Nghiên cứu xây dựng công thức viên nang chứa cao Alkaloid chuẩn hóa từ lá sen (Nelumbo Nucifera Gaertn.)

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

Hai mẫu b và a cho trong các lần cùng thử nghiệm th cho số lượng

v s v

sống sót ngang nhau, đạt 4,8X

105 cfii/g sau 1 giờ và 2,9 X 10s sau 2 giờ. Điều này chứng tỏ việc bổ sung thêm tá được độn là tinh bột

không giúp cải thiện số lượng

v s v

sống sót trong điều kiện axít dạ dày.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của alginate đến khả năng sổng sót của vi k hụẩn L. acidophilus trong
quá tr n h tạo nang cứng

Bảng 5. Số lượng

v sv

sống sót trong 1 viên nang trong mơi tnrờng axít HC1 pH 1,2vói tốc độ khuấy 50 vòng/phút

SỐ IưọTĩgvsv

Ban đầu Sau 15 phút Sau 30 phlit Sail 1giờ Sau 2 giờ

M aul Mẫu 2 Mầu 1 Mâu 2 Mẫu 1 Mâu 2 Mầu 1 Mẫu 2

2,5 0,2 x10s1,5±0,1x10* 1,8±0,1 X 106

—:— —wm

m

1,3 ±0,1---X10311,5 0,1 X105 1,5 +0,1'X I023,7 ± 0,2X1G4 ­ ­

Chú thích: (­): khơng thấy xuất hiện khuẩn lạc

Kết quả cho thấy mầu nang có sử dụng alginate làm tá dược độn cho tỷ lệ sống sót v s v trong mơi trường
axít pH 1,2 lớn hơn so với mẫu nang có sử đụng tinh bột làm tá dược độn. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ sống
v s v của mẫu sử dụng aíginate cao gấp 100 lần so với mẫu sử dụng tinh bột. Như vậy, đối với mail naiig tinh
bột, lượng v s v sống sót bị giảm mạnh ngay trong 15 phút đầu, còn nang alginate lượng v s v sống sót bị
giảm mạnh sau 1,5 giờ. Tuy nhiên, sau 2 giờ trong mơi trường axít pH 1,2 hầu như khơng cịn v s v song sót.

IV. K ẾT LUẬN

Nghiên cứu đã đánh giá được ảnh hưởng của aiginate đến khả năng sống sót của v khuẩn L. acidophilus
trong quá tr nh đông khô. Khi sử dụng dung dịch natri alginate 2% ỉàm tá dược bảo vệ trong quá tr nh đồng
khô đã làm tăng tỷ lệ sống sót của L acidophilus so với mẫu đơng khơ với nước cất. Tuy nhiên, sản phẩm
thu được sau đông khơ với alginate 2% khó làm nhỏ và nhanh bị hút ẩm trở lại.

Nghiên cứu đánh giá được ảnh hưởng của alginate đến khả năng sống sót của vi khuẩn L. acidophilus
trong quá tr nh đóng thuốc bột và thuốc nang cứng. Khi sử dụng natri aíginat làm tá được độn cho dạng
thuốc bột probiotic trong điều kiện tiểp xổc với mơi trường axít HCi pH 1,2 cho số lượng VSV sống sót
khoảng (106 ­ 107 cfụ/g) cao hơn so với các mẫu không sử dụng thêm ta dược độn và mấu bột đơng khơ có
kết hợp tá dược độn thường dùng là tinh bột­ Trong điều kiện tiếp xúc với mơi trường axít pH 1,2 với tốc độ
khuấy 50 vòng/phút, mẫu nang cứng với alginate làm tá dược độn cho tỷ lệ v s v song sot cao hơn so VƠI
mâu nang cứng với tinh bột làm tá dược độn, và tỷ lệ này cao hơn so với mẫu thuốc bột.

TÀI LIỆU TH AM KHẢO
1. Bộ Y tế (2010), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học.

2. Nguyln Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đửc, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đ nh Quyển, Nguyễn Phùng
Tỉên, Phạm Văn Ty (Ỉ976). Một số phương pháp nghiên cứu v s v học. NXR Khoa học Kỹ thuật, tập 2, tr. 68,69,128.

3. Đào Thị Hạnh (2012). Nghiên cứu bào chế cốm probiotic chửa vi khuẩn Lactobacillus acidophilus. Luân văn
Thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội, tr,7­12.

