Nghiên cứu tách tinh chế một số đặc tính của Tyrosinase từ nấm ăn mushroom và khảo sát điều kiện tạo kit Tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp chất phenol
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.44 MB, 97 trang )
bộ giáo dục và đào tạo
trường đại học bách khoa hà nội
---------------------------------------
luận văn thạc sĩ khoa học
ngành : công nghệ sinh học
nghiên cứu tách tinh chế, một số
đặc tính của tyrosinase từ nấm ăn
(mushroom) và khảo sát điều kiện tạo kit
tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp
chất phenol
đỗ minh trung
hà néi 2007
Đỗ Minh Trung
MỤC LỤC
CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... 4
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ ..................................................... 5
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ .................................................. 6
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 8
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 10
1.1. Đại cương về tyrosinase ........................................................................... 10
1.1.1 Phức hệ Tyrosinase ............................................................................... 10
1.1.2. Cấu tạo của tyrosinase........................................................................... 12
1.1.2.1. Vài nét về nhóm metalloprotein có chứa đồng .................................. 12
1.1.2.2. Cấu tạo của tyrosinase........................................................................ 17
1.1.3. Tính chất của tyrosinase ........................................................................ 19
1.1.4. Cơ chế phản ứng xúc tác của enzym tyrosinase ................................... 23
1.1.5. Các nguồn thu chế phẩm tyrosinase...................................................... 27
1.1.6. Tách, tinh chế thu tyrosinase từ nấm ăn................................................ 30
1..1.7. Vai trò và ứng dụng của tyrosinase ...................................................... 33
1.1.7.1. Vai trò của tyrosinase ......................................................................... 34
1.1.7.2. Ứng dụng của tyrosinase .................................................................... 35
1
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 42
2.1. Đối tượng và vật liệu ................................................................................ 42
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................ 42
2.1.2. Hoá chất................................................................................................. 42
2.1.3. Thiết bị .................................................................................................. 42
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 43
2.2.1. Thu chế phẩm Tyrosinase từ nấm ăn .................................................... 43
2.2.2. Kiểm tra độ tinh sạch của enzyme bằng phương pháp điện di
protein trên gel polyacrylamide SDS – PAGE ............................................... 45
2.2.3. Phương pháp xác định hoạt độ Tyrosinase ........................................... 46
2.2.4. Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Lowry .......... 48
2.2.5..Xác định hoạt độ Tyrosinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch.. 49
CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 50
3.1. Khảo sát hoạt tính Tyrosinase từ một số loại nấm ăn .............................. 50
3.2. Tách chiết, tinh chế Tyrosinase từ Agaricus bisporus ............................. 53
3.2.1. Tách chiết tyrosinase và khảo sát các loại dung môi chiết ................... 53
3.2.1.1. Khảo sát các loại dung môi chiết ....................................................... 54
3.2.1.2. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ đệm kali phosphat đến khả năng chiết
tyrosinase ......................................................................................................... 54
3.2.1.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất chống oxi hóa
(axit ascobic 0,1M ) đến hoạt tính tyrosinase trong q trình chiết................ 55
3.2.1.4. Khảo sát hoạt độ tyrosinase trong các phần khác nhau của nấm ....... 56
3.2.2. Tinh sạch tyrosinase từ A.bisporus ....................................................... 57
3.2.2.1.Khảo sát tác nhân kết tủa tyrosinase ................................................... 57
3.2.2.2. Tinh sạch tyrosinase bằng phương pháp sắc ký trao đổi anion (DEAE
Shepharose HR 16/10) trên hệ thống FPLC ................................................... 60
2
