Xây dựng quy trình phát hiện staphylococcus aureus kháng methicilin (mrsa) và xác định yếu tố di truyền sccmec của mrsa trên thịt tươi sống bằng kỹ thuật multiplex realtime polymerase chain reaction

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƢƠNG XUÂN VÂN

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN
Staphylococcus aureus KHÁNG METHICILIN (MRSA)
VÀ XÁC ĐỊNH YẾU TỐ DI TRUYỀN
SCCmec CỦA MRSA TRÊN THỊT TƢƠI SỐNG
BẰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX REALTIME
POLYMERASE CHAIN REACTION
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2018


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA – ĐHQG HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS.Cao Hữu Nghĩa

Cán bộ chấm nhận xét 1: TS.Hoàng Mỹ Dung

Cán bộ chấm nhật xét 2: TS.Lƣơng Thị Mỹ Ngân

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG HCM
ngày 12 tháng 01 năm 2018
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1.

Chủ tịch: PGS.TS.Nguyễn Đức Lƣợng

2.

Thƣ ký: PGS.TS.Nguyễn Thúy Hƣơng

3.

Phản biện 1: TS.Hoàng Mỹ Dung

4.

Phản biện 2: TS.Lƣơng Thị Mỹ Nga

5.

Ủy viên: PGS.TS.Lê Phi Nga
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trƣởng khoa quản lý chuyên

ngành sau khi LV đã đƣợc sửa chữa (nếu có)
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: VƯƠNG XUÂN VÂN

MSHV: 13310321

Ngày, tháng, năm sinh: 22/08/1989

Nơi sinh: TP.Hồ Chí Minh

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học

Mã số : 60420201

I. TÊN ĐỀ TÀI:
Xây dựng quy trình phát hiện Staphylococcus aureus kháng methicilline (MRSA) và
xác định yếu tố di truyền SCCmec của MRSA trong thịt tươi sống bằng kỹ thuật Multiplex
Realtime Polymerase Chain Reaction.
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Xây dựng quy trình phát hiện MRSA và xác định yếu tố di truyền SCCmec tuýp IIV trên nền mẫu thịt tươi sống bằng kỹ thuật Multiplex Real-time PCR

-

Thẩm định quy trình đã xây dựng và so sánh với phương pháp nuôi cấy kết hợp với
phương pháp thử nghiệm kháng sinh đồ bằng đo đường kính vịng kháng khuẩn.

-

Ứng dụng quy trình đã xây dựng vào kiểm tra mẫu thịt tươi sống bán lẻ trên thị trường.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : (Ghi theo trong QĐ giao đề tài) 10/07/2017
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: (Ghi theo trong QĐ giao đề tài) 03/12/2017
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (Ghi rõ học hàm, học vị, họ, tên):
PGS.TS.BS.Cao Hữu Nghĩa
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

Tp. HCM, ngày 02 tháng 01 năm 2018
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên
và chữ ký)

TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
(Họ tên và chữ ký)

Ghi chú: Học viên phải đóng tờ nhiệm vụ này vào trang đầu tiên của tập thuyết minh LV


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:
PGS.TS.Cao Hữu Nghĩa đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ vào tạo điều kiện
cho tơi trong q trình thực hiện đề tài cũng nhƣ trong suốt thời gian công tác.
Qúy Thầy Cô – Trƣờng Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh đã giảng
dạy, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ cho tơi trong suốt q trình học tập.
ThS.Nguyễn Thị Nguyệt – Trƣởng Labo.Vi sinh thực phẩm Viện Pasteur
TP.HCM đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành các nghiên cứu trong
luận văn.

Các Cô, các Anh Chị Em đồng nghiệp trong Lab.Vi sinh Thực phẩm đã
luôn hỗ trợ và giúp đỡ tơi trong q trình nghiên cứu và làm việc.
Các đồng nghiệp trong Lab.HIV, Lab.Vi sinh bệnh phẩm, Trung tâm
Cúm Quốc gia Viện Pasteur TP.HCM đã giúp đỡ tôi hồn thành đề tài này.
Gia đình ln bên cạnh động viên, yêu thƣơng và là điểm tựa vững chắc cho
tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả.

i


TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
 Tiếng Việt
Kể từ khi S.aureus kháng methicillin đƣợc tìm thấy trong thực phẩm, sự quan
tâm về sự lan truyền của chúng trong thực phẩm ngày càng gia tăng. Nghiên cứu
này xây dựng phƣơng pháp phát hiện MRSA trên nền mẫu thịt tƣơi sống và xác
định yếu tố SCCmec I-IV của chúng bằng kỹ thuật Multiplex Realtime PCR hai giai
đoạn. Mẫu thịt tƣơi sống đƣợc tiền tăng sinh trong môi trƣờng Giolitti Cantoni
broth, tách chiết DNA vi khuẩn bằng phƣơng pháp đun sôi trong Triton X100. Phản
ứng Multiplex Realtime PCR1 sẽ phát hiện MRSA dựa trên hai gen nuc và mecA.
Phản ứng Multiplex Realtime PCR2 sẽ xác định yếu tố di truyền SCCmec dựa trên
ba gen SCCmec I, SCCmec II III, SCCmec I II IV. Kết quả thẩm định cho thấy
phƣơng pháp xây dựng có độ đặc hiệu tƣơng đƣơng với phƣơng pháp nuôi cấy và
đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn theo chuẩn mực CLSI; có giới hạn phát hiện là
100CFU/g và có tính ổn định cao. Ứng dụng phƣơng pháp để kiểm nghiệm 100 mẫu
thịt tƣơi sống bán lẻ trên thị trƣờng cho thấy tỷ lệ nhiễm MRSA là 26% (26/100
mẫu), trong đó mẫu nhiễm MRSA SCCmec tuýp IV là 9/26 mẫu, MRSA SCCmec
tuýp I phát hiện đƣợc 6/26 mẫu, MRSA SCCmec tuýp III nhiễm trong 2/26 mẫu,
khơng có mẫu nhiễm MRSA SCCmec tp II, còn lại 9/26 mẫu nhiễm MRSA mang
yếu tố SCCmec các tuýp khác.

