Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp g csf trên e coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp g csf

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỔ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT KỸ THUẬT HĨA HỌC
BỘ MƠN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
---------------o0o---------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHẢO SÁT BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP
G-CSF TRÊN E.COLI VÀ NGHIÊN CỨU QUY
TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN
TÁI TỔ HỢP G-CSF
GVHD: PGSTS. Nguyễn Thúy Hƣơng
HV:

Đặng Thị Tuyết Ân (11310602)

TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2012


CƠNG TRÌNH ĐƢỢC HỒN THÀNH TẠI
CƠNG TY TNHH CNSH DƢỢC NANOGEN

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THÖY HƢƠNG
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 1:……………………………………………………………
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký)

Cán bộ chấm nhận xét 2:……………………………………………………………
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị, chữ ký)

Luận văn thạc sĩ đƣợc bảo vệ tại trƣờng Đại Học Bách Khoa, ĐHQG Tp. Hồ Chí
Minh ngày 16 tháng 12 năm 2012
Thành phần hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm:
(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ
1. PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG
2. TS. PHAN NGỌC HÕA
3. ……………………………………..
4. ……………………………………..
5. ………………………………….....
6.
Xác nhận của chủ tịch hội đồng đánh giá luận văn và trƣởng khoa quản lý chuyên
ngành sau khi luận văn đã đƣợc sửa chữa (nếu có)
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TRƢỞNG KHOA


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

Cộng hòa xã hội chủ nghĩa Việt Nam

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: ĐẶNG THỊ TUYẾT ÂN…………………….MSHV: 11310602
Ngày, tháng, năm sinh: 24/03/1986…………………………...Nơi sinh: Quảng Nam
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC……………………Mã số: 604280

I. TÊN ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP G-CSF
TRÊN E.COLI VÀ NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH PROTEIN TÁI
TỔ HỢP G-CSF
II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
 Tạo dòng gen hg-csf vào vecto pET-26b(+)

 Dựng đƣờng cong sinh trƣởng của chủng biểu hiện BL21DE3 mang vecto tái
tổ hợp pET26b(+)-hg scf
 Khảo sát sự biểu hiện của protein hG-CSF
 Tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF
III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 04/ 11/2011
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 02/07/2012
V. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN THUÝ HƢƠNG
Tp. Hồ Chí Minh, ngày ….. tháng…… năm ……
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS. TS. Nguyễn Thúy
Hƣơng, TS. Đỗ Minh Sĩ, cô và thầy đã định hƣớng, tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ, kiểm
tra tiến độ làm việc, động viên tơi rất nhiều trong suốt q trình thực hiện và viết
luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tổng giám đốc công ty TNHH CNSH Dƣợc Nanogen –
anh Hồ Nhân – anh đã tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành tốt luận văn này.
Tơi xin cám ơn chị Nguyễn Thị Thùy Trang, anh Nguyễn Trƣơng Trọng Nghĩa, chị
Lê Thị Thanh Nga, chị Hoàng Thị Linh Sa, bạn Nguyễn Mai Khôi và các anh chị

em thuộc bộ phận R&D, MP của công ty TNHH CNSH Dƣợc Nanogen lời cám ơn
chân thành. Xin cám ơn mọi ngƣời đã tạo mọi điều kiện, luôn theo sát và giúp đỡ để
tơi hồn thành từng phần nhỏ của luận văn.
Tơi xin cám ơn các thầy cô trƣờng Đại học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh đã giúp đỡ
tơi những năm qua, đặc biệt là các thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã truyền
đạt những kiến thức cũng nhƣ những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều kiện thuận
lợi trong q trình theo học để tơi có đƣợc nhƣ ngày hôm nay – chân thành cảm ơn!
Xin cảm ơn bố mẹ, gia đình và những ngƣời thƣơng yêu nhất của tơi đã ln là chỗ
dựa vững chắc, đã khuyến khích động viên và tạo mọi điều kiện cho chúng tôi trong
suốt thời gian học tập.
Cuối cùng, xin gửi đến các anh chị, tất cả bạn bè thân thiết của tôi – những ngƣời
luôn sát cánh cùng tôi, giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều cả trong học tập lẫn trong
cuộc sống – lời cảm ơn chân thành nhất.
Tp. Hồ Chí Minh tháng 8 năm 2012
Đặng Thị Tuyết Ân


