Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan khối lượng phân tử thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ

ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA
CỦA FUCOIDAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP
CHẾ TẠO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Hoàng
MSSV

: 1511537705

GVHD

: PGS.TS. Lê Quang Luân
ThS. Trần Lệ Trúc Hà

TP. HCM, 2020


ĐẠI HỌC
NGUYỄN TẤT THÀNH
THỰC HỌC - THỰC HÀNH - THỰC DANH - THỰC NGHIỆP

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HĨA
CỦA FUCOIDAN KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ THẤP
CHẾ TẠO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Hồng

Mã số sinh viên

: 1511537705

Chun ngành

: Cơng nghệ Sinh học

Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS. Lê Quang Luân
ThS. Trần Lệ Trúc Hà

TP. HCM, 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH

CỘNG HỊA XÃ HƠI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Khoa Công nghệ Sinh học

Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

------------------

-----oOo-----

NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Họ và tên: Nguyễn Hồng

MSSV: 1511537705

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Lớp: 15DSH1B

1. Đầu đề luận văn:
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan khối lượng phân tử thấp chế tạo
bằng phương pháp chiếu xạ
2. Mục tiêu
- Tách chiết được fucoidan nguyên liệu từ rong nâu;
- Chế tạo được fucoidan Mw thấp bằng phương pháp chiếu xạ;
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan.
3. Nội dung:
-

Khảo sát ảnh hưởng của các dung mơi lên quy trình tách chiết fucoidan;

-

Nghiên cứu chế tạo fucoidan Mw thấp bằng phương pháp chiếu xạ;

-

Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan.
4. Thời gian thực hiện: tháng 10/2019 đến tháng 4/2020
5. Người hướng dẫn chính: PGS.TS. Lê Quang Luân
Người hướng dẫn phụ: ThS. Trần Lệ Trúc Hà

Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn.
TP. HCM, ngày…… tháng……năm20…
Khoa/Bộ môn

Cán bộ hướng dẫn

(Ký và ghi rõ họ tên)

(Ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện khoá luận này tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của
Thầy (cô), gia đình, anh chị,... Tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại học Nguyễn Tất Thành, Ban chủ nhiệm khoa Cơng
nghệ Sinh học cùng tồn thể thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời gian học
tập tại trường.
Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh hỗ trợ tồn bộ kinh phí và máy
móc, trang thiết bị để tơi có thể hồn thành đề tài nghiên cứu.
Thầy PGS.TS. Lê Quang Luân đã hướng dẫn khoa học trong suốt thời gian thực
hiện khoá luận này.
Cô Th.S Trần Lệ Trúc Hà Trường Đại học Nguyễn Tất Thành.

Anh Nguyễn Thanh Vũ cùng các anh (chị) phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu và
Nano đã giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện đề tài.
Đồng thời Tơi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện
thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành khố luận trong thời gian qua.

(Sinh viên ký tên)

Nguyễn Hồng
Khoa Cơng nghệ Sinh học
Trường Đại Học Nguyễn Tất Thành

i


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN........................................................................................................ i
MỤC LỤC ............................................................................................................ ii
TÓM TẮT ..............................................................................................................v
SUMMARY ......................................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH ........................................................................ vii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................... viii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... ix
ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................................x
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................... 12
1.1 Giới thiệu về rong nâu ................................................................................... 12
1.1.1 Hình thái ..................................................................................................... 12
1.1.2 Phân bố ở Việt Nam và thế giới.................................................................. 13
1.1.3. Thành phần hóa học chính của rong nâu ................................................... 14
1.2 Fucoidan......................................................................................................... 15

1.2.1. Khái quát về fucoidan ................................................................................ 15
1.2.2. Tác dụng sinh học của fucoidan ................................................................ 16
1.3 Khái quát chung về gốc tự do, sự oxy hóa và chất chống oxy hóa ............... 19
1.3.1 Gốc tự do .................................................................................................... 19
1.3.1.1 Khái niệm ................................................................................................. 19
1.3.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể ............................................ 19
1.3.2 Sự oxy hóa .................................................................................................. 20
1.3.3 Chất chống oxy hóa .................................................................................... 20
ii


1.4 Phương pháp tách chiết fucoidan từ rong nâu ............................................... 20
1.5. Một số phương pháp cắt mạch fucoidan ....................................................... 21
1.5.1 Cắt mạch bằng phương pháp sinh học ........................................................ 21
1.5.2 Cắt mạch bằng phương pháp hóa học ......................................................... 21
1.5.3 cắt mạch bằng phương pháp vật lý ............................................................. 22
1.6 Phương pháp xác định hoạt tính của fucoidan ............................................... 22
1.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước........................................... 23
1.7.1 Nghiên cứu trong nước ............................................................................... 23
1.7.2 Nghiên cứu ngoài nước ............................................................................... 24
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 25
2.1 Nơi thực hiện ................................................................................................. 25
2.2 Nội dung nghiên cứu...................................................................................... 25
2.3 Hóa chất và thiết bị ........................................................................................ 25
2.3.1 Nguyên vật liệu ........................................................................................... 25
2.3.2 Thiết bị ........................................................................................................ 25
2.4 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 26
2.4.1. Quy trình tách chiết fucoidan .................................................................... 26
2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung mơi trong q trình tách chiết fucoidan
...................................................................................................................................... 26

