Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---------------o0o---------------

NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƯƠNG
NGHIÊN CỨU TRÍCH LY GINSENOSIDE TỪ CỦ TAM THẤT BẮC
BẰNG PHƢƠNG PHÁP CÓ HỖ TRỢ ENZYME
VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH
(Enzyme-assisted extraction of ginsenosides from Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen
and examination of the extract biological activities)

Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC
Mã số: 60520301

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2019


Cơng trình được hồn thành tại: Trƣờng Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Hoàng Minh Nam……………………………….
TS. Nguyễn Hữu Hiếu……………………………...
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh..……………………………..……
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS. Nguyễn Quốc Thắng…………………………………..
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM
Tp. HCM, ngày 22 tháng 01 năm 2019
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. GS. TS. Đống Thị Anh Đào – Chủ tịch
2. TS. Huỳnh Ngọc Oanh – Ủy viên phản biện 1
3. TS. Nguyễn Quốc Thắng – Ủy viên phản biện 2
4. PGS. TS. Phan Thị Phượng Trang - Ủy viên

5. TS. Huỳnh Khánh Duy – Thư kí
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn và Trưởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC

GS. TS. ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO

GS. TS. PHAN THANH SƠN NAM

i


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƢƠNG

MSHV: 1770453

Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1995

Nơi sinh: Đồng Tháp

Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học

Mã số: 60520301

I. TÊN ĐỀ TÀI:
Tên tiếng Việt: “Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng
phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích”
Tên

tiếng

Anh:

“Enzyme-assisted

extraction

of

ginsenosides

from

Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen and examination of the extract biological
activities”
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
2.1. Tổng quan: tam thất bắc và các loại ginsenoside, tình hình nghiên cứu trong và
ngồi nước, ứng dụng của cao trích củ tam thất bắc, phương pháp trích ly, phương pháp
định lượng ginsenoside, phương pháp thử hoạt tính sinh học của cao trích.

2.2. Thực nghiệm
 Trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc
 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện trích ly:
 Khảo sát từng yếu tố: pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân;
 Khảo sát đồng thời ba yếu tố trên bằng quy hoạch thực nghiệm tâm xoay bậc hai
với mơ hình Box-Wilson, xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11.0;
 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích: kháng tiểu đường và kháng ung thư.
2.3. Kết quả và bàn luận
2.4. Kết luận
ii


III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/07/2018
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 15/01/2019
V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS. HOÀNG MINH NAM, TS. NGUYỄN HỮU HIẾU
Tp. HCM, ngày … tháng… năm 2019
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 1

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN 2

TS. HOÀNG MINH NAM

TS. NGUYỄN HỮU HIẾU

PTN Trọng điểm ĐHQG-HCM – Công nghệ Hóa học và Dầu khí (CEPP)

TS. NGUYỄN HỮU HIẾU
TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

GS. TS PHAN THANH SƠN NAM

iii


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ
tinh thần và hỗ trợ tác giả trong quá trình thực hiện và hồn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô trong khoa Kỹ thuật Hóa học,
Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM đã nhiệt tình giúp đỡ tác giả và tạo điều
kiện thuận lợi cho tác giả trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến TS. Hoàng Minh Nam và TS. Nguyễn Hữu Hiếu
đã tận tình hướng dẫn tác giả hồn thành luận văn.
Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh chị và bạn bè ở Phịng thí nghiệm
Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ hóa học và Dầu khí (CEPP) đã tạo điều kiện
thuận lợi để tác giả hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo và quý anh chị ở
Cục Thú Y – Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú Y Trung Ương II đã tạo điều kiện
thuận lợi và hỗ trợ tác giả trong quá trình thực hiện luận văn.
Tác giả
Nguyễn Trần Xuân Phƣơng

iv


TÓM TẮT
Trong luận văn này, hai hoạt chất ginsenoside Rb1 và Rg3 được trích ly từ
củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ viscozyme L. Đây là phức hợp nhiều
cacbohydrase khác nhau như cellulase, arabanase, xylanase và hemicellulase.
Khi bổ sung viscozyme L vào q trình trích ly thì phức hợp các enzyme này sẽ
phân cắt các thành phần cấu tạo nên thành tế bào như pectin, cellulose,

