Phân lập và nhận diện một số dòng vi sinh vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid trong nước thải của các cơ sở chế biến thủy sản

NTTU-NCKH-05

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

--------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016 - 2017

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI SINH VẬT CĨ
HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN GIẢI LIPID TRONG NƯỚC THẢI CỦA
CÁC CƠ SỞ CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Số hợp đồng: 2017.01.56 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Giang Cẩm Tú
Đơn vị công tác: Khoa CNSH & MT
Thời gian thực hiện: 12 tháng

TP. Hồ Chí Minh, ngày 29 tháng 08 năm 2018

TP. Hồ Chí Minh, ngày 15 tháng 04 năm 2018


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
-----------------------------------------------------

Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Nguyễn Tất Thành

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NCKH
DÀNH CHO CÁN BỘ - GIẢNG VIÊN 2016-2017

Tên đề tài: PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ DÒNG VI SINH VẬT CĨ
HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN GIẢI LIPID TRONG NƯỚC THẢI CỦA
CÁC CƠ SỞ CHẾ BIẾN THỦY SẢN
Số hợp đồng: 2017.01.56 /HĐ-KHCN

Chủ nhiệm đề tài: Giang Cẩm Tú
Đơn vị công tác: Khoa CNSH & MT
Thời gian thực hiện: 12 tháng

ii


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………..1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................2
1.1 Tác động của nước thải chế biến thủy hải sản đến môi trường..............................2
1.1.1

Tác

hại

của

các

chất

hữu

cơ

(chủ

yếu

là

thành

phần

protein).................................... ......................................................................................2
1.1.2 Tác hại của các chất lơ lửng ..........................................................................2
1.1.3 Tác hại của dầu mỡ .......................................................................................3
1.2 Vi sinh vật phân giải Lipid ......................................................................................3
1.3 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải Lipid ..................................................4
1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới ................................................................................4
1.3.2 Nghiên cứu trong nước..................................................................................5
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................8
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...........................................................................8
2.2 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................8
2.2.1 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................8
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm ..........................................................................8
2.2.3 Hóa chất thí nghiệm ......................................................................................8

2.3 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................10
2.3.1. Thí nghiệm 1: Thu mẫu và phân lập các dịng vi sinh vật .........................10
2.3.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc các dịng vi sinh vật và mơ tả hình thái tế bào vi
khuẩn ...........................................................................................................................11
2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải Lipid trên mơi trường Tween
20 .................................................................................................................................13
2.3.4 Thí nghiệm 4: Định danh vi khuẩn có khả năng phân giải Lipid................13

iii


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................14
3.1 Kết quả phân lập ...................................................................................................14
3.2 Đặc điểm và hình thái khuẩn lạc ..........................................................................14
3.2 Khảo sát khả năng phân giải Lipid trong môi trường Tween 20 của các dòng vi
sinh vật ........................................................................................................................17
3.3 Kết quả định danh bằng phương pháp Sinh học phân tử .....................................26
3.4 Quy trình phân lập vi sinh vật có khả năng phân giải lipid .................................27
3.4.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình ...................................................................................27
3.4.2 Thuyết minh quy trình ....................................................................................28
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................30
4.1 Kết luận ................................................................................................................30
4.2 Đề nghị ..................................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................31
PHỤ LỤC: KẾT QUẢ GIẢ TRÌNH TỰ .................................................................34

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Gram (+):

Gram dương

Gram (-):

Gram âm

LB:

Luria Bertani

A. Tandoii:

Acinetobacter tandoii

P. Aeruginosa:

Pseudomonas aeruginosa

BIOFILM:

Màng sinh học

ĐKTB:

Đường kính trung bình

TP.HCM:

Thành phố Hồ Chí Minh

v


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 3.1 Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên mơi trường LB............15
Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 3 ngày của các dịng vsv thu tại
TP.HCM ……………………………………………………………………….........16
Hình 3.3 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 4 ngày của các dịng vsv thu tại
TP.HCM………………………………………………………………......................17
Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng halo sau 5 ngày của các dòng vsv thu tại
TP.HCM ……………………………………………………………………...........19
Hình 3.5 Kết quả thử hoạt tính của dịng TSB1……………………………..............20
Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vịng Halo sau 2 ngày của các dịng vsv tại Cần
Thơ………………………………………………………………………………......21
Hình 3.7 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 2 ngày của các dịng vsv tại Cần
Thơ …………………………………………………………………...................... 21
Hình 3.8 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 4 ngày của các dịng vsv tại Cần
Thơ……………………………………………………………………......................22
Hình 3.9 Biểu đồ thể hiện ĐKTB vòng Halo sau 5 ngày của các dòng vsv tại Cần
Thơ ………………………………………………………………………................22
Hình 3.10 Kết quả thử hoạt tính của dòng M1A2- 2………......................................24

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Trang

Bảng 2.1 Môi trường phân lập vi sinh……………………………………………….9
Bảng 2.2 Môi trường dinh dưỡng LB……………………………………………......9
Bảng 2.3 Môi trường Tween 20 kiểm tra hoạt tính lipase…………………………..10
Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc những dịng vi sinh vật phân lập được…....15
Bảng 3.2 Bảng đặc điểm hình thái những vi sinh vật phân lập được………………16
Bảng 3.3 Kết quả thử hoạt tính của các dịng vi khuẩn phân lập ở TP.HCM sau 3
ngày, 4 ngày, 5 ngày………………………………………………………………..20
Bảng 3.4 Kết quả thử hoạt tính các dịng vi khuẩn sau 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày
sau khi đã được xử lý thống kê…………………………………………………….24

vii


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sản phẩm thực đạt được

Sản phẩm đăng kí trong thuyết minh

 Quy trình phân lập một số dịng vi sinh

 Quy trình phân lập một số dịng vi sinh

vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid

vật có hoạt tính sinh học phân giải lipid

trong nước thải của các cơ sở chế biến

trong nước thải của các cơ sở chế biến

thuỷ sản.

thuỷ sản.