2.4.2.1 Tách chiết fucoidan bằng nước ................................................................ 26
2.4.2.2 Tách chiết fucoidan bằng nước có hỗ trợ đánh sóng siêu âm.................. 27
2.4.2.3 Tách chiết fucoidan bằng HCl ................................................................. 27
2.4.3 Tinh sạch fucoidan và xác định hiệu suất tách chiết .................................. 27
2.5 Chế tạo fucoidan Mw thấp bằng phương pháp chiếu xạ ................................ 28
2.6 Xác định đặc trưng cấu trúc của fucoidan Mw thấp ....................................... 28
2.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan Mw thấp ............................ 28
iii


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................... 30
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại dung môi trong quá trình tách chiết fucoidan
...................................................................................................................................... 30
3.2 Sự suy giảm Mw của fucoidan ....................................................................... 33
3.3 Phân tích đặc trưng cấu trúc fucoidan ........................................................... 34
3.4 Hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan Mw khác nhau trong điều kiện in vitro
...................................................................................................................................... 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 39
PHỤ LỤC............................................................................................................ 43

iv


TÓM TẮT
Fucoidan được biết đến như một polysaccharide tư nhiên với nhiều hoạt tính sinh
học cao và có giá trị. Khóa luận “Khảo sát hoạt tính kháng oxy của fucoidan khối
lượng phân tử thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ” được thực hiện từ tháng 03
năm 2020 tới tháng 09 năm 2020 tại phịng Cơng nghệ Sinh học Vật liệu và Nano, Trung
tâm Công nghệ Sinh học Tp. Hồ Chí Minh với mục tiêu chế tạo fucoidan bằng phương

pháp chiếu xạ khào sát khả năng kháng oxy hóa.
Đề tài bao gồm ba nội dung: Khảo sát ảnh hưởng của các dung mơi lên quy trình
tách chiết fucoidan; nghiên cứu chế tạo fucoidan Mw thấp bằng phương pháp chiếu xạ;
Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan.
Những kết quả đạt được trong 6 tháng khảo sát và nghiên cứu:
1. Fucoidan được tách chiết thành công từ rong nâu với hiệu suất thu nhận
từ tách chiết bằng nước có hỗ trợ sóng siêu âm đạt 4,31%; tách chiết bằng
HCl đạt 4,04%; tách chiết bằng nước đạt 3,56%;
2. Fucoidan ban đầu là 426,5 kDa và giảm dần khi gia tăng liều xạ từ 0 - 20
kGy; đạt 426,5 xuống 25,2 kDa;
3. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của fucoidan Mw ~ 25,2 kDa đạt 74,65% ở
nồng độ 1000 µg/mL.

v


SUMMARY
Fucoidan is known as a natural polysaccharide with many high and valuable
biological activities. The thesis " Study on the anti-oxygen activities of low molecular
weight fucoidan preparing by irradiation method" Was done from March 2020 to
September 2020 at the Department of Bio-material and Nano Biotechnology,
Biotechnology Center of Ho Chi Minh City with aim of making fucoidan by irradiation
to observe oxidation resistance.
The thesis includes three part: Surveying the effects of solvents on fucoidan
extraction process; rreparing on low fucoidan mw by irradiation method; Investigation
anti-oxidant activity of fucoidan.
The results achieved in 6 months of survey and research:
1. Fucoidan is successfully extracted from brown algae with the performance
obtained from water extraction with ultrasonic wave support reaching 4.31%;
HCl extraction reached 4.04%; water extraction reached 3.56%;

2. The initial fucoidan is 426.5 kDa and gradually decreases with an increase in
the dose of radiation from 0 - 20 kGy; 426.5 to 25.2 kDa;
3. DPPH free radical capture activity of fucoidan Mw ~ 25.2 kDa reaches 74.65%
at a concentration of 1000 μg/mL.

vi


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
Hình 3. 1 Mẫu rong nâu ............................................................................................... 30
Hình 3. 2 a) Hỗn hợp rong trước tách chiết; b) Hỗn hợp rong sau tách chiết ............. 30
Hình 3. 3 Ca-alginate ở các nghiệm thức .................................................................... 31
Hình 3. 4 Fucoidan tách chiết ở các nghiệm thức........................................................ 31
Hình 3. 5 Sự suy giảm Mw của fucoidan sau khi chiếu xạ .......................................... 33
Hình 3. 6 Phổ IR của fucoidan được tách chiết ở các nghiệm thức khác nhau ........... 34
Hình 3. 7 Phổ IR của fucoidan ở các liều xạ khác nhau .............................................. 35
Hình 3. 8 Hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan ở nồng độ 600 ppm, ở dải liều xạ .. 36
Hình 3. 9 Hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan Mw 25,2 kDa ................................. 36