hemicellulose,…
Do đó, làm phá vỡ cấu trúc thành tế bào – cơ quan bảo vệ bên ngồi của tế bào
khơng bị mất nước và duy trì tính tồn vẹn của tế bào, làm giải phóng các hoạt chất
vào
dung mơi trích ly.
Ảnh hưởng của từng yếu tố đến sự hoạt động của enzyme như pH, nhiệt độ và
thời gian thủy phân được khảo sát để tìm khoảng biến thiên phù hợp. Sau đó, dựa trên
các khoảng giá trị tìm được, tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố này
bằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp tâm xoay bậc hai với mơ hình Box –
Wilson và xử lý số liệu bằng phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly
phù hợp cho hàm lượng ginsenoside Rb1 và Rg3 trong cao trích cao nhất.
Hàm lượng Rb1 và Rg3 trong cao trích được xác định bằng phương pháp sắc kí
lỏng hiệu năng cao (High-performance Liquid Chromatography – HPLC).
Đồng thời, mẫu đối chứng không bổ sung viscozyme L được tiến hành để so sánh
hàm lượng ginsenoside với mẫu trích ly ở điều kiện phù hợp tìm được.
Cao trích có hàm lượng Rb1 và Rg3 cao nhất ứng với điều kiện phù hợp được
thử nghiệm các hoạt tính sinh học: kháng tiểu đường bằng phương pháp ức chế
enzyme α-glucosidase và kháng ung thư trên ba dòng tế bào phổi Lu, gan Hep-G2 và
vú MCF-7 bằng phương pháp tetrazolium (MTT assay).

v


ABTRACT
In this essay, two ginsenosides Rb1 and Rg3 were extracted from
Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen by enzyme-assisted method, which was
viscozyme L. This was a complex of different carbohydrases such as cellulase,
arabanase, xylanase and hemicellulase. When viscozyme L was added to the extraction
process, the complex of these enzymes could break down the cell walls such as pectin,
cellulose and hemicellulose. Therefore, ginsenosides were dissolved into solvent

extraction.
The effect of three independent variables in terms of pH, temperature and
hydrolysis time was investigated to find a range of suitable conditions, which could
help
viscozyme L to activate well. Then, the Box and Wilson design was applied to survey
the simultaneous effect of these factors, using Design Expert 11.0 software for the
experimental design and regression analysis of the experimental data. The target of
this research was the highest of concentration ginsenoside Rb1 and Rg3 obtained
in the extract.
The concentration of Rb1 and Rg3 in the extract were determined by
high-performance liquid chromatography (HPLC).
At the same time, the control sample was extracted similarly in that process,
but viscozyme L was not added in the sample.
The extract with the highest of concentration ginsenoside Rb1 and Rg3 was tested
for biological activities concluding antidiabetic using α-glucosidase inhibitor and
anticancer on three cell lines such as Human lung carcinoma (Lu), Hepatocellular
carcinoma (Hep-G2), and Human breast carcinoma (MCF-7) using the tetrazolium
assay (MTT assay).

vi


LỜI CAM ĐOAN
Tác giả xin cam đoan luận văn này là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tác giả và
được thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS. Hoàng Minh Nam và TS. Nguyễn Hữu
Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ Hóa học và Dầu khí
(CEPP), Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM.
Số liệu, kết quả nghiên cứu và kết luận trong luận văn này là hoàn tồn trung thực.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2019
Tác giả

Nguyễn Trần Xuân Phƣơng

vii


MỤC LỤC
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ........................................................................ ii
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... iv
TÓM TẮT ................................................................................................................. v
ABTRACT ................................................................................................................ vi
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... vii
MỤC LỤC .............................................................................................................. viii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. x
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ xiii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT (tiếp theo) ............................................................. xiv
ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................... 2
1.1. Tam thất bắc và các loại ginsenoside .......................................................... 2
1.1.1. Danh pháp và phân loại khoa học ........................................................... 2
1.1.2. Mô tả thực vật .......................................................................................... 2
1.1.3. Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng và thu hoạch ........................................ 3
1.1.4. Thành phần hóa học trong củ TTB .......................................................... 4
1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc ................................................ 9
1.2.1. Ngoài nước............................................................................................... 9
1.2.2. Trong nước............................................................................................. 10
1.3. Ứng dụng của cao trích củ TTB ................................................................. 11
1.3.1. Kháng tiểu đường .................................................................................. 11
1.3.2. Kháng ung thư ....................................................................................... 14
1.4. Phƣơng pháp trích ly .................................................................................. 20

