Ứng dụng bã mía thủy phân nuôi cấy nấm men yarrowia lipolytica po1g có khả năng sinh tổng hợp chất béo

I H C QU C GIA TP. HCM

TR

NG

TR

I H C BÁCH KHOA

NG TH C M TÚ

NG D NG BÃ MÍA TH Y PHÂN NUÔI C Y
M MEN YARROWIA LIPOLYTICA PO1G CÓ
KH N NG SINH T NG H P CH T BÉO

Chun ngành: Cơng ngh Hóa h c
Mã s : 60 52 75

LU N V N TH C S

TP.H CHÍ MINH, tháng 7 n m 2013


I H C QU C GIA TP. HCM

TR

NG

TR

I H C BÁCH KHOA

NG TH C M TÚ

NG D NG BÃ MÍA TH Y PHÂN NUÔI C Y
M MEN YARROWIA LIPOLYTICA PO1G CÓ
KH N NG SINH T NG H P CH T BÉO

Chun ngành: Cơng ngh hóa h c
Mã s : 60 52 75

LU N V N TH C S
NG D N KHOA H C
1. TS. H Qu c Phong
2. PGS.TS. Nguy n Thúy H

TP.H

ng

CHÍ MINH, tháng 7 n m 2013


CƠNG TRÌNH
TR

Cán b h

NG

C HỒN THÀNH T I

I H C BÁCH KHOA – HQG – HCM

ng d n khoa h c: TS. H Qu c Phong – PGS.TS Nguy n Thúy H

Cán b ch m nh n xét 1: TS. Hu nh K Ph

ng

ng H ............................................

Cán b ch m nh n xét 2: TS. Nguy n Quang Long...............................................

Lu n v n th c s

c b o v t i Tr

ng

i h c Bách Khoa, HQG Tp.HCM

Ngày 06 tháng 9 n m 2013

Thành ph n h i

ng ánh giá lu n v n th c s g m:

1. PGS. TS Nguy n Ng c H nh – Ch t ch h i

2. TS. Hu nh K Ph

ng ............................................

ng H – Ph n bi n 1 ..........................................................

3. TS. Nguy n Quang Long – Ph n bi n 2 ............................................................
4. TS. H Qu c Phong – y viên..........................................................................
5. TS. Lý C m Hùng – Th ký..............................................................................

Xác nh n c a Ch t ch H i ng ánh giá LV và Tr
ngành sau khi lu n v n ã
c s a ch a (n u có).

CH T CH H I

NG

TR

ng Khoa qu n lý chuyên

NG KHOA…..


TR

I H C QU C GIA TP.HCM
NG
I H C BÁCH KHOA

NG HÒA XÃ H I CH NGH A VI T NAM
c l p - T do - H nh phúc

NHI M V LU N V N TH C S
tên h c viên:…………TR

NG TH C M TÚ ............... MSHV:…..11880185 .....

Ngày, tháng, n m sinh:……………09/01/1988....................... N i sinh:…..M Tho......
Chun ngành:……………Cơng ngh Hóa h c ...................... Mã s :…..60 52 75 ......
I. TÊN

TÀI: ............................................................................................................

NG D NG BÃ MÍA TH Y PHÂN NI C Y N M MEN YARROWIA LIPOLYTICA
PO1G CÓ KH N NG SINH T NG H P CH T BÉO................................................
........................................................................................................................................
II. NHI M V VÀ N I DUNG: .................................................................................
Hoàn thành lu n v n úng h n ........................................................................................
Th y phân bã mía và nuôi c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g..................................
III. NGÀY GIAO NHI M V : ……………………….21/01/2013 ............................
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V :………….....21/06/2013 ............................
V. CÁN B

H

NG D N:…TS. H Qu c Phong – PGS.TS Nguy n Thúy H

ng ...

........................................................................................................................................

Tp. HCM, ngày . . . . tháng .. . . n m 20....
CÁN B H
NG D N
(H tên và ch ký)

TR

CH NHI M B MÔN ÀO T O
(H tên và ch ký)

NG KHOA….………
(H tên và ch ký)


i

IC M N
œ¯•

Tơi xin g i l i c m n chân thành nh t
Nguy n Thúy H

ng - ã t n tình h

hi n lu n v n và t o

u ki n

n TS. H Qu c Phong và PGS TS.

ng d n, giúp

tơi trong su t q trình th c

tơi có th hồn thành lu n v n này.

Xin chân thành c m n quý th y cô ã d y b o tôi trong th i gian qua.
Xin c m n cô Nguy n Th Thu Vân - B môn K thu t môi tr
th y cô c a B mơn Cơng ngh Hóa h c ã t o m i

ng và quý

u ki n t t nh t trong su t

th i gian tôi th c hi n lu n v n. C m n TS. Hu nh Liên H

ng - B mơn Cơng

ngh Hóa h c, ã phân tích m u giúp tơi.
C m n t t c các anh ch em l p Cao h c Cơng ngh Hóa h c K2011, K2012
i h c Bách Khoa Tp.HCM, các em sinh viên Công ngh Hóa h c K35, K36
c C n Th

ã t n tình giúp

trong su t th i gian th c hi n

Xin c m n gia ình ã dành cho tơi tình yêu th
m n t t c m i ng

i ã quan tâm, giúp

và

i

tài.

ng và s h tr t t nh t.
ng viên tôi trong su t th i

gian v a qua.