 Tiếng Anh
Since Methicillin - resistance S.aureus (MRSA) was first found in food, there
has been attention that they can possibly spread in food. Our study developed a
method for MRSA detection in retal meat, and determining their SCCmec elements
type I to type IV by two-step Multiplex Realtime PCR technique. Sample was precultured in Giolitti Cantoni broth, then bacteria DNA was extracted by boiling with
Triton X100. MRSA was detected by Multiplex Realtime PCR1 reaction based on
two genes mecA and nuc. SCCmec elements of MRSA were determined by
Multiplex Realtime PCR2 reaction based on three genes - SCCmec I, SCCmec II III,

ii


SCCmec I II IV. Validation results showed that our method had the same
specification as culture method and disk diffusion according to CLSI standard;
detection limit was 100CFU/g and had a high stabillity. We applied this method for
analysing 100 samples of retail meat. Prevalence of MRSA contamination of retail
meat was 26% (26/100 samples). Among that, MRSA SCCmec type IV
contaminated on 9/26 samples; MRSA SCCmec type I, MRSA SCCmec type III
were found on 6/26 samples; and 9/26 samples contaminated by other SCCmec type
of MRSA. There were no samples contaminated by SCCmec type II.

iii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ
cơng trình nào khác.

Ký tên

Vƣơng Xuân Vân

iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ ............................................................................ ii
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... iv
MỤC LỤC ...................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................x
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ ..................................................................... xi
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................3
1.1 LƢỢC SỬ MRSA .................................................................................................3
1.2 Ý NGHĨA LÂM SÀNG CỦA MRSA ..................................................................4
1.2.1 MRSA có nguồn gốc từ bệnh viện (HA-MRSA) ...............................................4
1.2.2 MRSA có nguồn gốc từ cộng đồng (CA-MRSA) ..............................................5
1.2.3 MRSA trên động vật (LA-MRSA).....................................................................6
1.3 PHÂN LOẠI - ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ - KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CỦA MRSA ...................................................................................................6
1.3.1 Phân loại .............................................................................................................6
1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý .............................................................................6
1.3.3 Yếu tố độc lực ....................................................................................................8
1.3.4 Khả năng gây bệnh .............................................................................................9
1.4 CƠ CHẾ KHÁNG KHÁNG SINH HỌ BETA-LACTAM CỦA MRSA...........11
1.5 CÁC KỸ THUẬT PHÁT HIỆN MRSA VÀ XÁC ĐỊNH YẾU TỐ DI TRUYỀN

SCCmec .....................................................................................................................12
1.5.1 Nƣớc ngoài .......................................................................................................12
1.5.2 Trong nƣớc .......................................................................................................15
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...............................17
2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................................17

v


2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN THỰC HIỆN .......................................................17
2.3 THIẾT BỊ, SINH PHẨM, HĨA CHẤT, MƠI TRƢỜNG ..................................17
2.3.1 Thiết bị .............................................................................................................17
2.3.2 Sinh phẩm, hóa chất .........................................................................................18
2.3.3 Mơi trƣờng .......................................................................................................20
2.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................................21
2.4.1 Xây dựng kỹ thuật phát hiện MRSA và yếu tố SCCmec của MRSA trên thịt
tƣơi sống ....................................................................................................................21
2.4.2 Thẩm định quy trình đã xây dựng và so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy kết
hợp với phƣơng pháp thử nghiệm kháng sinh đồ bằng đo đƣờng kính vịng kháng
khuẩn .........................................................................................................................32
2.4.3 Ứng dụng phƣơng pháp trên mẫu thịt tƣơi sống bán lẻ trên thị trƣờng ...........35
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.............................................................36
3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG KỸ THUẬT PHÁT HIỆN MRSA VÀ YẾU TỐ DI
TRUYỀN SCCmec CỦA MRSA TRÊN THỊT TƢƠI SỐNG .................................36
3.1.1 Kết quả kiểm tra hiệu quả mồi và Taqman probe ............................................36
3.1.2 Kết quả tối ƣu hóa mồi và Taqman probe ........................................................41
3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐÃ XÂY DỰNG ...............................53
3.2.1 Độ đặc hiệu ......................................................................................................54
3.2.2 Độ nhạy – giới hạn phát hiện ...........................................................................59
3.2.3 Độ lặp lại – độ tái lặp .......................................................................................60

3.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP TRÊN MẪU THỊT BÁN LẺ TRÊN
THỊ TRƢỜNG ..........................................................................................................64
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...........................................................67
4.1 KẾT LUẬN .........................................................................................................67
4.2 KIẾN NGHỊ ........................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................69
PHỤ LỤC

