Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng

Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
MỤC LỤC
CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU................................................................................................................. 3
CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN............................................................................4
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ.................................................................................................4
2.1.1. Giới thiệu..............................................................................................................4
2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ........................................................................5
2.1.3.Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ...........5
2.2 Giới thiệu về enzyme papain........................................................................................5
2.2.1 Cysteine protease..................................................................................................5
2.2.2 Nguồn gốc..............................................................................................................5
2.2.3 Tính chất của papain...........................................................................................5
2.2.3.1 Tính chất vật lý.........................................................................................6
2.2.3.2 Tính chất hóa học.....................................................................................7
a) Cấu tạo hóa học:.............................................................................................................7
b) Cấu trúc không gian.......................................................................................................8
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain.............................................................................9
d) Phản ứng của papain....................................................................................................11
e) Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain.........................................13
CHƯƠNG III: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN ............14
3.1 Phương pháp thu nhận papain..................................................................................14
3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ........................................................................................14
3.1.2 Thu nhận papain................................................................................................14
3.2 Phương pháp tinh sạch papain..................................................................................15
. . 3.2.1. Điện di.....................................................................................................15
3.2.2 Lọc qua Sephadex G-75.....................................................................................15
CHƯƠNG IV: ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU
PHỘNG..............................................................................................................................17
4.1 Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng.................17
4.1.1 Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân...............................................................17
a/ Nguyên lý chung:..........................................................................................................17

b/ Thuyết minh quy trình chung:....................................................................................18
Nhóm _08DSH2 - 1 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân..........................................18
4.1.3 Tính chất của sản phẩm sau thủy phân...........................................................19
4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành...............................19
4.1.5 Phương pháp xác định hoạt tính......................................................................20
a. Cơ chất:.........................................................................................................................20
b. Điều kiện:.......................................................................................................................20
c. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme:....................................................................20
. . c.1. Khái quát......................................................................................................20
c.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain............................................21
4.2 Một số ứng dụng của enzyme papain.......................................................................25
4.2.1 Trong y học.........................................................................................................25
4.2.2 Trong công nghiệp thực phẩm:........................................................................25
4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác:...............................................................26
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN...............................................................................................28
Tài lệu tham khảo........................................................................................................29
Nhóm _08DSH2 - 2 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
CHƯƠNG I : LỜI MỞ ĐẦU
Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase.
Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là
một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa,
giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và
loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi
các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi
trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng
trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g
mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu

quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm.
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm
enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như:
chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme
thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị
mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh
vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược
phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm....
Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực
hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản
phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi.
Nhóm _08DSH2 - 3 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
CHƯƠNG II: GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN
2.1 Giới thiệu về cây đu đủ
2.1.1 Giới thiệu
Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac
Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô
hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu,
nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và
cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa
không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại
hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay
đổi nhiệt độ.
2.1.2 Phân bố sinh thái của cây đu đủ.
Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m),
từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C.
Nhóm _08DSH2 - 4 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở

vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng
rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi.
2.1.3 Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ
1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da.
2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip
(Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe
gan.
3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng.
4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic
enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm
chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể
dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó.
5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem
đánh răng, xà bông gội đầu.
6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng
trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên
cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng
chống vi khuẩn gram dương (gram-positive bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét,
làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu
hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi
nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta
tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn.
Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain.
2.2 Giới thiệu về enzyme papain
2.2.1 Cysteine protease
Nhóm _08DSH2 - 5 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
- Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong
khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết:
peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động.

- Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme
trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp.
- Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và
endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở
đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa
chuỗi polypeptide.
2.2.2 Nguồn gốc
Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập
lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu
tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong
nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain,
glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu
đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn
định quanh năm.
2.2.3 Tính chất của papain
2.2.3.1 Tính chất vật lý
Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain
Tính chất vật lý Giá trị
Điểm đẳng điện pI = 8.75
Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04
Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13
Phân tử lượng 20,700
Độ triền quang [α]D -66.7
0
Nhóm _08DSH2 - 6 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Độ xoắn 17%
Vòng hiệu ứng cotton 290nm
Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724