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3. 1 Hiệu suất thu nhận fucoidan ở các nghiệm thức ......................................... 32
Bảng 3. 2 Hiệu suất thu nhận alginate và fucoidan ở các nghiệm thức ....................... 32

viii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

FTIR

Fourier-transform infrared spectroscopy

DPPH

1,1- diphenyl-2-picryl-hydrazyl

ABTS

3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

TPC

Total plate count

HCL

Axit clohyđric

CaCl2-

Canxi clorua

GPC

Gel Permeation Chromatography

NaOH

Sodium hydroxide hoặc Natri hydroxit

EtOH

Ethanol

NK

Natural killer cell

AOAC

Association of Official Analytical Chemists

B

Bcell receptor

ABTS+

2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)

DNA

Deoxyribonucleic acid

UV-VIS

Ultraviolet-Visible

SSA

Sóng siêu âm

ix


ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam ở trung tâm Đơng Nam Á, có tổng chiều dài bờ biển khoảng 3260 km,
với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2. Bên cạnh đó Việt Nam là quốc gia có
tính đa dạng sinh học cao đặc biệt là các sinh vật biển như rong. Trong đó vùng biển
Khánh Hịa là tỉnh có diện tích rong nâu lớn nhất, tổng diện tích rong lên tới 2.000.000
m2, trữ lượng khai thác với hơn 11.000 tấn rong tươi/năm, tập trung nhiều ở các vùng
Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo Cam Ranh, Hịn Tre và một số đảo khác. Trong đó hai
vùng Hịn Chồng và Bãi Tiên là hai nơi có các điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật
độ khá dày đặc, sản lượng trung bình khá cao lên tới hơn 5,5 kg/m2.
Thêm vào đó, Fucoidan là một loại polysaccharide tư nhiên Mw chứa nhiều trong
rong nâu. Nhờ sự đa dạng về cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học có
giá trị, một số nghiên cứu khoa học khẳng định khả năng ngăn chặn sự hình thành cục
máu đơng của fucoidan ngồi ra cịn kháng khuẩn, kháng virus, chống nghẽn tĩnh mạch,
chống ung thư, chống viêm khớp, chống viêm nhiễm, giảm mỡ máu, hạ cholesterol, tăng
cường miễn dịch.v..v.. với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực mỹ phẩm, thực
phẩm chức năng và dược phẩm. Việc nghiên cứu thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt
tính sinh học của fucoidan từ rong nâu có vai trị rất quan trọng có nhiều trong rong biển,
với khả năng kích thích sự sản sinh tế bào miễn dịch, giúp cho cơ thể có khả năng chống
lại các tác nhân có hại như nấm, ký sinh trùng và các tế bào ung thư.
Tuy nhiên, việc tách chiết fucoidan với khối lương phân tử cao. Một số phương
pháp hiện nay khơng được thân thiên với mơi do tồn dư hóa chất sau tách chiết, hay về
vấn đề tinh sạch fucoidan trong sản phẩm, hay làm gia tăng hoạt tính sinh học của

fucoidan bằng cách cắt mạch fucoidan để tạo fucoidan có Mw thấp. Chiếu xạ là phương
pháp hiệu quả để cắt mạch polysaccharide tự nhiên chế tạo sản phẩm có Mw thấp với ưu
điểm kiểm soát được hiệu suất cắt mạch, q trình chế tạo an tồn và thân thiện với môi
trường. Từ đây tôi sẽ thực hiện đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxy của fucoidan
khối lượng phân tử thấp chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ” nhằm tìm ra phương

x


pháp tách chiết cho hiệu suất thu nhận fucoidan cao, và khảo sát gia tăng hoạt tính sinh
học bằng cách chế tạo fucoidan Mw thấp.
2. Mục tiêu của đề tài
- Tách chiết được fucoidan nguyên liệu từ rong nâu;
- Chế tạo được fucoidan Mw thấp bằng phương pháp chiếu xạ;
- Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của fucoidan.

xi


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Giới thiệu về rong nâu
Rong biển hay cịn được gọi là tảo kích thước lớn, rong biển là thực vật bậc thấp
sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản. Rong biển sinh trưởng phát
triển nhanh, có vịng đời sinh trưởng khơng q một năm, tốc độ tăng trọng nhanh và
tạo ra sinh khối lớn 1,2. Trên thới giới rong biển được chia thành 3 lồi, có 900 lồi thuộc
ngành rong lục (Chlorophyta), 1500 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta) và 4000
loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta). Hiện nay đã có nhiều cơng trình nghiên cứu
phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới.