TĨM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ
hG-CSF (yếu tố kích thích sự tăng trƣởng của tế bào hạt), gồm 174 amino axit, là
một hoocmon kích thích tủy xƣơng sản xuất bạch cầu hạt và tế bào gốc, sau đó đƣa
vào máu. hG-CSF đƣợc chỉ định dùng cho bệnh nhân bị ung thƣ đƣợc điều trị bằng
phƣơng pháp hóa trị, bệnh nhân bị giảm bạch cầu trung tính mãn tính nghiêm trọng.
Trong nghiên cứu này, đoạn gen hg-csf đƣợc dịng hóa vào vector pET26b(+) để tạo
thành vector pET26b(+) G-CSF và đƣợc chuyển vào chủng biểu hiện BL21(DE3).
Dòng tế bào này sẽ biểu hiện vƣợt mức trong môi trƣờng LB bổ sung 0,4% glucose,
0,5Mm IPTG, lắc ở chế độ 250 vòng/phút ở nhiệt độ 370C trong thời gian 6 giờ.
Quá trình tinh sạch protein G-CSF từ thể vùi của tế bào E.Coli có độ tinh sạch >
95% và protein tổng số thu đƣợc > 1mg/ml ở pH 3,5 – 4,0. Trọng lƣợng phân tử của
protein G-CSF sau khi tinh sạch nằm trong khoảng 18 – 20 KDa, khơng có lẫn
DNA của tế bào chủ, khơng có edotoxin và có hoạt tính sinh học.

ABSTRACT
hG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor), consisting of 174 amino
acid, is a colony-stimulating factor hormone, to stimulate the bone marrow to
produce granulocytes and stem cells. G-CSF then stimulates the bone marrow to
release them into the blood. hG-CSF was approved to treat for cancer patients
receiving myelosuppressive chemotherapy, patients with acute myeloid leukemia
receiving induction or consolidation chemotherapy patients with severe chronic
neutropenia. In this study, gene endoing for hG-CSF was cloned to pET26b(+)GCSF expression vector and transformed to E.coli to create E.coli BL21(DE3) GCSF1 strain used to overexpress hG-CSF in LB medium with 0.4% glucose, 0.5mM
IPTG, 250rpm, 370C, 6 hours. Extraction and purification of hG-CSF procedure
archived the recombinant hG-CSF with purity of >95%, total protein concentration
>1mg/ml, pH 3.5-4.5, molecular weight of 18-20 KDa, no host cell derived DNA
and peptide residue contamination, endotoxin free and the biological activity of
101.13 MU/m


MỤC LỤC
MỤC LỤC............................................................................................................................i
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ....................................................................vi
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ PHỤ LỤC .................................................................. viii
PHẦN 1: TỔNG QUAN ......................................................................................................
1.1. Tổng quan về nhân tố kích thích dịng tế bào bạch cầu hạt G-CSF .................. 1
1.1.1.

Giới thiệu ...................................................................................................... 1

1.1.2.

Nguồn gốc ..................................................................................................... 1

1.1.3.

Vị trí hình thái .............................................................................................. 3

1.1.4.

Cấu trúc ........................................................................................................ 4

1.2. Chức năng sinh học................................................................................................. 6
1.2.1.

Cảm ứng sự tăng sinh .................................................................................. 6

1.2.2.

Kích hoạt sự biệt hóa ................................................................................... 7

1.2.3.

Các tác dụng khác trên tế bào bạch cầu hạt trung tính đã trƣởng
thành ............................................................................................................. 8

1.2.4.

Tác dụng của G-CSF bên ngoài hệ thống tế bào máu .............................. 9

1.3. Cơ chế hoạt động..................................................................................................... 9
1.4. Ứng dụng ............................................................................................................... 12
1.4.1.

Trong phản ứng viêm ................................................................................ 13

1.4.2.

Trong cấy ghép tế bào/mô/cơ quan .......................................................... 14

1.4.3.

G-CSF trong cấy ghép tế bào mầm .......................................................... 15

1.4.4.

Trong điều trị bệnh Neutropenia (bệnh giảm bạch cầu trung tính) ..... 15

1.5. Bệnh giảm bạch cầu trung tính (Neutropenia), nguy cơ bị bệnh giảm
bạch cầu trung tính trong điều trị hóa trị của bênh nhân ung thƣ và
cách điều trị ........................................................................................................... 16
1.5.1.

Bệnh giảm bạch cầu trung tính ................................................................ 16

i


1.5.2.

Nguy cơ bị bệnh giảm bạch cầu trung tính trong điều trị hóa trị
của bệnh nhân ung thƣ .............................................................................. 18

1.5.3.

Cách điều trị ............................................................................................... 19

1.6. Tình hình sản xuất hG-CSF trên thế giới và nhu cầu ở Việt Nam .................. 20
1.6.1.

Tình hình sản xuất hG-CSF trên thế giới ................................................ 20

1.6.2.