4. Nguyễn Ngọc Hiệp, Bùi Timg Hiệp (2008). v s v trong sản phẩm probiotic, Tạp chí Dược học số 390.

5.Asma Soha ỉ, Mark s. Turner, Aỉĩan Coombes, Thor Bostrom, Bhesh Bhanđari (2011). Survivability of probiotic
encapsulated in alginat gel microbeads using a novel impinging earosols method. International Journal of Food
Microbiology. 145, pp.162­168.

6. c Morgan, G Vesey (2009). Freeze­Drying of Microorganisms, Elsevier, Australia.

7. Dianawati Dianawati, Vijay Mishra, Nagendra p. Shah (2013). Survival of Bifidobacterium iongum Ỉ941
microencapsulated with proteins andsugarsafter freezing and freeze drying. Food Research International 51 pp.503­509.

8. Lim Chi Ming, Raha Abd Rahim, Ho Yin Wan, Arbakariya B. Ariff (2009). Formulation of protective agents for
improvement of Lactobacillus saỉivarỉus I 24 Survival Rate subjected to freeze drying for production of live cells in
powderized form. Food Bioprocess Technol 2, pp.431­436.

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

NGHIẾN CỨU XÂY DỰNG CÔNG THỨC VIÊN NANG CHỨA CAO ALKALOID

CHUẨN HÓA TỪ LÁ SEN (NELUMBO NUCIFERA GAERTN.)

DS. L ữ Thiện Phúc*; DS. Nguyễn Quốc Duy*
Hướng dẫn: ThS. B Châu M inh Vĩnh Thọ*
TĨM TẮT

Nhiều cơng tr nh nghiên cứu về thành phần hóa học, định lượng và thử tác dụng sinh học trên in vitro lá Sen
Nelumbo nucifera Gaertn., cho thấy alkaloid là thành phàn chính có tác dụng sinh học như giảm cholesterol trong máu,
hạ đường huyết... Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào tiến hành tối ưu hóa cơng thức viên nang chứa cao alkaloid chuẩn
hóa lá sen thơng qua phép thử độ hịa tan kiểm sốt sự phóng thích các alcaloid có tác dụng sinh học nhằm tăng hiệu
quả và tính an tồn trong sử dụng. Nghiên cứu nhằm:

Tối ưu hóa cơng thức viên nang cho khả năng phóng thích nuciferin, o­nomuciferin, norarmepavin và kiểm soát
hàm ượng bằng HPLC/PDA đạt theo yêu cầu quyđịnh của Dược điển Mỹ.

Phương pháp nghiên cứu: Thiết kế các công thức thực nghiệm dựa trên ảnh hưởng của lượng cao chuẩn, các tá
dược ỉrơn chảy, chổng dính, độn. Từ đó, t m ra cơng ĩhức tối ưu cho độ hịa tan đạt theo quy định.

Kết q: Cơng thức tối ưu viên nang chứa cao alcaỉoid chuẩn hóa từ lá sen (cao chuẩn alkaỉoid 300 mg, iacỉose 90 mg,
MgC03 100 mg, talc 5 mg, Mg stearate 5 mg) được thẩm định lần đầu tiên cho khâ năng phóng thích nuciferin 94,8%;
o­nomuciferin 92,4%, norarmepavin 96,3%­

Kết luận: Nghiên cứu đã góp phần nâng cao chất lượng của chể phẩm được bào chế từ nguyên liệu iá sen làm tăng
hiệu quả điều trị và tính an tồn của thuốc.

* Từ khóa: Lá sen; Cao alcaloid.

Establishment o f form ulation o f capsules containing standardized Alkaloid extract

f r o m lo tu s lea ves

Summary

Many researches on chemical constituents, qualitative and quantitative analysis and pharmacological effects of lotus
leaves show that alkaloids are main bioactive compounds. However, to the best of our knowledge there has not been
any studies on preparation of capsules containing standardized alkaloid extracted from leaves of N lumbo nucif ra
based on dissolution test to control amounts of bioactive alkaloids (nuciferin, o­normiciferin, norarmepavin). The study
aimed: To optimiz formulation o f capsul s control r l as amounts of nucif rin, O-nomucif rin, norarm pavin that
m t all r quir m nts of dissolution t st of USP34.

Methods: Evaluate main affected factors to release of main active alkaloids including amounts of standardized
alkaloid extract, excipients of capsules to build many different experimental values to find out the best preparation.