 Một số chủng vi sinh vật có khả năng

 Một số chủng vi sinh vật có khả năng

phân giả lipid

phân giả lipid

 Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài

 Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài

 Bài báo khoa học đăng trên tạp chí khoa

 Bài báo khoa học đăng trên tạp chí khoa

học chuyên ngành

học chuyên ngành

 2 luận văn tốt nghiệp

 2 luận văn tốt nghiệp

viii

Thời gian đăng ký : từ ngày 04/2017 đến ngày 07/2018
Thời gian nộp báo cáo:

ngày

MỞ ĐẦU
Nước thải thủy sản chứa phần lớn các chất thải hữu cơ trong đó lipid gây ảnh hưởng
lớn đến mơi trường vì khơng tan trong nước nên khó bị thủy phân. Khi xả vào nguồn
nước, lớp váng lipid còn tồn tại trên mặt nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong
nước và ảnh hưởng đến vi sinh vật sử dụng oxy hòa tan để phân hủy các chất hữu cơ.
Hiện nay, có nhiều phương pháp được thực hiện loại bỏ lớp váng lipid từ nước thải
thủy sản như là phương pháp vật lý, phương pháp hóa học cũng mang lại hiệu quả tốt tuy
nhiên cả hai phương pháp này tốn nhiều chi phí khi phát triển trên quy mơ lớn. Dựa vào
hoạt động sống của vi sinh vật mà các kỹ thuật xử lý chất thải bằng vi sinh ở quy mơ
phịng thí nghiệm thu hút rất nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học nước ngoài tuy
nhiên số lượng nghiên cứu trong nước thuộc lĩnh vực này còn khá hạn chế.
Trong nghiên cứu này, từ các mẫu nước thải được thu thập từ công ty thủy sản tại
Cần Thơ và thành phố Hồ Chí Minh, sau khi phân lập, sàng lọc và thử khả năng sinh
Lipase trên môi trường Tween 20 bước đầu sàng lọc được 33 dòng vi sinh vật trong đó có
22 dịng có khả năng phân giải lipid. Chọn ra 5 dịng có khả năng phân giải cao để định
danh phân tử, kết quả được 3 loài là: Pseudomonas otitidis, Pseudomonas aeruginosa và
Acinetobacter tandoii.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tác động của nước thải chế biến thủy hải sản đến môi trường [3],[1], [14]
Nước thải chế biến thuỷ sản có hàm lượng các chất ô nhiễm cao nếu không được xử
lý sẽ gây ô nhiễm các nguồn nước mặt và nước ngầm trong khu vực.
Đối với nước ngầm, tầng nông, nước thải chế biến thuỷ sản có thể thấm xuống đất

và gây ơ nhiễm nước ngầm. Các nguồn nước ngầm nhiễm các chất hữu cơ, dinh dưỡng và
vi sinh vật rất khó xử lý thành nước sạch cung cấp cho sinh hoạt. Đối với các nguồn nước
mặt, các chất ơ nhiễm có trong nước thải chế biến thuỷ sản sẽ làm suy thoái chất lượng
nước, tác động xấu đến môi trường và sinh vật thủy sinh.
Các chất hữu cơ chứa trong nước thải chế biến thuỷ sản chủ yếu là dễ bị phân hủy.
Trong nước thải chứa các chất như cacbonhydrat, protein, chất béo... khi xả vào nguồn
nước sẽ làm suy giảm nồng độ oxy hòa tan trong nước do vi sinh vật sử dụng ơxy hịa tan
để phân hủy các chất hữu cơ.
Nồng độ oxy hịa tan dưới 50% bão hịa có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát
triển của tôm, cá. Oxy hịa tan giảm khơng chỉ gây suy thối tài nguyên thủy sản mà còn
làm giảm khả năng tự làm sạch của nguồn nước, dẫn đến giảm chất lượng nước cấp cho
sinh hoạt và công nghiệp.
1.1.1 Tác hại của các chất hữu cơ (chủ yếu là thành phần protein)
Lượng chất hữu cơ trong nước quá cao sẽ dẫn đến suy giảm nồng độ oxy hoà tan
trong nước, do vi sinh vật sử dụng oxy hoà tan để phân huỷ các chất hữu cơ. Nồng độ
oxy hoà tan dưới 50% nồng độ oxy bão hồ có khả năng gây ảnh hưởng tới sự phát hiển
của tơm cá.
Oxy hồ tan giảm không chỉ gây tác hại nghiêm trọng đến tài nguyên thủy sinh mà còn
làm giảm khả năng tự làm sạch của nước.
1.1.2 Tác hại của các chất lơ lửng

1


Các chất rắn lơ lửng làm hạn chế độ sâu tầng nước được ảnh sáng chiếu xuống, gây
ảnh hưởng đến q trình quang họp của rong, tảo... do đó cũng là tác nhân gây ảnh hưởng
tiêu cực đến tài nguyên thuỷ sinh.
Các chất lơ lửng cũng là tác nhân gây tắc cống, làm tăng độ đục các nguồn nước,
bồi lắng lòng kênh, ảnh hưởng tiêu cực đến tài nguyên thủy sinh, đồng thời gây tác hại về
mặt cảm quan.