Tình hình ung thƣ và nhu cầu sản xuất hG-CSF tái tổ hợp ở Việt
Nam ............................................................................................................. 23

1.7. Tổng quan về tạo dòng và biểu hiện protein ngoại lai trong E.Coli ................ 24
1.7.1.

Tổng quan về tạo dòng .............................................................................. 24

1.7.2.

Biểu hiện protein ngoại lai trong E.coli ................................................... 25

1.7.2.1. Hệ thống vector biểu hiện pET-26b(+) .................................................... 25
1.7.2.2. Chủng biểu hiện BL21(DE3) .................................................................... 28
1.8. Các nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về hG-CSF .............................................. 29
1.8.1.

Các nghiên cứu trong nƣớc ....................................................................... 29

1.8.2.

Các nghiên cứu ngoài nƣớc ....................................................................... 31

PHẦN 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................ 33
2.1. Nguyên vật liệu ...................................................................................................... 33
2.1.1.

Thiết bị, dụng cụ ........................................................................................ 33

2.1.2.

Hóa chất ...................................................................................................... 34

2.2. Phƣơng pháp ......................................................................................................... 38
2.2.1.

Sơ đồ nghiên cứu chung ............................................................................ 38

2.2.2.

Nội dung nghiên cứu .................................................................................. 40

2.2.3.

Các phƣơng pháp phân tích...................................................................... 48

PHẦN 3: KẾT QUẢ......................................................................................................... 60
3.1. Tạo dịng gen hg-csf vào vector pET-26b(+) ...................................................... 60
3.2. Dựng đƣờng cong sinh trƣởng của chủng biểu hiện BL21(DE3) mang
vector tái tổ hợp pET26b(+)-hg csf ..................................................................... 64

3.3. Khảo sát sự biểu hiện protein hG-CSF ............................................................... 65

ii


3.3.1.

Dựa vào đƣờng cong sinh trƣởng, khảo sát thời điểm biểu hiện
IPTG cho kết quả biểu hiện cao nhất (Thí nghiệm 1) ............................ 65

3.3.2.

Khảo sát nồng độ IPTG cảm ứng (Thí nghiệm 2) .................................. 68

3.3.3.

Khảo sát lƣợng glucose bổ sung trong q trình ni cấy .................... 70

3.3.4.

Khảo sát số vịng lắc và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng ................... 72

3.3.5.

Khảo sát thời gian cảm ứng ...................................................................... 74

3.3.6.

Lên men thu nhận G-CSF quy mơ 5 lít để tiến hành nghiên cứu
quá trình tinh sạch ..................................................................................... 76

3.4. Tinh sạch protein hG-CSF ................................................................................... 76
3.4.1.

Tách chiết G-CSF ...................................................................................... 76

3.4.2.

Tinh sạch G-CSF........................................................................................ 80

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................ 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 85
PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 89

iii


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Quy định các chữ viết tắt
Kí hiệu/chữ viết tắt

Thuật ngữ tiếng Anh

Amp

Ampiciline

Ampr

Ampicilline resistance

APS

Ammonium Persulfate

bp

base pair

DNA

Deoxyribonucleoic

Acid

Triphosphate
E.coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylenendiamine Tetraacetic Acid