Results: An optimized formulation of capsules containing standardized alkaloid extracted from Lotus leaves (300 mg
of standardized alkaloid extract, 100 mg of MgCC>3, 5 mg of talc, 5 mg of stearate) was validated for the first time that
amounts of nuciferine, o­nomuciferine, norarmepavine were released 94.8%; 92.4%; 96.3%, respectively.

Conclusion: This study could be used as markers for quality control and increasing of therapeutic effects and safety.
* Key words: Lotus leaves; Standardized alkaloid.

I.ĐẶTVẤNĐ

Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn, Nelumbonaceae) là một trong số ít các dược liệu mà tất cả các bộ

phận đều ỉà những vị thuốc q, có giá trị sinh học cao trong số đó, lá sen là một vị thuốc quý từ loài
dược thảo này, địch chiết á sen có hoạt tính sinh học mạnh trên in vivo như: an thần, giảm lipiđ máu [4],
chống oxy hóa, viêm gan, hạ đường huyết, kháng HIV [2]. Các hoạt tính này đã được chứng minh liên quan
đến sự hiện diện của một số alkaloid chính có tác dụng sinh học trong lá sen như nuciferin, O­ nornuciferin,

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

norarmepạvin, Thêm vào đó, hiện nay việc sử dụng lá Sen phục vụ công tác điều trị bệnh ngày càng trở nên
phổ biến hầu hết ở dạng dịch chiết cồn nhằm thu được cao tồn phần, sau đó, bào chế dạng viên nén hay viên
nang lá sen chứa cao cồn toàn phần với rất nhiều thành phần tạp chất đi cùng dẫn đến việc kiểm soat chất
lượng sẽ gặp nhiều khó khãn trên thực tiễn. Do đó, việc thiết kể công thức viên nang chứa cao chuẩn alkaloid
ỉá Sen GĨ thể cho sự phóng thích hoạt chất lối ưu của những thành phần alkaloid có tác dụng sinh học như
nuciferme, o­nomuciferine, norarmepavine là một yêu cầu rất cần thiết và mang tính cải tiến cơng nghệ, giúp
nâng caọ chất lượng và tính an tồn của sản phẩm. Chính v vậy, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu này nhằm:

­ Tối im h a công thức viên n ang chứa cao chuẩn alkaloid lá s n cho độ hồa tan của nucỉ/ rin,
o- nom ucif rin, norarm pavin đạt th o yêu cầu quy định của Được Điển Mỹ, bằng phư ng pháp sắc kỷ
lỏng hiệu năng cao với đầu dị dãy diod quang.

- Thần định quy trình

thử

độ hịa

tan

với cơng thức

tối

ưu.

n . ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u

Lá sen được íhu hái vào tháng 8 ­ 2012 tại khu vực IV, nông trường sông Hậu, TP. cần Thơ. Đối tượng
nghiên cứu được định đanh bằng cách so sánh và mơ tả h nh íhái thực vật với các thông tin trên các tài liệu
tham khảo, mẫu lá sen được loại tạp cơ học, bỏ cuống, phơi khô, xay thành bột thô và bảo quản trong điếu
kiện phù hợp. Thực hiên quy tr nh chiết thu cao định chuẩn alcaloiđ từ nghiên cứu của đề tài ưước (h nh 1).

Chất chuẩn đối chiểu: Các chất đối chiếu: nuciferine, o­nomuciferine, norarmepavine được phân lâp và
biện giải cấu trúc bằng các phương pháp phổ học (ƯV, MS, NMR) cũng như xác định độ tinh khiết bằng
phương pháp sắc HPLC/PDA từ các nghiên cứu trước đây với độ tinh khiết lần lượt là 97,2%; 98,4%; 96 8%.

Quy trình chiết cao chuẩn h a alkaloid lá s n

H nh 1: Sơ đồ quy tr nh chiết cao định chuẩn alkaloid ỉá sen

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

Dựa vào cấu trúc hóa học cùa norarmepavine, o­nomuciferin và nuciferine dạng base hữu cơ kém phân
cực, cả ba đều có pKa từ 7,5 đến 8 nên kỹ thuật sắc ký pha đảo đã được áp dụng với hệ dung mơi phân cực
thăm dị bao gồm MeOH, ACN và các đệm pH 7,0 pH 7,8; TEA trong nước cất hai lần ở các nồng độ
0,07%, 0,1%, 0,13% và 0,16%. Tiến hành chạy sắc ký trên mẫu hồn hợp chuẩn o­nomuciferine, nuciferine,
norarmepavin và chế phẩm trước và sau thử độ hịa tan ở một cơng thức lựa chọn ngẫu nhiên để t m điều
kiện sắc ký tối ưu tách đồng thời ba alkaloid này thỏa mãn yêu cầu của thơng số sắc ký cũng như tính tương
thích hệ thống và độ lặp lại.