1.4.1. Phương pháp cổ điển ............................................................................. 20
1.4.2. Phương pháp hiện đại............................................................................ 20
1.5. Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ............ 23
1.5.1. Tính cấp thiết ......................................................................................... 23
1.5.2. Mục tiêu ................................................................................................. 24

viii


1.5.3. Nội dung ................................................................................................. 24
1.5.4. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 24
CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 32
2.1. Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị – dụng cụ và địa điểm thực hiện ............ 32
2.1.1. Nguyên liệu ............................................................................................ 32
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................. 32
2.1.3. Thiết bị – dụng cụ .................................................................................. 34
2.1.4. Địa điểm thực hiện ................................................................................. 35
2.2. Thí nghiệm ................................................................................................... 36
2.2.1. Quy trình trích ly ginsenoside từ củ TTB............................................... 36
2.2.2. Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly ................................................... 37
2.2.3. Phân tích hàm lượng ginsenoside .......................................................... 38
2.2.4. Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích ........................................ 40
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................ 41
3.1. Điều kiện trích ly ......................................................................................... 41
3.1.1. Ảnh hưởng từng yếu tố ........................................................................... 41
3.1.2. Áp dụng quy hoạch thực nghiệm tìm điều kiện trích ly phù hợp ........... 44
3.2. Hoạt tính sinh học của cao trích ................................................................ 59
3.2.2. Hoạt tính kháng tiểu đường ................................................................... 59
3.2.3. Hoạt tính kháng ung thư ........................................................................ 61
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN ...................................................................................... 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ
PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Các bộ phận của TTB ......................................................................................3
Hình 1.2. Cơng thức hóa học của dammaran ..................................................................6
Hình 1.3. Bộ khung cacbon của polyacetylen .................................................................8
Hình 1.4. Sơ đồ chuyển hóa polysaccarit vào máu .......................................................13
Hình 1.5. Quá trình tăng cường sự hấp thu glucose vào nội bào ..................................14
Hình 1.6. Nhóm các nước có số ca mắc bệnh ung thư trên thế giới .............................15
Hình 1.7. Thống kê của WHO về tình hình mắc ung thư ở Việt Nam ..........................15
Hình 1.8. Cơ chế kháng ung thư của Rb1 .....................................................................17
Hình 1.9. Cơ chế kháng ung thư của Rg3 .....................................................................18
Hình 1.10. Quá trình phá vỡ cấu trúc tế bào của enzyme .............................................21
Hình 1.11. Một số loại chế phẩm enzyme .....................................................................21
Hình 1.12. Vị trí cắt của endo-β-1,4-glucanase trên mạch cellulase .............................22
Hình 1.13. Sơ đồ nguyên lý hoạt động HPLC ...............................................................27
Hình 1.14. Thiết bị phân tích HPLC..............................................................................28
Hình 1.15. Nguyên tắc thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường ...................................29
Hình 1.16. Ngun tắc thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư ........................................30
Hình 2.1. Củ TTB ..........................................................................................................32
Hình 2.2. Chất chuẩn Rb1 và Rg3 .................................................................................33
Hình 2.3. Chế phẩm viscozyme L .................................................................................33
Hình 2.4. Các thiết bị sử dụng .......................................................................................34
Hình 2.5. Quy trình trích ly ginsenoside từ củ TTB......................................................36

Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH ........................................................................................41
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................42
Hình 3.3. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân ..............................................................43
Hình 3.4. Hàm lượng Rb1 từ số liệu thực nghiệm và dự đốn......................................47
Hình 3.5. Sự tác động của ba yếu tố khảo sát................................................................48
Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng Rb1 .....................................49
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng Rb1 ...........50
Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và pH đến hàm lượng Rb1 ...................51

x


Hình 3.9. Hàm lượng Rg3 từ số liệu thực nghiệm và dự đốn......................................54
Hình 3.10. Sự tác động của ba yếu tố khảo sát..............................................................55
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hàm lượng Rg3 ...................................56
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng Rg3.........57
Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân và pH đến hàm lượng Rg3 .................58
Hình 3.14. Hoạt tính kháng tiểu đường của cao trích củ TTB ......................................60
Hình 3.15. Hoạt tính kháng ung thư của cao trích củ TTB đối với ba dòng tế bào
ung thư Lu, Hep-G2 và MCF7 ......................................................................................61

xi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Cấu trúc các ginsenoside trong củ TTB ..........................................................6
Bảng 1.2. Hoạt tính sinh học của một số loại ginsenoside quan trọng............................8
Bảng 1.3. Mơ hình Box – Wilson với 3 yếu tố độc lập .................................................26
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng ...........................................................................................32
Bảng 2.2. Hóa chất sử dụng (tiếp theo) .........................................................................33