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
S.aureus

Staphylococcus aureus

MRSA

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

MSSA

Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus

ISO

International Organization for Standardization

CLSI

Clinical and Laboratory Standard Institute

CFU

Colony Forming Unit

BP

Baird Parker

MH

Mueller Hinton

BHI

Brain Heart Infusion

SCCmec

Staphylococcal Catssette Chromosome mec

PCR

Polymerase Chain Reaction

PBP

Penicillin-binding protein

PBP2a

Penicillin-binding protein 2a

HA-MRSA

Hospital-Assositate MRSA

CA-MRSA

Community-Acquired MRSA

LA-MRSA

Livestock MRSA

CDC

Centers for Disease Control and Prevention

TSST-1

Toxin shock syndrome toxin -1

R

Resistant

S

Sensitive

vii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1: Các mồi và Taqman probe sử dụng trong nghiên cứu .............................18
Bảng 3.2: Các chủng S.aureus chuẩn kháng methicilline ........................................19
Bảng 3.3: Các chủng vi sinh vật chuẩn không phải MRSA .....................................19
Bảng 3.4: Kiểm tra hiệu quả của primer và Taqman probe trên từng đối tƣợng VSV
...................................................................................................................................23
Bảng 3.5: Thiết lập phản ứng Realtime PCR theo kit GoTaq Probe PCR ...............24
Bảng 3.6: Chu trình nhiệt của phản ứng Realtime PCR ...........................................24
Bảng 3.7: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 1 với tỷ lệ mồi mec và nuc là 9:9 ...25
Bảng 3.8: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 1 với tỷ lệ mồi mec và nuc là 9:8...25
Bảng 3.9: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 1 với tỷ lệ mồi mec và nuc là 9:10 .26
Bảng 3.10: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với tỷ lệ Taqman probe mec và
nuc là 2,5:2,5 .............................................................................................................26
Bảng 3.11: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với tỷ lệ Taqman probe mec và
nuc là 2,5:3,0 .............................................................................................................27
Bảng 3.12: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với tỷ lệ Taqman probe mec và
nuc là 2,5:2,0 .............................................................................................................27
Bảng 3.13: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 2 với tỷ lệ mồi SCC I: SCC II III:
SCC I II IV lần lƣợt là 900nM: 900Nm: 900nM ......................................................28
Bảng 3.14: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 2 với tỷ lệ mồi SCC I: SCC II III:
SCC I II IV lần lƣợt là 900nM: 800Nm: 700nM ......................................................29
Bảng 3.15: Phản ứng Multiplex Realtime- PCR 2 với tỷ lệ mồi SCC I: SCC II III:
SCC I II IV lần lƣợt là 900nM: 800Nm: 1000nM ....................................................29
Bảng 3.16: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 với tỷ lệ Taqman probe của SCC I:
SCC II III: SCC I II IV là 200Nm:200Nm:200nM ....................................................30

Bảng 3.17: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 với tỷ lệ Taqman probe của SCC I:
SCC II III: SCC I II IV là 200Nm:150Nm:100nM ....................................................31
Bảng 3.18: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 với tỷ lệ Taqman probe của SCC I:
SCC II III: SCC I II IV là 200Nm:100Nm:250nM ....................................................31

viii


Bảng 3.19: Thực nghiệm kiểm tra xác nhận độ lặp lại và độ tái lặp của phƣơng pháp
...................................................................................................................................33
Bảng 4.1: Kết quả thực nghiệm độ đặc hiệu - tính bao gồm của phƣơng pháp .......55
Bảng 4.2: Kết quả thực nghiệm độ đặc hiệu - tính loại trừ của phƣơng pháp ..........57
Bảng 4.3: Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp Multiplex Realtime PCR so với
phƣơng pháp nuôi cấy ...............................................................................................59
Bảng 4.4: Độ lặp lại đối với phản ứng Multiplex Realtime PCR1 ...........................60
Bảng 4.5: Độ lặp lại đối với phản ứng Multiplex Realtime PCR2 ...........................61
Bảng 4.6: Độ tái lặp đối với phản ứng Multiplex Realtime PCR1 ...........................62
Bảng 4.7: Độ tái lặp đối với phản ứng Multiplex Realtime PCR2 ...........................63
Bảng 4.8: Tỷ lệ nhiễm S.aureus và MRSA trên thịt tƣơi sống .................................64
Bảng 4.9: Tuýp SCCmec của MRSA trên mẫu thịt tƣơi sống bán lẻ .......................65

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1: Hiệu quả mồi và Taqman probe phát hiện gen nuc ..................................37
Hình 4.2: Hiệu quả mồi và Taqman probe phát hiện gen mecA...............................38
Hình 4.3: Hiệu quả mồi và Taqman probe phát hiện gen SCC I ..............................40
Hình 4.4: Hiệu quả mồi và Taqman probe phát hiện gen SCC II III .......................40
Hình 4.5: Hiệu quả mồi và Taqman probe phát hiện gen SCC I II IV .....................41