Xác định hàm ẩm cao chuẩn h a alkaloid

Cân 300 mg cao chuẩn hóa alkaloid tồn phần. Tiến hành xác định hàm ẩm bằng cân phân tích hàm ẩm.
Hàm ẩm khổng được quá 20% đối với cao dặc.

Xác định lượng tá dược hút cho độ ẩm tối ưu

Cân 300 mg cao alkaloid tồn phần đã chuẩn hóa. Phối hợp làn lượt với 25, 50, 75 và 100 mg M gC03.
Hàm ẩm của hỗn hợp cao và MgCƠ3phải nhỏ hơn 5%.

Thiết kế công thức viên nang chứa cao chuẩn alkaloid lá S n cho độ hòa tan norarm pavin , 0-nomucif rin
vànucỉ/ rỉn tồi ưu được kiểm soát bằng phư ng pháp HPLC/PDA.

Lựa chọn khối lượng bột thuốc đóng vào nang: theo các nghiên cứu về sự tương quan giữa thể tích nang
và khối lượng bột thuốc theo tỷ trọng chứa trong nang, quyết định chọn khối lượng thuốc đóng vào nang là
500 mg, khối lượng trung b nh theo các nghiên cứu và lượng cao alcaloid định chuẩn để đóng vào nang là
300 mg, khối lượng này đảm bảo nồng độ của các alkaloid đạt được liều điều trị [2, 3,4].

Bảng 1. Các công thức thiết kế dự kiến cho việc tối ưu công thức viên nang [1]

Thành phần {%) CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 CT6 CT7 CT8 CT9 CT10

Cao lá Sen 60% 60% 60% 60% 60% 60% 60% 60% 60% 60%

MgC03 Nồng độ tối ưu cho độ ẩm bột thuốc tốt nhất

Tá dược độn A 18% 17% 16% 15% 14% 17% 16% 15% 14% 13%

Mg stearate ĩ% 2% 3% 4% 5% 1% 2% 3% 4% 5%

Talc 1% 1% ỉ % \% 1% 2% 2% 2% 2% 2%

Tiến hành đo độ hòa tan của viêng nang thành phẩm theo tiêu chuẩn ƯSP34 [5]

Thẩm định quy trình thừ độ hòa tan đồng thời norarm pavin , o-nomucif rin và nudf rin trong viên
nang lá s n chứa cao chuẩn h a alkaloid ờ công thức tối im

Tiến hành thẩm định theo hướng đẫn của USP34 [5]
III. KÉT QUẢ

Hàm ẩm trung b nh của cao định chuẩn aỉkaloid lá sen (n = 3) ỉà 11,11 % < 20%.

Tương quan gĩữa độ m và khối

lư ng Magie carbonate

—*~Tirong quan giũa đ ộ ẳm và
khéi lưộiỉg Magic caibonsie

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

Nhận thấy khi lượng M gC 03 tăng, độ ẩm của cao dược liệu được cảí Ihiện và ở lượng 100 mg M gC 03 độ

ẩm của cao giảm dưới 5%, đáp ứng được yêu cầu của bột thuốc khi đóng nang.

H nh 3. Overlay SKĐ mẫu thử độ hịa tan của CTỈ­CT10
Bảng 2. Thành phần cơng thức (1) tối ưu

Thành phần Cao chuẩn hóa alcaloỉd MgCOs Magie stearat Talc Tá đưực độn A

Tỷ lệ (%) 60% 20% m 1% 18%

Khối lượng (mg) 300 100 5 5 90

Bảng 3: Mức độ phóng thích hoạt chất của cơng thức (1) tối ưu

Diện tích đinh _{Mức độ phóng thích}

Cơng thức tối ưu Nguyên liệu Aỉ A2 (%) A3

AI A2 A3 AI A2 A3

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

­►•Talc

H nh 4. Biểu đồ biểu thị sự tương quan giữa mức độ phóng thích hoạt chất tính theo diện tích đỉnh với
các tá được khác nhau ở các tỷ ệ khác nhau của nuciferin; (2) o­nomuciferin; (3) norarmepavin
Độ hòa tan tăng theo tỷ lệ lactose trong công thức và ngược lại đối với talc và Magie stearate.
Thẩm định quy trình thử độ hịa tan viên nang lá S n chứa cao chuẩn h a alkaloid ở công thức tối ưu
Bảng 4. Kết quả khảo sát tính phù hợp cùa hệ thống trên mẫu hỗn hợp chuẩn (n = 6)