Tổng số lồi rong biển ở Việt Nam ước tính khoảng 1.000 lồi, trong đó có khoảng
639 lồi: 151 lồi thuộc ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu
(Phaeophyta), 269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong
lam (Cyanophyta) 1. Trong tất cả các loài này, 310 lồi phân bố ở vùng ven biển các tỉnh
phía Bắc và 484 hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố ở cả hai vùng 3.
Rong nâu chủ yếu sinh sống bờ biển. Có 2 lồi chính: Sargassaceae và Sargassum.
Trong đó lồi Sargassum phân bố nhiều nhất. Rong nâu là thực vật thủy sinh có đời
sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn bào, đa bào và sống thành quần thể.
Rong nâu thuộc ngành tảo màu (Chromophyta) 4.
1.1.1 Hình thái
Rong nâu có nhiều lồi, có độ đậm nhạt của màu nâu khác nhau do sự khác nhau
về các thành phần sắc tố trong cấu tạo.
Cây rong tùy vào từng loại mà có kích thước khác nhau nhưng đều là lồi rong to,
mọc thành bụi, có nhánh mang phiến có dạng lá, phiến có răng mịn. Hầu như các lồi
rong nâu đều có phao, tuy nhiên số lượng và kích thước của các phao khác nhau.
Phao có dạng hình cầu hay trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5-0,8
mm, phao lớn khoảng 5 – 10 mm 2.

12


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Hình 1. 1 Rong nâu

1.1.2 Phân bố ở Việt Nam và thế giới
Rong nâu phân bố nhiều ở Nhật Bản, Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Bồ Đào Nha.
Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và được sử dụng nhiều nhất của rong nâu đại
diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng
cận nhiệt đới.

Đối với rong nâu Việt Nam, nhiều tác giả đã nghiên cứu tương đối đầy đủ về mặt
phân loại. Việc phân loại được thực hiện theo phương pháp hình thái so sánh, trong đó
các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản, là cơ quan ít biến đổi theo các
điều kiện sinh thái, là phương pháp sử dụng từ lâu nhưng vẫn còn phổ biến và vẫn đảm
bảo được mức độ tin cậy trong điều kiện Việt Nam và trên thế giới. Đến thời điểm này
một số chi rong nâu thống kê được: Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi
Turbinaria 5 loài (4 loài 1 thứ), chi Sargassum 68 lồi trong đó ở Khánh Hịa có 39 lồi
1-6

.
Theo số liệu nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy khu vực miền Trung và Nam Trung

Bộ nguồn rong nâu có nhiều ở vùng biển Quảng Nam, Đà Nẵng, Khánh Hịa, Ninh
Thuận và Bình Định trong đó ở Khánh Hòa, Ninh Thuận tập trung với trữ lượng rong
lớn và cho chất lượng cao.
Sản lượng rong nâu ở Việt Nam
Vùng biển Khánh Hịa là vùng có diện tích rong nâu mọc nhiều nhất trong các tỉnh,
tổng diện tích rong lên tới 2.000.000 m2, trữ lượng khai thác được hàng năm có thể ước
13


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

tính hơn 11.000 tấn rong tươi, tập trung nhiều ở các vùng Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo
Cam Ranh, Hòn Tre và một số đảo khác. Trong đó hai vùng Hịn Chồng và Bãi Tiên là
hai nơi tiếp giáp nhau có các điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật độ khá dày đặc,
sản lượng trung bình khá cao lên tới hơn 5,5 kg/m2 7.
1.1.3. Thành phần hóa học chính của rong nâu
Rong nâu có chứa các loại sắc tố như diệp lục tố (chlorophyl), diệp hoàng tố
(xantophyl), sắc tố màu nâu (fucoxanthin), sắc tố đỏ (carotene). Tùy theo tỷ lệ loại sắc

tố mà rong nâu có màu nâu - vàng nâu - nâu đậm - vàng lục 8.
Laminarin: laminarin là tinh bột của rong nâu. Laminarin có hàm lượng từ 10 15 % trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và mơi trường sinh sống
của từng loại rong nâu. Thường thì mùa hè hàm lượng laminarin giảm vì phải tiêu hao
cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong 8.
Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng cellulose trong rong nâu
nhiều hơn rong đỏ 8.
Protein: Protein trong rong nâu khơng cao lắm nhưng khá hồn hảo. Do vậy rong
nâu có thể sử dụng làm thực phẩm. Hàm lượng protein vùng biển Nha Trang dao động
từ 8,05 - 21,11 % so với trọng lượng rong khô. Hàm lượng acid amin cũng đáng kể và
có giá trị cao trong protein của rong biển 8.
Chất khoáng: Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn
trong nước biển. Chẳng hạn I-ốt trong rong nâu thường lớn hơn trong nước biển từ 80 90 lần. Hàm lượng barium lớn hơn trong nước biển gần 1800 lần 8.
Alginate: Chủ yếu được tìm thấy ở thành tế bào cây rong nâu, tạo nên cấu trúc
lưới gel bền trên thành tế bào rong nâu nổi bật của alginic là khả năng tạo gel, tính nhớt.
Ngồi ra alginic cịn có chức năng trong giải độc cho cơ thể 8.
Fucoidan: là loại muối giữa acid fucoidinic với các kim loại hóa trị khác nhau như:
Ca, Cu, Zn. Fucoidin có tính chất gần giống alginic nhưng hàm lượng thấp hơn alginic
8

.