Hình 4.6: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ mồi mecA:nuc là
900(nM):900(nM) .....................................................................................................42
Hình 4.7: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ mồi mecA:nuc là
900(nM):800(nM) .....................................................................................................43
Hình 4.8: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ mồi mecA:nuc là
900(nM):1000(nM) ...................................................................................................44
Hình 4.9: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ Taqman probe
mecA:nuc là 250(nM):250(nM) ................................................................................45
Hình 4.10: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ Taqman probe
mecA:nuc là 250(nM):300(nM) ................................................................................46
Hình 4.11: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 1 với nồng độ Taqman probe
mecA:nuc là 250(nM):200(nM) ................................................................................46
Hình 4.12: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 .....................................................48
với nồng độ mồi SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 900(nM):900(nM):900(nM) .....48
Hình 4.13: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 .....................................................49
với nồng độ mồi SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 900(nM):800(nM):700(nM) .....49
Hình 4.14: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 .....................................................50
với nồng độ mồi SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 900(nM):800(nM):1000(nM) ...50
Hình 4.15: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 .....................................................51
với nồng độ Taq SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 200(nM):200(nM):200(nM) .....51
Hình 4.16: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 .....................................................52
với nồng độ Taq SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 200(nM):150(nM):100(nM) .....52

x


Hình 4.17: Phản ứng Multiplex Realtime PCR 2 với ...............................................53
nồng độ Taq SCC I: SCC II III: SCC I II IV là 200(nM):100(µM):250(nM) ...........53

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tổng quát quy trình kỹ thuật Multiplex Realtime PCR phát hiện
MRSA và yếu tố SCCmec trên thịt tƣơi sống ...........................................................21
Biểu đồ 4.1: So sánh tỷ lệ phát hiện S.aureus và MRSA giữa phƣơng pháp nuôi cấy
truyền thống và phƣơng pháp Multiplex Realtime PCR ...........................................64
Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ phát hiện các tuýp SCCmec của MRSA trên mẫu thịt tƣơi sống
...................................................................................................................................65

xi


MỞ ĐẦU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

Staphylococcus aureus là một trong những tác nhân hàng đầu gây nhiều bệnh
trên ngƣời nhƣ ngộ độc thực phẩm, viêm phổi, nhiễm trùng vết thƣơng và nhiễm
trùng bệnh viện [23]. Trƣớc khi có sự hiện diện của kháng sinh, các bệnh nhiễm
trùng do S.aureus có khả năng dẫn đến tử vong. Việc ra đời của penicillin đã cải
thiện đáng kể khả năng chữa trị thành công trong những ca bệnh nhiễm khuẩn
S.aureus, nhƣng chỉ trong một vài năm sử dụng, hiện tƣợng kháng kháng sinh đã
xuất hiện dựa trên nhiều cơ chế, trong đó có sự sản xuất beta-lactamases của vi
khuẩn. Methicillin đƣợc thiết kế để ức chế beta-lactamase, tuy nhiên chủng vi
khuẩn S.aureus kháng methicillin (MRSA) cũng đã đƣợc phát hiện sau khi
methicillin đƣợc đƣa vào điều trị một thời gian ngắn sau đó [18]. Hiện nay, chúng là
nguyên nhân của nhiều ca nhiễm trùng bệnh viện nghiêm trọng trên thế giới [19].
Kể từ khi MRSA đƣợc tìn thấy trong thực phẩm có nguồn gốc từ động vật và
thịt bán lẻ, sự quan tâm về việc xâm nhiễm loại vi khuẩn này từ ngƣời vào trong

chuỗi thực phẩm ngày càng gia tăng [23]. Bên cạnh đó, vật ni nhiễm MRSA cũng
là con đƣờng làm lây nhiễm vi khuẩn kháng thuốc vào động vật và ngƣời tiếp xúc
với vật ni và qua đó chúng có thể lan truyền trong cộng đồng qua chuỗi thực
phẩm [13].
Khả năng kháng methicillin của S.aureus do nhiều gen quy định, trong đó chủ
yếu là do sự hiện diện của gen mecA, nằm trong yếu tố di truyền SCCmec, mã hóa
cho protein PBP2a [8]. Xác định yếu tố di truyền SCCmec của MRSA cũng là một
yếu tố quan trọng trong dịch tễ học nằm phân biệt giữa các chủng MRSA cũng nhƣ
mối liên hệ giữa các nhóm MRSA với yếu tố độc lực của chúng [8].
Xuất phát từ nhu cầu kiểm nghiệm và đánh giá nguy cơ thực phẩm nhiễm
MRSA, nhiều phƣơng pháp đã đƣợc xây dựng và ứng dụng trong thực tế. Nhìn
chung, các phƣơng pháp này đều địi hỏi phải qua bƣớc nuôi cấy và phân lập
S.aureus trƣớc khi khảo sát tính kháng methicillin của chúng. Những phƣơng pháp
này đòi hỏi thời gian từ 3 đến 7 ngày để đi đến kết quả cuối cùng [23]. Việc ứng
dụng kỹ thuật Real-time PCR sẽ giảm thời gian phân tích xuống còn 18 giờ sau khi
tăng sinh mẫu bệnh phẩm trong môi trƣờng tăng sinh lỏng, hoặc nhỏ hơn 2 giờ
trong mẫu máu dƣơng tính [23]. Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu sử dụng kỹ

1


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

thuật Real-time PCR để phát hiện MRSA trong mẫu bệnh phẩm, rất ít các phƣơng
pháp ứng dụng phát hiện MRSA trên vật nuôi và thịt. Bên cạnh đó, phƣơng pháp
xác định yếu tố di truyền SCCmec của MRSA trên nền mẫu thịt tƣơi sống vẫn cịn
rất hạn chế.
Vì vậy, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện

Staphylococcus aureus kháng methicilline (MRSA) và xác định yếu tố di truyền
SCCmec trong thịt tươi sống bằng kỹ thuật Realtime Multiplex Polymerase Chain
Reaction” để góp phần phát triển một kỹ thuật nhanh để phát hiện MRSA đồng thời
với xác định yếu tố di truyền SCCmec của chúng trên nền mẫu thịt tƣơi sống với
mục tiêu nhƣ sau:
 Mục tiêu chung
Thiết kế và thẩm định quy trình phát hiện MRSA và xác định yếu tố di truyền
SCCmec tuýp I-IV trên nền mẫu thịt tƣơi sống bằng kỹ thuật Multiplex Real-time
PCR.
 Mục tiêu cụ thể
-

Xây dựng quy trình phát hiện MRSA và xác định yếu tố di truyền SCCmec
tuýp I-IV trên nền mẫu thịt tƣơi sống bằng kỹ thuật Multiplex Real-time
PCR

-

Thẩm định quy trình đã xây dựng và so sánh với phƣơng pháp nuôi cấy kết
hợp với phƣơng pháp thử nghiệm kháng sinh đồ bằng đo đƣờng kính vịng
kháng khuẩn.

-

Ứng dụng quy trình đã xây dựng vào kiểm tra mẫu thịt tƣơi sống bán lẻ trên
thị trƣờng.

2

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN
TÀI LIỆU


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

1.1 LƢỢC SỬ MRSA
Vi khuẩn kháng kháng sinh đã và đang vấn đề trong sức khỏe cộng đồng đƣợc
quan tâm toàn cầu. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), cùng với
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus là một trong ba tác
nhân đƣợc quan tâm hàng đầu trong vấn đề vi khuẩn kháng kháng sinh toàn cầu
[24]. Hệ quả của những ca bệnh nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh là gây khó khăn
cho quá trình điều trị, tăng thời gian cũng nhƣ chi phí điều trị và giảm khả năng
thành cơng trong điều trị.
S.aureus là một trong những nguyên nhân hàng đầu của các bệnh nhiễm khuẩn
ở các nƣớc đang phát triển và gây nhiều bệnh với hậu quả và mức độ khác nhau, từ
nhiễm trùng da nhẹ đến viêm phổi hoại tử gây tử vong. Vào những năm đầu thập
niên 1940, penicillin đã đƣợc đƣa vào điều trị các bệnh nhiễm trùng do S.aureus và
mang lại nhiều thành công trong điều trị. Nhƣng cũng kể từ thời gian này, việc vi
khuẩn kháng với kháng sinh beta-lactam đã bắt đầu xuất hiện và phát triển. Đây là
hệ quả của việc chuyển plasmid, mã hóa cho enzym penicillinase – enzym ức chế
khả năng hoạt động của penicillin, có khả năng cắt vịng beta-lactam và bất hoạt
phân tử kháng sinh. Những chủng vi khuẩn này đã sớm lan truyền không những
trong môi trƣờng bệnh viện mà cịn trong cộng đồng. Để đối phó với thực trạng
nhiễm khuẩn do S.aureus sinh beta-lactamase, methicillin (penicillin phổ hẹp bán
tổng hợp) đã đƣợc đƣa vào sử dụng. Tuy nhiên, chỉ khơng lâu sau đó, vào năm

1961, ca nhiễm S.aureus kháng methicillin đầu tiên đã đƣợc phát hiện.
Ban đầu, MRSA chỉ đƣợc tìm thấy ở bệnh viện, nhƣng vào những năm cuối
thập nhiên 1990, ca nhiễm MRSA có nguồn gốc từ cộng đồng (CA-MRSA) mang
độc tố Panton-Valentine leukocidin (PVL) đã xuất hiện. Chúng nhanh chóng lan
truyền trong cộng đồng và sau đó xâm nhập vào mơi trƣờng bệnh viện, thay thế cho
các ca bệnh điển hình do HA-MRSA (MRSA có nguồn gốc từ bệnh viện). Vì lý do
này, ngày nay, sự phân biệt giữa CA-MRSA và HA-MRSA là một thách thức với y
học hiện đại [8]. May mắn là các chủng CA-MRSA này còn nhạy cảm với các
kháng sinh không phải họ beta-lactam, trong khi hầu hết các ca nhiễm trùng do
MRSA đều là những chủng đa kháng thuốc, gây khó khăn trong điều trị. Sau đó,

3


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

các kháng sinh họ glycopeptide đƣợc sử dụng có thể kể đến vancomycin (từ thập
niên 1950) và teicoplanin, những kháng sinh này đƣợc sử dụng qua đƣờng tiêm và
phải đƣợc theo dõi chặt chẽ để tránh các tác dụng phụ. Một lựa chọn mới trong điều
trị bệnh nhiễm trùng do MRSA hiện nay là linezolid (thập niên 1970) và
daptomycin (thập niên 1980) nhƣng các loại kháng sinh này cũng mang lại nhiều
tác dụng không mong muốn trong điều trị.
Không chỉ là tác nhân gây bệnh cho ngƣời, MRSA cũng là một thực trạng
đƣợc quan tâm trong thú y và chăn nuôi. Chúng xuất hiện trong nhiều chi động vật
nhƣ chó, mèo, thỏ, ngựa, dê, heo, gà,… Việc phát hiện MRSA trong nhiều loài
động vật và trong thực phẩm đã dẫn tới sự quan tâm về vai trò của động vật trong
dịch tễ học về sự lây nhiễm của MRSA trong cộng đồng. [26]
Thực phẩm có nguồn gốc từ động vật cũng không phải là ngoại lệ. Đã có bằng