ÍR s Rs As N

o­Nomuciferine TB 7,86 2589068 5,65 0,86 7091

RSD% 0,38 0,50 1,31 1,92 0,26

Nuciferine TB 17,32 2268751 24,10 1,05 30962

RSD% 0,3 0,43 0,39 1,24 0,36

Norarmepavine TB 6,23 3262417 5,49 U I 2Ỉ597

RSD% 0,13 0,58 0,76 1,27 0,51

Bảng 5: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên mẫu thừ (n = 6)

ÍR s Rs As N.

O­nomuciferin TB 7,35 2849270 4,70 0,95 8575

RSD% 1,04 1,04 1,36 0,72 0,58

Nuciferin TB 17,33 3559710 27,67 1,08 29476

RSD% 0,34 0,69 0,93 0,69 0,7 ỉ

TB 6,23 3573407 4,29 1,15 22244

RSD% 0,31 0,93 1,07 1,63 0,92

Bảng 6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ

nuciferin o­nomucịferin norarmepavin

Khoảng tuyến tính (ppm, R2) 1­200

R2= 0,9997 R2= 0,99971­200 R2= 0,99965­400

Độ chính xác, n S36 (RSD%) _4,31 4,64 2,37

Độ đúng, n = 18 (H%) 91,06 84,92 92,89

Giới hạn phát hiện (ppm) 0,3125 0,3125 0,7813

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

IV. BÀN LUẬN

Kiểm tra độ tinh khiết của các pic alkaloid chính trong mẫu nguyên liệu lá Sen bằng cách so sánh sự
tương đồng phổ u v của những điểm bất kỳ trên pic so với phổ trung b nh lấy từ 03 điểm, với ngưỡng tương
đồng 950 và ngưỡng nhiễu là 5% cho thấy các pic alkaỉoid này đều đạt độ tinh khiết nghĩa là pic này chỉ là
một pic khơng có sự trùng lặp của pic khác ở điều kiện sắc ký tối ưu. Thêm vào đó, phổ u v của chuẩn và
thừ tại cùng tRcủa các alkaloid này giống nhau cũng như có sự tăng rõ rệt chiều cao và diện tích pic khi thêm
chuẩn vào mẫu.

Quy tr nh đạt độ đặc hiệu do pha động, dịch đo độ hịa tan và giả dược đều khơng ảnh hưởng đến việc ghi
nhận tín hiệu pic của 3 alcaloid cần định lượng khi tiến hành tiêm 6 mũi gồm mẫu thử đo độ hòa tan, mẫu
thử đo độ hòa tan thêm chuẩn, hỗn hợp chuẩn, giả dược, dung dịch đo độ hòa tan và pha động. Đồng thời,
ghi nhận trên sắc ký đồ cho thấy có sự đặc hiệu về thời gian lưu của các mũi mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn
và hỗn họp chuẩn.

Quy tr nh định lượng này đã thỏa mãn đầy đủ các mức yêu cầu của một quy tr nh định lượng theo hướng
dẫn của ƯSP 34 nên có thể áp đụng thực tiễn cho việc định lượng mẫu chứa các thành phần alkaloid chính trên.

V. K ẾT LUẬN

Nghiên cứu đã góp phần nâng cao khả năng sử dụng cũng như đánh giá chất lượng của chế phẩm được
bào chế từ nguyên liệu lá sen làm tăng hiệu quả điều trị và tính an tồn của thuốc.

TÀ I LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế và sinh dược học tập 2, NXB Y Học TPHCM, tr.208~210.
2.Y. Kashiwada, A. Aoshima, et al. (2005), Anti­HIV benzylisoquinoline alkaloids and flavonoids from the leaves
of nelumbo nucifera, and structure ­ activity correlations with related alkaloids. Bioorganic & M dicinal Ch mistry,

Í 3 ,443­448.

3. K. H. Nguyen, T. N. Ta, et ai. (2012), Nuciferine stimulates insulin secretion from beta cells. An in vitro comparison
with glibenclamide, Journal o fEthnopharmacology, 142,488­495.

4.Y. Ono, E. Hattori, etal.(2006), Anti­obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats, Journal
ofEthnopharmacology, 106,238­244.

</div>

<!--links-->