1.1.3 Tác hại của dầu mỡ
Dầu mỡ khi xả vào nguồn nước sẽ loang trên mặt nuớc tạo thành màng dầu gây cạn
kiệt oxy của nuớc, một phần nhỏ hoà tan trong nuớc hoặc tồn tại ở dạng nhũ tương. Cặn
chứa dầu khi lắng xuống sẽ tích tụ trong bùn đáy.
Ơ nhiễm dầu mỡ dẫn đến mất khả năng tự làm sạch của các nguồn nuớc do giết chết
các vi sinh vật phiêu sinh, sinh vật đáy tham gia vào quá trình tự làm sạch.
Ngồi ra, dầu trong nuớc cịn có tác động tiêu cực đến đời sống thủy sinh và ảnh
huởng đến mục đích cấp nuớc sinh hoạt, ni trồng thủy sản.
1.2 Vi sinh vật phân giải Lipid
Có rất nhiều lồi phân giải chất béo. Các chi Pseudomonas, Vibrio, Sarcine,
Bacillus, Alcaligenes, Burkholderia, Chromobacterium,…có khả năng sản sinh ra
enzyme lipase nội bào và ngoại bào, chuyển triglyceride trong phản ứng thủy phân thành
sản phẩm glycerin và acid béo . Sau đó, glycerin và acid béo lại được chuyển hóa thành
nhiều sản phẩm khác.
Hiện nay, đã tìm ra được các chủng vi khuẩn như Acinetobacter sp. SOD-1 từ
nghiên cứu của Sugimori et al.,2002 [28], Acinetobacter sp. SS192 và Pseudomonas
aeruginosa SS-219 của Sugimori và Utsue, 2012 [27] hay Bacillus sp. của Okuda et
al.,1991 có khả năng phân giải lipid [24] .
Bacillus subbtilis: được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion Erenberg
và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis”. Gần 30 năm sau, Casimir
Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium”. Năm 1872, Ferdimand Cohn xác
định thấy lồi trực khuẩn này có đầu vng và đặt tên là Bacillus subtilis.
Bacillus subtilis: là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt màu tím Gram (+), kích thước
0,5 – 0,8µm x 1,5 – 3µm, đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Chúng là vi sinh vật hiếu khí,
2


nhiệt độ tối thích cho chúng sinh trưởng và phát triển là 360 _ 500 C, tối đa khoảng 600C,
bào tử chịu nhiết khá cao. Nồng độ muối ăn làm ngừng phát triển của Bacillus subtilis là
10 – 15%. Bacillus subtilis BN 1010 đang được sử dụng rất phổ biến trong các hệ thống

xử lý nước thải cơng nghiệp có chứa Lipid [10].
Acinetobacter là các loài vi khuẩn gram âm hiếu khí phân bố rộng trong đất và
nước, đơi khi phân lập được từ da, màng nhầy, chất bài tiết và cả mơi trường bệnh viện.
Vi khuẩn có dạng cầu khuẩn hoặc cầu trực khuẩn, trên lam nhuộm chúng rất giống với họ
Nesseriae.
Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng, hiếu khí, có khả
năng di động nhờ vào một sợi chùm cực. Pseudomonas aeruginosa dễ dàng phát triển
trên môi trường nuôi cấy thông thường. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 370C, có thể phát
triển được ở nhiệt độ 150C – 550C. Tính chất đặc trưng của P. aeruginosa là sinh sắc tố,
chất thơm, sinh lipase… P. aeruginosa tiết ra nhiều loại sắc tố, bao gồm pyocyanin (lam
- lục), sắc tố huỳnh quang (vàng - lục, hiện tại được gọi là pyoverdin) và pyorubin (đỏ nâu). [23]
1.3 Một số nghiên cứu về vi sinh vật phân giải Lipid
1.3.1 Nghiên cứu trên thế giới
Nhiều thành phần chất béo có trong mỡ động vật vi sinh vật có thể thủy giải thành
Glycerol và acid béo. Cả hai loại này có thể được một số loài vi sinh vật phân hủy chất
béo để lấy năng lượng và carbon cần thiết. [Error! Reference source not found.6]
Theo “Letter Applied Microbiologi”, Ruiz C. và cộng sự [25] đã phân lập được 724
dòng vi khuẩn hầu hết thuộc chi Bacillus trong đất có chứa nhiều chất hữu cơ và dầu ăn.
Nhiều chi khác cũng được tìm thấy như Pseudomonas, Burkholderia, Acinetobacter,
Escherichia và nấm men.
Trong “Bioscience Bioengineering” của Matsumeya và cộng sự của mình đã nghiên
cứu chọn lọc và phối hợp nhiều chủng hay loại vi sinh vật trong chế phẩm, xử lý chất béo
để tìm kiếm, chọn lọc và thử nghiệm trên nhiều loại chất béo khác nhau để có hiệu quả
tốt nhất. [21]
Okuda và các đồng sự vào năm 1991 đã hoàn thành nghiên cứu về việc xử lý nước
thải lipid nhờ vào việc sử dụng vi khuẩn để đồng hóa lipid. Một số dịng vi khuẩn có khả
3


