Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi (citrus maxima)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

NGUYỄN QCH NHẬT HỒNG

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
VÀ KHÁNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẠT BƢỞI
(Citrus maxima)

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số: 60 54 01 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 7 năm 2016.


ii

Cơng trình đƣợc hồn thành tại: Trƣờng Đại học Bách Khoa – ĐHQG-HCM
Cán bộ hƣớng dẫn khoa học : TS. Trần Thị Ngọc Yên – TS. Nguyễn Thị Lan Phi
Cán bộ chấm nhận xét 1 : TS. Phan Ngọc Hòa
Cán bộ chấm nhận xét 2 : TS. Nguyễn Hoài Hƣơng
Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại Trƣờng Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp. HCM
ngày 12 tháng 07 năm 2016
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
1. PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu
2. TS. Nguyễn Hoài Hƣơng
3. TS. Phan Ngọc Hòa
4. TS. Trần Thị Thu Trà
5. TS. Tôn Nữ Minh Nguyệt

Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận Văn và Trƣởng Khoa quản lý
chuyên ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có).
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


iii

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Nguyễn Quách Nhật Hoàng

MSHV: 7140462

Ngày, tháng, năm sinh: 08.11.1988

Nơi sinh: Tây Ninh

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm

Mã số : 60 54 01 01

I. TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng oxy hóa của dịch
chiết từ hạt bƣởi (Citrus maxima)

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
+ Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật (vi khuẩn và nấm mốc) của dịch chiết
hạt bƣởi trích li bằng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn và chiết Soxhlet với dung môi
ethyl acetate theo hai phƣơng pháp đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn và xác định
nồng độ ức chế tối thiểu (MIC).
+ Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của hai dịch chiết hạt bƣởi kể trên bằng
phƣơng pháp DPPH.
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 11/01/2016
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 17/06/2016
V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN :

- TS. Trần Thị Ngọc Yên
- TS. Nguyễn Thị Lan Phi

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . năm 2016
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO

TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC


iv

LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô hƣớng dẫn của tôi là
TS. Trần Thị Ngọc Yên và TS. Nguyễn Thị Lan Phi. Các cô là ngƣời đã theo sát
hƣớng dẫn và giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm,
trƣờng Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giảng dạy, truyền

đạt kiến thức và kỹ năng trong suốt quá trình học tập.
Đồng hành trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài, tôi xin gửi lời
cảm ơn đến chị Lan Chi, các em Nam Hải, Hữu Thành và các bạn đồng học lớp Cao
học Cơng nghệ thực phẩm khóa 2014.
Cuối cùng, con xin bày tỏ lịng kính u và biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ và gia
đình đã đồng hành cùng con trong suốt quá trình học tập.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2016.
Học viên

Nguyễn Quách Nhật Hoàng


v

TÓM TẮT
Đề tài đã sử dụng dịch chiết hạt bƣởi (Citrus maxima) có hoạt chất limonin
đƣợc trích li bằng CO2 siêu tới hạn và chiết Soxhlet với dung môi ethyl acetate từ
hạt bƣởi Thanh Trà (Thừa Thiên Huế) để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa và
kháng vi sinh vật. Dịch chiết hạt bƣởi đƣợc trích li bằng CO2 siêu tới hạn và ethyl
actetate đều có hoạt tính kháng oxy hóa theo phƣơng pháp DPPH với giá trị IC50 lần
lƣợt là 45,34 và 7,55 mg/mL.
Đề tài đã khảo sát khả năng kháng vi sinh vật của dịch chiết hạt bƣởi đối với
6 chủng vi sinh vật gây hƣ hỏng và ngộ độc thực phẩm gồm có: Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Fusarium
solani và Aspergillus flavus.
Kết quả cho thấy dịch chiết hạt bƣởi đƣợc trích li bằng CO2 siêu tới hạn có
khả năng kháng các chủng vi sinh vật nghiên cứu, ngoại trừ Aspergillus flavus.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL và 160
mg/mL tƣơng ứng với các chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus,
Salmonella typhi và Pseudomonas aeruginosa.

Dịch chiết hạt bƣởi đƣợc trích li bằng ethyl acetate có khả năng kháng các
chủng Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas
aeruginosa. MIC đối với Staphylococcus aureus là 128 mg/mL và > 192 mg/mL
đối với các chủng Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa.
Kết quả khảo sát cho thấy dịch chiết hạt bƣởi bằng CO2 siêu tới hạn có hoạt
tính cao hơn 1,3 lần so với dịch chiết hạt bƣởi bằng ethyl acetate đối với
Staphylococcus aureus.


vi

ABSTRACT

In this study, the antioxidant and antimicrobial activities of the supercritical
carbon dioxide extract and the Soxhlet extract with ethyl acetate obtaining from
Thanh Tra pomelo seed were investigated. The IC50 values resulted from DPPH
assay were found to be 45.34 mg/mL for supercritical carbon dioxide extract and
7.55 mg/mL for ethyl acetate extract.
The study has also examined the antimicrobial activity of pomelo seed
extract extracts against the six food pathogenic microorganisms: Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus
flavus and Fusarium solani.
The supercritical carbon dioxide pomelo extract showed the strong effect
against S. aureus, B. cereus, S. typhi, P. aeruginosa and F. solani. The Minimum
Inhibitory Concentration (MIC) values were 96 mg/mL, 144 mg/mL, 160 mg/mL
and 160 mg/mL for S. aureus, B. cereus, S. typhi and P. aeruginosa, respectively.
The ethyl acetate extract collected by using Soxhlet equipment showed the
effect against S. aureus, B. cereus, S. typhi and P. aeruginosa . The MIC of this
extract was 128 mg/mL for S. aureus and more than 192 mg/mL for B. cereus, S.
typhi and P. aeruginosa.