Bảng 2.3. Thiết bị sử dụng ............................................................................................34
Bảng 2.4. Dụng cụ sử dụng ...........................................................................................35
Bảng 2.5. Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng từng yếu tố ..................................................37
Bảng 2.6. Thiết kế thí nghiệm theo mơ hình Box-Wilson ............................................38
Bảng 2.7. Chương trình pha động .................................................................................39
Bảng 2.8. Chuẩn bị chất chuẩn làm việc .......................................................................39
Bảng 3.1. Khoảng biến thiên phù hợp ...........................................................................44
Bảng 3.2. Mức thí nghiệm .............................................................................................44
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình Box-Wilson đối với Rb1 ............45
Bảng 3.4. Kết quả phân tích ANOVA đối với Rb1 .......................................................46
Bảng 3.5. Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm .......................47
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm thiết kế theo mơ hình Box-Wilson đối với Rg3 ............52
Bảng 3.7. Kết quả phân tích ANOVA đối với Rg3 .......................................................53
Bảng 3.8. Kết quả phân tích sự phù hợp của mơ hình với thực nghiệm .......................54
Bảng 3.9. Kết quả thực nghiệm kiểm chứng mơ hình ...................................................59

xii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

TTB
TCA

Tam thất bắc

Tricacboxylic acid

Tricacboxylic axit

PPD

Protopanaxadiol

PPT

Protopanaxatriol

TLC
HPLC

Thin Layer Chromatography
High-performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MS

Mass Spectrometry

Khối phổ

GC

Gas Chromatography

Sắc ký khí

Ultraviolet – Visible

Quang phổ hấp thu

Spectroscopy

tử ngoại khả kiến

UV-Vis

IC50

SPECT

PET

The half maximal inhibitory
concentration

Nồng độ ức chế 50%

Single Photon Emission

Chụp cắt lớp phát xạ đơn

Computer Tomography

photon

Positron Emission

Chụp cắt lớp phát xạ

Tomography
CT
MRI

SW480
NCI-H460

Computed Tomography

Quét cắt lớp vi tính

Magnetic Resonance

Chụp cộng hưởng từ

Imaging

hạt nhân

Human Colorectal Cancer

Dịng tế bào ung thư

cell lines

đại trực tràng

Human Lung Cancer cell line

Dòng tế bào ung thư phổi

xiii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT (tiếp theo)
Từ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