chứng về việc vi khuẩn kháng kháng sinh có nguồn gốc từ động vật xâm nhập vào
chuỗi thực phẩm. Cụ thể, MRSA đã đƣợc tìm thấy trong 12% sản phẩm có nguồn
gốc từ động vật – bị, heo, cừu.. ở Đan Mạch, và trong các sản phẩm từ sữa ở Ý.
Những ngƣời tham gia vào quá trình sản xuất, phân phối, chế biến các loại thực
phẩm này trƣớc khi chúng đƣợc nấu chín hoặc sau khi chƣa đƣợc xử lý phù hợp sẽ
đối mặt với nguy cơ nhiễm các vi khuẩn kháng thuốc. [24]
Tóm lại, kể từ khi MRSA đƣợc phát hiện lần đầu tiên, chúng đã thành một vấn
đề đƣợc quan tâm trên tồn cầu, dóng lên hồi chuông cảnh báo về thực trạng kháng
kháng sinh của vi khuẩn. Với khả năng lây nhiễm cao, từ trong môi trƣờng bệnh
viện, trong cộng đồng, trong chăn nuôi, thú y và trong cả chuỗi thực phẩm, MRSA
vẫn tiếp tục đƣợc nghiên cứu và khảo sát, mang lại cho chúng ta một bức tranh tồn
diện về MRSA, từ đó có thể có các biện pháp phịng ngừa thích hợp để cải thiện
tình trạng lây nhiễm MRSA trong cộng đồng và giảm thiểu bệnh do tác nhân
MRSA.
1.2 Ý NGHĨA LÂM SÀNG CỦA MRSA
1.2.1 MRSA có nguồn gốc từ bệnh viện (HA-MRSA)
Kể từ khi ca nhiễm MRSA đầu tiên xuất hiện, MRSA đã trở nên phổ biến
trong môi trƣờng bệnh viện, là nguyên nhân gây nhiễm trùng huyết, viêm phổi,

4


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

nhiễm trùng phẫu thuật và các nhiễm trùng bệnh viện khác. Nhiễm trùng bệnh viện
do MRSA gây gánh nặng không những cho bệnh nhân mà cịn cho hệ thống y tế,
bởi vì chúng làm tăng nguy cơ tử vong và tăng chi phí điều trị. Các số liệu báo cáo
của Trung tâm Kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh (CDC) cho thấy rằng hầu hết

60% ca nhiễm S.aureus bệnh viện tại Mỹ là do MRSA. Trong cuộc khảo sát toàn
quốc về nhiễm trùng máu, các con số cho thấy rằng S.aureus là tác nhân phổ biến
thứ hai gây nhiễm trùng máu, trong đó tỷ lệ nhiễm trùng máu do MRSA tăng từ
22% từ năm 1995 lên 57% vào năm 2001. Đặc biệt, các bài báo cáo chỉ ra răng
trong vòng khoảng 10 năm, các chủng MRSA đã vƣợt qua và thay thế các chủng
S.aureus nhạy cảm với methicilline (MSSA) để trở thành tác nhân hàng đầu gây
bệnh nhiễm trùng tụ cầu ngày càng trở nên phổ biến hơn. [12]
1.2.2 MRSA có nguồn gốc từ cộng đồng (CA-MRSA)
Trong một vài thập kỷ, các chủng MRSA đã xuất hiện trong cộng đồng, lây
nhiễm trong các bệnh nhân khơng có yếu tố nguy cơ liên quan đến các chủng HAMRSA, ví dụ nhƣ có chƣa có tiền sử nhập viện, khơng bị bệnh mãn tính, nhiễm
HIV, lọc thận hoặc tiêm thuốc qua đƣờng tĩnh mạch. Mặc dù các chủng CA-MRSA
là nguyên nhân chủ yếu của các bệnh áp xe da, hoại tử da, sốc nhiễm trùng, viêm
phổi có thể dẫn đến tử vong. Tuy nhiên, các chủng CA-MRSA thƣờng chỉ kháng
với các kháng sinh họ beta-lactam và nhạy cảm với các kháng sinh khác, chúng hầu
hết mang yếu tố di truyền mec (SCCmec) tuýp IV, V hay VII. Các chủng này có sự
kết hợp của nhiều yếu tố độc lực và có tính di truyền khác với HA-MRSA. Các nhà
khoa học cho rằng các chủng CA-MRSA xuất phát từ nền tảng di truyền khác nhau
hơn là việc có từ một nguồn gốc và càng có nhiều chủng S.aureus có khả năng trở
thành CA-MRSA. [12]
Ban đầu, các chủng CA-MRSA đƣợc phân lập từ các ca nhiễm trùng trong
cộng đồng và đƣợc phát hiện có kiểu hình và kiểu gen khác biệt so với các chủng
HA-MRSA. Tuy nhiên, sự khác biệt giữa HA-MRSA và CA-MRSA đã khơng cịn
là vấn đề nữa bởi vì CA-MRSA đã có mặt tại nhiều bệnh viện tại Mỹ. Chúng đang
dần thay thế HA-MRSA trong các ca nhiễm trùng bệnh viên. Bởi vì CA-MRSA có
thể lây nhiễm qua ngƣời bệnh không tiếp xúc với các yếu tố nguy cơ liên quan đến