The results showed that the antibacterial activity on S. aureus of the
supercritical carbon dioxide pomelo seed extract was higher (1.3 times) compared
to that of the ethyl acetate pomelo seed extract.


vii

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu đƣợc trình bày trong phần kết quả của luận văn này do
bản thân tôi thực hiện, không sao chép của bất kỳ ngƣời nào khác.
Nguyễn Quách Nhật Hoàng


1

MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................ 3

MỞ ĐẦU .....................................................................................................................4
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................................5
1.1 Giới thiệu về hạt bƣởi ................................................................................................... 5
1.2 Một số phƣơng pháp tách chiết ................................................................................... 8
1.2.1 Trích li bằng Soxhlet ...................................................................................8
1.2.2 Trích li bằng CO2 siêu tới hạn ....................................................................9
1.2.3 Trích li có sự hỗ trợ của vi sóng ...............................................................10
1.2.4 Trích li có sự hỗ trợ của sóng siêu âm .....................................................11
1.3. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ........................................ 12
1.3.1. Một số chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh thường gặp .............................12
1.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật .................................17
1.4. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa ............................................ 18

1.4.1 Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl radical) ...........................18
1.4.2 Phương pháp ABTS ..................................................................................19
1.4.3 Phương pháp ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) ................19
1.4.4 Phương pháp TRAP (Total Radical – Trapping Antioxidant Potential) 20
1.4.5 Phương pháp FRAP (Ferric Reducing – Antioxidant Power) ................20
1.4.6 Phương pháp Reducing power .................................................................20
1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc .............................................................. 21
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................23
2.1. Vật liệu ........................................................................................................................ 23
2.1.1 Nguyên liệu ...............................................................................................23
2.1.2 Chủng vi sinh vật ......................................................................................23
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và mơi trường thử nghiệm ...........................23
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu .......................................................................................... 26
2.2.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn........26
2.2.2. Khảo sát quy trình tách chiết Soxhlet sử dụng dung môi ethyl acetate ...27


2

2.2.3. Phân tích hàm lượng limonin bằng HPLC ..............................................27
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật .................................28
2.2.4.1 Phương pháp đo đường kính vịng kháng khuẩn ...............................28
2.2.4.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ....................29
2.2.5 Phương pháp DPPH xác định hoạt tính kháng oxy hóa ..........................30
2.3. Xử lý số liệu ............................................................................................................... 30
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..............................................................31
3.1. Quy trình tách chiết dịch chiết hạt ........................................................................... 31
3.1.1. Khảo sát quy trình tách chiết bằng phương pháp CO2 siêu tới hạn........31
3.1.2. Khảo sát quy trình chiết Soxhlet sử dụng dung mơi ethyl acetate ...........34
3.1.3 Chuẩn bị mẫu dịch chiết thí nghiệm .........................................................36

3.2. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ....................................................................... 36
3.2.1 Kết quả đo đường kính vịng kháng vi sinh vật ........................................36
3.2.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) ....................................38
3.3. Hoạt tính kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp DPPH ..........................................39
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................. 41
4.1 Kết luận ........................................................................................................................ 41
4.2 Kiến nghị ...................................................................................................................... 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................43
PHỤ LỤC 1 ...............................................................................................................53
PHỤ LỤC 2 ...............................................................................................................55
PHỤ LỤC 3 ...............................................................................................................57
PHỤ LỤC 4 ...............................................................................................................59
PHỤ LỤC 5 ...............................................................................................................61
PHỤ LỤC 6 ...............................................................................................................63
PHỤ LỤC 7 ...............................................................................................................65
PHỤ LỤC 8 ...............................................................................................................66
PHỤ LỤC 9 ...............................................................................................................67


3

DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng ........................................................................... 24
Bảng 2.2. Thành phần môi trƣờng Tryptone Soya Broth (TSB) .................... 25
Bảng 2.3. Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Broth (PDB).................. 25
Bảng 2.4. Thành phần môi trƣờng Mueller – Hinton Agar (MHA) ............... 25
Bảng 2.5. Thành phần môi trƣờng Potato Dextrose Agar (PDA) .................. 25
Bảng 3.1. Nồng độ limonin theo nhiệt độ trích li ........................................... 31
Bảng 3.2. Nồng độ limonin theo lƣợng đồng dung môi ................................. 32
Bảng 3.3. Nồng độ limonin theo áp suất ........................................................ 32

Bảng 3.4. Nồng độ limonin theo thời gian ..................................................... 33
Bảng 3.5. Nồng độ limonin theo thời gian ..................................................... 34
Bảng 3.6. Nồng độ limonin theo tỷ lệ nguyên liệu:dung môi ........................ 35
Bảng 3.7. Kết quả đo đƣờng kính vịng kháng khuẩn .................................... 36
Bảng 3.8. Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của DC1 và DC2 ........................ 39
Bảng 3.9. Giá trị IC50 của dịch chiết hạt bƣởi ................................................ 40


4

MỞ ĐẦU
Quả bƣởi là một loại trái cây rất đƣợc ƣa chuộng, nhiều vitamin và khoáng
chất. Theo y học cổ truyền, mỗi bộ phận của quả bƣởi đều có tác dụng riêng, trong
đó có hạt bƣởi. Hạt bƣởi vị đắng, tính ấm, có tác dụng chữa viêm lt dạ dày, hành
tá tràng. Tuy nhiên, trong quy trình sản xuất các sản phẩm, hạt bƣởi thƣờng đƣợc
loại bỏ. Mặt khác, ở nƣớc ta, nhu cầu về các chất có hoạt tính kháng oxy hóa và
kháng vi sinh vật ngày càng cao, trong khi đó đến thời điểm này có rất ít cơng trình
nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật của dịch chiết từ hạt bƣởi. Do đó, để tận
dụng nguồn phế liệu, tăng giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cho các sản phẩm từ quả
bƣởi, giảm ô nhiễm môi trƣờng, đồng thời, tìm hiểu về khả năng kháng khuẩn và
kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bƣởi, tạo tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn,
chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật và
kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt bưởi (Citrus maxima)”.