BT474

Human Breast Cancer

Dòng tế bào ung thư vú

ADN

cell lines acid
Deoxyribonucleic

Deoxyribonucleic axit

PTN

Phịng thí nghiệm

CN

Cơng nghiệp

GLUT1

Glucose transporter 1

Glucose vận chuyển 1

GLUT4

Glucose transporter 4

Glucose vận chuyển 4

IRS-1

Insulin-1

PI3K

Photphatidylinositol 3

Akt hay PKB

kinase
Protein
kinase B

PEDF

CYP1A1

Pigment Epithelium-

Yếu tố có nguồn gốc

Derived Factor

biểu mơ sắc tố

Cytochrome P450 1A1

AhR
NF-κB

Aryl hydrocacbon thụ thể
Nuclear Factor-kappa B
Enzyme-Assisted

EAE

Trích ly có hỗ trợ enzyme

Extraction

xiv


ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, áp lực, căng thẳng trong công việc, chế độ ăn uống, nghỉ ngơi không
hợp lý là những hiện tượng khá phổ biến ở giới trẻ. Tình trạng này kéo dài là
nguyên nhân làm tăng nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 và có thể dẫn đến
ung thư. Theo thống kê của Hiệp hội Đái tháo đường thế giới, năm 2017, có hơn
400 nghìn người mắc bệnh tiểu đường có độ tuổi từ 20 đến 79 tuổi. Bên cạnh
tiểu đường, số ca mắc bệnh ung thư trên thế giới cũng tăng vượt trội trong 5 năm
trở lại đây, trong đó có Việt Nam. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới, tình trạng
ung thư nếu tiếp tục tăng sẽ đưa Việt Nam vào nhóm những nước có số lượng ca
ung thư hàng năm cao nhất thế giới.
Sự phát triển của khoa học công nghệ trong y học đã khơng cịn là thách thức
đối với bệnh tiểu đường và ung thư. Tuy nhiên, các phương pháp về điều trị bệnh
thường ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân và chi phí điều trị đắt đỏ. Từ lâu, dân gian
đã biết sử dụng các loại dược liệu như nấm linh chi, nhân sâm, tam thất bắc, xạ đen,…
trong việc điều trị bệnh nhưng khơng có cơ sở khoa học. Bắt nguồn từ đó,
nhiều cơng trình nghiên cứu lần lượt ra đời trên thế giới. Tại Việt Nam, với điều kiện
khí hậu, đất đai phù hợp, tam thất bắc được trồng khá nhiều ở các vùng núi cao
phía Bắc, tạo điều kiện nghiên cứu và phát triển loại dược liệu này. Đến nay,
những công bố về phương pháp trích ly hoạt chất, thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học của tam thất bắc được trồng tại Việt Nam vẫn chưa phổ biến. Vì vậy, đề tài
luận văn “Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng phƣơng pháp
có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích” được chọn
nghiên cứu nhằm làm đa dạng nguồn dược liệu điều trị tiểu đường, ung thư và nâng
cao giá trị của loài thực vật bản địa Việt Nam.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tam thất bắc và các loại ginsenoside
1.1.1. Danh pháp và phân loại khoa học
Tên khoa học: Panax notoginseng hay Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen,
có tên gọi khác: sâm tam thất bắc, nhân sâm tam thất bắc, điền thất, kim bất hốn
(vàng khơng đổi) có nghĩa là vị thuốc rất quý, vàng cũng không đổi được. Ở Việt
Nam, tên gọi phổ biến là tam thất bắc (TTB) [1, 2]. Ở Trung Quốc, TTB cịn có tên
Sanqi, Tianqi hay Tien-chi [3]. TTB có phân loại khoa học như sau:

 Ngành: Angiospermae (hạt kín);
 Lớp: Eudicots (hai lá mầm);
 Bộ: Apiales (hoa tán);
 Họ: Araliaceae (nhân sâm);
 Chi: Panax (sâm);
 Loài: Panax notoginseng hay Panax notoginseng (Burk.) F.H. Chen.
1.1.2. Mô tả thực vật
TTB là loại cây thân thảo sống lâu năm. Thân mọc thẳng cao 30-50 cm, màu tím tía.
Lá kép chân vịt, 3-4 cái mọc vịng, cuống lá chung dài 3-6 cm, mang 3-7 lá chét hình
mác dài, mép có khía răng cưa, có lơng cứng ở gân trên cả hai mặt, mặt trên sẫm, mặt
dưới nhạt và cuống lá chét dài 0,6-1,2 cm như thể hiện ở hình 1.1a.
Cụm hoa mọc thành tán đơn ở ngọn thân, nụ hoa màu lục vàng nhạt với 5 lá đài,
5 cánh hoa, 5 nhị và bầu dưới 2 ô như thể hiện ở hình 1.1b. Quả mọng hình cầu dẹt,
khi chín có màu đỏ; hạt hình cầu, màu trắng như thể hiện ở hình 1.1c. Củ (rễ)
sần sùi, màu vàng nhạt và có mùi đặc trưng như thể hiện hình 1.1d [1].

2

(a)

(b)

(c)

(d)
Hình 1.1. Các bộ phận của TTB

(a) Cây, (b) Nụ hoa, (c) Hoa khi chín và (d) Củ
1.1.3. Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng và thu hoạch
Khu vực phân bố của TTB chủ yếu ở các nước châu Á như Myanmar, Nepal,
Nhật Bản và đặc biệt loài cây này được trồng nhiều ở phía Tây Nam Trung Quốc [4].
Ở Việt Nam, TTB được trồng nhiều ở tỉnh Hà Giang (Đồng Văn), Lào Cai
(Mường Khương, Bát Xát, Phà Lùng), Cao Bằng,… tại các vùng núi cao
1.200-1.500 m. Cần chọn những nơi sườn núi ít gió mạnh, phải làm các giàn che nắng
và phải rào để chống chuột hay sóc đến ăn củ.
Đất phải được bón phân, chuẩn bị kỹ một năm trước khi gieo trồng và chia thành
luống dọc cách nhau 1 m. Vào tháng 10-11 chọn những hạt ở cây đã mọc 3-4 năm,
gieo vào vườn ươm. Đến khoảng tháng 2 năm sau, cây con mới mọc. Một năm sau,
3