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
3.2.2.3. Kiểm tra độ tinh sạch protein bằng phương pháp diện di trên gel
Polyacrylamide SDS-PAGE ......................................................................................... 63
3.3. Xác định một số đặc tính của tyrosinase .................................................. 66
3.3.1. Xác định pH tối ưu của tyrosinase ........................................................ 66
3.3.2. Xác định nhiệt độ tối ưu của tyrosinase ................................................ 66
3.3.3. Khảo sát độ bền nhiệt của tyrosinase .................................................... 67
3.3.4. Khảo sát độ bền pH của tyrosinase ....................................................... 68
3.3.5. Xác định điểm đẳng điện (pI) của tyrosinase........................................ 69
3.3.6. Khảo sát động học tyrosinase (Km, Vmax) ..................................................... 70
3.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất kìm hãm tới hoạt
tính của tyrosinase ....................................................................................................... 73
3.4. Ứng dụng tyrosinse phát hiện nhanh hợp chất phenol ............................ 74
3.4.1.Khảo sát khả năng phát hiện các hợp chất phenol của tyrosinase tự do........ 74
3.4.2. Khảo sát một vài yếu tố tạo KIT thử phát hiện nhanh hợp chất phenol ...... 76
3.4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ tyrosinase gắn chất mang ................... 76
3.4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định enzym lên chất mang ............ 77
3.4.2.3. Khảo sát thời gian sấy enzym cố định lên chất mang ........................ 78
3.4.2.4. Khảo sát khả năng phát hiện hợp chất phenol của kit tyrosinase ...... 79
3.4.2.5. Khảo sát khả năng phát hiện hợp chất phenol của kit tyrosinase đối
với các nguồn nước thải có chứa hợp chất phenol .......................................... 81
3.4.2.6. Khảo sát thời gian bảo quản kit tyrosinase ........................................ 83
KẾT LUẬN .................................................................................................... 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 89
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 93
TÓM TẮT LUẬN VĂN ................................................................................. 95
3
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Da
Dalton
kDa
Kilodalton
KC
Kiểm chứng
TN
Thí nghiệm
ĐVHĐ
Đơn vị hoạt độ
HĐ
Hoạt độ
HĐTĐ
Hoạt độ tương đối
HĐT
Hoạt độ tổng
L- DOPA
L- 3,4 dihydroxy phenylalanin.
EDTA
Etylen diamin tetra acetic acid
PAGE
Polyacrylamide gel electrophoresis
PPO
Polyphenol oxidase
PVPP
Polyvinylpolypyrrolidone
SDS
Sodium dodecylsulfate
FPLC
Fast performance liquid chromatograph
4
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
Bảng 1.1: Một vài tính chất chính của tyrosinase từ một số loại nấm
Bảng 1.2: Kết quả các bước tinh sạch tyrosinase từ Agaricus bisporus
Bảng 2.1 : Bảng thành phần gel SDS –PAGE
Bảng 3.1: Bán kính vịng phân giải trên đĩa thạch của dịch tyrosinase thô chiết
từ các loại nấm khác nhau
Bảng 3.2. Hoạt độ tyrosinase từ các loại nấm khác nhau xác định theo phương
pháp đo quang.
Bảng 3.3: Ảnh hưởng của các dung môi đến khả năng chiết tyrosinase
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát tỷ lệ đệm Kali phosphat 25mM, pH = 6,8
dùng chiết Tyrosinase
Bảng 3.5: Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ axit ascorbic trong quá trình chiết.
Bảng 3.6: Kết quả chiết tyrosinase từ các phần của Nấm Mỡ
Bảng 3.7: Tủa bằng Ethanol
Bảng 3.8: Khảo sát nồng độ acetone kết tủa tyrosinase
Bảng 3.9: Kết tủa phân đoạn tyrosinase bằng (NH 4 ) 2 SO 4
Bảng 3.10: Các bước tinh sạch tyrosinase từ Agaricus bisporus
Bảng 3.11: Điểm đẳng điện pI
Bảng 12 : Kết quả vận tốc phản ứng của các cơ chất
Bảng 3.13: Kết quả Km, Vmax của các cơ chất khác nhau
Bảng 3.14: Ảnh hưởng của một số ion kim loại và chất kìm hãm.
5
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1: Phản ứng chuyển hóa L-tyrosine thành L-DOPA của tyrosinase
Hình1.2: Phản ứng dehydro hóa bởi catechol oxidase
Hình 1.3: Phản ứng chuyển hóa diphenol của laccase
Hình 1.4: Cấu trúc khơng gian của tyrosinase
Hình 1.5: Cấu trúc trung tâm hoạt động của tyrosinase
Hình1.6: Tyrosinase xúc tác chuyển hố cả hai dạng mono và di-phenol
Hình 1.7: Cơ chế xúc tác của tyrosinase với sự tham gia của phân tử O 2
Hình 1.8: Cơ chế phản ứng của tyrosinase
Hình 1.9: Nấm mỡ Agaricus bisporus
Hình 2.1: Hệ thống chạy sắc ký FPLC
Hình 3.1: Vịng phân giải trên đĩa thạch
Hình 3.2: So sánh các tác nhân tủa.