5

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về hạt bƣởi
Ngày nay, hầu hết các cây thuộc chi Citrus đƣợc trồng rộng rãi ở các vùng

nhiệt đới ở Bắc bán cầu và Nam bán cầu [1].
Quả bƣởi có tên khoa học là Citrus maxima (Burm) Merril hay Citrus
grandis Osbeck, thuộc họ Cam Rutaceae. Bƣởi là loại cây to cao 10 – 13 m, vỏ thân
màu vàng nhạt, đôi khi ở kẽ nứt thân chảy ra một thứ gơm nhựa. Cành có gai dài,
nhọn. Lá hình trứng, dài 11 – 12cm, rộng 4,5 – 5,5 cm, hai lá đầu tù, nguyên, dai,
cuống có dìa cánh to. Hoa đều, to, mọc thành chùm 6 – 10 hoa, rất thơm [2].
Có vài chục giống ở khắp đất nƣớc và có những giống bƣởi ngon nổi tiếng.
Miền Nam có bƣởi ổi, bƣởi Biên Hịa, bƣởi Năm Roi; bƣởi Thanh Trà ở Huế; miền
Bắc có bƣởi Phúc Trạch (Hà Tĩnh), bƣởi Đoan Hùng, bƣởi đỏ Mê Linh, bƣởi
Diễn...[3]
Hầu hết các bộ phận của cây bƣởi đều đƣợc sử dụng [2] nhƣ:
+ Lá bƣởi tƣơi thƣờng đƣợc dùng nấu với nhiều lá thơm khác để xông chữa
cảm cúm, nhức đầu, nhức đầu.
+ Vỏ quả bƣởi chữa ăn uống khó tiêu, đau bụng, ho.
+ Vỏ hạt bƣởi có thể dùng lấy pectin làm thuốc cầm máu.
+ Dịch ép múi bƣởi làm thuốc chữa tiêu khát, thiếu vitamin C, làm nguyên
liệu chế acid citric thiên nhiên.
+ Nƣớc hoa bƣởi thƣờng bán ở các hiệu làm bánh đƣợc cất từ hoa bƣởi phối
hợp với nhiều vị thuốc có vị thơm khác nhƣ hồi, quế... dùng để tạo hƣơng cho thực
phẩm.
Trong các bộ phận của cây bƣởi có chứa một số hợp chất nhƣ:
+ Alkaloids: 5-hydroxyacronycine, acriginine A, atalafoline, baiyumine A
&B, buntanine, buntanmine, grandisine I & II, pumiline, honyumine, natsucrin,
prenyl citpressine, citropone A & B, glycocitrine I có trong rễ và vỏ cây bƣởi.
Trong hoa bƣởi cịn có chứa caffeine [4, 5, 6, 7, 8, 9].


6

+ Amino acids: Alanine, asparigine, aspartic acid, coline, glutamic acid,

glycine và proline có trong lá bƣởi [10, 11].
+ Carbohydrates: Phytol, synephrine, methyl antralinate, fructose, glucose
và pectin có trong lá, vỏ và hoa bƣởi [12, 13, 14, 15].
+ Carotenoids: Carotene và roseoside có trong vỏ bƣởi [16, 17].
+Coumarins: 5 – geranoxy – 7 – methoxy – coumarin, aurapte, auraptene,
bergamottin có trong vỏ và 5-methoxy seselin, 5-methyltodannol, 6-hydroxy
methylherniarin có trong vỏ thân và vỏ rễ cây bƣởi [8, 18, 19, 20].
+ Flavonoids:

acacetin, rutin, tangeretin, cosmosiin, diosmetin, diosmin,

eriocitrin, hespeidin, naringin [21, 22, 23].
+ Monoterpenes: α-pinene, α-terpineol, anethole, β-pinene, camphene,
camphor, citral, citronellal, citroonellol, farnesol, geraniol, myrcene, neral,
terpinene [24, 25, 26].
+ Sesquiterpenes: α-bisabolol, α-cadinene, α-copaene, elemol [27, 28, 29].
+ Steroids: β-sitosterol, campesterol, daucosterol, stigmasterol [30, 31].
+ Ngồi ra, cịn có một số thành phần khác nhƣ: α - tocopherol, ascorbic
acid, chlorophylls, decyl acetate, malonic acid, fumaric acid, succinic acid và citric
acid [11]
Ngồi ra, cịn có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất từ các
bộ phận khác nhau của cây bƣởi nhƣ kháng oxy hóa [32] , giảm đau và kháng viêm
[33, 34] , ổn định đƣờng huyết [35, 36], chống trầm cảm [37], giảm sự phát triển
của khối u [38], bảo vệ gan [39, 40], kháng khuẩn [41], ức chế hoạt động của
enzyme Angiotensin - 1- Converting [42].
Hạt bƣởi thƣờng có hình dẹt, hạt khá to và có gân ghồ ghề. Thai hạt thƣờng
là đơn phôi. Số múi trong một quả thƣờng từ 13 đến 18 múi [43].
Thành phần chính của hạt bƣởi bao gồm chất béo, protein, chất xơ, tro,
limonoids… Đồng thời, limonoids đƣợc tìm thấy nhiều nhất trong hạt bƣởi so với
các hạt Citrus khác.

