào nuôi cấy có giá trị tăng hiệu ứng kháng
HIV và rõ ràng là rất có khả năng cho liệu pháp gen.
Vấn đề tiềm tàng trong liệu pháp gen dựa vào dominant negative proteins là các protein này
xa lạ với cơ thể do đó có thể khởi động đáp ứng miễn dịch khi được biểu hiện trong các tế bào
chủ làm chúng bị tiêu diệt nên không xuất hiện hiệu quả điều trị.


3.3.2.2 Các protein của tế bào
Sự gắn chặt của các gen mã hoá protein thuộc tế bào (ví dụ các protein của tế vật chủ ban đầu
với hiệu quả kháng HIV) có thể được sử dụng trong liệu pháp gen chống HIV. Phân tử CD4 được
biểu hiện trên bề mặt các lympho bào CD4
+
và có thể gắn với HIV. Trong canh trường tế bào, các
tế bào mà gen được đưa vào để các phân tử CD4 đã biến đổi giữ lại trong tế bào chất, cho thấy
chắc chắn hiệu quả kháng HIV, nhưng điều này không thành công trên in vivo. Sự đưa gen vào
interferon a-2 (một loại protein do tế bào cơ thể sinh ra khi bị virus tấn công nhằm ngăn không

cho virus phát triển) rõ ràng có hiệu quả kháng HIV trong canh trường tế bào không được tiến
hành xa hơn trong các thử nghiệm y học, một phần bởi rủi ro của các phản ứng phụ với chiến
lược này. Hơn nữa, các kết quả thú vị đã được báo cáo với việc đưa gen tới interferon b trong
canh trường tế bào từ các bệnh nhân HIV. Cách này duy trì được sự tái tạo thấp của interferon b
đã đạt được trong các tế bào. Điều này rõ ràng có hiệu quả kháng HIV và nó cũng làm tăng chức
năng miễn dịch của các tế bào.

3.3.2.3 Intrabodies
Nó khả thi trong việc chuyển gen trong các tế bào chủ, gồm cả các lympho bào CD4, nhân tố
cần cho sự tổng hợp của intrabodies, antigene gắn với các chuỗi đơn thu được từ các các phân tử
kháng nguyên bình thường. Các intrabodie này có thể được thiết kế để phản ứng chọn lọc với các
protein HIV thiết yếu và có thể kìm hãm sự tái bản của virus trong các canh trường tế bào. Các
thử nghiệm pha I đầu tiên của các bệnh nhân HIV thường tiến triển với liệu pháp gen dựa vào các
intrabodie chống lại protein Rev và chống lại HIV-1 gp 120 (Env).

3.3.2.4 Các gen tự sát (Suicide gene)
Đưa trực tiếp hay gián tiếp một số gen tự sát khác nhau vào canh trường nuôi cấy sẽ làm cho
các tế bào nhiễm HIV bị chết. Điều này có thể đạt được chẳng hạn bởi việc đưa gen diphtheria
toxin hay gen thymidin kinase từ Herpes simplex virus (virus làm tế bào chết nếu nó tiếp xúc trực
tiếp với thuốc kháng virus ganciclovir)

Hình 20: liệu pháp gen tự sát. (a) Vector adenovirus (AdV) phân phối gen Herpes simplex
thymidine kinase (TK) tới tế bào đích của nó. (b) Sự biểu hiện của thuốc chống virus ganciclovir
(GCV). (c) GCV-P có thể chuyển đến ngay sát các tế bào xuyên qua khe hở nơi (d) các enzim
kinases của động vật có thể gắn thêm 2 phosphates tạo thành trinucleotide (GCV-P-P-P). (e)
GCV-P-P-P có thể hợp nhất vào DNA; tuy nhiên, DNA polymerases không tái bản DNA chứa
GCV-P-P-P. Sự phân bào bị gián đoạn và các tế bào chết. Vì GCV-P có thể chuyển tới các tế bào
gần kề nên không cần chuyển gen tới tất cả các tế bào bởi vector virus và gọi là hiệu ứng ngoài.