14


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.2 Fucoidan
1.2.1. Khái quát về fucoidan
Fucoidan là một sulfated polysaccharide phân lập từ rong nâu lần đầu tiên bởi
Kylin vào năm 1913 9. Theo danh pháp carbohydrate, vì các polysaccharide được tạo

nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Sulfated polysaccharide có nguồn
gốc từ rong nâu và động vật trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai (echinoderms),
cụ thể là cầu gai và hải sâm 10. Nhưng ngược lại, cấu trúc của các sulfated polysaccharide
từ rong nâu phức tạp hơn nhiều trong thành phần. Ngoài fucose và sulfate, chúng cịn
có thể chứa thêm các monosaccharide khác như: galactose, xylose, manose, acid
glucuronic,… đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các
polymer sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp cịn chưa được biết đến. Chính
vì vậy, tên gọi thơng thường “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các
sulfated polysaccharide từ rong nâu, độc lập với thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên
nó khơng được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật 10.
Fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các hoạt tính sinh
học đa dạng và đặc thù của chúng như: chống đông tụ máu, chống huyết khối, kháng
virut, kháng dính, kháng tạo mạch, kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể, điều biến hệ
miễn dịch, ngừa thai 11. Vì vậy, mà fucoidan trở thành một nguồn tiềm năng cho các ứng
dụng làm thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng, dược liệu,.v..v.. và số các cơng
trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng 10 năm trở lại đây 12.

Hình 1. 2 Cấu trúc fucoidan

Fucoidan là một dạng anion polysaccharide có trong rong nâu, một số động vật
thân mềm sử dụng rong nâu làm thức ăn có thành phần sulfate fucan trong cơ thể chúng,
tuy nhiên cấu trúc những sulfate fucan này đơn giản, là mạch thẳng và chỉ có fucose
15


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

trong thành phần đường. Xác định và mô tả, một loại polysaccharide được chiết từ rong
nâu bởi Kylin gọi là fucoidin, 40 năm sau, fucoidin được đổi tên thành fucoidan cho
đúng với tên gọi của polysaccharide này (polysaccharide nomenclature) 13.

Fucoidan polysaccharide có chứa tỷ lệ phần trăm cao khoảng hơn 70% của LFucose và nhóm ester sulfate, là thành phần của rong nâu và một số động vật không
xương sống.
Cấu trúc của fucoidan giống như cấu trúc của chondroitin sulfate, có mạch thẳng
với đơn cấu trúc 1,2 - D-Galactose hoặc 1,2 - D-Mannose, có phân nhánh tại vị trí 1,2
hoặc 1,4 -L-Fucose, 1,4 -D-Glucuronic acid, d-Xylose đầu cuối và đôi khi 1,4-DGlucose 13.
Fucoidan phần lớn có mặt trong thành tế bào của các loài rong nâu chủ yếu thuộc
Bộ Laminariales và Bộ Fucales thuộc họ Phaeophyceae 11.
1.2.2. Tác dụng sinh học của fucoidan
1.2.2.1. Một số tác dụng chữa bệnh của fucoidan
Fucoidan là một hợp chất thiên nhiên có khả năng, kháng ung thư. Fucoidan kích
thích sự sản xuất tế bào miễn dịch cần cho sự sống, giúp cho cơ thể có khả năng chống
lại những kẻ thù chết người như vi khuẩn, virus, nấm, ký sinh trùng, tế bào ung thư và
rất nhiều hoạt tính mà fucoidan mang lại như:
 Kích hoạt và tăng cường miễn dịch
Fucoidan thúc đẩy các tế bào diệt tự nhiên NK (natural killer). Bảo vệ hệ miễn
dịch đầu tiên của các tế bào NK. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng khi những người sức khỏe
yếu tăng mức sử dụng glyconutrients, số tế bào NK tăng lên đáng kể làm cho họ có khả
năng tự bảo vệ bản thân nhiều hơn khỏi sự suy nhược của các mô mà nó đi kèm với
bệnh tật, thối hóa. Tập hợp cân bằng các glyconutrients của fucoidan làm tăng sự tái
tạo tế bào NK và tế bào B, nhờ vậy làm tăng tốc độ miễn dịch của cơ thể, chống lại sự
xâm nhập bên ngoài 14.
 Hỗ trợ điều trị ung thư
Fucoidan được biết đến qua tạp chí Nghiên cứu chống ung thư (Anticancer
Research) các nhà khoa học đã công bố rằng fucoidan ức chế việc lan truyền ung thư
phổi 14.
16