năng đã tăng trưởng trong mơi trường có chứa dầu ô liu là được phân lập từ hai nhà máy

thịt ở quận Sendai của Nhật Bản. Tất cả các chủng được thử nghiệm đồng hóa mỡ bị, mỡ
lợn, dầu ơ liu và dầu của hạt có dầu được sử dụng như một nguồn carbon duy nhất trong
sự tăng mật số vi khuẩn. Một trong những phân lập trên, dòng 351, tiêu hóa chất béo hiệu
quả nhất. Vi khuẩn này được xác định là vi khuẩn Bacillus sp.[24]
Sugimori cùng các đồng sự vào năm 2002 đã công bố nghiên cứu vi khuẩn phân giải
lipid Acinetobacter sp. dòng SOD – 1 và Acinetobacter sp. SOD – 1 được phân lập từ đất,
có khả năng nhanh chóng phân giải dầu. Dịng SOD - 1 cho thấy tăng trưởng tốt và phân
giải 68,7 ± 2,7 và 83,0 % của một 3000ppm dầu ban đầu trong 24 giờ ở 200C, pH 7.0 và
ở 350C ở pH tương ứng là 8.0. Tỷ lệ suy giảm phụ thuộc vào độ pH, nhiệt độ, nồng độ
phosphate, và mật độ tế bào ban đầu.[28]
Một nghiên cứu của Sugimori và Utsue (2012) về hiệu quả của các loại dầu ăn bị
phân hủy trong điều kiện kiềm đã phân lập được Acinetobacter sp. SS192 và
Pseudomonas aeruginosa SS - 219 từ đất Nhật Bản. Nồng độ lipid cao chứa trong nước
thải ức chế sự hoạt động của vi sinh vật trong các hệ thống xử lý nước thải sinh học như
bùn hoạt tính và lên men metan. Để làm giảm tác dụng ức chế các vi sinh vật có khả năng
làm giảm hiệu quả các loại dầu ăn đã được sàng lọc từ các nguồn môi trường khác nhau,
từ đất Nhật Bản, phân lập 2 chủng vi khuẩn với khả năng phân giải lipid cao ở pH kiềm
mà không tiêu thụ các nhu cầu oxy sinh học. Acinetobacter sp. dòng SS - 192 và
Pseudomonas aeruginosa dòng SS - 219 phân giải 77,5 ± 0,6 % và 89,5 ± 1,5 %, tương
ứng, 3.000 ppm dầu hỗn hợp gồm mỡ dầu, mỡ lợn, thịt bò ở 37 0C và pH 9.0 trong 24h,
phân giải hiệu quả của hai chủng xảy ra ở pH 8-9 và 25-40 0C.[27]
1.3.2 Nghiên cứu trong nước
Phân giải lipid là vấn đề đang được quan tâm trong nước nhưng các nghiên cứu về
chúng còn nhiều hạn chế.
Dương Minh Lam cùng các cộng sự năm 2011 đã công bố nghiên cứu tuyển chọn
Bacillus sinh lipase kiềm từ rừng ngập mặn của trường Đại học Sư phạm Hà Nội, Hà
Nội. Enzyme lipase đang được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến và cơng
nghiệp dược phẩm trên tồn thế giới. Hiện nay, enzyme lipase giữ vị trí thứ 2 về lượng
enzyme được sản xuất và tiêu thụ trên thị trường, sau enzyme protease. Trong nghiên cứu
4