IPTG

Isopropyl-β-D-Thiogalactoside

Kan

Kanamycin

Kanr

Kanamycin resistance

Kb

kilobase

kDA

kiloDaltone

MCS

Multicloning site

ORF

Open Reading Frame

PCR

Polymerase Chain Reacton

PT7

Promoter T7

RNA

Ribonucleic Acid

Rnase

Ribonuclease

iv

Deoxyribonucleotide


SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE

Sodium

Dodecyl

Sulfate

Polyacrylamide

Electrophoresis
N, N, N, N-Tetramethyl-Ethylenediamine

TEMED

Quy định mã hóa cho amino acid:
Acid Glutamic

Glu

E

Leucine

Leu

L

Alanine

Ala

A

Lysine

Lys

K

Arginine

Arg

R

Methionine

Met

M

Asparagine

Asn

N

Phenylalanine

Phe

F

Aspartic acid

Asp

D

Proline

Pro

P

Cystein

Cys

C

Serin

Ser

S

Glutamine

Gln

Q

Threonine

Thr

T

Glycine

Gly

G

Tryptophan

Trp

W

Histidine

His

H

Tyrosine

Tyr

Y

Isoleucine

Ile

I

Valine

Val

V

v

Gel


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Các tế bào sản sinh G-CSF .................................................................................. 3
Hình 1.2: Cấu trúc gen g-csf, mRNAG-CSF và protein G-CSF .......................................... 4
Hình 1.3: Trình tự amino acid của protein G-CSF ............................................................. 5
Hình 1.4: Cấu trúc protein G-CSF ...................................................................................... 5
Hình 1.5: Vai trị của G-CSF trong việc hình thành tế bào máu ......................................... 8
Hình 1.6: Mơ hình thụ thể ................................................................................................. 10
Hình 1.7: Phức hợp của G-CSF/GCSF-R .......................................................................... 11
Hình 1.8: Các con đƣờng truyền tín hiệu của G-CSF........................................................ 12
Hình 1.9: Cơ chế điều hịa phản ứng viêm ........................................................................ 13
Hình 1. 10: Các sản phẩm G-CSF thƣơng mại .................................................................. 24
Hình 1.11: Qúa trình kiểm sốt của promotor T7lac ......................................................... 27
Hình 1.12: Ảnh hƣởng của T7lysozyme đến T7 RNA polymerase. ................................. 28
Hình 1.13: Cơ chế biểu hiện ở BL21(DE3) .............................................................................29
Hình 2.1: Thang protein (A) và thang DNA (B) – fermentas ................................................38
Hình 3.1: Thu nhận đoạn gen hg-csf ................................................................................. 61
Hình 3.2: Sơ đồ của vector pET26b(+) .............................................................................. 62
Hình 3.3: kết quả PCR khuẩn lạc để sàn lọc dòng tái tổ hợp ............................................ 63
Hình 3.4: Sơ đồ vector tái tổ hợp pET26b(+)-hg csf ......................................................... 63
Hình 3.5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng BL21(DE3) mang vector tái tổ hợp
pET26b(+)-hg csf ............................................................................................................... 64
Hình 3.6: Khảo sát thời điểm cảm ứng IPTG .................................................................... 65

Hình 3.7: Khảo sát cảm ứng nồng độ IPTG ...................................................................... 68
Hình 3.8: Kết quả khảo sát nồng độ glucose bổ sung vào mơi trƣờng LB trƣớc khi
cảm ứng .............................................................................................................................. 70
Hình 3.9: Kết quả khảo sát số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng ............................................ 72
Hình 3.10: Khảo sát biểu hiện G-CSF theo thời gian ........................................................ 74
Hình 3.11: Kết quả lên men 5L trong chai Schott ............................................................ 76

vi


Hình 3.12: Phổ trong giai đoạn cation ............................................................................... 81
Hình 3.13: phổ giai đoạn loại muối ................................................................................... 81
Hình 3.14: Phổ giai đoạn sử dụng cột CM ........................................................................ 82
Hình 3.15: SDS-PAGE (A) và Western blot (B) các giai đoạn tinh chế ........................... 82
Hình 3.16: Phổ chạy kiểm tra độ sạch của mẫu tinh chế G-CSF bằng HPLC .................. 83

vii


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ PHỤ LỤC
Bảng 1. 1: Các dạng G-CSF tái tổ hợp và các chỉ định đƣợc công nhận .......................... 22
Bảng 3. 1: Kết quả ELISA theo thời điểm bố sung chất cảm ứng .................................... 67
Bảng 3. 2: Kết quả ELISA theo nồng độ IPTG cảm ứng .................................................. 69
Bảng 3. 3: Kết quả ELISA theo nồng độ glucose .............................................................. 71
Bảng 3. 4: Kết quả ELISA theo số vòng lắc và nhiệt độ cảm ứng .................................... 73
Bảng 3. 5: Kết quả ELISA theo thời gian cảm ứng ........................................................... 75
Bảng 3. 6: Kết quả ELISA lên men 5L.............................................................................. 79
Phụ lục 1: Số liệu thô của đƣờng cong sinh trƣởng .......................................................... 89
Phụ lục 2: Kết quả so sánh giải trình tự gen sau khi dịng hóa vào vector pET26b(+)
và trình tự gen ban đầu ....................................................................................................... 90

Phụ lục 3: Kết quả giải trình tự ......................................................................................... 91
Phụ lục 4: Phổ đồ HPLC ................................................................................................... 93