7

Limonin đƣợc tìm thấy trong thành phần của các cây thuộc chi Citrus từ
những năm 1841 [44]. Limonin thuộc nhóm limonoid aglycones, có dạng tinh thể
màu trắng, vị đắng, đƣợc tìm thấy nhiều trong hạt Citrus [45]. Limonin có cơng
thức phân tử C26H30O8.
Limonoids đƣợc tìm thấy ở hạt bƣởi đƣợc phân thành hai nhóm: limonoids
aglycones và limonoids glucosides [46, 47].
Limonoids aglycones trong hạt bƣởi gồm có: Limonin, nomilin, obacunone
và deacetylnomilin [46, 47].
R. Rouseff, S. Nagy [48] và Hasegawa cùng cộng sự [45] đã phân tích thành
phần limonoids trong những hạt của tám loài thuộc chi Citrus và kết quả cho thấy
rằng thành phần limonoid chủ yếu là limonin [45, 48]. Trong nghiên cứu của
Hasegawa [49] và Hashinaga cùng cộng sự [50] cũng cho thấy limonin là limonoid
chứa nhiều trong các cây thuộc chi Citrus. Trong 1 kg hạt bƣởi khô chứa khoảng 19
g limonin [51]. Virkam và cộng sự đã định lƣợng limonin từ bốn loài thuộc chi
Citrus và kết quả cho thấy limonin chứa nhiều trong bƣởi Rio Red, 616,6 mg/100g
hạt [52]. Một số nghiên cứu khác cho thấy limonin từ loài Citrus wilsonii Tanaka
thuộc tỉnh Hồ Nam (Trung Quốc) là 2,345 mg/g hạt [53]. Kết quả nghiên cứu của
Liu và cộng sự cho thấy hạt Citrus reticulate Blanco thu đƣợc nhiều limonin nhất
(7,85 mg/g) và có độ tinh khiết là 98%.
Limonin có khả năng ức chế sự phiên mã của retrovirus nhƣ HIV-I và HTLV
– I [54]. Nghiên cứu của Yoon và cộng sự [55] cho thấy limonin có tác dụng ổn
định thần kinh. Ngồi ra, limonin cịn làm giảm sự phát triển của tế bào ung thƣ ruột
kết, giảm cholesterol LDL, giảm nguy cơ xơ vữa động mạch [56].
Năm 1995, H. Ohta và S. Hasegawa [57] đã nghiên cứu thành phần limonoid
trong hạt và dịch quả bƣởi. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong hạt bƣởi có chứa
limonin, nomilin, obacunone, deacetylnomilin. Hàm lƣợng limonoid aglycone trong

hạt bƣởi chiếm khoảng 773 – 9900 ppm và hàm lƣợng limonoid glucosides khoảng
130 – 1912 ppm.
Đã có nhiều nghiên cứu về hoạt tính sinh học của limonoids. Thí nghiệm trên
chuột cho thấy limonoids từ quả bƣởi có khả năng ức chế enzyme gluthathione S-


8

transferase [58] và ức chế khối u ở dạ dày, miệng, phổi, da, đại tràng trên cơ thể
ngƣời [59, 60]. Thí nghiệm trên tế bào ung thƣ vú ở ngƣời cho thấy limonoids có
tiềm năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thƣ [61]. Ngoài ra, một số nghiên cứu
cho thấy limonoids có khả năng ức chế sự phát triển của sâu bọ [62].
1.2 Một số phƣơng pháp tách chiết
Có nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ. Các kỹ thuật đều xoay quanh
hai phƣơng pháp chính là chiết lỏng – lỏng và chiết rắn – lỏng [63].
Trong thực nghiệm, chiết rắn – lỏng đƣợc áp dụng nhiều hơn, bao gồm
phƣơng pháp ngấm kiệt, ngâm dầm, trích li với máy chiết Soxhlet... Ngồi ra, cịn
có phƣơng pháp chiết lôi cuốn hơi nƣớc, sử dụng chất lỏng siêu tới hạn...[63].
Nguyên tắc chiết cơ bản là dung môi không phân cực (thí dụ eter dầu hỏa...)
sẽ hịa tan tốt các hợp chất có tính khơng phân cực (thí dụ các alcol béo, ester
béo...), dung mơi phân cực trung bình (thí dụ dietyl eter, cloroform...) hịa tan tốt
các hợp chất có tính phân cực trung bình (các hợp chất chứa nhóm chức eter –O–,
aldehyt –CH=O, ceton –CO– , ester –COO– ... ) và dung mơi phân cực mạnh (thí dụ
metanol...) hịa tan tốt các hợp chất có tính phân cực mạnh (các hợp chất có chứa
nhóm chức –OH , – COOH...) [63].
1.2.1 Trích li bằng Soxhlet
Chiết Soxhlet là q trình chiết hồi lƣu dựa trên ngun tắc hóa hơi. Dung
mơi tinh khiết khi đƣợc đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, khi gặp hệ thống làm lạnh,
ngƣng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống pha rắn chứa chất cần hòa tan. Dung môi
ngấm vào và chiết những chất hữu cơ nào có thể hịa tan vào dung mơi, theo q

trình đun nóng lƣợng dung mơi càng lúc càng nhiều sẽ bị trút về bình cầu ban đầu.
Các hợp chất đƣợc trút xuống bình cầu và nằm tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là
đƣợc bốc hơi bay lên để tiếp tục q trình chiết.
Ưu điểm: Tiết kiệm dung mơi, chỉ một lƣợng ít dung mơi mà chiết kiệt đƣợc
mẫu; không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới nhƣ các kỹ thuật khác; chiết
kiệt hợp chất trong mẫu vì mẫu ln đƣợc chiết liên tục bằng dung môi tinh khiết.


9

Nhược điểm: Kích thƣớc của máy Soxhlet làm giới hạn lƣợng mẫu cần chiết;
trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ mẫu đƣợc trữ lại trong bình cầu, bị
đun nóng ở nhiệt độ sơi của dung mơi nên các hợp chất kém bền nhiệt có thể bị thay
đổi.
Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp Soxhlet để tách chiết
limonoids từ hạt Citrus. H. Ohta [64] đã sử dụng phƣơng pháp Soxhlet để tách chiết
thành phần limonoids trong hạt Citrus depressa và Citrus iyo. Hạt Citrus đƣợc loại
béo bằng dung mơi n-hexane và sau đó đƣợc chiết tiếp bằng acetone và methanol.
Cao chiết methanol đƣợc chiết tiếp với dung môi methylene chloride:water (1:1).
Kết quả nghiên cứu cho thấy thành phần limonoids trong hạt Citrus depressa và
Citrus iyo khác nhau. Trong hạt Citrus depressa chứa nhiều nomilin glucoside (7,59
mg/g), cịn trong hạt Citrus iyo thì chứa nhiều limonin (4,57 mg/g). Trong một
nghiên cứu khác, J. Patil [65] cũng sử dụng phƣơng pháp Soxhlet để tách chiết các
hợp chất trong hạt chanh Citrus aurantifolia. Trƣớc tiên, hạt Citrus aurantifolia
đƣợc tách béo bằng phƣơng pháp Soxhlet với n-hexane và sau đó đƣợc tách chiết
với ethyl acetate, acetone, MeOH, MeOH: Water (8:2). Kết quả cho thấy thành
phần limonoids đều có trong các loại cao chiết trong đó cao chiết ethyl acetate chứa
limonin nhiều nhất (390,79 mg/100g).
1.2.2 Trích li bằng CO2 siêu tới hạn
Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt tới một áp

suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngƣợc lại. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà
tại đó, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng khơng hóa hơi trở lại mà tồn tại ở
một dạng đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở trạng thái trung gian này,
mang đặc tính của cả chất khí và chất lỏng [66].
Các dung mơi siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả ba dạng rắn,
lỏng và khí. Dung mơi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả
các cấu tử không bay hơi của mẫu [67].
CO2 siêu tới hạn (SCO2) là dung môi đƣợc ƣu tiên lựa chọn do CO2 dễ
kiếm, rẻ tiền và ít có phản ứng với các chất cần tách chiết. Khi đƣợc đƣa lên đến
trạng thái tới hạn, CO2 không gây nổ, khơng bắt lửa và khơng duy trì sự cháy; CO2


10

khơng độc với cơ thể, khơng ăn mịn thiết bị; Ít tốn năng lƣợng hơn so với các chất
khác để đƣa tới vùng siêu tới hạn; Có khả năng hịa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể
rắn và lỏng, đồng thời cũng hòa tan đƣợc cả các chất thơm dễ bay hơi, khơng hịa
tan các kim loại nặng và có thể điều chỉnh các thơng số trạng thái nhƣ áp suất và
nhiệt độ để nâng cao độ chọn lọc khi chiết tách; Khơng có dƣ lƣợng cặn độc hại
trong chế phẩm chiết [66, 67, 68, 69].
Trên thế giới đã sử dụng cơng nghệ trích li bằng SCO2 vào việc loại cafein
của chè và cà phê trong quá trình sản xuất các loại đồ uống không cafein [66, 70,
71]. Trong cơng nghiệp thuốc lá, SCO2 cịn đƣợc sử dụng để chiết những thành
phần dễ bay hơi và tách phần hƣơng tự nhiên từ cây thuốc lá để nâng cao chất lƣợng
sản phẩm. Trong công nghiệp thực phẩm ứng dụng cơng nghệ SCO2 để sản xuất
các sản phẩm có hàm lƣợng chất béo và cholestesrol thấp hoặc các thực phẩm chức
năng (giàu axit béo DHA, EPA, FOS .v.v...); SCO2 cũng đƣợc dùng để chiết các
hợp chất của hoa houblon [66, 67] dùng trong công nghệ bia và dƣợc phẩm cũng
nhƣ chiết các hoạt chất chống oxy hóa có nguồn gốc tự nhiên.
J. Yu và cộng sự [72] đã sử dụng phƣơng pháp CO2 siêu tới hạn để trích li

limonoid và naringin từ hạt Citrus paradisi Macf. Kết quả nghiên cứu cho thấy hàm
lƣợng limonin thu đƣợc cao nhất (6,3 mg/g hạt) ở 48,3 MPa, 50oC trong 60 phút;
hàm lƣợng limonin-17-β-d-glucopyranoside thu đƣợc cao nhất (0,62 mg/g hạt) ở
41,1 MPa, 60oC trong 40 phút với đồng dung môi là ethanol 30%; và hàm lƣợng
naringin thu đƣợc cao nhất (0,2 mg/g hạt) ở 41,4 MPa, 50oC trong 40 phút với đồng
dung môi là ethanol 20%.
1.2.3 Trích li có sự hỗ trợ của vi sóng
Dƣới tác dụng của vi sóng, nƣớc trong các tế bào thực vật bị nóng lên thật
nhanh, áp suất bên trong tăng đột ngột, làm các mô bị vỡ ra, thốt ra bên ngồi, bị
lơi cuốn theo hơi nƣớc sang hệ thống ngƣng tụ hoặc hòa tan vào dung mơi hữu cơ
đang bao phủ bên ngồi ngun liệu [73].
Ngồi việc nƣớc bị tác dụng nhanh chóng bởi vi sóng, các cấu tử phân cực
(nhóm hợp chất có chứa oxigen) cũng bị ảnh hƣởng bởi vi sóng. Ngƣợc lại, thành
phần hidrocacbon ít chịu ảnh hƣởng của vi sóng hơn (do chúng có độ phân cực


11

kém). Nhƣng q trình ly trích bằng chƣng cất hơi nƣớc bình thƣờng sẽ nhanh hơn
do nƣớc đƣợc đun nóng nhanh bởi vi sóng [73].
Ưu điểm: Có hiệu quả đối với các phân tử phân cực. Thời gian trích li nhanh.
Dung mơi sử dụng ít. Thiết bị dễ vận hành.
Nhược điểm: Khó áp dụng quy mơ cơng nghiệp do chi phí đầu tƣ cho thiết bị
tạo vi sóng là khơng nhỏ để đủ công suất. Không áp dụng cho các phân tử không
phân cực. Nhiệt độ sôi của dung môi đạt rất nhanh, có thể gây nổ.
1.2.4 Trích li có sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Siêu âm là âm thanh có tần số nằm ngồi ngƣỡng nghe của con ngƣời (16Hz
– 18kHz). Siêu âm cung cấp năng lƣợng thông qua hiện tƣợng tạo và vỡ “bọt”.
Trong môi trƣờng chất lỏng, bọt có thể hình thành trong nửa chu kỳ đầu và sẽ vỡ
trong nửa chu kỳ sau, giải phóng một năng lƣợng rất lớn [73].