Xin chân thành c m n!


ii

TÓM T T
Nghiên c u này

c th c hi n nh m chuy n

i ph ph m nông nghi p nh

bã mía thành các s n ph m có giá tr . B ng cách s

d ng n m men Yarrowia

lipolytica Po1g có kh n ng s d ng ngu n carbon t s n ph m th y phân bã mía
sinh t ng h p thành ch t béo. ây là ngu n nguyên li u ti m n ng dùng

s n xu t

u sinh h c (biodiesel). Bã mía là ngu n ph ph m nơng nghi p phong phú và d i
dào

Vi t Nam.

ây là ngu n nguyên li u lignocellulose ti m n ng cho quá trình

n xu t diesel th h th hai vì trong bã mía có hàm l
lignin th p. Nghiên c u g m hai ph n: kh o sát các y u t

ng carbonhydrate cao,
nh h

ng

n quá trình

th y phân bã mía b ng axit lỗng và q trình ni c y Y.lipolytica Po1g.
Sau khi ti n x lý, bã mía
ki n nhi t

, th i gian, n ng

c th y phân b ng axit H2SO4 loãng

các

u

axit và t l bã mía/dung d ch axit khác nhau.

u

ki n t i u c a quá trình th y phân là th y phân bã mía v i H2SO4 3% trong 6 gi
90 oC, t l bã mía/dung d ch axit 1/25 (g/mL) và n ng
c là 22,45 g/L. Dung d ch bã mía th y phân
các c ch

nh h

ng

n s t ng tr

c kh

ng t ng cao nh t thu
c b ng Ca(OH)2

lo i

ng và tích l y ch t béo c a n m men.

Trong q trình ni c y n m men b ng dung d ch bã mía th y phân, các
u ki n nh h
nh n ng

ng

n s sinh tr

ng, nhi t

ng và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men

, th i gian, ngu n carbon và nit c ng

c kh o sát.

t qu nh n th y r ng Y. lipolytica Po1g phát tri n t t nh t trong mơi tr
mía th y phân ã kh

c có n ng

ng t ng 30 g/L

th i gian 4 ngày và pepton là ngu n nit . Trong ó, n ng
cao nh t thu

ct

ng bã mía th y phân ã kh

sinh kh i và ch t béo

ct

ng t nh d u th c v t. T

ó cho th y

c th s d ng nh m t ngu n carbon thay

th ti m n ng cho Y. lipolytica Po1g phát tri n và sinh t ng h p ch t béo
u vi sinh v t.

26 oC,

ng ng là 13,67 g/L và 46,68%. K t qu phân tích b ng GC

cho th y r ng thành ph n d u thu
môi tr

u ki n nhi t

ng bã

t o ra


iii

ABSTRACT

This study was carried out to convert agricultural waste such as sugarcane
bagasse into valuable products. The yeast Yarrowia lipolytica has ability to use
sugarcane bagasse hydrolysate (SCBH) as carbon source for lipid biosynthesis. This
is a potential source of raw material for biodiesel production. Sugarcane bagasse is
the richness and abundance of agricultural by-products in Vietnam. This
lignocellulosic material is a potential source for second-generation diesel production
because it has high carbohydrate and low lignin content. This study consists of two
parts: investigates the effects of factors associated with the diluted acid hydrolysis
of sugarcane bagasse and the cultivation of Y.lipolytica Po1g.
After pretreatment, hydrolysis of the sugarcane bagasse by dilute sulphuric
acid was performed under different conditions of time, acid concentration,
temperature and the ratio between bagasse and acid solution. The optimized
condition for hydrolysis process is sugarcane bagasse hydrolysis with 3% H2SO4 for
6 hours at 90 °C, the ratio between bagasse and acid solution 1/25 (g/mL) and the
highest sugar concentration was obtained 22,45 g/L. Then, detoxification of SCBH
by Ca(OH)2 removed inhibitors that affected on the growth and lipid accumulation
of oleaginous yeast.
In the cultivation process, the conditions effected the growth and lipid
accumulation of yeast such as sugar concentration, temperature, time, carbon and
nitrogen sources were also investigated. The results showed that Y.lipolytica Po1g
was grown best in DSCBH at 26 °C for 4 days, total sugar concentration of 30 g/L
with peptone as nitrogen source. The highest biomass concentration and lipid yield
were 13,67 g/L and 46,68% respectively. GC analysis showed that the composition
of lipid is similar to vegetable oil. Thus, DSCBH can be used as a alternative carbon
source for the growth and lipid biosynthesis of Yarrowia lipolytica Po1g to produce
cheap microbial oil.


iv

I CAM OAN

Tôi cam oan r ng, ngo i tr các k t qu tham kh o c a các cơng trình
nghiên c u, các cơng vi c trình bày trong lu n v n này là do chính tơi th c hi n.