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

Dùng chuột thí nghiệm Hitosh đã phát hiện ra rằng, tiêm fucoidan ngăn chặn ung
thư biểu bì phổi lan truyền. Họ đã kết luận rằng những phát hiện của họ làm xuất hiện
khả năng rõ ràng rằng fucoidan có thể có giá trị lâm sàng thực sự trong việc ngăn chặn
ung thư trong cơ thể. Các nhà khoa học đã khám phá ra tác dụng chống ung tương tự và
ám chỉ cho fucoidan tác dụng chống sinh sôi nảy nở trong các tế bào ung thư trong một
ấn phẩm xuất bản năm 1993 15.
Ngồi ra, fucoidan cịn có thể ngăn chặn sự phân chia tế bào nguy hiểm. Trong các
thử nghiệm sử dụng các tế bào ung thư biểu bì tĩnh mạch phế quản người (tế bào ung
thư phổi) fucoidan trong pha phân chia tế bào G1, làm suy giảm sự phát triển của các u
ác tính. Fucoidan tác dụng thẳng lên tế bào ung thư ngăn chặn không cho chúng phát
triển 16.
 Kháng khuẩn và kháng virus
Fucoidan có khả năng ức chế đáng kể sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và
vi khuẩn Gram âm, fucoidan cũng có khả năng ngăn chặn loại viêm màng não, một biến
chứng của viêm do vi rút và vi khuẩn gây ra. Fucoidan tăng khả năng sản xuất các dạng
interferon kích hoạt các tế bào miễn dịch khác nhau cần thiết để phòng nhiễm trùng và
bệnh tật 11,12,18.
Trong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng sulfate polysaccharide
(bao gồm fucoidan) thể hiện các hoạt tính kháng virus được thử nghiệm cả trên động
vật thực nghiệm (in vivo) và trong ống nghiệm (in vitro), yếu tố gây độc tế bào thấp của
chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử dụng trong y
học lâm sàng. Fucoidan từ Laminaria japonica có chức năng kháng RNA và DNA của
virus. Hiệu quả chống virus của fucoidan trên bệnh nhiễm trùng do poliovirus III,
adenovirus III, ECHO6 virus, virus coxsackie B3 virus và virus coxsackie A16 là đáng
kể. Fucoidan có thể ức chế sự phát triển của hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) và bảo vệ
các tế bào được cấy ghép khỏi sự nhiễm trùng gây ra bởi các virus ở trên. Herpes là một
bệnh nhiễm trùng gây ra bởi virus herpes simplex (HSV). Fucoidan từ Adenocytis
utriculari, Undaria pinnatifida (Mekabu), Stoechospermum marginatum, Undaria
pinnatifida, Cystoseira indica và Undaria pinnatifida cho thấy hoạt tính kháng virus
HSV-1 và HSV-2 mà khơng gây độc cho tế bào. Hơn nữa, fucoidan cịn cho thấy hoạt

tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm
17


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

miễn dịch của người và cytomegalovirus 12,17,20.
 Làm giảm cholesterol và phòng chống cao huyết áp
Mặc dù fucoidan được biết đến bởi sự hỗ trợ hệ miễn dịch của nó, đồng thời nó
cịn có làm giảm cholesterol và phịng chống cao huyết áp, những con chuột ăn rong nâu
có mức mỡ máu thấp hơn đáng kể đối chứng những con không ăn rong. Sau 21 ngày
thử rong biển các nhà khoa học đã kết luận rằng các hợp chất rong nâu làm thay đổi hoạt
tính của các enzyme trong gan, kiểm sốt cách các acid béo được chuyển hóa, dẫn đến
mức cholesterol thấp hơn trong máu 21.

 Kiểm soát đường huyết
Các nhà nghiên cứu đã cơng bố rằng các polysaccharide tìm thấy trong rong biển
tác động lên phản ứng insulin và đường huyết ở động vật thí nghiệm. Việc đưa thêm các
polysacharide này vào cơ thể động vật đã dẫn đến việc giảm một cách đột ngột cân bằng
hấp thụ đường. Điều này giả thiết rằng các hợp chất polysaccharide giống fucoidan làm
chậm việc truyền glucose vào máu từ ruột, nhờ vậy giúp giữ mức đường máu ổn định
và ngăn chặn phản ứng insulin quá mức 11,12,22.

 Hỗ trợ điều trị bệnh đau khớp
Các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng fucoidan giúp đẩy mạnh việc tạo ra một
chất được gọi là fibronectin có vai trị quan trọng trong việc giữ các khớp được bôi trơn
và linh động. Nghiên cứu phát hiện ra rằng sự có mặt của fucoidan đã góp phần cho việc
sản xuất bình thường chất này gợi ý rằng việc bổ sung fucoidan có thể có tác dụng hữu
ích trong việc tái tạo sụn cho các khớp đau 23.

 Hỗ trợ điều trị bệnh về gan
Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc gián tiếp
sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory
cytokine) ở chuột 24. Các chất xơ trong rong nâu (Laminaria sp., Sargassum fulvellum
và Eisenia bicyclis) có tác dụng chống lại bệnh gan gây ra bởi D-galactosamine (DGalN) và tác dụng bảo vệ này được gây ra ít nhất một phần nhờ fucoidan 25. Kết quả xơ
gan do tổn thương mãn tính gan cùng với sự tích lũy tăng dần các protein hình sợi nhỏ.
Sự có mặt của fucoidan làm giảm suy gan cấp tính và mãn tính gây ra bởi. Gan xơ hóa
gây ra bởicũng giảm bớt bằng cách tiêm fucoidan. Nguyên nhân chính gây ra xơ gan là
18