Hình 3.3: Sắc ký đồ tinh sạch tyrosinase từ cột DEAE Shepharose HR 16/10
Hình 3.4: Hoạt tính tyrosinase của các phân đoạn
Hình 3.5: Điện di đồ tinh sạch tyrosinase tren gel polyacrylamide SDS-PAGE
Hình 3.6: Qui trình tách chiết, tinh chế tyrosinase từ nấm Agaricus bisporus
Hình 3.7: Xác định pH tối ưu
Hình 3.8: Xác định nhiệt độ tối ưu
Hình 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tính bền tyrosinase
Hình 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của pHtới tính bền của tyrosinase
Hình 3.11: Cơ chất nồng độ 10-2M sau 20 phút phản ứng.
Hình 3.12: Cơ chất nồng độ 10-3M sau 20 phút phản ứng
Hình 3.13. Cơ chất nồng độ 10-4M sau 20 phút phản ứng.
Hình 3.14: Ảnh hưởng nồng độ enzym tạo kit phát hiện cơ chất (L-DOPA)
Hinh 3.15: Thời gian cố định enzym lên chất mang
Hình 3.16: Thời gian sấy enzym cố định
6
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Hình 3.17: Khả năng phát hiện hợp chất phenol trên kit tyrosinase
Hình 3.18: Sơ đồ kiểm tra hợp chất phenol bằng kit tyrosinase
Hình 3.19 : Khả năng phát hiện hợp chất phenol trong nước thải bằng tyrosinase tự do
Hình 3.20: Khả năng phát hiện nhanh hợp chất phenol trong nước thải bằng kit tyrosinase
Hình 3.21: Kit tyrosinase phát hiện hợp chất phenol ở thời gian đầu bảo quản
Hình 3.22: Kit tyrosinase phát hiện hợp chất phenol sau 7 ngày bảo quản
Hình 3.23: Kit tyrosinase phát hiện hợp chất phenol sau 14 ngày bảo quản
Hình 3.24: Kit tyrosinase phát hiện hợp chất phenol sau 21 ngày bảo quản
Hình 3.25: Hộp và túi bảo quản kit tyrosinase
Đồ thị 3.1: Xác định Km, Vmax với cơ chất là L-DOPA
Đồ thị 3.2: Xác định Km, Vmax với cơ chất là Catechol
Đồ thị 3.3: Xác định Km, Vmax với cơ chất là L-tyrosine
7
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
MỞ ĐẦU
Tyrosinase (EC 1.14.18.1) là một enzym thuộc nhóm kim loại có chứa
nguyên tử kim loại Cu trong phân tử và thuộc họ polyphenoloxydase (PPO).
Tyrosinase có khả năng hydroxyl hoá các cơ chất họ monophenol tạo thành
các o-diphenol và sau đó có khả năng chuyển hố tiếp hợp chất o-diphenol
thành hợp chất o-quinon là một chất có liên quan tới sự hình thành những chất
trung gian tạo nên các chất có màu nâu sẫm. Bởi vậy, tyrosinase được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như trong y học, nông nghiệp, trong lĩnh vực xử lý
mơi trường, ứng dụng có triển vọng nhất của tyrosinase trong xử lý môi
trường là khả năng phát hiện và loại bỏ dư lượng các hợp chất phenol.
Phenol và các dẫn xuất của chúng là những chất độc, được sử dụng
rộng rãi trong các ngành cơng nghiệp như hố chất, sản xuất nhựa, bột giặt, và
trong các phế thải trong các ngành sản xuất than đá, tinh chế dầu hoả v.v.. Các
hợp chất phenol này thường được xác định bằng phương pháp sắc ký hoặc đo
quang. Các phương pháp này rất nhạy nhưng nhược điểm là chi phí tốn kém,
thời gian phân tích lâu. Một trong những ứng dụng có triển vọng được các
nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm là dùng Tyrosinase tạo điện cực
sinh học kiểm tra các hợp chất phenol có trong các sản phẩm nơng nghiệp,
thực phẩm, trong xử lý môi trường và sẽ rút ngắn thời gian rất nhiều.