TP.H Chí Minh, ngày tháng n m 2013

Tr

ng Th C m Tú


v

CL C
IC M

N......................................................................................................... i

TÓM T T LU N V N......................................................................................... ii
I CAM OAN ................................................................................................. iv
C L C...............................................................................................................v
DANH M C HÌNH ...............................................................................................ix
DANH M C B NG ............................................................................................ xii
DANH M C CH
CH

NG 1: M

1.1.

tv n

VI T T T ...........................................................................xiv
U ..........................................................................................1
...................................................................................................1

1.2. M c tiêu ......................................................................................................3
1.3. N i dung nghiên c u ..................................................................................3
CH

NG 2: T NG QUAN ..................................................................................5

2.1. D u vi sinh v t ............................................................................................5
2.2. Ch t béo ......................................................................................................6
2.2.1. Triacylglycerol và các h p ch t liên quan ............................................7
2.2.2. Sterol và sterol este ..............................................................................7
2.2.3. Sáp.......................................................................................................8
2.2.4. Axit béo ...............................................................................................8
2.2.5. Các phospholipid .................................................................................9
2.2.6. Các ch t béo khác ................................................................................9
2.3. Vi sinh v t cho d u .....................................................................................9
2.4. N m men cho d u ....................................................................................11
2.5. N m men Yarrowia lipolytica ...................................................................13
2.5.1. S tích l y ch t béo............................................................................15
2.5.2. Hóa sinh và s

u ch nh kh n ng tích l y ch t béo.........................19

2.5.3. Ti m n ng s d ng c a Yarrowia lipolytica .......................................21

2.6. N m men Yarrowia lipolytica Po1g .........................................................21


vi

2.7. Các y u t môi tr

ng nh h

ng

n s sinh tr

ng c a n m men....22

2.7.1. Nhi t

.............................................................................................22

2.7.2. Dinh d

ng........................................................................................23

2.7.3. pH......................................................................................................23
2.8. Nguyên li u lignocellulose ........................................................................24
2.8.1. Cellulose ............................................................................................25
2.8.2. Hemicellulose ....................................................................................26
2.8.3. Lignin ................................................................................................27
2.9. Bã mía ......................................................................................................29
2.10. Ph

ng pháp th y phân lignocellulose..................................................31

2.10.1. Th y phân b ng hóa h c ..................................................................32
2.10.1.1. Th y phân b ng axit

m

c...................................................33

2.10.1.2. Th y phân b ng axit loãng.......................................................33
2.10.2. Th y phân b ng enzyme ..................................................................35
2.10.2.1. Chuy n hóa cellulose ...............................................................36
2.10.2.2. Chuy n hóa hemicellulose .......................................................37
2.11. Ch t c ch .............................................................................................38
2.11.1. Các s n ph m thối hóa

ng.........................................................38

2.11.2. Các s n ph m thối hóa lignin..........................................................39
2.11.3. Các h p ch t có ngu n g c t c u trúc lignocellulose ......................39
2.11.4. Ion kim lo i n ng .............................................................................40
2.12. Ph

ng pháp kh

c ............................................................................40

2.12.1. Bay h i ............................................................................................40
2.12.2. Trung hịa.........................................................................................41

2.12.3. Than ho t tính ..................................................................................41
2.12.4. Nh a trao

i ion .............................................................................41

2.12.5. Enzyme ............................................................................................41
2.12.6. Overliming.......................................................................................42
2.13. Ph

ng pháp trích ch t béo...................................................................43

2.14. Ph

ng pháp xác

nh l

ng

ng .....................................................45


vii

2.14.1.

nh l

2.14.2. Ph
2.15. Ph

CH

ng

ng kh b ng ph

ng pháp xác

ng pháp xác

ng pháp DNS ..............................45

nh thành ph n

ng .........................................46

nh thành ph n ch t béo.........................................46

NG 3 N I DUNG VÀ PH

NG PHÁP NGHIÊN C U .......................47

3.1. N i dung nghiên c u ................................................................................47
3.1.1. Quá trình th y phân............................................................................47
3.1.2. Quá trình ni c y..............................................................................47
3.2. Ph

ng ti n và

3.2.1. Ph

a

m thí nghi m........................................................47

ng ti n nghiên c u......................................................................47

3.2.1.1. Hóa ch t ....................................................................................47
3.2.1.2. Thi t b và d ng c ....................................................................48
3.2.1.3. Nguyên li u ...............................................................................48
3.2.2.
3.3. Ph

a

m thí nghi m...........................................................................48

ng pháp nghiên c u .........................................................................49

3.3.1. Ti n x lý...........................................................................................50
3.3.2. Quá trình th y phân bã mía ................................................................52
3.3.3. Q trình kh

c ..............................................................................53