vào tháng 1-2 có thể đào cây con lên, cắt bỏ lá gốc và trồng vào vườn chính thức.
Sau 3-7 năm mới bắt đầu thu hoạch [1].
Bộ phận thường được dùng làm thuốc của TTB là củ, đây chính là kết tinh của
TTB, nơi có chứa rất nhiều dược chất quý hiếm tốt cho sức khỏe.
1.1.4. Thành phần hóa học trong củ TTB
Thành phần hóa học chứa trong củ TTB khá phức tạp, chứa saponin, flavonoid,

polyacetylen, polysacarit, axit amin, axit béo, tinh dầu và peptit; trong đó, saponin là
các loại dammaran chiếm 12% tổng khối lượng khô. Những chất này đều là những
hợp chất tự nhiên có chứa hoạt tính sinh học cao, nhiều cơng dụng dược lý có lợi [1].
1.1.4.1. Hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học
Các hợp chất hữu cơ tự nhiên từ lâu đã là đối tượng được các nhà hóa học,
sinh học và dược liệu học quan tâm nghiên cứu. Hợp chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học (hay cịn gọi là hoạt chất tự nhiên) là những hợp chất có nguồn gốc từ
sinh vật (thực vật, động vật, vi sinh vật) có dược tính hoặc độc tính đối với động vật và
con người. Hầu hết hoạt chất tự nhiên là sản phẩm biến dưỡng bậc hai (hợp chất
thứ cấp) có cấu trúc phân tử vô cùng đa dạng do cây sản xuất ra, khơng trực tiếp
chuyển hóa năng lượng mà nhằm những mục đích khác như tự vệ (gây độc,
mùi hăng, vị đắng…), hấp dẫn thụ phấn, phát tín hiệu hóa học,…
Các hoạt chất tự nhiên từ dược liệu thường là các hợp chất được sinh tổng hợp từ
quá trình đường phân, chu trình Krebs (chu trình tricacboxylic axit – TCA) hoặc
chu trình Calvin. Theo đó, phân biệt về mặt nguồn gốc có ba nhóm hợp chất thứ cấp
lớn là terpenoid, phenolic và hợp chất chứa nito. Về mặt hoạt tính sinh học, kéo theo
sự phân biệt rõ hơn nữa mối liên quan giữa cấu trúc phân tử và chức năng chung mà
hoạt chất tự nhiên được chia thành các nhóm lớn như alkaloid, quinonoid, coumarin,
flavonoid, tinh dầu, glycoside tim, saponin,… [5, 6]. Trong luận văn này, saponin
được chọn để nghiên cứu.

4


1.1.4.2. Saponin
a. Định nghĩa và tính chất
Saponin cịn gọi là saponoside do chữ Latinh “sapo” có nghĩa là xà phịng (vì dễ tạo
thành bọt bền vững khi lắc với nước), là một nhóm glycoside lớn, thường gặp trong
thực vật. Cấu trúc của saponin cũng như các glycoside khác đều có hai phần:
sapogenin (aglycon) và đường. Phần sapogenin có thể là một chất steroid hay

triterpenoid. Phần đường thường là β-D-glucose, β-D-xylose, α-L-rhamnose hay α-Larabinose,... [7, 8].
Một số tính chất chung của saponin là:
 Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước;
 Làm vỡ hồng cầu ngay khi ở nồng độ loãng;
 Độc với cá, diệt các loại thân mền như giun, sán, ốc sên,...;
 Kích thích niêm mạc mắt gây đỏ mắt, hắt hơi;
 Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3-β-hydroxysteroid.
Trong TTB, saponin là một trong những thành phần chiếm hàm lượng lớn.
b. Saponin trong TTB
Saponin trong TTB thuộc nhóm dammaran có phần sapogenin chủ yếu là
(20S)-protopanaxadiol (PPD) và (20S)-protopanaxatriol (PPT). Đã có 56 saponin được
phân lập từ củ TTB, trong đó có 35 saponin thuộc (20S)-PPD và 21 saponin thuộc
nhóm (20S)-PPT. Các saponin này thường được gọi là ginsenoside hoặc
notoginsenoside
tùy theo cấu trúc khác nhau:

 Saponin có phần sapogenin là (20S)-PPD gồm: ginsenoside Rb1, Rb2, Rd, Rg3
và các notoginsenoside R4, R7, A, B, C, D, E, I, K, L;

 Saponin có phần sapogenin là (20S)-PPT gồm: ginsenoside Re, Rf, Rg1, Rg2,
Rh1 và các notoginsenoside R1, R2, R3, R6.
Trong đó, các ginsenoside chính là Rb1, Rg3, Rg1 và Rd. Đối với chi sâm, hàm
lượng ginsenosde của củ TTB là cao nhất và ginsenoside tồn phần có thể cao hơn 8%

5


khối lượng củ khơ. Các cơng thức hóa học của ginsenoside được thể hiện ở hình 1.2 và
bảng 1.1 [7, 9].