này, đã lựa chọn được 8 chủng vi khuẩn có khả năng sinh lipase kiềm mạnh trong số 250
chủng vi khuẩn phân lập từ rừng ngập mặn. Cả 8 chủng biểu hiện hoạt tính mạnh tại giá
trị pH 9 và môi trường 3 % NaCl. Tất cả các chủng nghiên cứu đều là các loài vi khuẩn
thuộc chi Bacillus [9].
Theo Võ Hồng Chi (2011) tổng kết về “Nghiên cứu quá trình phân hủy chất hữu cơ
giàu dầu mỡ trong điều kiện kỵ khí” chỉ nghiên cứu nước thải trong điều kiện kỵ khí để
tái sử dụng năng lượng thơng qua công cụ sinh học, nhưng các nghiên cứu thuần túy là
các nghiên cứu cơ bản chưa có kết quả ứng dụng chủ yếu là bùn thải chứa nhiều dầu mỡ
động vật. Các nghiên cứu chủ yếu thông qua các hệ thống biogas kỵ khí để thu lại năng
lượng mà cụ thể ở đây là khí methan chứ khơng chủ động nghiên cứu phân lập, tuyển
chọn và ứng dụng vi sinh vật để phân hủy dầu mỡ vốn chúng thường nhẹ hơn nước và nổi
trên bề mặt nước thải [3].
Năm 2014, nhóm nghiên cứu do TS. Lê Thị Nhi Cơng, Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã Nghiên cứu thành cơng sự hình
thành màng sinh học (BIOFILM) từ các vi sinh vật phân lập tại Việt Nam nhằm định
hướng ứng dụng trong xử lý ô nhiễm dầu mỏ. Kết quả nghiên cứu đã được cơng bố trên
Tạp chí Journal of Science, Natural Science and Technology, tạp chí Sinh học của Viện
Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, Tạp chí Khoa học - Đại học Quốc gia Hà
Nội. Từ các mẫu nước thải khu cơng nghiệp Từ Liêm, Hà Nội. Nhóm nghiên cứu phân
lập được chủng Bacillus sp. B8 vừa có khả năng tạo màng sinh học cao vừa có khả năng
phân hủy dầu diesel tốt. Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA, chủng B8 đã được định
tên là Bacillus sp.B8 với mã số đăng ký trên GenBank là JQ764732. Bằng thực nghiệm
đã xác định được một số điều kiện sinh lý sinh hóa tối ưu cho sự hình thành màng và khả
năng hoạt động bề mặt của chủng là: nhiệt độ 300C, pH 7, nồng độ NaCl 0,5 %. Dưới các
điều kiện tối ưu này, mật độ quang học ở bước sóng 570 nm của màng sinh học do chủng
B8 tạo thành đạt gần 27,89 và khả năng đánh tan dầu đạt 68 %. Nuôi tĩnh chủng B8 dưới
các điều kiện bổ sung 1% dầu diesel, sau 5 ngày ở dưới dạng màng sinh học cao, hoạt
động bề mặt lớn và phân hủy tốt dầu diesel, chủng B8 có tiềm năng ứng dụng trong xử lý

nước bị ô nhiễm dầu [2].

5


Vào năm 2014, Nguyễn Văn Trương đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp Đại học với
đề tài: phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid trong nước thải từ quán ăn, cơ sở
chế biến của ba phường An Thới, Long Tuyền và Thới An Đông của trường Đại học Cần
Thơ,Cần Thơ. Đề tài đã phân lập, nhận diện và định danh được một số dòng vi khuẩn
phân giải lipid cao trong quy mơ phịng thí nghiệm [13].
Theo Ngơ Thanh Phong (2014) “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn phân hủy chất
béo từ nước thải ở thành phố Cần Thơ”. Cũng đã đưa ra dòng vi sinh vật phân hủy chất
béo nhưng nồng độ và thành phần lipid có trong mẫu nước thải tương đối thấp cho với
mẫu nước thải trong chế biến thủy hải sản. Chính vì lẽ đó, điều cấp thiết là phải chọn lọc
được các dịng vi sinh vật có khả năng phân giải các chất thải gây ô nhiễm dưới các điều
kiện nhiệt độ, nồng độ pH và dinh dưỡng khác nhau có khả năng phân hủy lipid ở nồng
độ cao [11].

6


CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện tại khoa NNCNC & CNSH trường Đại Học Nguyễn Tất
Thành và Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học TP. HCM.
Thời gian thực hiện : từ 04/2017 đến 07/2018
2.2 Vật liệu nghiên cứu
2.2.1 Vật liệu thí nghiệm
Mẫu nước thải được lấy trực tiếp từ ống thải của 3 công ty chế biến thủy sản xuống
kênh Tham Lương, KCN Tân Tạo, Tân Tạo A, Bình Tân, TPHCM:

-Cơng ty Cổ phần kinh doanh thủy hải sản Sài Gịn (4-8 Đường 1A, Tân Tạo A,
Bình Tân, TPHCM)
-Công ty TNHH chế biến thủy sản Thanh Hải (Đường số 1, Tân Tạo A, Bình Tân,
TPHCM)
-Cơng ty Cổ phần chế biến thủy sản Trung Sơn (số 2, Song hành, Tân Tạo A, Bình
Tân, TPHCM)
Mẫu nước thải ở bể chứa và khu vực đống gói sản phẩm ở Cơng ty thủy sản Miền
Nam, Cần Thơ.
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm
Dụng cụ thu và trữ mẫu: hũ nhựa có nắp, muỗng
Dụng cụ phân lập và nuôi cấy vi khuẩn: Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que trải,
ống hút mẫu, micropipette, đèn cồn, bình tam giác, lame, lamelle, bao nilon chịu nhiệt,
chai đựng mẫu…
Dụng cụ pha chế mơi trường: Bình tam giác, ống đong, cốc đong
(10ml,100ml,200ml)
Tủ an toàn sinh học, tủ ủ, nồi hấp khử trùng nhiệt ướt, cân điện tử (0,01g), kính
hiển vi, máy đo pH, máy lắc, tủ mát, máy Vortex SCI ROGEX.
2.2.3 Hóa chất thí nghiệm

7


Các hóa chất pha mơi trường phân lập, ni cấy vi khuẩn, mơi trường kiểm tra
hoạt tính phân giải lipid:
* Môi trường phân lập: [13]
Bảng 2.1 Môi trường phân lập vi sinh
Thành phần