5


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

bệnh viện, nguy cơ lây nhiễm của chúng là đáng ngại hơn rất nhiều so với HAMRSA. Mặc dù, theo lý thuyết, các chủng CA-MRSA khơng thể sống sót trong mơi
trƣờng bệnh viện bởi vì chúng cịn nhạy cảm với các kháng sinh khơng phải họ
beta-lactam, tuy nhiên CA-MRSA hồn tồn có khả năng phát triển thành các chủng
vi khuẩn kháng với nhiều loại kháng sinh. [12]
1.2.3 MRSA trên động vật (LA-MRSA)
Có lẽ khơng là điều ngạc nhiên khi MRSA xuất hiện và đã trở nên phổ biến
trong nhiều loài động vật dƣới nhiều con đƣờng lây nhiễm. Sự tiếp xúc giữa ngƣời
và nhiều loài động vật tạo nên khả năng phơi nhiễm vi khuẩn kháng thuốc giữa
động vật và con ngƣời. Hơn nữa, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi cũng là
một tác nhân giúp hình thành và lây nhiễm vi khuẩn kháng thuốc [26]. Nhiều báo
cáo dịch tễ trong một số nƣớc ở Châu Âu cho thấy rằng tỷ lệ lớn các chủng MRSA
ở động vật là MLST tuýp ST398 ở ngƣời tiếp xúc với lợn. Chủng MRSA này cịn
đƣợc tìm thấy ở nhiều đàn lợn tại Mỹ [12].
1.3 PHÂN LOẠI - ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH LÝ - KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CỦA MRSA
Để hiểu hơn về cơ chế làm tổ và lây nhiễm phức tạp của MRSA hiện nay,
chúng ta phải có cái nhìn tổng quan về đặc điểm hình thái, di truyền, cấu trúc bề
mặt, cơ chế sinh tổng hợp, và tác nhân gây bệnh của S.aureus.
1.3.1 Phân loại
Staphylococcus aureus thuộc [7]:
Giới: Prokaryote
Ngành: Firmicute
Lớp: Firmibacteria
Họ: Micrococceae
Giống: Staphylococcus
1.3.2 Đặc điểm hình thái và sinh lý
 Hình dạng

S.aureus là cầu khuẩn gram dƣơng, khơng di động, khơng sinh nha bào, có
đƣờng kính trung bình khoảng 1µm, và tụ lại thành cụm nhƣ dạng chùm nho khi

6


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

quan sát dƣới kính hiển vi. Sự hình thành chùm thƣờng xảy ra trong quá trình vi
khuẩn phát triển trên mơi trƣờng đặc, do kết quả của sự phân chia tế bào quá nhiều.
 Nuôi cấy
Khi phát triển trên mơi trƣờng thạch máu, staphylococci hình thành khuẩn lạc
trịn, bờ đều, kích thƣớc từ 1-2 mm, thƣờng có màu vàng và có thể bao quanh bởi
vịng tán huyết β-hemolysis.
Trên môi trƣờng không chọn lọc nhƣ Tryptic soy agar (TSA), khuẩn lạc hình
thành có màu kem đến màu hồng sáng.
Trên môi trƣờng Baird Parker (BP), khuẩn lạc đặc trƣng của S.aureus có màu
đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5mm, quanh khuẩn lạc có vịng sáng rộng 25mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lịng đỏ
trứng của lethinase). [7]
Trên mơi trƣờng MSA (Manitol salt agar) hay cịn gọi là mơi trƣờng
Chapman, S.aureus cho khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm
và làm vàng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc (do khả năng lên men đƣờng
manitol) [7]
 Điều kiện tăng trưởng và phân bổ
So với pneumococci và streptococci, staphylococci có khả năng chống chịu
cao hơn với các tác nhân hóa học và vật lý. Chúng có thể chống lại q trình làm
khơ, chịu đƣợc nồng độ NaCl 10%, và sống sót, thậm chí sinh sơi ở khoảng nhiệt độ
rộng từ 100C đến 450C. Chúng có thể phát triển ở điều kiện hiếu khí hay kỵ khí.

[27] [7] Chính vì vậy, S.aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu phân lập từ da, màng
nhày, tóc và mũi của ngƣời và động vật máu nóng. Chúng có thể có mặt trong
khơng khí, bụi và trong nƣớc vì khả năng sống tốt bên ngồi kí chủ.
Có 10-50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S.aureus. Tuy nhiên, khả
năng lây nhiễm và gây bệnh của S.aureus cũng rất lớn do chúng phân bổ ở khắp nơi
và có khả năng sinh độc tố.
 Cấu trúc tế bào
Cấu trúc tế bào của S.aureus khá phức tạp, đa số các chủng có lớp vỏ
polysacharide. Màng tế bào của S.aureus có cấu tạo tƣơng tự nhƣ streptococcus