(20S)-PPD

(20S)-PPT

Hình 1.2. Cơng thức hóa học của dammaran
Bảng 1.1.Cấu trúc các ginsenoside trong củ TTB [10]
Tên

Nhóm

hoạt chất

R1

R2

R3

Rb1

-glc2-1glc(3)

-glc6-1glc

Rb2

-glc2-1glc

-glc6-1ara(p) (6)

(20S)-

Rd

-glc2-1glc

-glc

PPD

Rg3

-glc2-1glc

20(S), -H

A

-glc2-1glc

(S2)a, -glc6-1glc

B

-glc2-1glc

(S3)a, -glc6-1glc

G(1)

N(2)

(20S)-

Re

-glc2-1rha(5)

-glc

Rf

-glc2-1glc

-H

Rg1

-glc

-glc

Rh1

-glc

-H

G

PPT

R1

-glc2-1xyl(4)

OH-glc

R2

-glc2-1xyl

OH

N
(1)

Ginsenoside,

(2)

Notoginsenoside,

(3)

β-D-glucopyranosyl,

(5)

α-L-rhamnopyranosyl (6)α-L-arabinopyranosyl.

6

(4)

β-D-xylopyranosyl,


Các hoạt tính sinh học chính của ginsenoside được thể hiện ở bảng 1.2.

7


Bảng 1.2. Hoạt tính sinh học của một số loại ginsenoside quan trọng [10]
STT

1

Tác dụng

Ginsenoside

Kích thích chức năng miễn dịch và

Rg1, Rb1, Rb2, Rc, Rg3, Rh2,

hoạt động thực bào

Re,
Rg2, Rh1

2

Kháng tiểu đường

Rb1, R2

3

Kháng viêm

Hợp chất Y, Mc

4

Kháng khối u, ung thư

5

Giãn mạch máu

Rb1, Rd, Rg1

6

Phòng chống xơ vữa động mạch

Rb1, Rb2, Rc

7

Tập hợp chống tiểu cầu

R0, R1, Rg1, Rg2

8

Phòng chống và phục hồi bệnh Alzheimer

PPT, PPD

9

Bảo vệ chống lại sự căng thẳng

R2

10

Phục hồi thận hư

Rd, Re

Rb1, Rh1, Rh2, Rg3,
hợp chất K

Ngoài ginsenoside, polyacetylen cũng là một trong những thành phần chính có
trong củ TTB.
1.1.4.3. Polyacetylen
Polyacetylen được phát hiện trong nhân sâm vào những năm 1960. Polyacetylen
thường là các hydrocacbon mạch thẳng có 17-18 cacbon và những nhóm liên kết.

Đó là đặc điểm của đa số hợp chất có chứa một đầu là nhóm 3-hydroxyl (hoặc 3-oxo)
heptadeca-1-en-4,6-diyn, đầu cịn lại của các hợp chất là chuỗi C7H15 [11]. Bộ khung
cacbon của polyacetylen được thể hiện ở hình 1.3.

Hình 1.3. Bộ khung cacbon của polyacetylen
Hai polyacetylen trong củ TTB và nhân sâm Hàn Quốc đã được phân lập bằng việc
sử dụng dung mơi trích n-hexan sau đó sử dụng sắc ký lớp mỏng (Thin Layer
8