Tyrosinase có mặt trong các loại động vật có vú, các loại động vật
không xương sống, thực vật và vi sinh vật, với các chức năng sinh học và có
sự khác nhau khá lớn. Tyrosinase từ động vật có vú lần đầu tiên được mô tả
với sự liên quan trong sự phát triển của các u tế bào và các vấn đề về sắc tố
như bệnh bạch tạng và bệnh lang trắng. Trong nấm, tyrosinase nói chung liên
quan tới sự hình thành và sự bền vững của các bào tử, liên quan tới cơ chế
phòng vệ và cơ chế gây độc và cũng liên quan tới sự nâu hoá và hình thành
sắc tố. Trong suốt các thập kỉ gần đây, các nghiên cứu đều tập trung vào
8
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
tyrosinase tách chiết từ một loại nấm ăn đó là Agaricus bisporus, với ưu thế
hơn hẳn do hoạt độ enzym cao, nguồn nguyên liệu phổ biến và rẻ tiền, quy
trình tách chiết lại khá đơn giản. Xuất phát từ những tiềm năng ứng dụng của
tyrosinase, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tách tinh chế,
một số đặc tính từ nấm ăn (Mushroom) và khảo sát điều kiện tạo kit
tyrosinase phát hiện nhanh dư lượng hợp chất phenol”.
Nội dung của đề tài:
- Khảo sát một số loại nấm thực vật, chọn loại nấm có hoạt lực tyrosinase cao.
- Khảo sát các phương pháp chiết tyrosinase
- Tách tinh chế bằng phương pháp kết tủa muối, dung môi hữu cơ.
- Sắc ký qua cột trao đổi anion.
- Điện di kiểm tra độ tinh sạch.
- Xác định một số đặc tính của tyrosinase.
- Tìm điều kiện thích hợp cố định tối ưu trên chất mang để tạo kit
enzym phát hiện nhanh các hợp chất phenol.
- Khảo sát khả năng phát hiện hợp chất phenol của kit tyrosinase
9
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
CHƯƠNH I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đại cương về Tyrosinase
1.1.1. Phức hệ Tyrosinase
Tyrosinase là enzym thuộc họ Polyphenol Oxidase - là một enzym có
chứa nguyên tử Cu trong nhóm ngoại. Polyphenol oxidase xúc tác oxy hóa cơ
chất phenol thành quinon khi có mặt phân tử oxy. Enzym này khá phổ biến
trong tự nhiên từ vi sinh vật, thực vật cho tới một số lồi động vật (Robb,
1984).
Có 3 loại protein enzym thuộc họ Polyphenol Oxidase là Tyrosinase,
catechol oxidase và laccase (Yelena và cộng sự, 1996).
• Tyrosinase (monophenol monooxygenase E.C 1.14.18.1) hydroxyl hóa
các monophenol như tyrosine, p-cresol và p-coumaric axít thành odiphenol sau đó oxy hóa o-diphenol thành dopaquinone. Tyrosinase
phần lớn được tìm thấy ở thực vật, động vật và vi sinh vật (Whitaker,
1994) [26].
O
O
O-
O+
H3N
+
CH
H 3N
CH
CH2
CH2
OH
OH
OH
L-Tyrosine
L-DOPA
Hình 1.1: Phản ứng chuyển hóa L-Tyrosine thành L-DOPA của tyrosinase
• Catechol oxidase hay catecholase (EC 1.10.3.1), được tìm thấy nhiều
trong thực vật, cây thuốc lá, lá chè và các loại quả như táo, quả đào,
10
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
khoai tây (Whitaker, 1994) và trong nấm mốc những enzym này oxy
hóa một lượng lớn monophennol và các hợp chất o-diphenol [26].
O
OH
O
OH
1/2O2
H2O
CH3
CH3
4-metyl catechol
4-metyl benzoquinone
Hình1.2: Phản ứng dehydro hóa bởi catechol oxidase
• Laccase (E.C.1.10.3.2) được xác định đầu tiên ở cây gỗ sơn mài. Sau
này người ta tìm thấy nhiều trong nấm mốc và gần đây người ta đã tìm
thấy enzym này trong một số lồi vi khuẩn. Laccase xúc tác q trình
oxy hóa các o- và p-diphenol, các aminophenol và các hợp chất diamin
thơm [26].