Hàm lượng

Dầu thực vật

10g

(NH4)2SO4

0,5g

MgSO4.7H2O

5g

KH2PO4

1g

Nước

1 lít

Khử trùng và chỉnh pH= 6,5 - 7,5
Môi trường phân lập là môi trường lỏng chứa các khoáng như: NH+, Mg2+, K+ và
nguồn cacbon chính là dầu ăn thực vật chính vì vậy để sống được trong mơi trường này
thì vi sinh phải có khả năng dị hóa dầu, các nhóm vi sinh khơng sử dụng được nguồn
cacbon này sẽ chết đi chỉ còn nhóm vi sinh sinh trưởng và phát triển được tồn tại. Việc
ni vi sinh vật trong mơi trường có nguồn cacbon chính là dầu trước khi tách dịng giúp
các bước đầu loại bỏ được nhóm vi sinh khơng cần thiết.
*Mơi trường Luria Bertani (LB)( Bennasar et al., 1998)
Bảng 2.2 Môi trường dinh dưỡng LB
Thành phần

Hàm lượng

peptone

10g

yeast extract

5g

NaCl

5g

agar

20g

nước

1 lít
Khử trùng và chỉnh pH=6,5-7,5.

Môi trường LB là môi trường đầy đủ chất dinh dưỡng với agar là chất làm đông
đặc, đây là môi trường phù hợp cho hầu hết vi sinh vật phát triển, các nhóm vi sinh vật
sau khi ủ trong mơi trường phân lập sẽ được tách dịng trên mơi trường này.

8

* Môi trường Tween 20 ( El- Bestawy et al., 2005).
Bảng 2.3 Mơi trường Tween 20 kiểm tra hoạt tính lipase.
Thành phần

Hàm lượng

Peptone

10g

NaCl

5g

CaCl2.2H2O

0,1g

Agar

20g

Nước

1 lít

Bổ sung 1% Tween 20 ( Tween 20 được khử trùng nhiệt ướt ở 1210C trong
20 phút trước khi được bỏ vào môi trường) và điều chỉnh pH = 7,5.
Môi trường Tween 20 là môi trường dùng để kiểm tra hoạt tính lipase của các

chủng vi sinh vật sau khi được tách dịng từ mơi trường LB. Môi trường Tween 20 chứa
đầy đủ các chất dinh dưỡng cho hầu hết vi sinh vật phát triển đồng thời có bổ sung thêm
Tween 20 là chất giúp chỉ thị chủng vi sinh nào có hoạt tính lipase thơng qua vòng kết
tủa halo xung quanh khuẩn lạc.
* Thuốc nhuộm Gram: crystal violet, dung dịch Lugol, cồn 96%, Fushin.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thí nghiệm 1: Thu mẫu và phân lập các dòng vi sinh vật
2.3.1.1 Thu mẫu chất thải
14 mẫu gồm 6 mẫu được thu tại các ống xả nước thải của các công ty chế biến
thủy sản thuộc KCN Tân Tạo A, TP.HCM và 8 mẫu thu trong các bể chứa nước thải ở
các khu vực chế biến và đóng gói thuộc cơng ty Thủy sản Miền Nam, Cần Thơ.
Mẫu lấy được sẽ lưu trữ trong lọ nhựa có nắp. Mẫu sau khi thu về được bảo quản
trong tủ mát và được sử dụng trong vòng 3 ngày kể từ ngày thu.
STT

Tên mẫu

Địa điểm lấy mẫu

1

THA

Công ty Cổ phần kinh doanh

50*

2

THB

thủy hải sản Sài Gịn

10*

3

TSA

Cơng ty TNHH chế biến thủy

50*

4

TSB

sản Thanh Hải

10*

9

Vị trí thu mẫu


5

SGA

Công ty Cổ phần chế biến

50*

6

SGB

thủy sản Trung Sơn

10*

7

M1A1

Bể 1 khu vực 1

8

M1A2

Bể 1 khu vực 2

9

M2A1

Bể 2 khu vực 1

10

M2A2

Công ty Thủy sản Miền Nam,

Bể 2 khu vực 2

11

M3A1

Cần Thơ

Bể 3 khu vực 1

12

M3A2

Bể 3 khu vực 2

13

XKA1

Khu vực đóng gói 1

14

XKA2

Khu vực đóng gói 2

[*]Vị trí lấy mẫu: Khoảng cách thu mẫu nước đối với ống xả nước thải xi theo dịng chảy

2.3.1.2 Phân lập
Mẫu nước thải được thu về tiến hành lắc đều để các thành phần trong mẫu được
xáo trộn giúp dễ dàng thu hết mẫu vi khuẩn mà khơng bỏ sót.
Rút 1ml dung dịch gốc cho vào 5ml mơi trường phân lập (có thành phần dầu thực
vật) sau đó đem ủ ở 300C trên máy lắc 120rpm trong 72 tiếng. Chỉ những vi khuẩn có khả
năng sử dụng lipid mới có thể phát triển được trên mơi trường phân lập. Mục đích của
bước này là để sàng lọc bước đầu các dòng vi sinh vật khơng có khả năng sử dụng lipid.
Dùng micropipette P200 hút 100µl mẫu từ mơi trường phân lập vào tâm của đĩa
môi trường LB, trãi mẫu nước vừa nhỏ ra khắp các bề mặt của môi trường cấy. Thao tác
này rất quan trọng vì khi trãi kỹ chúng ta sẽ thu được nhiều khuẩn lạc rời khác nhau tăng
hiệu suất phân lập.
Sau đó tiến hành bảo quản trong tủ ủ 300C trong khoảng 1-2 ngày để vi khuẩn có
thời gian thích nghi với mơi trường và phát triển
2.3.2 Thí nghiệm 2: Sàng lọc các dịng vi sinh vật và mơ tả hình thái tế bào vi
khuẩn.
2.3.2.1 Mục tiêu