Chrotomagraphy – TLC) hệ dung môi n-hexan – etylacetat (19:1 và 10:1) để thu được
hai polyacetylen là panaxynol và panaxydol [12].
Ngồi ra, trong củ TTB, nhiều nghiên cứu cịn tìm thấy flavonoid, polysacarit,
protein, amino axit,... Các hợp chất này đều có hoạt tính sinh học cao như khả năng
kháng khuẩn, kháng oxy cũng như kháng viêm cao.
1.1.4.4. Một số thành phần khác
Quecertin và quecertin-3-O-sophoroside là hai hợp chất thuộc họ flavonoid cũng
như các loại polysacarit được phân lập từ củ TTB. Các hợp chất này được định tính và
định lượng bằng nhiều phương pháp phân tích hiện đại như sắc ký lỏng hiệu năng cao
ghép nối khối phổ (High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry –
HPLC/MS), sắc ký khí (Gas Chromatography – GC), TLC, quang phổ hấp thu tử
ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible spectroscopy – UV-Vis [2].
Củ TTB chứa nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, ginsenoside
Rb1 và Rg3 là hai hoạt chất có khả năng kháng tiểu đường và ung thư nên trong
luận văn, sử dụng viscozyme L để hỗ trợ q trình trích ly hai ginsenoside này.
Việc phân lập, xác định cấu trúc, thành phần của các chất có chứa trong củ TTB
bằng nhiều phương pháp khác nhau đã được công bố khá nhiều trên thế giới, trong đó
có
Việt Nam. Ngồi ra, các nghiên cứu còn mở rộng theo hướng thử nghiệm các hoạt tính
sinh học của cao trích, dịch trích TTB.

1.2. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc
1.2.1. Ngoài nước
TTB là một trong những loại thảo dược mang đặc trưng của vùng Nam Á.
Vì vậy, các nghiên cứu hầu như tập trung ở khu vực này như Singapore, Hàn Quốc,
Nhật Bản, đặc biệt là Trung Quốc.
Năm 2003, nghiên cứu ở Singapore đã xây dựng được phương pháp phân tích
sáu loại saponin bao gồm notoginsenoside R1, ginsenosides Rg1, Re, Rb1, Rc, Rd
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, sử dụng metanol để xử lý mẫu. Phương
pháp cho độ nhạy cao, có giới hạn phát hiện 0,008-0,013 mg/mL, giới hạn định lượng
0,027-0,041 mg/mL [3].
9


Trong cùng năm, một nghiên cứu khác ở Trung Quốc cơng bố về hoạt tính chống
xơ gan do rượu gây ra của cao trích nước nóng từ củ TTB. Thử nghiệm được thực hiện
trên chuột. Kết quả cho thấy, với hàm lượng 50 mg/kg, cao trích thể hiện hoạt tính
lên đến 35,7% [13].
Năm 2008, bằng cách sử dụng phương pháp đếm số lượng tế bào, sự ức chế
tế bào ung thư lan rộng đã được thử nghiệm đối với bốn trích xuất từ thân, hoa, quả và
củ ở mức 0,05-1,0 mg/mL. Cao trích từ hoa có tác dụng mạnh hơn so với ba bộ phận
còn lại; ở mức 1,0 mg/mL có khả năng ức chế 93,1% sự tăng trưởng tế bào. Ảnh
hưởng của dung mơi trích ly đến chu trình tế bào và sự rụng chết tế bào ung thư
đại trực tràng (Human Colorectal Cancer cell lines – SW480) cũng được đánh giá để
so sánh, đối chiếu [14].
1.2.2. Trong nước
Năm 2016, bằng các phương pháp phân lập sắc ký và phân tích khối phổ,
cộng hưởng từ hạt nhân thu được năm hợp chất saponin bao gồm ginsenoside Rc, Rd,
Re, Rb1 và Rg1 từ phân đoạn giàu saponin của củ tam thất ở vùng Tây Bắc.
Từ phân đoạn saponin, phức hợp phytosome – saponin được tổng hợp với hiệu suất
88,76%. Đây là công bố đầu tiên trong nước về nghiên cứu điều chế phức phytosome –

saponin TTB [15].
Nghiên cứu về khả năng ngăn ngừa ung thư của phức hợp saponin – phospholipid.
Giá trị nồng độ ức chế 50% (The half maximal Inhibitory Concentration – IC50) của
phức hợp saponin – phospholipit đối với tế bào ung thư phổi (Human Lung Cancer cell
line – NCI-H460), ung thư vú (Human Breast Cancer cell lines – BT474) lần lượt là
28,47 và 53,18 mg/mL. IC50 của trích xuất saponin đối với NCI-H460 47,97 mg/mL
và BT474 86,24 mg/mL [16].
Các nghiên cứu về TTB tại Việt Nam rất ít, mặc dù đây là một trong các loại
thảo dược quý và chủ yếu do truyền miệng trong dân gian. Các tác dụng có lợi của
TTB có thể kể đến như ức chế phản ứng α-glucosidase hóa và khả năng gây độc tế bào
của nhiều loại ung thư khác nhau.

10