Trị số ma sát f/fo 1.16
Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các
chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt.
2.2.3.2. Tính chất hóa học
a) Cấu tạo hóa học:
Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên
cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng
lượng phân tử là 20.900 Dalton.
Bảng 2.2: Thành phần hóa học:
Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng
Alanine 13 Lyeine 9
Arginine 10 Proline 4
Aspartic acid 17 Serine 9
Half – Cysteine 6 Threonie 11
Glutamid acid 17 Tryptophan 7
Glycine 23 Tyrosine 5
Histidine 2 Valine 17
Isoleucine 10 Methionine 15
Leucine 10 0
Tổng cộng: 185
Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong
đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch
Nhóm _08DSH2 - 7 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu
disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính
bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25.
b) Cấu trúc không gian
Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp
thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này,

nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải
khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử.
Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt
động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt
tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57
0
C.
c) Cấu trúc tâm hoạt động của papain
- Tâm hoạt động của papain gồm có nhóm –SH của cysteine 25 và nitrogen bậc 3 của
histidine 159. Bên cạnh đó nhóm imidazole của His 159 cũng liên kết với Asp 175 bởi liên
kết hydrogen.
- Vùng tâm hoạt động của papain chứa mạch polypeptide với các amino acid là:
Nhóm _08DSH2 - 8 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Lys-Asp-Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Ser-Cys.
- Theo các nghiên cứu của Lowe, chuỗi polypeptide trong trung tâm hoạt động của
papain gần giống như của ficin hay trypsin, mặc dù chúng có nguồn gốc khác nhau.
Ficin: Arg-Glu-Glu-Gly-Glu-Cys-Gly-Ser-Cys.
Trypsin: Lys-Asp-Ser-Cys-Glu-Gly-Gly-Asp-Ser.
 Hoạt tính enzyme và cơ chất tác dụng:
- Papain thủy phân peotein thành các polypeptide và các polypeptide và các amino acid,
đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase.
- Các endopeptidase thủy phân protein chủ yếu thành các peptid:
(-NH-CH(R)-CO-NH-CH(R)-CO-)n + HOH  (-NH-CH(R)-COOH)I + (H2N- CH(R)-
CO-)k
i+k=n
- Các exopeptidase thủy phân các peptide thành các amino acid
(H2N-CH(R )-CO-NH-CH(R )-CO-)n + HOH  (H2N-CH(R)-COOH)n
`
+ (H2N-CH(R)-

CO-)k
n
`
+k = n
Nhóm _08DSH2 - 9 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
- So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thì papain có khả năng
thủy phân sâu hơn. Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất rộng vì nó có khả năng phân hủy
hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kết với proline và các glutamic acid có nhóm
carboxy tự do. Papain có thể nhận biết 1 chuỗi gồm 7 amino aicd trên cơ chất peptide của
mình và sẽ ưu tiên cắt liên kết peptide trên 1 chuỗi có phenylamine như sau: nếu peptide có
dạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papainsex cắt tại vị trí giữa Y và Z,
nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y ( có Phe nằm ở vị trí thứ 2 trước đầu tận cùng) thì
không được thủy phân bởi papain.
- Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và trafnerase.
 Hoạt hóa papain:
Papain chỉ thể hiện hoạt tính xác tác của mình khi nhóm –SH ở dạng tự do. Vì vậy ta sử
dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động.
do trung tâm hoạt động của papain có tính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính
khử như cysteine, glytation aicd, hdrocyanic… trong đó cysteine là chất hay dùng nhất. hki
có mặt các chất này thì nhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain.
Để thu được hoạt tính cao nhất thì thích hợp là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA, trong đó
cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vai trò chất liên kết tạo phức
với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ.
 Bất hoạt:
- Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3,
H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác. Các chất này phản ứng với
nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó.
- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp. papain tác
dụng với chloromethul cetone của Phe và Lys thì mất hoàn toàn hoạt tính. Tuy nhiên

papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dung môi hữu cơ ( độ quay cực của papain
hầu như không biến đổi trong ethanol 70% hay urea 6-8m).
d) Phản ứng của papain
Nhóm _08DSH2 - 10 -
Công nghệ enzyme T.s Nguyễn Hoài Hương
Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các acid amin, nó đóng vai trò vừa
như endopeptidase vừa như exopeptidase.
Nhóm _08DSH2 - 11 -