HO
R
laccase
HO
HO
R
O
Hình 1.3: Phản ứng chuyển hóa diphenol của laccase
Như vậy, Tyrosinase, catecholase và Laccase đều có khả năng oxy hóa
các hợp chất diphenol. Tuy nhiên, các enzym này khác nhau cơ bản là cơ chất
đặc hiệu và độ nhạy với các chất ức chế. Sự khác nhau quan trọng của hai
enzym này là Laccase có khả năng oxy hóa các chromophores thơm như
syringaldazine, ABTS (2,2-Azino-di-[3-ethylbenzthiazoline sulfonate).. và chỉ
Tyrosinase mới biểu hiện hoạt tính của cresolase và khả năng oxy hóa Ltyrosine.
11
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
1.1.2. Cấu tạo của tyrosinase
1.1.2.1. Vài nét về nhóm metalloprotein có chứa đồng
Người ta ước tính rằng có khoảng 1/3 tổng số các loại protein có chứa
một hay nhiều nguyên tử kim loại trong phân tử với vai trị là một nhóm
ngoại. Rất nhiều loại protein có chứa Magie (Mg) và canxi (Ca) với vai trò
làm bền vững và ổn định cấu trúc. Một phần lớn các metalloprotein có chứa
các ion kim loại vận chuyển như sắt (Fe), đồng (Cu), niken (Ni), kẽm (Zn),
molibden (Mo), vanadi (V). Một số trong các kim loại đó có tính oxi hố khử
vì chúng có thể tồn tại ở nhiều trạng thái oxi hoá bền vững. Những protein
chứa các kim loại này có liên quan tới q trình trao đổi electron với môi
trường xung quanh trong các phản ứng xúc tác và vận chuyển electron. Chúng
chính là các chất xúc tác sinh học quan trọng trong cơ thể sống hay còn được
gọi là enzym.
Các nguyên tử kim loại kết hợp với phân tử enzym thông qua các tương
tác với các axit amin như His, Asp, Asn, Cys và Met. Cấu trúc hình học của
các ion kim loại này được xác định bởi vị trí và sự định hướng của các axit
amin trong mạng lưới và hơn cả là do chính ion kim loại đó. Mạng lưới này
đóng một vai trị chủ yếu trong sự trao đổi giữa các phân tử, ví dụ như sự trao
đổi electron giữa 2 phân tử hay giữa phân tử enzym và phân tử cơ chất trong
quá trình xúc tác. Tính chất của phân tử kim loại ở trên (VD như khả năng oxi
khử) có thể được điều chỉnh bởi chính mạng lưới nó kết hợp, ví dụ như phụ
thuộc vào một sự thay đổi trong dung dịch như là pH hoặc sự kết hợp hoặc
giải phóng của phân tử. Vì lí do trên, các metalloprotein đảm nhiệm rất nhiều
chức năng, trong đó mỗi metalloprotein đảm nhiệm chức năng của nó với tính
đặc hiệu cao.
12
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Nói riêng về các metalloprotein Cu, chúng có 4 chức năng: 1) Dự trữ
kim loại; 2) Vận chuyển và hấp thu; 3) Dự trữ, vận chuyển và hấp thu oxy; 4)
Xúc tác. Sự có mặt của nguyên tử Cu trong phân tử protein làm tăng đặc tính
hấp thụ quang phổ. Dựa vào đặc điểm này, trước đây người ta chia các copper
protein thành nhiều nhóm khác nhau. Đầu tiên người ta chia chúng thành 3
nhóm (nhóm 1, nhóm 2 và nhóm 3). Sau đó nhờ những hiểu biết thêm về cấu
trúc của các copperprotein và các trung tâm chứa kim loại Cu mà người ta
chia ra thành 7 nhóm như sau [27]:
Loại 1: Trung tâm chứa Cu của các copperprotein loại 1 này được tìm
thấy trong các phân tử protein vận chuyển electron đơn giản như
plastocyanin, azurin, pseudoazurin và amicyanin. Chính vì màu xanh da trời
đậm do dạng oxi hố của Cu(II) mà những protein này cịn được gọi là những
copperprotein xanh, có khả năng hấp thụ mạnh bước sóng 600nm là do sự
chuyển trạng thái của nguyên tử lưu huỳnh S trong nhóm cystein và của
nguyên tử Cu, nhưng hiện nay nguyên nhân được tìm ra là do sự chuyển trạng
thái π-π*. Các trung tâm của các protein Cu loại 1 cịn được tìm thấy trong
các enzym oxi hoá khử như nitrit reductase và trong các enzym multicopper
oxidase như ascorbate oxidase, laccase, cerruloplasmin chứa nhiều hơn một
trung tâm Cu. Trung tâm Cu được tạo bởi 2 nguyên tử N (của His), 1 nguyên
tử S (của Cys) và 1 liên kết trục yếu với nguyên tử S từ methionin hoặc
glutamin hoặc leucin.