10


Làm thuần những mẫu vi sinh vật có trong nước thải thủy sản đã thu về, quan sát
khuẩn lạc, hình thái vi sinh vật, nhuộm Gram để chuẩn bị cho bước khảo sát hoạt tính
phân giải lipid của vi sinh vật.
2.3.2.2 Bố trí thí nghiệm

* Kỹ thuật làm rịng vi khuẩn.
Mẫu sau khi vi sinh vật đã phát triển dựa vào đặc điểm, hình dạng, màu sắc, kích
thước tiến hành cấy chuyền các dạng khuẩn lạc nhiều lần sang môi trường LB mới cho
đến khi xuất hiện các khuẩn lạc rời. Làm rịng là hình thức tách rời từng tế bào vi sinh
vật, mỗi tế bào sẽ phát triển thành khuẩn lạc độc lập. Khi đó tế bào vi khuẩn đã đươc tách
rịng. Dùng kính hiển vi quang học để kiểm tra độ ròng và lưu trữ mẫu trong ống nghiệm
chứa mơi trường LB.
* Mơ tả hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn
Sau khi được tách rịng mỗi chủng vi khuẩn được mơ tả sơ lược về hình dạng
đường kính, dạng bìa, màu sắc, độ nổi của khuẩn lạc. Sau đó dùng kính hiển vi ở vật kính
40X để quan sát, mơ tả hình dạng tế bào vi khuẩn [11].
* Nhuộm Gram:
- Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vơ trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy
24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khơ trong khơng khí.
- Cố định tế bào: hơ nhanh vết bơi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
- Nhuộm bằng dung dịch crystal violet trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước,
thấm khô.
- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 2-3 phút, rửa nước, để khơ trong
khơng khí.
- Quan sát dưới vật kính 40X, 100X, (có sử dụng dầu soi)
Kết quả: vi khuẩn Gram + có thành tế bào phủ lớp peptidoglycan dày (chiếm 5090% vỏ tế bào), nên trong quá trình nhuộm, nó sẽ bắt màu của dung dịch crystal violet
(màu xanh tím), nhóm vi khuẩn Gram - do có lớp peptidoglycan mỏng hơn (10%) nên nó
khơng bắt được màu tím kết tinh mà sẽ bắt màu hồng của chất nhuộm Fushin.
11


2.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng phân giải Lipid trên môi trường
Tween 20

- Nuôi lỏng trong môi trường LB: Khuẩn lạc sẽ được nuôi lỏng trong môi trường
LB khơng có agar trong máy lắc ủ nhiệt 300C, 120 rpm, trong thời gian 3 ngày để tăng
sinh khối.
- Thử hoạt tính trên mơi trường Tween 20
- Tạo giếng trên môi trường Tween 20 bằng cách dùng đầu cone đường kính 5mm
đục lỗ trên mơi trường thạch để tạo giếng nhỏ 20µl dịch vi khuẩn phân lập trong mơi
trường LB vào giếng.
- Tiến hành ủ 300C sau đó tiến hành quan sát và đo đường kính các vịng halo ở
các mốc thời gian 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày, thí nghiệm được lặp lại 3 lần và ghi nhận kết
quả đạt được. Căn cứ vào vòng phân giải xung quanh điểm đã cấy, chọn lọc ra những
mẫu có vi sinh vật phân giải được Lipid và loại bỏ những mẫu không đạt yêu cầu. Mẫu
không đạt yêu cầu là mẫu vi sinh vật khơng có khả năng tạo vịng phân giải Lipid hoặc
khả năng phân giải thấp.
- Ghi nhận số liệu đo được, xử lý kết quả bằng phần mềm thống kê
2.3.4 Thí nghiệm 4: Định danh vi khuẩn có khả năng phân giải Lipid
2.3.4.1 Mục tiêu
Từ thí nghiệm 1, 2 và thí nghiệm 3 tìm ra được những dịng vi sinh vật có khả
năng phân giải Lipid tốt nhất góp phần vào việc xử lý chất thải trong các nhà máy chế
biến thủy sản. Nhằm tìm hiểu rõ hơn những dòng vi sinh vật này, dựa vào những đặc
điểm hình thái đã quan sát được, tiếp tục định danh bằng phương pháp sinh học phân tử.
2.3.4.2 Bố trí thí nghiệm
Những mẫu sau khi thử hoạt tính trên mơi trường Tween 20 có khả năng kết tủa
vịng Halo lớn nhất sẽ được chọn đem mẫu khuẩn lạc đi định danh tại Công ty TNHH
Dịch vụ & Thương mại Nam Khoa. (793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Quận
7, TPHCM).