3.3.4. Q trình ni c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g ......................53
3.3.5. C y chuy n n m men trên YPDA ......................................................55

CH

3.3.6. T ng sinh – nhân gi ng trong môi tr

ng YPD ..................................57

3.3.7. Ph

ng pháp xác

nh hàm l

ng

ng ...........................................58

3.3.8. Ph

ng pháp xác

nh n ng

sinh kh i ...........................................59

3.3.9. Ph

ng pháp chi t Soxhlet.................................................................60

3.3.10. Ph

ng pháp kh sáp và gum...........................................................62

3.3.11. Xác

nh thành ph n

ng..............................................................62

3.3.12. Xác

nh thành ph n ch t béo...........................................................63

NG 4: K T QU VÀ TH O LU N........................................................64

4.1. Chu n b bã mía .......................................................................................64
4.2. Q trình th y phân.................................................................................64
4.2.1. nh h

ng c a th i gian

n n ng

ng .....................................64


viii

4.2.2. nh h

ng c a n ng

4.2.3. nh h

ng c a t l bã mía và dung d ch axit

4.2.4. nh h

ng c a nhi t

4.2.5. So sánh n ng

axit

n n ng

n n ng

ng ...............................66
n n ng

ng.....68

ng ......................................70

ng t ng thu

c khi s d ng lo i axit và lo i bã

mía khác nhau..............................................................................................71
4.2.6. Q trình kh

c dung d ch bã mía th y phân ..................................74

4.3. Q trình ni c y....................................................................................75
4.3.1.

nh h

ng c a th i gian nuôi c y

n s phát tri n và kh n ng tích

y ch t béo c a Y. lipolytica Po1g ..............................................................75
4.3.2.

nh h

ng c a ngu n carbon

n s phát tri n và kh n ng tích l y

ch t béo c a Y. lipolytica Po1g ....................................................................78
4.3.3. nh h

ng c a ngu n nit

n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t

béo c a Y. lipolytica Po1g............................................................................80
4.3.4.

nh h

ng c a nhi t

nuôi c y

n s phát tri n và kh n ng tích

y ch t béo c a Y. lipolytica Po1g ..............................................................82
4.3.5. nh h

ng c a n ng

ng t ng trong môi tr

ng nuôi c y

ns

phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a Y.lipolytica Po1g .....................84
4.3.6. Phân tích ch t béo ..............................................................................87
CH

NG 5: K T LU N VÀ KI N NGH .......................................................91

5.1. K t lu n.....................................................................................................91
5.2. Ki n ngh ...................................................................................................92
TÀI LI U THAM KH O....................................................................................94
PH L C............................................................................................................101

ix

DANH M C HÌNH
Hình 2.1 C u trúc c a TAG, DAG và MAG .......................................................... 7
Hình 2.2 Cholesteol ................................................................................................ 8
Hình 2.3 C u trúc c a vài axit béo quan tr ng......................................................... 8
Hình 2.4 Phosphatidycholin .................................................................................... 9
Hình 2.5 T bào c a n m men cho d u Rhodosporidium toruloides, Cryptococcus
curvatus và Yarrowia lipolytica ch p t kính hi n vi

n t ..................................13

Hình 2.6 Hình thái c a Yarrowia lipolytica............................................................14
Hình 2.7 Ki u hình c a Yarrowia lipolytica
Hình 2.8 S

v các con

Hình 2.9 S

s h p thu các ch t n n k n

kính hi n vi

n t ........................15

ng t ng h p ch t béo de novo.................................18
c c a Yarrowia lipolytica...............19

Hình 2.10 C u trúc c a lignocellulose....................................................................24

Hình 2.11 C u trúc c a cellulose............................................................................26
Hình 2.12 Glucose .................................................................................................26
Hình 2.13 C u trúc c a hemicellulose ....................................................................27
Hình 2.14 M t s lo i

ng trong hemicellulose..................................................27

Hình 2.15 M t ph n c u trúc c a lignin .................................................................28
Hình 2.16 Các monome trong lignin ......................................................................29
Hình 2.17 Phân b các vùng tr ng mía

n

c ta ...................................................30

Hình 2.18 Ph n ng th y phân hemicellulose ........................................................32
Hình 2.19 Ph n ng th y phân cellulose ................................................................33
Hình 2.20 Thành ph n sau th y phân ph ph m nơng nghi p b ng axit lỗng........35
Hình 2.21 S

ph n ng th y phân cellulose b ng enzyme cellulase ..................36

Hình 2.22 Các ch t c ch và c u trúc hóa h c ......................................................38
Hình 2.23 Các s n ph m thối hóa

ng có th hình thành trong q trình th y

phân b ng axit ........................................................................................................39
Hình 2.24 H th ng chi t Soxhlet ..........................................................................44
Hình 2.25 Ph

ng trình ph n ng t o màu gi a

ng kh và DNS......................45


x

Hình 3.1 S

q trình thí nghi m ......................................................................49