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

do những thương tổn tế bào gan và sự kích hoạt các tế bào gan hình sao và điều thú vị
là fucoidan có khả năng ngăn chặn tế bào chết do gây ra và ức chế các tế bào gan phát
triển. Vì vậy, fucoidan có thể là một chất chống xơ có tiềm năng nhờ sở hữu chức năng
kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao 12,26.
1.3 Khái quát chung về gốc tự do, sự oxy hóa và chất chống oxy hóa
1.3.1 Gốc tự do
1.3.1.1 Khái niệm
Gốc tự do là những tiểu phần (nguyên tử, phân tử hoặc ion) mang electron độc
thân ở lớp vỏ điện tích. Do sự có mặt của điện tử này mà các gốc tự do có khả năng phản
ứng cao. Các electron này có xu hướng bắt cặp với các electron khác để tạo ra liên kết
hóa học giúp nó có thể phản ứng với gốc tự do khác hoặc phân tử trung hòa. Gốc tự do
đóng vai trị quan trọng trong các q trình cháy, hóa học trong khí quyển, polyme hóa,
hóa sinh và nhiều q trình hóa học khác, gồm cả các q trình sinh lý trong cơ thể con
người.
1.3.1.2 Nguồn gốc phát sinh gốc tự do trong cơ thể
Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể được cho là nguyên nhân của sự lão hóa và các
bệnh về tim mạch do sơ vữa động mạch hay phá vỡ cấu trúc DNA, bệnh ngoài da như

bệnh vẩy nến... Các gốc tự do này gây oxy hóa màng tế bào, dần hủy diệt tế bào, làm
cho việc đào thải chất độc và hấp thu dinh dưỡng trở nên khó khăn hơn.
Sự phát sinh gốc tự do trong cơ thể theo 2 hình thức:
Sự phát sinh gốc tự do nội sinh từ chuỗi truyền điện tử từ trong cơ thể (các phản
ứng phosphoryl oxy hóa của mitochondria; superoxide anion; peroxxynitrate; hydrogen
peroxide; gốc hydroxyl) và từ quá trình tự chết của tế bào (apoptosis).
Sự phát sinh gốc tự do ngoại sinh là các gốc tự do có nguồn gốc hình thành từ các
bức xạ do tia UV, bức xạ ion hóa, ơ nhiễm mơi trường gây tổn hại đến tế bào dẫn đến
tình trạng tổn thương các tế bào thần kinh và mạch máu.

19


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

1.3.2 Sự oxy hóa
Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy
hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra trong phản ứng dây truyền phá hủy tế bào
sinh vật.
1.3.3 Chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là những chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm q trình q
trình oxy hóa các chất khác. Chất chống oxy hóa ngăn q trình phá hủy này bằng cách
khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa các gốc tự do. Chất oxy
hóa làm giảm tác dụng của các q trình oxy hóa bằng cách bổ sung điện tích cho gốc
tự do.
1.4 Phương pháp tách chiết fucoidan từ rong nâu
Có rất nhiều quy trình tách chiết fucoidan đã được sử dụng trên thế giới từ nhiều
năm trước. Những thử nghiệm tách chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi là nước.
Năm 1952 Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian tách chiết từ
nguyên liệu rong đến hiệu suất thu hồi fucoidan. Fucoidan còn có thể tách chiết bằng

cách đun nóng một phần rong khô với mười phần nước tại 1000C trong 3 đến 7,5 giờ,
bằng cách này có thể thu được 55-60% fucoidan 27.
Những nỗ lực đầu tiên nhằm tách chiết fucoidan có hệ thống đã được thực hiện bởi
Milan và Percival. Họ tiến hành xử lý rong với formaldehyde trước khi tiến hành chiết,
tiếp theo xử lý cồn 800C để loại bỏ mannitol, sau đó rong được khuấy trộn với CaCl2 để
phân lập fucoidan và được chiết tiếp với HCl. Đây là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo
của nhóm nghiên cứu Milan và Percival.
Tác giả Duarate đã sử dụng các phương pháp tách chiết đơn giản nhưng lại áp dụng
các bước làm sạch phức tạp tốn nhiều công sức 28.
Phương pháp định lượng
Định lượng phlorotannin tổng (TPC) theo phương pháp Folin-Ciocalteu như mô
tả bởi Swanson 29. với phloroglucinol là chất chuẩn. Lấy 300 μl dịch mẫu bổ sung 01 ml
Folin-Ciocalteu 10%, giữ 5 phút. Tiếp theo thêm vào 2 ml Na2CO3 10%, trộn đều, giữ