Khi sóng siêu âm đƣợc truyền vào mơi trƣờng chất lỏng, các chu trình kéo và
nén liên tiếp đƣợc tạo thành. Trong điều kiện bình thƣờng, các phân tử chất lỏng ở
rất gần nhau nhờ liên kết hóa học. Khi có sóng siêu âm, trong chu trình nén các
phân tử ở gần nhau hơn và trong chu trình kéo chúng bị tách ra xa. Áp lực âm trong
chu trình kéo đủ mạnh để thắng các lực liên kết giữa các phân tử và tạo thành những
bọt khí nhỏ [74].
Sóng siêu âm làm rung động những bọt khí này, tạo nên hiện tƣợng “ sốc
sóng “ và hình thành dịng nhiệt bên trong chất lỏng. Bọt khí ổn định có thể lơi kéo
những bọt khí khác vào trong trƣờng sóng, kết hợp lại với nhau và tạo thành dịng
nhiệt nhỏ [74].
Sóng siêu âm cƣờng độ cao truyền vào trong lịng chất lỏng sẽ gây nên sự
kích thích mãnh liệt. Tại bề mặt tiếp xúc giữa 2 pha lỏng/rắn hay khí/rắn, sóng siêu
âm gây nên sự hỗn loạn cực độ do tạo thành những vi xoáy. Hiện tƣợng này làm
giảm ranh giới giữa các pha, tăng cƣờng sự truyền khối đối lƣu và thúc đẩy xảy ra
sự khuyếch tán ở một vài trƣờng hợp mà khuấy trộn thông thƣờng không đạt đƣợc
[74].


12

1.3. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
1.3.1. Một số chủng vi khuẩn, vi nấm gây bệnh thường gặp
1.3.1.1 Staphylococcus aureus [75]
Staphylococcus aureus là vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy ý, Gram dƣơng.
Theo phân loại quốc tế

Staphylococcus aureus thuộc giới Bacteria, ngành

Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus,
lồi aureus. S. aureus có hình cầu, có đƣờng kính từ 0,8 – 1,0 µm và tụ với nhau

thành từng đám, khơng có lơng, khơng sinh nha bào, thƣờng khơng có vỏ.
S. aureus thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển đƣợc ở nhiệt độ 10 – 45oC và
nồng độ muối cao hơn 10%, thích hợp ở điều kiện hiếu và kỵ khí.
Trên mơi trƣờng thạch thƣờng, S. aureus tạo thành khuẩn lạc dạng S, đƣờng
kính 1 – 2 mm, nhẵn, khuẩn lạc và thƣờng có màu vàng chanh. Trên môi trƣờng
thạch máu, S. aureus phát triển nhanh và tạo tan máu hồn tồn. Trong mơi trƣờng
canh thang, S. aureus làm đục môi trƣờng, để lâu có thể lắng cặn.
S. aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi
khuẩn khơng có nha bào khác. S. aureus bị diệt ở 80oC trong một giờ. S. aureus
cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trƣờng.
S. aureus ký sinh ở da và niêm mạc nên chúng có thể xâm nhập qua các vết
thƣơng hoặc lỗ chân lông gây nhiễm khuẩn sinh mủ: mụn nhọt, đầu đinh, các ổ
apxe, eczema... S. aureus là vi khuẩn hay gây nhiễm khuẩn huyết nhất. Nhiễm
khuẩn thƣờng xảy ra sau những nhiễm khuẩn tiên phát, đặc biệt là các nhiễm khuẩn
ngoài da, từ đó vi khuẩn xâm nhập vào máu. S. aureus gây nhiễm độc thức ăn và
viêm ruột cấp do ăn uống phải độc tố ruột hoặc do tụ cầu vàng vốn cƣ trú ở đƣờng
ruột gây ra.
S. aureus bị tiêu diệt bởi nhiều kháng sinh. Tuy nhiên, hiện nay S. aureus đã
kháng lại nhiều loại kháng sinh thông dụng.


13

1.3.1.2 Bacillus cereus [76]
Theo phân loại quốc tế, Bacillus cereus thuộc giới Bacteria, ngành
Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Bacillales, họ Bacillaceaem, chi Bacillus, loài cereus.
B. cereus là trực khuẩn, Gram dƣơng, tạo nội bào tử. Kích thƣớc 0,5–1,5 x 24 µm. B. cereus khơng tạo giáp mơ, khơng có khả năng di động, bào tử dạng hình
ovan, có khả năng sinh nha bào, đƣợc phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc
thực phẩm vào năm 1955.
B. cereus là loại vi khuẩn dễ mọc, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, tăng trƣởng trong

khoảng nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ƣu ở 35 – 40oC; pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ tạo
bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng.
Trên mơi trƣờng chọn lọc lồi này tạo khuẩn lạc rất to, mọc lan, rìa nhăn.
Trên mơi trƣờng Nutrient Agar hay Tryptone Soya Agar sau 24 giờ tạo khóm lớn,
nhăn nheo, xù xì. Trên mơi trƣờng Blood Agar tạo dung huyết rộng. Trên môi
trƣờng MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vịng
sáng. Trên mơi trƣờng Mossel (thạch Cereus Selective Agar): khóm to hồng chung
quanh có vịng sáng. Trên mơi trƣờng canh Nitrate Broth, Tryptone Soya Broth: đục
tạo váng, sau cặn lợn cợn
B. cereus hiện diện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn
hợp gia vị, sản phẩm khô...). Vi khuẩn này phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào
các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thƣờng gây ngộ độc thực phẩm.
B. cereus lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, khơng lên men
mannitol; khử nitrat thành nitrit; phản ứng Voges - Proskauer (+); phân giải
Tyrosine; catalase (+), kháng lyzozyme (+).
B. cereus có thể tiết ra hai loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy
và emetic toxin gây nôn mửa.
* Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố
trên thịt, rau quả và gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm
mạc ruột gây bệnh tiêu chảy.


14

* Độc tố gây nôn mửa (Type 2): Emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo,
cơm nguội, đậu các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không
bị phân hủy ở nhiệt độ cao và dịch dạ dày.
Ngồi ra vi khuẩn cịn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có
thể gây chết ngƣời. Độc tố này có thể trung hịa bởi cholesterol trong huyết thanh
nhƣng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn.

Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc.