viii


PHẦN MỞ ĐẦU
Ngày nay, khi xã hội càng phát triển thì nhiều căn bệnh cũng xuất hiện theo. Hiện
nay căn bệnh ung thƣ ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung đang rất phổ
biến, việc tìm ra các phƣơng pháp cũng nhƣ các loại thuốc đặc trị là vấn đề cấp thiết
đƣợc đặt ra và đó cũng là lúc công nghệ sinh học bắt đầu phát triển.
Ở Việt Nam, tình hình ung thƣ đang ngày càng có xu hƣớng tăng cao, các bệnh
nhân ung thƣ cần điều trị cũng ngày càng gia tăng. Theo thống kê của Bệnh viện K,
tỷ lệ ngƣời mắc bệnh ung thƣ máu trên 100.000 dân vào năm 2001-2004 đƣợc
thống kê nhƣ sau: tại Hà Nội ghi nhận đƣợc 66 ca (30,8%), Hải Phịng 12 ca bằng
số ca với u lympho ác tính (15,4%), Thái Nguyên 26 ca (46,4%), Thừa Thiên Huế
24 ca (30,1%), Cần Thơ 34 ca (30,9%).
Hóa trị liệu ung thƣ hiện vẫn là một trong những phƣơng pháp điều trị ung thƣ chủ
yếu ở Việt Nam, do đó nhu cầu sử dụng G-CSF để giảm thiểu các rủi ro gây ra do
neutropenia trong quá trình điều trị là rất lớn. Hiện nay, sản phẩm G-CSF thƣơng
mại có mặt ở Việt Nam là Neupogen® do cơng ty Amgen sản xuất và đƣợc nhập
chủ yếu từ hãng Hoffmann – La Roche. Ở bệnh nhân điều trị bằng phƣơng pháp hóa
trị bị mắc neutropenia, liều Neupogen đƣợc chỉ định dùng là 0.5MUI
(5mcg/kg/ngày), tiêm một lần trong ngày. Với một bệnh nhân 60kg, lƣợng thuốc
cần dùng là 1 lọ Neupogen 30MUI (300mcg hay 0,3mg). Với giá thành một lọ tiêm
300mcg/ml Neupogen là 1.760.000 VND, điều trị trong 2 tuần với trƣờng hợp bệnh
nhân hóa trị ung thƣ không liên quan đến tủy. Nhƣ vậy thì chi phí điều trị là một
mối lo hàng đầu của các bệnh nhân ung thƣ. Do đó việc sản xuất G-CSF giá thành
rẻ là điều rất cần thiết ở Việt Nam.
Trong định hƣớng sản xuất G-CSF với giá thành rẻ phục vụ cho bệnh nhân mắc

bệnh neutropenia trong quá trình hóa trị ung thƣ, phịng nghiên cứu phát triển thuộc
công ty trách nhiệm hữu hạn công nghệ sinh học dƣợc Nanogen đã thực hiện các
nghiên cứu tạo dòng tế bào vi sinh vật có khả năng tổng hợp G-CSF phục vụ cho


việc phát triển công nghệ sản xuất G-CSF làm thuốc. Trong giới hạn của luận văn
này, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Khảo sát biểu hiện protein tái tổ hợp G-CSF
người trên E. Coli và nghiên cứu quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp G-CSF” với
các nội dung nhƣ sau:
- Dịng hóa gen hg-csf mã hóa cho protein G-CSF của ngƣời vào vectơ biểu
hiện pET26b(+) và tiến hành biểu hiện trên E.Coli
- Khảo sát điều kiện biểu hiện protein G-CSF xoanh quanh các nội dung: thời
điểm biểu hiện, nồng độ chất cảm ứng, lƣợng glucose bổ sung, số vòng lắc
và nhiệt độ trong quá trình cảm ứng, thời gian cảm ứng.
- Lên men 5 lít để thu nhận G-CSF
- Tinh sạch protein G-CSF từ dịch tách chiết của 5 lít lên men.
- Kiểm tra độ tinh sạch bằng hệ thống HPLC


CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN


Tổng quan

1.1.

Luận văn thạc sĩ

Tổng quan về nhân tố kích thích dịng tế bào bạch cầu hạt G-CSF

1.1.1. Giới thiệu
hG-CSF (human Granulocyte Colony-Stimulating Factor) là một cytokine có bản
chất là glycoprotein, bao gồm 174 amino axít, đóng vai trị quan trọng trong phát
sinh tế bào máu, biệt hóa các tiền tế bào máu và hoạt hóa các tế bào bạch cầu hạt
trung tính trƣởng thành. G-CSF đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh giảm
bạch cầu do hóa trị. G-CSF của chuột lần đầu tiên đƣợc nhận diện và tinh chế tại Öc
vào năm 1983. Năm 1986, Nigata và cộng sự đã sử dụng mẫu dò oligonucleotide để
thu nhận cDNA bằng lai Southern Blot và sử dụng cDNA này làm khn để dịng
hóa và biểu hiện G-CSF, báo cáo này đã mở ra thời kỳ sản xuất hG-CSF tái tổ hợp
với số lƣợng lớn. Có hai trình tự amino axit của G-CSF, một trình tự bao gồm 174
amino axit và một trình tự bao gồm 177 amino axit. Sự khác nhau của hai trình tự
này là do quá trình cắt bỏ các đoạn intron, một mRNA cắt bỏ còn 174 amino axit và
một mRNA cắt bỏ còn 177 amino axit. Nhiều nghiên cứu cho thấy phân tử G-CSF
có trình tự bao gồm 177 amino axit có hoạt tính thấp hơn nhiều so với G-CSF có
trình tự bao gồm 174 amino axit. [1, 2]
1.1.2. Nguồn gốc
G-CSF cũng nhƣ các nhân tố tăng trƣởng khác, đƣợc sản xuất ở nhiều loại mô và tế
bào khác nhau trong cơ thể nhƣ nguyên bào sợi, đại thực bào, những tế bào nội mô
và các tế bào nền tủy xƣơng qua trung gian là các cytokine (interleukine-1,
interleukine-6) và các nhân tố TNFα qua con đƣờng tín hiệu thứ 2. Tuy nhiên, các
mơ thơng thƣờng chỉ sản xuất G-CSF khi bị kích thích. [3]
Sau khi G-CSF đƣợc tạo ra, chúng lập tức làm nhiệm vụ biệt hóa những tế bào gốc
trong tủy xƣơng thành tế bào bạch cầu hạt trung tính trƣởng thành và đồng thời
kích thích đƣa chúng vào hệ máu ngoại vi để thực hiện nhiệm vụ của chúng. [4]
Ở điều kiện bình thƣờng, nồng độ G-CSF trong huyết thanh của ngƣời ở mức khơng
phát hiện đƣợc hoặc ở mức rất thấp (ít hơn 100pg/ml). Tuy nhiên trong các đáp ứng