3.4. LIỆU PHÁP MIỄN DỊCH

Từ một số triển vọng trong sự kìm hãm chu trình sống nội bào và tái bản của virus, liệu pháp
gen cũng có thể được sử dụng để khởi động đáp ứng miễn dịch của người bệnh chống lại HIV.
Điều này có thể dạt được thông qua các chiến lược vừa khởi động các phản ứng miễn dịch chống
lại HIV vừa làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào trung gian thông thường.
3.4.1. Liệu pháp miễn dịch đặc hiệu HIV
3.4.1.1 Cytotoxic T-lymphocytes
Đây không phải các yếu tố được thiết lập cuối cùng quyết định tính kháng HIV trong hệ
thống miễn dịch, nhưng một số quan sát đã chỉ ra rằng các lympho bào cytotoxic CD8 là quan
trọng trong khía cạnh này. Nó đã sớm được thẻ nghiệm để chứa các lympho bào CD8 từ người
bệnh, tăng số lượng các tế bào bằng nuôi cấy ex vivo, sau đó cấy các tế bào trở lại người bệnh.
Một thăm dò mới để sử dụng liệu pháp lympho bào CD8 dựa trên sự biến đổi liệu pháp gen của
lympho bào CD8 tự chủ, bằng cách gắn xen gen dẫn đầu sự biểu hiện của bề mặt cơ quan thụ cảm
(cơ quan gắn chọn lọc với các lympho bào CD4 bị nhiễm HIV). Sau khi gắn, các tế bào đã nhiễm
bị chết. Vấn dền với phương thức này là các lympho bào CD8 có khả năng sống rất hạn chế trong
cơ thể. Ba nghiên cứu thử nghiệm pha I khác nhau dựa vào nguyên lí này đang phát triển.

3.4.1.2 Vắcxin DNA
Các vắcxin cổ điển đưa virus không có hoạt tính hoặc hoạt tính yếu vào cơ thể nhằm khởi
động hệ thống miễn dịch chống lại (hay ngăn cản) virus không phải lúc nào cũng thích hợp và
thành công. Trong một số trường hợp nó gây ra các bệnh nghiêm trọng. Vắcxin DNA là khái
niệm tương đối mới trong đó các đoạn DNA hay các đoạn gen được tiêm vào cơ, gây đáp ứng
miễn dịch trực tiếp đến sản phẩm gen tạo bởi đoạn DNA lạ. Khi virus hay vi khuẩn với sản phẩm
gen vào trong cơ thể, sự phát triển sau này của nó sẽ bị ngăn cản bởi các kháng thể đã được sản
xuất hay các tế bào T (T-cells) đã được hoạt hoá nhằm vào các protein lạ. Phương pháp này có
thể xem như dạng đặc biệt của liệu pháp gen.
Tiêm chủng DNA đã được sử dụng trong các thí nghiệm động vật từ 30 đến 40 năm trước
đây, sự nhiễm DNA riêng biệt từ các vi khuẩn gây bệnh được tạo ra để gây đáp ứng miễn dịch
chống lại chính chúng. Kết quả tạo thành các protein từ DNA, protein gây đáp ứng miễn dịch.
Khi kỹ thuật DNA tái tổ hợp được sử dụng, nó trở nên dễ dàng hơn trong việc chuyển các đoạn
DNA xác định từ vi sinh vật gây bệnh và liên kết chúng với các phân tử chất mang (plasmids).