Hình 3.2 S

q trình ti n x lý bã mía.............................................................50

Hình 3.3 Bã mía ép th cơng và bã mía t nhà máy ...............................................51
Hình 3.4 Bã mía sau khi s y và bã mía c t nh ......................................................51
Hình 3.5 Máy xay bã mía.......................................................................................51
Hình 3.6 Th y phân bã mía....................................................................................53
Hình 3.7 S

q trình ni c y..........................................................................55

Hình 3.8 Quá trình c y chuy n n m men trên YPDA.............................................56
Hình 3.9 N m men trên YPDA ..............................................................................57
Hình 3.10 N m men phát tri n trong YPD .............................................................57
Hình 3.11 Chi t Soxhlet.........................................................................................61
Hình 4.1 Bã mía ép th cơng và bã mía nhà máy sau khi ti n x lý........................64
Hình 4.2 Bã miá th y phân theo th i gian ..............................................................65

Hình 4.3

th bi u di n nh h

ng c a th i gian

Hình 4.4 Bã miá th y phân theo n ng
Hình 4.5

th bi u di n nh h

n n ng

ng .................66

axit ........................................................66

ng c a n ng

axit

n n ng

ng............68

Hình 4.6 Bã miá th y phân theo t l bã mía và dung d ch axit..............................69
Hình 4.7

th bi u di n nh h

ng c a t l bã mía và dung d ch axit

n n ng

ng t ng ........................................................................................................69
Hình 4.8

th bi u di n nh h

ng th c t thu
Hình 4.9

ng c a t l bã mía và dung d ch axit

nl

ng

c...........................................................................................70

th bi u di n nh h

ng c a nhi t

n n ng

ng ..................71

Hình 4.10 Bã miá th y phân theo lo i bã mía.........................................................72
Hình 4.11 Bã miá th y phân theo lo i axit .............................................................73

Hình 4.12 Dung d ch bã miá th y phân ch a và ã kh
Hình 4.13

th bi u di n nh h

Hình 4.14 Sinh kh i thu
Hình 4.15

ng c a s kh

c

c theo th i gian t ngày 1

th bi u di n nh h

c...................................74
n n ng

ng t ng ....75

n ngày 7 ........................76

ng c a th i gian. n ng

ng

n s phát

tri n và kh n ng tích l y ch t béo c a n m men ....................................................78

Hình 4.16 Sinh kh i thu

c c a các ngu n carbon khác nhau.............................79


xi

Hình 4.17

th bi u di n nh h

ng c a ngu n carbon

n s phát tri n và kh

ng tích l y ch t béo c a n m men .......................................................................80
Hình 4.18 Sinh kh i thu
Hình 4.19

c c a các ngu n nit khác nhau .................................81

th bi u di n nh h

ng c a ngu n nit

n s sinh tr

ng và kh

ng tích l y ch t béo c a n m men .......................................................................82

Hình 4.20 Sinh kh i thu
Hình 4.21

c

các nhi t

th bi u di n nh h

khác nhau.........................................83

ng c a nhi t

n s phát tri n và kh n ng

tích l y ch t béo c a n m men................................................................................84
Hình 4.22 Sinh kh i thu
Hình 4.23

c

các n ng

th bi u di n nh h

ng c a n ng

ng t ng khác nhau ......................85
ng t ng

n s phát tri n và

kh n ng tích l y ch t béo c a n m men.................................................................86
Hình 4.24 D u vi sinh v t ......................................................................................88


xii

DANH M C B NG
ng 2.1 Thành ph n ch t béo c a vi sinh v t cho d u và d u
ng 2.2 M t s loài vi sinh v t cho d u và hàm l

ng th c v t .......... 6

ng d u ...................................10

ng 2.3 Thành ph n ch t béo c a n m men cho d u và d u th c v t ....................12
ng 2.4 Các gen liên quan

n s tích l y ch t béo trong Yarowia lipolytica .......16

ng 2.5 Lo i gen và ki u hình c a Yarrowia lipolytica Po1g ...............................22
ng 2.6 Nhi t

phát tri n t i thích c a m t vài loài n m men............................23

ng 2.7 Thành ph n chính trong lignocellulose....................................................25
ng 2.8 Các lo i liên k t trong các polyme...........................................................29
ng 2.9 Thành ph n c a bã mía............................................................................31
ng 2.10 So sánh các ph

ng 2.11 Các ph

ng pháp th y phân......................................................37

ng pháp kh

c khác nhau áp d ng cho ph

ng pháp th y

phân lignocellulose b ng axit..................................................................................42
ng 3.1 Các b

c ti n hành d ng

ng chu n D-Glucose..................................59

ng 4.1 nh h

ng c a th i gian

ng 4.2 nh h

ng c a n ng

ng 4.3 nh h

ng c a t l bã mía và dung d ch axit

ng 4.4 nh h

ng c a nhi t

ng 4.5 nh h

ng c a lo i bã mía

ng 4.6 nh h

ng c a lo i axit

n n ng

axit

ng ..........................................65

n n ng

n n ng
n n ng
n n ng

ng ....................................67
n n ng

ng..........69

ng ...........................................71
ng.......................................72