1.3.1.3 Salmonella [77]
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí và kỵ khí tùy ý, có khả năng di
động, không tạo bào tử, lên men glucose và mannitol sinh acid nhƣng không lên
men saccharose và lactose.
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thƣớc trung bình từ 2 – 3 x 0,5 – 1
µm, di chuyển bằng tiên mao trừ S. gallimarum và S. pullorum, không tạo bào tử,
chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6oC – 42oC, thích hợp nhất ở 35oC – 37oC, pH từ 6 –
9 và thích hợp nhất ở pH 7,2. Ở nhiệt độ từ 18oC – 40oC vi khuẩn có thể sống đến
15 ngày.
Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, phát triển đƣợc trên các môi trƣờng
nuôi cấy thông thƣờng. Trên mơi trƣờng thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24
giờ. Có thể mọc trên những mơi trƣờng có chất ức chế chọn lọc nhƣ DCA
(Deoxycholate Citrate Agar) và XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), trong đó mơi
trƣờng XLD ít chất ức chế hơn nên thƣờng đƣợc dùng để phân lập Salmonella.
Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella trên môi trƣờng này là trịn, lồi, trong suốt, có
tâm đen, đơi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trƣờng xung quanh chuyển
sang màu đỏ.
Salmonella không lên men lactose, lên men đƣờng glucose và sinh hơi.
Thƣờng không lên men sucrose, salicin và inositol, sử dụng đƣợc citrate ở môi
trƣờng Simmons.
Tuy nhiên, không phải lồi Salmonella nào cũng có những tính chất trên, các
ngoại lệ đƣợc xác định là S. typhi lên men đƣờng glucose không sinh hơi, không sử


15

dụng citrate trong môi trƣờng Simmon, hầu hết các chủng S. paratyphi và S.
cholerasuis không sinh H2S, khoảng 5% các chủng Salmonellla sinh bacteriocin

chống lại E. coli, Shigella và ngay cả một số chủng Salmonella khác.
Các chủng vi khuẩn Salmonella gây bệnh bao gồm S. typhi và S. paratyphi A,
B, C có khả năng gây bệnh thƣơng hàn. Nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn hay viêm
dạ dày – ruột cấp, thƣờng gặp do S. typhymurium , S. enteritidis.

1.3.1.4 Pseudomonas aeruginosa [75][76]
Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hiếu khí, Gram âm, có một lông ở
một đầu, di động, không sinh nha bào. P. aeruginosa mọc dễ dàng trên các môi
trƣờng nuôi cấy thơng thƣờng, nhiệt độ thích hợp 37oC, pH thích hợp 7,2 – 7,5.
Khuẩn lạc của P. aeruginosa có ba dạng: (1) khuẩn lạc nhỏ, thô ở những
chủng hoang dại phân lập từ đất, nƣớc; (2) khuẩn lạc to, trơn, rìa phẳng, nhơ cao và
(3) khuẩn lạc có dạng nhầy. Dạng (2) và (3) là đặc điểm của các chủng đƣợc phân
lập từ bệnh phẩm.
Trong môi trƣờng lỏng, vi khuẩn mọc váng ở trên, mơi trƣờng đục.
Tính chất đặc trƣng của trực khuẩn mủ xanh là sinh sắc tố. Có hai loại sắc tố
chính là pyoverdin và pyocyanine. Pyoverdine là sắc tố phát huỳnh quang màu xanh
vàng khi đƣợc kích thích bởi bƣớc sóng thấp hơn 260nm. Sắc tố này đƣợc tạo ra
trong mơi trƣờng có nồng độ sắt thấp, dễ khuếch tán và có chức năng trong cơ chế
trao đổi sắt của vi khuẩn. Pyocyanine là sắc tố có màu xanh ở pH trung tính hay
kiềm, màu đỏ trong mơi trƣờng acid. Sắc tố này là yếu tố tạo màu xanh trong mủ
xanh là đặc tính gây bệnh bởi P. aeruginosa.
Tính chất sinh hóa: Khơng lên men glucose; có khả năng thủy giải gelatin,
tinh bột; khử nitrate (+), oxidase (+); sử dụng citrate (+); sử dụng maltose (+).
P. aeruginosa hiện diện phổ biến trong đất, nƣớc bề mặt động thực vật, là
loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội trên ngƣời. P. aeruginosa có thể gây nhiều loại bệnh
khác nhau: gây viêm màng trong tim, viêm đƣờng hô hấp, viêm phổi, nhiễm trùng
đƣờng máu, đƣờng tiết niệu, viêm màng não mủ và áp xe não, viêm tủy xƣơng,
viêm tai, gây bệnh hóa sừng ở mắt, gây nhiễm trùng da, mơ mềm...

P. aeruginosa

16

là vi khuẩn kháng thuốc phổ biến đối với nhiều loại kháng sinh. Chỉ có một số ít các
kháng sinh có hiệu nghiệm đối với Pseudomonas là fluoroquinolone, gentamicin và
imipenem.

1.3.1.5 Aspergillus flavus [77]
Nấm Aspergillus flavus thuộc giới Fungi, ngành Ascomycota, lớp
Eurotiomycetes, bộ Eurotiales, họ Trichocomaceae, giống Aspergillus, loài
Aspergillus flavus.
Nấm mốc Aspergillus có dạng hình sợi, phân nhánh, có vách ngăn (cấu tạo
đa bào), không màu, màu nhạt hoặc trở nên nâu, nâu nhạt ở một số vùng nhất định
của khuẩn lạc.
Aspergillus flavus tồn tại một cách tự nhiên trong không khí và đất và có thể
gây bệnh trên các loại ngũ cốc tích trữ trong thời gian dài. Nhiều dịng nấm sinh ra
một lƣợng lớn độc tố aflatoxin.
Aspergillus flavus ƣa sống trong điều kiện nhiệt độ khô. Nhiệt độ tố ƣu để
phát triển là 37oC, nhƣng nấm sẽ phát triển ở nhiệt độ 12-48oC và phát triển nhanh
chóng ở khoảng giữa nhiệt độ là 25 – 42oC.