1

Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

đối với sự xâm nhiễm, nồng độ G-CSF tăng cao và có thể đạt đến 2000pg/ml, và chỉ
hạ xuống mức bình thƣờng sau khi phục hồi. [5]

2


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.1: Các tế bào sản sinh G-CSF [3]
1.1.3. Vị trí hình thái
Gen mã hố cho G-CSF của ngƣời tồn tại ở dạng đơn bản sao, định vị ở vùng q1122 thuộc nhiễm sắc thể 17, dài khoảng 2,5Kb, bao gồm 5 exon và 4 intron. Trong
đó, vùng 300bp ở đầu 5‟ của vị trí khởi sự phiên mã đóng vai trị kiểm sốt sự biểu
hiện của gen g-csf. Đoạn trình tự giàu AU trong vùng 3‟ khơng mã hóa là vị trí cốt
yếu làm mất tính ổn định của phân tử mRNA của G-CSF, ảnh hƣởng đến sự biểu
hiện ở mức độ phiên mã và hậu phiên mã. mRNA của G-CSF sau khi hình thành
trải qua q trình chế biến từ đó dịch mã thành 2 chuỗi polypeptide khác nhau từ
3


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

cùng một gen cấu trúc. Những mRNA này mã hóa cho hai protein tiền chất lần lƣợt

dài 204 và 207 amino acid. Đầu N của chúng có chứa trình tự leader ƣa nƣớc dài 30
amino acid đặc trƣng ở các protein tiết, khi bị cắt sẽ tạo nên hai phân tử protein
trƣởng thành với 174 và 177 amino acid. Phân tử G-CSF dài 174 amino acid là
phân tử chiếm ứu thế và có hoạt tính mạnh hơn so với phân tử 177 amino acid. [6]

Hình 1.2: Cấu trúc gen g-csf, mRNAG-CSF và protein G-CSF [6]
1.1.4. Cấu trúc
hG-CSF trƣởng thành có 174 amino axit, nặng 18.7 kDa, có 5 gốc cystein: Cys17,
Cys36, Cys42, Cys64, Cys74 tạo thành 2 cầu nối disulfide Cys36-Cys42, Cys64Cys74 và 1 cystein tự do ở vị trí Cys17. hG-CSF tự nhiên khơng có vị trí Nglycosyl nhƣng có một vị trí O-glycosyl hóa tại vị trí Thr133 nhằm bảo vệ hG-CSF
khỏi sự kết tủa ở pH trung tính và đảm bảo tính ổn định cho hG-CSF, nhƣng nó
khơng cần thiết cho hoạt tính sinh học. hG-CSF tái tổ hợp trong E. coli đƣợc tổ
chức thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ chứng minh rằng chúng có thể đƣợc sử dụng nhƣ
một lọai thuốc trong điều trị bệnh giảm bạch cầu cấp.

4


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.3: Trình tự amino acid của protein G-CSF [2]
Trong cấu trúc không gian 3 chiều, G-CSF là một bó 4 xoắn α nằm đối song với
nhau, 4 xoắn đƣợc đánh kí hiệu từ A-D bắt đầu từ đầu N. Ngồi bốn xoắn chính,
cấu trúc G-CSF cịn có thêm một xoắn phụ E nhỏ hơn nối xoắn A và xoắn B. Hai
cầu nối disulfide Cys36 – Cys42 và Cys64 – Cys74 nằm đối diện nhau trong vịng
nối giữa xoắn A và xoắn B.