ng ...........................................73

ng 4.7 So sánh k t qu th y phân v i các nghiên c u khác ................................74
ng 4.8 nh h

ng c a kh

ng 4.9

ng c a th i gian

nh h

c

n n ng

ng t ng ...................................75

n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo

a n m men ..........................................................................................................77


xiii

ng 4.10 nh h

ng c a ngu n carbon

n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t

béo c a n m men....................................................................................................79
ng 4.11

nh h

ng c a ngu n nit

n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t

béo c a n m men....................................................................................................81
ng 4.12

nh h

ng c a nhi t

n s phát tri n và kh n ng tích l y ch t béo

a n m men ..........................................................................................................83
ng 4.13

nh h

ng c a n ng

ng t ng

n s phát tri n và kh n ng tích

y ch t béo c a n m men ......................................................................................85
ng 4.14 So sánh k t qu nuôi c y v i các nghiên c u khác ................................87
ng 4.15 Thành ph n ch t béo c a SCO khi nuôi c y Yarrowia lipolytica Po1g v i
ngu n nit và carbon khác nhau .............................................................................88
ng 4.16 Thành ph n axit béo t do v i ngu n nit và carbon khác nhau ............89


xiv

DANH M C CH
SCO: D u

VI T T T

n bào hay d u vi sinh v t (Single cell oil)

DHA: Axit docosahexaenoic
AA: Axit arachidonic
GLA: Axit γ-linolenic
SE: Steryl este
TAG: Triacylglycerol
DAG: Diacylglyerol
MAG: Monoacylglyerol
G-3-P: Glycerol-3-phosphate
DHAP: Dihydroxyacetone
PA: Axit phosphatidic
PAP: Phosphatase phosphatidate
PL: Glycerophospholipid
ME: Enzyme malic

HMF: 5-hydroxymethylfurfural
ADH: Alcohol dehydrogenase
PDH: Pyruvate dehydrogenase
ALDH: Aldehyde dehydrogenase
DNS: Axit 3,5 dinitrosalicylic
YPD: Yeast extract peptone dextrose
YPDA: Yeast extract peptone dextrose agar
OD: M t

quang

v/v: Th tích/th tích


xv

FFA: Axit béo t do
UV: Tia c c tím
UV-VIS: Ph t ngo i và kh ki n (Ultraviolet-Visible)
HPLC: S c ký l ng hi u n ng cao
GC: S c ký khí


1

CH

NG 1
U

1.1.

tv n
Ngày nay, th gi i ang ph i

ho ng n ng l

i m t v i hi n t

ng bi n

ng. H n th n a, ngu n d tr d u m

gây b t n v an ninh n ng l

ng và nh h

ng x u

i khí h u và kh ng

ang c n ki t, giá thành cao
n mơi tr

ng. Vì v y, các

nhà khoa h c ã n l c khơng ng ng tìm ki m các gi i pháp thay th các d ng n ng
ng i t nguyên li u hóa th ch b ng các d ng n ng l
n, thân thi n v i mơi tr

ng và

c bi t có th tái t o

phát tri n nhiên li u sinh h c là m t h
nào v n

nan gi i này c a th gi i, v a

nhu c u n ng l

ng m i xanh h n, s ch
c. Trong ó, nghiên c u

ng i ti m n ng giúp gi i quy t m t ph n
m b o an ninh n ng l

ng v a áp ng

ng c a t ng qu c gia [1],[2].

d ng nhiên li u sinh h c mang l i nhi u l i ích nh gi m thi u s ph
thu c vào d u m và gi m thi u ô nhi m. Do trong quá trình s d ng, nhiên li u
sinh h c ít phát sinh các ch t

c h i gây ô nhi m môi tr

ng nh l u hu nh,

carbon monoxit, polyaromatic. M t khác, nhiên li u sinh h c có t c

phân h y

sinh h c cao, nhanh h n so v i nhiên li u hóa th ch. Chính vì th d n

n s bùng

s n xu t nhiên li u sinh h c [3],[4]. Biodiesel là nhiên li u sinh h c có thành
ph n hóa h c ch y u là methyl este c a các axit béo. Biodiesel

c s n xu t t

q trình chuy n hóa este gi a các triglyceride ( ây là thành ph n chính có trong
u th c v t ho c m

ng v t) và methanol v i xúc tác axit ho c baz [2].