1.3.1.6 Fusarium solani [77]
Fusarium là chi lớn trong họ Tuberculariaceae. Các loài Fusarium chủ yếu
gây các bệnh héo và thối thân củ, rễ củ trên rau và hoa. Chúng không phải là tác
nhân phổ biến gây bệnh thối rễ. Tuy nhiên, nấm F. oxysporum và F. solani thƣờng
sống hoại sinh trên các mô rễ ảnh hƣởng bởi các tác nhân gây bệnh khác, và dễ
dàng đƣợc phân lập trên môi trƣờng không chọn lọc.
F. solani chủ yếu gây thối rễ và cổ rễ. Một số dạng F. solani gây thối cổ rễ
cây con họ đậu nhƣ đậu Hà Lan, đậu cô ve, và thối rễ ở các cây trƣởng thành. Các

dạng khác có thể gây hại ở khu vực gốc thân cây lớn, nhƣ cây vải, bị yếu đi do yếu
tố môi trƣờng làm stress và do các bệnh khác.
Trên môi trƣờng PDA, F. solani có màu trắng tới màu kem, một số có sắc tố
hơi xanh lá cây tới xanh lam.


17

1.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật
Có nhiều phƣơng pháp nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn. Có thể phân loại
các phƣơng pháp này bằng kỹ thuật đƣa chất thử vào hệ thử [78].
1.3.2.1 Phương pháp dùng khoanh giấy trên mơi trường đặc
Mẫu chứa các hoạt tính kháng sinh trên khoanh giấy sẽ khuếch tán vào môi
trƣờng thạch chứa vi khuẩn thử nghiệm và mức độ nhạy cảm của vi khuẩn với mẫu
chứa hoạt tính kháng sinh đƣợc biểu thị bằng đƣờng kính vịng kháng khuẩn xung
quanh khoanh giấy. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của chất thử càng mạnh [78].
1.3.2.2 Phương pháp dùng ống trụ trên môi trường đặc
Xác định khả năng kháng khuẩn của chất thử nghiệm cho vào ống trụ ; chất
thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch, gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung
quanh ống trụ đựng chất thử. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng của chất thử càng
mạnh [78].
1.3.2.3 Phương pháp hệ nồng độ trong môi trường lỏng
Dùng hàng loạt ống nghiệm chứa môi trƣờng lỏng, có chất dinh dƣỡng thích
hợp cho vi khuẩn định nghiên cứu. Thêm những nồng độ khác nhau của chất nghiên
cứu tác dụng kháng khuẩn vào các ống. Xác định nồng độ thấp nhất của chất nghiên
cứu ức chế đƣợc sự phát triển của vi khuẩn. Nồng độ này đƣợc gọi là nồng độ ức
chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC). Phƣơng pháp này còn
đƣợc gọi là phƣơng pháp hịa lỗng 2 lần liên tiếp hoặc phƣơng pháp hệ nồng độ
[78].
1.3.2.4 Phương pháp vi định lượng trong vi môi trường lỏng (Microbroth microtiter

technique) [78]
Phƣơng pháp này chủ yếu cũng nhƣ phƣơng pháp hịa lỗng 2 lần liên tiếp,
nhƣng phải có dàn máy ELISA ( Enzyme linked immunosorbent assay: thử nghiệm
miễn dịch gắn enzyme), nên hiện đại hơn, nhạy hơn, nhanh hơn, tự động, tiết kiệm
và có tính định lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp hệ nồng độ thơng thƣờng ở chỗ:
• Kỹ thuật thơng thƣờng chỉ dùng một hoặc vài ba dãy thí nghiệm, trong khi
ở đây dùng 8 dãy thí nghiệm.


18

• Kỹ thuật thơng thƣờng dùng 6 – 8 độ pha lỗng khác nhau của chất thử cịn
ở đây có thể dùng đến 11 độ pha lỗng.
• Kỹ thuật thơng thƣờng đọc kết quả bằng mắt thƣờng (có thể cho thêm chỉ
thị TTC), nhƣng ở đây, đƣợc xác định bằng cách đo mật độ quang học ở bƣớc sóng
492 nm của dàn máy ELISA.
1.3.2.5 Phương pháp sinh ký tự (Bioautography)
Phƣơng pháp này sử dụng khi đã xác định đƣợc dịch chiết tồn phần có tác
dụng kháng khuẩn trên một loại vi khuẩn nào đó và muốn xác định xem thành phần
nào trong dƣợc liệu này có tác dụng. Nguyên tắc tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp sử
dụng môi trƣờng đặc, sau khi chạy sắc ký dịch chiết tổng có hoạt tính trên bản
mỏng, tiến hành láng mơi trƣờng thạch đặc có chứa vi khuẩn nghiên cứu, ủ 18 – 24
giờ để xác định vùng vết chất làm vi khuẩn không mọc đƣợc; đó là chất có tác dụng
kháng khuẩn. Để phát hiện vi khuẩn mọc đƣợc dễ dàng nên dùng chỉ thị màu TTC
(Triphenyl tetrazolium Chloride) [78].
1.4. Các phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa
Để nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của các chất, hiện nay có một số
phƣơng pháp sau:
1.4.1 Phương pháp DPPH (Diphenylpicrylhydrazyl Radical)
Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1 – diphenyl – 2 picrylhydrazyl (DPPH).

DPPH là một gốc tự do bền, có màu tím và có độ hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 517
nm. Khi có mặt chất kháng oxy hóa, DPPH sẽ bị khử thành 2, 2 – Diphenyl – 1 –
Picrylhydrazine (DPPH – H), có màu vàng. Đo độ giảm độ hấp thu ở bƣớc sóng 517
nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất kháng oxy hóa [79].
Đã có nhiều nghiên cứu sử dụng phƣơng pháp DPPH để xác định hoạt tính
kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt Citrus. Mandahi và cộng sự đã sử dụng phƣơng
pháp DPPH để khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của dịch chiết từ hạt của năm lồi
bƣởi Mexican khác nhau, dịch chiết đƣợc chiết bằng Soxhlet với dung môi ethyl
acetate (EtOAc), acetone, methanol (MeOH) và nƣớc. Kết quả nghiên cúu cho thấy
tất cả dịch chiết đều có khả năng kháng oxy hóa, trong đó dịch chiết bằng dung môi