Hình 1.4: Cấu trúc protein G-CSF [2]
A. Mơ hình cấu trúc phẳng

B. Cấu trúc khơng gian

Hoạt tính sinh học của G-CSF đƣợc quyết định bởi tính tồn vẹn cấu trúc của phân
tử. Sự phá vỡ một hoặc cả hai cầu nối disulfide làm mất cấu trúc gấp cuộn vì thế
làm giảm hoạt tính G-CSF một cách đáng kể. Tƣơng tự, các đột biến mất đoạn hay
lặp lại các đoạn nhỏ trong cấu trúc protein nằm trong vùng amino acid 18 đến đầu C
(từ amino acid 165 đến 174) làm biến đổi căn bản cấu trúc bậc 4 đều dẫn đến mất
5


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

hoạt tính G-CSF. Ngƣợc lại, khi loại bỏ 11 amino acid đầu tiên không làm ảnh
hƣởng đến hoạt tính sinh học. Đột biến ở Cys17 thành Ser17 đã đƣợc chứng minh là
tăng hoạt tính sinh học và làm ổn định cấu trúc protein.
Các đột biến điểm tại Leu35 và Glu46 cũng làm mất chức năng của G-CSF. Tầm
quan trọng của vùng lân cận hai bên những axit amin này cũng đã đƣợc nghiên cứu.
Kháng thể trung hoà G-CSF gắn với G-CSF tại vùng axit amin 20 – 46 bao gồm đầu
C của xoắn A và phần vòng nối AB chứa cầu nối disulfide đầu tiên và phần xoắn
phụ. Vùng 20 – 46 này cùng với vùng 165 – 174 đƣợc xem là vùng tạo nên vị trí
gắn với thụ thể của G-CSF.
Các đột biến tại Leu35 và Glu46 sẽ làm mất chức năng của G-CSF, tầm quan trọng
của vùng lân cận hai bên các amino acid này cũng đã đƣợc làm rõ. Ngƣời ta nhận
thấy dạng G-CSF 177 amino acid chứa thêm ba amino acid nằm giữa Leu35 và
Cys36 đã làm giảm đáng kể hoạt tính sinh học của nó. Các kháng thể của G-CSF
gắn với G-CSF tại vùng amino acid 20-46. Cấu trúc không gian của vùng amino
acid 20-46 bao gồm đầu C của xoắn A và phần vòng nối AB (loop AB) chứa cầu

nối disulfide đầu tiên và phần xoắn phụ E. Vùng 20-46 cùng với vùng 165-174
đƣợc chứng minh là tạo nên vị trí gắn với thụ thể của G-CSF. [7]
1.2.

Chức năng sinh học

1.2.1. Cảm ứng sự tăng sinh
Cảm ứng sự tăng sinh là một hoạt tính đặc trƣng của G-CSF. Khi thử nghiệm nuôi
cấy không phân đoạn các tế bào tủy ngƣời và chuột trên mơi trƣờng ni cấy có bổ
sung G-CSF, kết quả cho thấy G-CSF kích thích hình thành lƣợng nhỏ các dịng
bạch cầu hạt trung tính. Các nhà nghiên cứu cho rằng G-CSF đã kích thích sự tăng
sinh của các tế bào bằng cách chuyển các tế bào ở giai đoạn nghỉ (giai đoạn G0) vào
chu trình tế bào để tiếp tục quá trình phân chia. Tuy nhiên, khả năng cảm ứng tăng
sinh của G-CSF không giới hạn trong phạm vi tiền bạch cầu hạt trung tính. Các
nghiên cứu in vitro đã cho thấy G-CSF cịn có hoạt tính tăng sinh các tiền bào của

6


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

các dòng tế bào máu khác. Đối với những dòng tế bào này, dƣờng nhƣ G-CSF hoạt
động trong một mơ hình kết hợp với các nhân tố tăng trƣởng khác để thúc đẩy sự
tăng sinh của các tế bào tiền khởi. [8]
1.2.2. Kích hoạt sự biệt hóa
Sau vài lần kích thích phân chia tăng sinh, G-CSF kích hoạt sự biệt hóa các tế bào
tiền khởi tạo nên các dạng tế bào bạch cầu hạt trung tính. Với hoạt tính này cùng
với khả năng kích thích sự tăng sinh, G-CSF đóng một vai trị quan trọng trong sự