Nguyên li u truy n th ng
ng d

ng, d u

s n xu t biodiesel bao g m d u h t c i, d u h t

u nành, d u c , d u chiên ã qua s d ng, m

Tuy nhiên, n u s d ng d u
cho chí phí cao và có th

ng th c v t làm nguyên li u

nh h

ng

nv n

an ninh l

ng v t [1],[5].

t ng h p biodiesel s
ng th c [6]. M t s


2

nghiên c u ã s d ng d u n ã qua s d ng nh ngu n nguyên li u.
cách hay

ây là m t

gi m chi phí [5],[7]. Tuy nhiên, nh ng ngu n nguyên li u này còn h n

ch , không áp ng

c nhu c u n ng l

ng [8]. Nh ng b t l i nêu trên ã làm giá

thành biodiesel còn cao nên vi c s d ng nhiên li u này còn h n ch . Vì v y, th

gi i ã và ang tìm ki m các ngu n d u m i
vi sinh v t hay d u

s n xu t biodiesel. Trong s

ó, d u

n bào (single cell oil) ang thu hút s quan tâm c a th gi i

[9],[10]. Vi sinh v t cho d u có kh n ng tích l y ch t béo trong t bào t s trao
i ch t c a các ngu n carbon khác nhau, v i m t s loài vi sinh v t có th tích l y
ch t béo kho ng 87% kh i l

ng t bào khô.

ây là ngu n nguyên li u ti m n ng

t ng h p biodiesel. Do chúng có m t s thu n l i nh không b
mùa hay th i ti t, thành ph n c a ch t béo t

nh h

ng theo

ng t nh các lo i d u n

c, có

th s n xu t t nhi u ngu n nguyên li u khác nhau v i th i gian s n xu t ng n, d
dàng m r ng quy mơ cơng nghi p [11].

m men Yarrowia lipolytica có kh n ng tích l y m t l
có th dùng

s n xu t d u sinh h c. Hàm l

thu c vào s phát tri n và

ng l n ch t béo và

ng ch t béo trong n m men này tùy

u ki n nuôi c y. Ngu n carbon khác nhau s cho kích

và thành ph n ch t béo khác nhau. M t s cơng trình nghiên c u trên th gi i s
ng glucose làm ngu n carbon
a glucose khá cao s

nh h

s n xu t ch t béo [10],[12]. Tuy nhiên, do giá
ng

n giá thành s n ph m. Vì v y, các ngu n

carbon thay th có giá m m h n ã

c nghiên c u nh glycerol công nghi p,

pectin và lactose, th y phân các ch t b

i [12],[13]. Trong ó,

ng thu

th y phân nguyên li u lignocellulose là ngu n carbon ti m n ng, r ti n

ct
s n xu t

u vi sinh v t [14].
Bã mía là m t trong nh ng ngu n lignocellulose khá ph bi n
i, trong ó có Vi t Nam. Thơng th

c nhi t

ng, mía sau khi tr i qua quá trình xay xát s

c dùng làm th c n cho trâu bò, cung c p nhi t,
ho c k t h p v i các ph gia khác

các n

n cho nhà máy mía

ng

s n xu t ván sàn ép, phân bón. Nh ng bi n

pháp x lý này ch a khai thác h t ti m n ng c a bã mía, ơi khi s gây ô nhi m môi

3

tr

ng [15],[16]. Vì v y, n u chúng ta tìm

lý s

c cách s d ng bã mía m t cách h p

em l i nhi u l i ích v kinh t , môi tr

ng và nâng cao giá tr cây mía.

Vi c nghiên c u s d ng ngu n lignocellulose giàu h p ch t carbonhydrate
nh bã mía làm nguyên li u
th

ng i úng

n,

s n xu t biodiesel v i s h tr c a vi sinh v t là

y ti m n ng và có hi u qu .

ó c ng là lý do mà

tài

ng d ng bã mía th y phân ni c y n m men Yarrowia lipolytica Po1g có kh
ng sinh t ng h p ch t béo” c a chúng tôi mu n óng góp m t ph n nh vào b c
tranh nhiên li u sinh h c c a th gi i.
1.2. M c tiêu
c ích chung c a

tài: nghiên c u kh n ng tích l y ch t béo c a n m

men Yarrowia lipolytica Po1g trong môi tr
c tiêu c n

t

c trong

– Nghiên c u tìm ra
ng axit lỗng

ng bã mía th y phân.

tài:

u ki n thích h p cho q trình th y phân bã mía
thu

c dung d ch th y phân có hàm l

ng

ng

cao nh t.
– Nghiên c u tìm ra

u ki n thích h p cho q trình lên men v i kh

ng tích l y ch t béo cao nh t.
1.3. N i dung nghiên c u
Các n i dung chính c n ph i th c hi n

t

c m c tiêu nêu trên

Quá trình th y phân
– Kh o sát nh h

ng c a th i gian

n quá trình th y phân.