13
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Loại 2: Trung tâm Cu của những Protein này được liên kết với 4
nguyên tử N hoặc O trong một mặt phẳng vng hoặc có dạng tứ diện méo.
Những protein này gần như khơng có màu và phổ cộng hưởng từ EPR
(Electron paramagnetic resonance) giúp phân biệt chúng với trung tâm Cu
loại 1. Đa số các protein này có liên quan tới sự xúc tác ở nơi mà sự có mặt
của các liên kết trống cho phép sự oxi hoá phân tử cơ chất. Trung tâm Cu loại
2 được tìm thấy trong copper amine oxidase, galactose oxidase và Cu-Zn
superoxit dimutase...
Loại 3: Có chứa 2 ion Cu nằm gần nhau về mặt không gian, mỗi ion Cu
được liên kết bởi 3 Histidin. Trung tâm Cu loại 3 ở dạng oxi hố khơng làm
tăng phổ EPR bởi vì sự kết hợp nghịch từ giữa 2 ion Cu (II). Các
metalloprotein có chứa trung tâm Cu loại 3 có liên quan tới sự vận chuyển và
hoạt hoá bởi O 2 như hemocyanin, catechol oxidase và tyrosinase.
14
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Loại 4: tâm Cu loại 4 có thể coi như được cấu tạo từ hỗn hợp tâm Cu
loại 2 và loại 3, tạo thành trung tâm chứa 3 nhân. Trung tâm này tìm thấy
trong các protein xúc tác cho phản ứng oxi hoá như laccase, ascorbate oxidase
và ceruloplasmin. 3 nguyên tử Cu liên kết với 8 Histidin. Thường các protein
chứa tâm Cu loại 4 này cũng chứa tâm Cu loại 1, do vậy trong 1 số trường
hợp chúng được gọi là multicopper oxidase (enzym oxi hoá chứa nhiều
nguyên tử Cu) hoặc blue oxidase ( enzym oxi hoá xanh ). Cụm 3 nhân và tâm
Cu loại 1 được liên kết với nhau thông qua con đường vận chuyển electron
giữa Cys-His.
Cu A : trung tâm Cu A có chứa 2 hạt nhân. 2 nguyên tử Cu được nối với
nhau bởi 2 nguyên tử S từ 2 Cystein. Mỗi nguyên tử Cu còn nối với nguyên tử
N từ His. Chức năng của trung tâm Cu A là ở trong chuỗi vận chuyển electron
và có thể tìm thấy trung tâm này trong cytochrom c oxidase và nitrous oxide
reductase. Nó có phổ EPR rất điển hình và có màu tía. Ở dạng oxi hoá, mỗi
nguyên tử Cu đều ở trạng thái hoá trị hỗn hợp Cu(1.5)Cu(1.5). Trái với hầu
hết các hệ thống Cu, tâm Cu A có tính chất thuận từ NMR rất đáng chú ý.
15
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Cu B : Trung tâm Cu B rất giống với nhóm ngoại hem chứa Fe trong
trung tâm phản ứng của cytochrome xúc tác phản ứng khử O 2 thành nước.
Năng lượng giải phóng ra được sử dụng để chuyển proton qua màng nơi gắn
cytochrome. Tâm Cu B được đặt xuyên qua trục của His trong tâm nhóm ngoại
Hem a3 và liên kết với 3 histidin dưới dạng hình chóp tam giác với vị trí liên kết mở
của ngun tử Cu hướng tới vị trí liên kết mở của nguyên tử Fe trong nhóm hem.