Bằng cách này, vắcxin rẻ và có hiệu quả hơn, plasmid có thời gian tồn tại lâu hơn. Các thí nghiệm
trên động vật (như chuột) cho thấy khi bị tiêm vào cơ, các plasmid gây ra đáp ứng miễn dịch
chống lại các sản phẩm gen có dạng DNA trong plasmid. Điều này có nghĩa rằng plasmid DNA
vào nhân tế bào sau đó vật chất di truyền được giải mã và các sản phẩm gen thích hợp được sinh
ra. Các sản phẩm này sau đó bị bài tiết hoặc bị suy biến và xuất hiện trên bề mặt các tế bào T (T-
cells), gây ra đáp ứng dịch thể (humoral cellular response) và đáp ứng tế bào (cellular response).
Đáp ứng tế bào có thể áp chế và là đáp ứng miễn dịch trung gian quan trọng nhất chống lại sự
nhiễm các vi sinh vật. Khái niệm này mang lại khả năng của công nghệ DNA trên plasmid với
các cách đặc biệt và các gen phân lập cho các protein bề mặt quan trọng của các vi sinh vật gây
bệnh.
Vắcxin DNA có rất nhiều hứa hẹn, với các ứng dụng trong y học dự phòng cũng như liệu
pháp gen. Các vắcxin này có khả năng chống lại sự nhiễm bệnh. Tuy có nhiều kết quả tốt song
vẫn còn tồn tại một số thách thức đáng kể:
 Tiên đoán, lựa chọn và xác định của các kháng thể tốt và sự tổ hợp của chúng.
 Tính ổn định và khả năng đáp ứng kháng thể tiếp tục ngày càng giảm.
 Quản lí liều lượng và hiệu ứng.
 Tế bào đích đặc hiệu của vắcxin và tăng đáp ứng miễn dịch.
 Các liệu pháp tổ hợp với các phương thức nhằm nâng cao hiệu quả và mở rộng phổ
đáp ứng miễn dịch.

Hình 21: Hai chiến lược để gắn vắcxin DNA HIV.
a. Mô tả 9 cấu trúc đọc mở (open reading frames) - Gag, Env, Pol, Tat, Rev, Vpu, Vif,
Vpr và Nef trong bộ gen của HIV-1.
b.Ví dụ của sự biểu hiện của một số protein từ DNA đơn bởi protein điều hoà HIV (Rev)
- phụ thuộc sự cắt nối. Tạo thành vắcxin DNA HIV-1 mà chúng ta triển khai trên các thử nghiệm
ở người. ‘X’ bao hàm một sự biến đổi an toàn mà hoạt hoá enzim phiên mã ngược hoặc các zinc
finger có vai trò trong bao gói RNA của virus.
c. Ví dụ sự biểu hiện lạc quan của protein dung hợp codon (codon-optimized fusion
protein). Vắcxin DNA này được cấu trúc bằng cách xoá đoạn giữa các gen mã hoá nhóm kháng
nguyên đặc hiệu (Gag) và các enzim protease (PR), enzim phiên mã ngược (RT) và enzim

integrase (IN) của virus. Gen PR chứa một sự biến đổi được hoạt hoá. Đoạn gắn được phát triển
tại National Institutes of Health Vaccine Research Center. Gen PR gồm có một sự đột biến được
hoạt hoá. Đoạn gắn được phát triển tại National Institutes of Health Vaccine Research Center.
CA, lớp vỏ protein p24; Env, protein màng ngoài; LTR, chuỗi lặp cuối cùng; MA, p17 matrix
protein; NC, p7 protein vỏ nhân; RT, p66/p51 enzim phiên mã ngược; SU, gp120 vỏ protein bề
mặt; TM, gp41 transmembrane envelope protein. vif, vpr, vpu and nef là các protein phụ của
virus; tat và rev là protein điều hoà của virus.

Hình 22: Tạo các bộ gen chức năng


Hình 23: Các vắcxin DNA tái bản nhanh chóng sản xuất nhiều
protein kháng nguyên hơn


Hình 24: Phác hoạ gen của vắcxin


Hình 25: Sự sinh sản của CTL bởi các vắcxin DNA