7


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

nhóm A, có sự hiện diện của một thành phần protein đóng vai trị kháng nguyên
carbohydrate, phức hợp protein và mucopeptide. Đối với S.aureus, kháng nguyên
đƣợc đề cập ở trên là teichoic acid - một polymer của N-acetylglucosamine và
polyribitol phosphate. Kháng thể của teichoic acid có thể đƣợc phát hiện ở huyết
tƣơng của ngƣời khỏe mạnh, và đối với ngƣời bệnh nhiễm trùng S.aureus nặng thì
hàm lƣợng kháng thể sẽ tăng cao. Phức hợp protein của màng tế bào bao gồm
protein A có khả năng gắn với IgG từ nhiều loài khác nhau, bao gồm cả con ngƣời.
Protein A có thể chống phân bào, nhƣng vai trò gây bệnh của chúng chƣa đƣợc hiểu
rõ. Mucopeptide có trong màng tế bào S.aureus có cấu trúc nhƣ mucopeptide của
nhiều loài vi khuẩn gram dƣơng khác.
1.3.3 Yếu tố độc lực
Hầu hết các chủng S.aureus sản xuất ra nhiều sản phẩm ngoại bào, bao gồm cả
enzyme và độc tố là nguyên nhân của khả năng tạo ra các lỗ hổng, phá hoại và làm

nhiễm trùng cục bộ. Enzyme coagulase tạo huyết khối, hình thành mạng lƣới fibrin
gây nên tình trạng áp xe. Staphylococci cịn có thể sản xuất lipase, protease,
hyaluronidase, và DNAse có khả năng phá hủy mơ. Một loại enzyme quan trọng
khác là penicillinase. Bởi vì penicillinase khơng có khả năng gây bệnh, những
chủng staphylococci sản xuất enzyme này thƣờng không nguy hiểm bằng các chủng
không sinh penicillinase. Tuy nhiên, enzyme này rất quan trọng trong lâm sàng và
dịch tễ học bởi vì nó có khả năng thủy phân vòng beta-lactam của penicillin và bất
hoạt phân tử này. Sự sản xuất enzyme penicillinase đƣợc kiểm soát bởi plasmid, hay
episome, nằm ngoài phân tử DNA và đƣợc sao chép trong suốt q trình phân chia
tế bào. Khơng giống các tác nhân R của trực khuẩn gram âm, plasmid khống chế
q trình sản xuất penicillinase khơng thƣờng dẫn đến việc đa kháng kháng sinh của
vi khuẩn.
Khả năng gây bệnh và độc lực của S.aureus còn liên quan đến khả năng sản
xuất độc tố bao gồm enterotoxin serotype A đến Q (SEA-SEQ), độc tố gây hội
chứng sốc TSST-1, độc tố cytolytic (alpha và beta hemolysin), độc tố exfoliative,
Panton-Valentine leukocidin (PVL), protein A.

8


LUẬN VĂN THẠC SĨ

VƢƠNG XUÂN VÂN

Độc tố enterotoxin và TSST-1 gây hội chứng sốc độc tố và các bệnh liên quan.
Chủng CA-MRSA phân lập đƣợc gần đây cho thấy bằng chứng của việc gia tăng
độc lực trong các ca sốc độc tố và hoại tử mô mềm, trầm trọng hơn là một số ca dẫn
đến tử vong. Tuy nhiên, TSST-1 có thể đƣợc sản xuất bởi HA-MRSA cũng nhƣ các
chủng S.aureus nhạy cảm với methicilline và vị vậy việc sản xuất TSST-1 không
đƣợc coi là dấu hiệu của việc nhiễm trùng CA-MRSA.

Một yếu tố độc lực quan trọng khác của S.aureus là Panton-Valentine
leukocidin (PVL). PVL phá hoại màng tế bào của vật chủ bởi sự phối hợp hoạt động
của hai protein LukS và LukF gây hoạt tử mô. Ban đầu, PVL đƣợc cho là đã đóng
một vai trị quan trọng trong việc lây nhiễm CA-MRSA vì các nghiên cứu cho thấy
rằng hầu hết các chủng CA-MRSA có khả năng sinh độc tố PVL. Tuy nhiên, một số
nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng PVL khơng đóng vai trị lớn trong độc lực
cũng nhƣ khả năng lây nhiễm của CA-MRSA. Thực tế, yếu tố độc lực của CAMRSA là do sự hiện diện của modulin tan trong phenol có khả năng phân giải bạch
cầu và làm suy yếu phản ứng của tế bào vật chủ. Loại protein này có mặt trong các
chủng USA 300 và USA 400 đều thuộc nhóm CA-MRSA. Các chủng CA-MRSA
PVL dƣơng tính đã khá phổ biến trên thế giới, và các nhà khoa học đã đặc biệt cảnh
báo một số chủng PVL dƣơng tính nhƣ ST 5 có khả năng gây nhiễm trùng nghiêm
trọng thậm chí dẫn đến tử vong [12].
1.3.4 Khả năng gây bệnh
S.aureus gây ra nhiều bệnh nhiễm trùng, tạo mủ và gây độc ở ngƣời. Một số
bệnh từ nhẹ đến nghiêm trọng do S.aureus có thể kể đến là nhiễm trùng da, viêm
phổi, viêm tĩnh mạch, viêm màng não, nhiễm trùng tiểu,…S.aureus cũng là nguyên
nhân chủ yếu của việc nhiễm trùng vết mổ và nhiễm trùng bệnh viện. Ngồi ra,
S.aureus cịn gây ngộ độc thực phẩm do tạo độc tố ruột enterotoxin trong thực phẩm
và gây hội chứng shock độc tố do tạo ra siêu kháng nguyên trong máu. [7]
 Nhiễm khuẩn huyết
S.aureus là một trong những tác nhân thƣờng gây nhiễm khuẩn huyết vì chúng
gây nhiều loại nhiễm khuẩn, đặc biệt là nhiễm khuẩn ngoài da, tạo điều kiện cho vi

9