12


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1

Kết quả phân lập
Từ 6 mẫu nước thải lấy tại các ống nước thải của các công ty thủy sản tại TP.HCM

phân lập được 13 dòng vi sinh vật và 8 mẫu nước thải từ cơng ty Thủy sản miền Nam thu
được 20 dịng vi sinh vật có đặc điểm và hình dạng khác nhau. Các dịng vi khuẩn này có
chung đặc tính là sinh trưởng và phát triển trong điều kiện hiếu khí.
3.2

Đặc điểm và hình thái khuẩn lạc
Sau khi phân lập và nuôi cấy trên môi trường thạch LB thu được khuẩn lạc của các

dòng thuần, nhận thấy rằng hầu hết các dòng vi khuẩn sinh trưởng và phát triển sau 2
ngày trong điều kiện ủ là 300C
Về đặc điểm hình thái khuẩn lạc: phần lớn các dịng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng trịn,
bìa ngun, độ nổi mơ, màu trắng đục hoặc trắng trong; một số ít khuẩn lạc có dạng
khơng đều, độ nổi lài, màu vàng đục và nâu đục.
Đặc điểm màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa của các dịng vi khuẩn trên mơi
trường LB sau khi nuôi cấy được thể hiện ở Phụ lục 1 và Hình 3.1

13


A

B

C

D

Hình 3.1 Một số khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập được trên mơi trường LB
A: Dịng TSA1 có khuẩn lạc dạng trịn, có bìa ngun, màu trắng đục, độ nổi lài;
B: Dịng SGB2 có khuẩn lạc dạng trịn, có bìa ngun, màu vàng chanh, độ nổi mơ.
C: Dịng M1A1- 2: khuẩn lạc màu trắng đục, dạng trịn, bìa ngun, độ nổi mơ
D: Dịng M1A1- 1: khuẩn lạc màu trắng đục, dạng trịn, bìa ngun, độ nổi mơ

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc những dịng vi sinh vật phân lập được
Đặc điểm hình thái
Hình dạng

Màu sắc

Số lượng

Tỷ lệ %

Trịn

25

75,8

Khơng đều

8

24,2

Trắng trong

1

3,0

Trắng đục

22

66,7

Vàng chanh

9

27,3

14


Độ nổi

Dạng bìa

Nâu

1

3,0

Mơ

20

60,6

Lài

13

39,4

Ngun

24

72,7

Răng cưa

9

28,3

Quan sát đặc điểm các dịng vi sinh vật phân lập được bằng phương pháp giọt ép và
nhuộm Gram, quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40X và 100X. Kết quả cho
thấy có hai dạng tế bào vi khuẩn: Que và hình cầu được trình bày ở Bảng 3.3.
Trong tổng số 33 dịng có 14 dịng tế bào vi sinh vật hình cầu và 19 dịng tế bào vi

sinh vật hình que và trong đó 11 dịng là vi khuẩn Gram (+) 22 dịng là Gram (-)
Bảng 3.2 Bảng đặc điểm hình thái những vi sinh vật phân lập được
STT

Tên mẫu

Hình dạng

Gram

1

THA1

Que

+

2

THA2

Que

+

3

THB1

Cầu

-

4

THB2

Que

-

5

TSA1

Cầu

+

6

TSA2

Que

-

7

TSB1

Que

-

8

TSB2

Cầu

-

9

SGA1

Que

-

10

SGA2

Que

-

11

SGB1

Cầu

+

12

SGB2

Cầu

-

13

SGB3

Que

-

14

M 1 A1 - 1

Que

-

15

M 1 A1 - 2

Cầu

-

16

M 1 A2 - 1

Que

+

15


27

M 1 A2 - 2

Que

-

18

M 2 A1 - 1

Que

-

19

M 2 A1 - 2

Cầu

-

20

M 2 A2 - 1

Que

-

21

M 2 A2 - 2

Que

+

22

M 3 A1 - 1

Cầu

+

23

M 3 A1 - 2

Cầu

-

24

M 3 A1 - 3

Cầu

-

25

M 3 A1 - 4

Que

+

26

M 3 A2 - 1

Cầu

-

27

M 3 A2 - 2

Que

+

28

XKA1- 1

Cầu

-

29

XKA1- 2

Que

-

30

XKA1- 3

Cầu

-

31

XKA2- 1

Que

+

32

XKA2- 2

Que

-

33

XKA2- 3

Cầu

+

Chú thích: (+): Gram dương (-): Gram âm

3.2 Khảo sát khả năng phân giải Lipid trong môi trường Tween 20 của các dòng vi
sinh vật.
Sau khi đã tiến hành phân lập và làm ròng được mẫu vi sinh vật, mẫu được nuôi
lỏng trong môi trường LB dạng lỏng, nuôi trong điều kiện lắc ủ nhiệt 300 C qua 3 ngày.
Kết thúc q trình ni lỏng sau 3 ngày, tiến hành thử hoạt tính trên mơi trường Tween
20. Với kết quả sau 2 ngày một số mẫu đã xuất hiện những điểm kết tủa quanh giếng
nhưng chưa có hình dạng rõ rệt.
Tiếp tục thử hoạt tính sau 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày cho các dòng vi khuẩn kết quả
ghi nhận được như sau:
3.2.1. Đối với các dòng vi khuẩn phân lập từ nước thải ở KCN Tân Tạo A,
TP.HCM
16