duy trì ổn định lƣợng bạch cầu hạt trung tính trong máu, cũng nhƣ điều hòa sự tạo
thành bạch cầu hạt trung tính trong các trƣờng hợp khẩn cấp. Thực nghiệm đã
chứng minh, khi thiếu G-CSF sẽ dẫn tới sự suy giảm của tế bào bạch cầu hạt trung
tính trong máu xuống 20% so với bình thƣờng, trong các trƣờng hợp khẩn cấp nhƣ
các đáp ứng đối với sự nhiễm trùng hay đáp ứng miễn dịch, lƣợng G-CSF tăng lên
rất nhiều và nhanh chóng (hình 1.5).
G-CSF cũng có vai trị đối với sự biệt hoá của các tế bào tạo máu khác. Tuy nhiên,
sự có mặt của G-CSF là chƣa đủ cho sự biệt hóa các dịng tế bào này mà cần có sự
kết hợp với các nhân tố khác. Trong khi đối với dòng tế bào bạch cầu hạt chỉ riêng
G-CSF là đủ cho sự tăng sinh và biệt hoá. [8]

7


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

Hình 1.5: Vai trị của G-CSF trong việc hình thành tế bào máu [8]
1.2.3. Các tác dụng khác trên tế bào bạch cầu hạt trung tính đã trưởng
thành
Trong điều kiện in vitro, sự có mặt của G-CSF tăng cƣờng thời gian sống sót của
các bạch cầu hạt trung tính. Các dữ liệu thực nghiệm cho thấy G-CSF đóng vai trị
nhƣ là một nhân tố chống lại sự phân huỷ tế bào theo chu trình chết của tế bào dẫn
đến việc tăng khả năng sống sót của các bạch cầu hạt trung tính cũng nhƣ các tiền
bào ở tuỷ xƣơng. Một loạt các chức năng của bạch cầu hạt trung tính cũng đƣợc
tăng cƣờng bởi G-CSF. Đặc biệt, G-CSF làm tăng các quá trình chế biến trong tế
bào liên quan đến việc bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của các vi sinh vật, bằng
cách làm cho các tế bào bạch cầu hạt trung tính trở nên phản ứng nhanh đối với
nhiều tác nhân kích thích.

G-CSF tăng khả năng gắn các peptide hƣớng hoá nhƣ N-formyl-Met-Leu-Phe
(fMLP) với bạch cầu hạt trung tính, đồng thời tăng khả năng đáp ứng in vitro đối
8


Tổng quan

Luận văn thạc sĩ

với những tác nhân kích thích này. G-CSF cũng điều hoà sự biểu hiện thụ thể C3b,
sự tạo ra các anion superoxide, giải phóng acid arachidonic và sự thực bào của các
tế bào bạch cầu hạt trung tính.
G-CSF có thể cảm ứng sự thay đổi ái lực của thụ thể Fc đối với IgA trên bạch cầu
hạt trung tính, giúp q trình thực bào qua trung gian IgA đƣợc dễ dàng hơn. GCSF cịn có hoạt tính hƣớng hố đối với bạch cầu hạt trung tính và bạch cầu đơn
nhân, làm tăng khả năng bám dính mạch của các bạch cầu hạt trung tính. [9]
1.2.4. Tác dụng của G-CSF bên ngoài hệ thống tế bào máu
G-CSF cũng có ảnh hƣởng bên ngồi hệ thống huyết học. Các nghiên cứu cho thấy
G-CSF tăng cƣờng sự tăng sinh và di cƣ trong in vitro của các tế bào nội mạc tĩnh
mạch rốn. Trong một mơ hình in vivo G-CSF gây phát sinh mạch và hình thành
mạch máu mới ở giác mạc thỏ.
Đặc biệt gần đây, nhiều vai trò của G-CSF đối với hệ thần kinh trung ƣơng cũng đã
đƣợc phát hiện. G-CSF có tác dụng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi tác dụng của
glutamate, G-CSF đóng vai trị giúp các tế bào thần kinh thốt khỏi sự chết theo
chƣơng trình trong mơ hình đột quỵ cấp tính in vivo. G-CSF cũng có tác dụng ức
chế q trình apoptosis làm tăng khả năng sống sót của các tế bào thần kinh cũng
nhƣ các tế bào gốc tổ tiên của chúng.
Đồng thời G-CSF cịn kích hoạt các tế bào gốc hình thành các tế bào thần kinh khác
nhau trong điều kiện in vitro cũng nhƣ in vivo. Các nghiên cứu khác cũng cho thấy
G-CSF tăng cƣờng khả năng hồi phục chức năng của các tế bào thần kinh sau khi
xảy ra chứng thiếu máu cục bộ ở vỏ não. [10]

1.3.

Cơ chế hoạt động

G-CSF thực hiện chức năng thông qua tƣơng tác với thụ thể GCSF-R (G-CSF
receptor) để hoạt hóa con đƣờng tín hiệu trong tế bào tiền thân của bạch cầu hạt
trung tính trong tủy xƣơng.

9