20


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

90 phút trong bóng tối, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 750 nm, đo trên máy UV-Vis
Spectrophotometer JenWay 6400/ 6405.
Định lượng carbohydrate theo AOAC 31.
1.5. Một số phương pháp cắt mạch fucoidan
1.5.1 Cắt mạch bằng phương pháp sinh học
Enzyme β-glucanase thường được sử dụng để làm giảm Mw tăng độ hịa tan trong
nước và hoạt tính sinh học của Fucoidan. Fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã bị phân
hủy một phần bởi β-glucanase trong các khoảng thời gian khác nhau. Sau khi sử lý với
enzyme Mw trung bình thu được trong khoảng từ 2,2 – 210 kDA và thể cấu tạo của
fucoidan rong nâu thay dổi từ một chuỗi bán linh hoạt thành dạng cuộn ngẫu nhiên.
Sự biến tính có thể ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc chính và cấu trúc không gian

của Fucoidan và các phương pháp biến đổi khác nhau cho thấy các hiệu ứng khác nhau
đối với cấu trúc Fucoidan. Biến tính vật lý thường ảnh hưởng dến cấu tạo của
polysaccharide thông qua việc thay đổi cấu trúc khơng gian của nó thay vì cấu trúc chính,
biến tính hóa học có thể thêm các nhóm trên chuỗi chính hoặc là chuỗi bên, dẫn đến
thay đổi của cả cấu trúc chính lẫn kết cấu khơng gian. Do đó, điều quan trọng là nghiên
cứu ảnh hưởng của các phương pháp cắt mạch trên cấu trúc Fucoidan, từ đó xác định
các phương pháp biến tính, cắt mạch tối ưu để đạt được fucoidan có hoạt tính sinh học
cao hơn.
1.5.2 Cắt mạch bằng phương pháp hóa học
Việc chế tạo fucoidan tan trong nước bằng phương pháp hóa học chủ yếu dựa trên
sự thủy phân các liên kết glycoside giữa các đơn phân D-glucose của phân tử Fucoidan.
Các liên kết glycoside này là những liên kết không bền nên rất dễ bị thủy phân bởi các
tác nhân hóa học và những nhân tố hóa học này thủy phân hồn tồn không đặc hiệu.
Hiệu suất cắt mạch fucoidan trong phản ứng này chủ yếu phụ thuộc vào nồng độ của tác
nhân hóa học, thời gian phản ứng và nhiệt độ. Tuy nhiên, quả trình phản ứng xảy ra lại
khơng phụ thuộc nghiêm ngặt vào các điều kiện môi trường như dộ pH, đệm, …. Đã có
nhiều nghiên cứu sử dụng acid để tiến hành cắt mạch Fucoidan. Mặc dù cắt mạch bằng
phương pháp hóa học thực hiện tương đối đơn giản có nhiều thuận lợi nhưng lại gặp
21


Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

phải những hạn chế nhất định như chi phí cao do sử dụng những chất có tính oxy hóa
mạnh, q trình cắt mạch khó kiểm sốt nên có thể làm tổn hại dến cấu trúc của polymer,
thải ra nhiều chất độc hại gây ơ nhiễm mơi trường. Bên cạnh đó, sản phẩm sau khi cắt
mạch phải được tách hết hóa chất ra khỏi và đem đi tinh chế lại.
1.5.3 cắt mạch bằng phương pháp vật lý
Cắt mạch bằng siêu âm: sóng siêu âm có gây suy thối các chuỗi phân tử fucoidan
thơng qua việc phá vỡ liên kết glucosidic và bắt đầu phản ứng oxy hóa - khử của các

gốc tự do. Sau khi cắt mạch bằng siêu âm có thể thu được các phân đoạn của fucoidan
với khối lượng phân tử thấp hơn.
Cắt mạch bằng chiếu xạ: Fucoidan cũng có thể được điều chỉnh thông qua chiếu
xạ, bao gồm tia γ, tia X, và chùm điện tử gia tốc để gây ra những thay đổi vật lý hóa học
trong cấu trúc của nó.
1.6 Phương pháp xác định hoạt tính của fucoidan
Chất chống oxy hóa có thể bảo vệ cơ thể tránh khỏi tác hại của sự dư thừa gốc tự
do trong cơ thể, Các gốc tự do cá tác dụng oxy hóa mạnh là ngun nhân chính gây ra
các tổn thương cấu trúc DNA, màng tế bào, protein. Hơn nữa, các gốc tự do còn gây tác
hại đến các acid nucleic làm cho DNA phiên mã khơng chính xác theo các thông tin sinh
học gây sai hỏng cấu trúc và tế bào ung thư được hình thành. Các chất chống oxy hóa
mạnh sẽ có tác dụng bắt giữ các gốc tự do này gây bất hoạt chúng.
Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa:
Chất chống oxy hóa là chất định dưỡng, có thể làm sạch các gốc tự do bằng cách
đưa lên một electron. Khi một phân tử gốc tư do nhận thêm một electron từ một phân tử
chống oxy hóa, các gốc tự do trở nên ổn định và khơng cịn khả năng gây hại. Ngồi ra,
chất chống oxy hóa cịn giúp hạn chế sự phân hủy các hydroperoxide.
 Khả năng bắt gốc tự do DPPH
Phương pháp bắt góc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng
cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do hay đánh giá cung cấp hydro của các chất
chống oxy hóa. Phương pháp này đơn giản, nhanh chóng và ổn dịnh nên được sử dụng
rộng rãi để sàng lọc chất chống oxy hóa.
22