– Kh o sát nh h

ng c a n ng

– Kh o sát nh h

ng c a t l bã mía và dung d ch axit

axit

n quá trình th y phân.

phân.
– Kh o sát nh h

ng c a nhi t

n quá trình th y phân.

n quá trình th y


4

Q trình ni c y
– Kh o sát nh h

ng c a th i gian

n s sinh tr

ng và tích l y ch t béo

a n m men.
– Kh o sát nh h

ng c a ngu n carbon

n s sinh tr

ng và tích l y ch t

béo c a n m men.
– Kh o sát nh h

ng c a ngu n nit

n s sinh tr

ng và tích l y ch t

béo c a n m men.
– Kh o sát nh h

ng c a nhi t

n s sinh tr

ng c a n ng

ng t ng

ng và tích l y ch t béo

a n m men.
– Kh o sát nh h

y ch t béo c a n m men.

n s sinh tr

ng và tích


5

CH

NG 2

NG QUAN

2.1. D u vi sinh v t
u vi sinh v t hay d u
lo i d u có th

n

c thu

nh d u th c v t hay m

n bào (single cell oil, SCO)

c

nh ngh a là các

c t vi sinh v t, có hình thái và thành ph n t
ng v t. Hàm l

ng d u cao

ng t

c tìm th y trong nhi u

lồi vi khu n, n m men, n m và vi t o. Ngày nay, d u vi sinh v t

c xem nh s n

ph m cơng ngh sinh h c óng vai trị quan tr ng trong vi c cung c p chính các axit
béo khơng bão hịa a (axit docosahexaenoic (DHA), axit arachidonic (AA) và axit
γ-linolenic (GLA),…) – ây là các ch t dinh d
con ng

ng c n thi t cho s phát tri n c a

i [17].
u vi sinh v t

c s n xu t

u tiên vào tr

c chi n tranh th gi i th hai,

khi d u và ch t béo r t khan hi m. Nh ng n m sau ó, do thi u các ngu n cung c p

axit béo khơng bão hịa t th c
tiêu th
bào

ng m i.
c bi t

(SE) mà chúng

ng v t nên d u

i v i vi sinh v t, ch t béo

n bào

c xem nh m t m c

c tích l y trong nh ng c quan t

c g i là h t ch t béo. Nó bao g m các triacylglycerol và steryl este
c bao quanh b i m t l p phospholipid

n v i m t vài protein

ng vào [17]. Do d u vi sinh v t r t có ti m n ng trong t

ng lai vì có th s n xu t

a trên ngu n nguyên li u là r m, r , bã mía – ây

c xem là ph ph ph m

nơng nghi p có th gây nh h
qu . Ngồi ra, do có tính ch t t

ng

n mơi tr

ng n u khơng có h

ng x lý hi u

ng t nhau (B ng 2.1) nên d u vi sinh v t

xem nh là m t ngu n ch t béo thay th ch t béo truy n th ng nh d u

c

ng th c

t trong s n xu t biodiesel và là ngu n th c n nuôi tr ng th y s n [11],[18].


6

ng 2.1 Thành ph n ch t béo c a vi sinh v t cho d u và d u

ng th c v t

[19],[20]

C16:0

C16:1

Thành ph n ch t béo
C18:0
C18:1
C18:2

C18:3

Khác

12 – 21
11 – 37
7 – 23
8 – 10
t
24
26
t
13

55 – 57
1–6
1–6
10 – 11

1–2
1 – 10
2–6
11 – 12

58 – 60
28 – 66
29 – 82
25 – 28

4 – 20
3 – 24
8 – 40
14 – 17

14 – 30
1–3
4 – 42
–

–
–
–
–

4
3

19
14

43
44

3
10

1
–

6
3

1

3

71

10

1

1

11

–

4

54

7

–

–

11

–

2

48

32

–

1

Lo i
Vi sinh v t
Vi t o
m men
m
Vi khu n
u ng v

bò
heo
u th c v
u oliu
u u
nành
u u
ph ng

2.2. Ch t béo
Ch t béo là nh ng h p ch t h u c ph bi n trong t nhiên và trong c th
ng th c v t và vi sinh v t, th
c tính khơng tan trong n

ng là este c a các axit béo và r

u. Ch t béo có

c, ch tan trong các dung môi h u c nh cloroform,

benzen, acetone, c n [21],[22],[23]. Phân lo i ch t béo có th d a vào: tính ch t v t
lý

nhi t

phịng (d u

d ng l ng, m

c và trung tính), s c n thi t c a ch t béo

d ng r n), tính phân c c (ch t béo phân
i v i con ng

i (axit béo thi t y u và

không thi t y u), c u trúc c a ch t béo. Tuy có nhi u cách phân lo i nh ng phân
lo i d a vào c u trúc là h p lý và thông d ng nh t [23]. D a vào c u trúc, ng
chia ch t béo thành hai lo i ch t béo
–

i v i ch t béo

i ta

n gi n và ph c t p:

n gi n trong phân t ch ch a C, H và O; bao g m axit

béo, triacylglycerol, sterol, sterol este và sáp [23].
–

i ch t béo ph c t p ngồi C, H và O trong phân t cịn ch a m t s
nguyên t

khác nhau P, S và N; bao g m glycerophospholipid

(phospholipid), glyceroglycolipid (glycolipid), sphingolipid [23].