Cu Z : Tâm Cu Z có trong các enzym xúc tác khử các oxit của nitơ liên
quan đến sự chuyển N 2 O thành N 2 . Trung tâm Cu Z bao gồm 4 ion đồng xắp
xếp trong một tứ diện méo và 7 histidin. 3 nguyên tử đồng gắn với nhau bởi 2
histidin, trong khi đó nguyên tử đồng thứ tư chỉ gắn với chỉ một, do đó hình
thành vị trí kết hợp với cơ chất. Các ion đồng được kết nối bởi 1 nguyên tử
lưu huỳnh.
16
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
1.1.2.2. Cấu tạo của tyrosinase.
Tyrosinase (còn gọi là monophenol, o-diphenol oxygen oxidoreductase
(EC.1.14.18.1) là một tetrametric có khối lượng phân tử là 128 kDa±5% khi
xác định thông qua vận tốc lắng, là 133±10 kDa khi xác định thông qua sự tán
xạ ánh sáng, còn khi xác định bằng phương pháp điện di tyrosinase có khối
lượng là 119.5 kDa [35]. Enzym này thuộc nhóm metalloprotein có chứa Cu
loại 3, bao gồm enzym catecholoxidase có trong thực vật và chất vận chuyển
oxy hemocyanin có trong các loại động vật thân mềm và chân đốt [25].
Hình 1.4: Cấu trúc khơng gian của tyrosinase
17
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Như đã nói ở trên, phân tử tyrosinase có chứa 2 ion đồng nằm rất gần
nhau trong mạng lưới liên kết. Vùng chứa 2 ion Cu gọi là ion Cu A và Cu B
đuợc tìm thấy trong tất cả các loại tyrosinase. Mỗi ion Cu kết hợp với 3
histidine tạo thành trung tâm hoạt động của enzym, là nơi kết hợp của enzym
với cơ chất và với nguyên tử oxy.
Hình 1.5: Cấu trúc trung tâm hoạt động của tyrosinase
Vùng này có sự tương đồng lớn với vùng tương ứng của hemocyanin
(HCS)-chất vận chuyển oxy tìm thấy trong động vật thân mềm và chân đốt và
trong catecholoxidase - enzym oxi hóa các diphenol nhưng khơng có hoạt tính
hydroxylase của tyrosinase. Nhờ có trung tâm Cu này mà enzym có khả năng
kết hợp với nguyên tử oxy một cách thuận nghịch như các peroxide. Trung
tâm Cu loại 3 có thể tồn tại ở nhiều trạng thái oxi hóa khác nhau phụ thuộc
vào trạng thái oxi hóa của ion đồng. Các trạng thái đó là trạng thái oxy hóaoxi CuII-O 2 -CuII (E oxy ), trạng thái khử-deoxy CuI-CuI (E red ), trạng thái met
(E met ) CuII-CuII. Trạng thái met có chuyển sang trạng thái deoxy bằng cách
nhận 2 electron và trạng thái deoxy nhận được có thể kết hợp một cách thuận
nghịch với nguyên tử oxy tạo thành dạng oxy. Dạng oxy cũng có thể nhận
được bằng cách trực tiếp thêm hydroperoxide vào dạng met trong trường hợp
của N. crassa hoặc bằng cách xử lí bởi các tác nhân khử như axid ascorbic,
hydroxylamine, dithionite trong trường hợp của Aspergillus flavipes, Fe2+
hoặc dithiothreitol trong trường hợp của A. bisporus.
18
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Tyrosinase từ các nguồn khác nhau thì có cấu tạo khác nhau. Tuy nhiên
cấu tạo chung của Tyrosinase có hai histidin His-62 và His-189 được xác
định là các axit amin liên kết với hai nguyên tử Cu trong tyrosinase, hai tác
nhân đột biến là His 62Asn và His 189Asn làm mất hoạt tính của Tyrosinase
và làm mất khả năng liên kết với O 2 . Kết quả nghiên cứu này được tìm ra bởi
Huber và Lerch [34].
- Tyrosinase từ nấm mỡ Agaricus bisporus là một tetrameric, có khối
lượng phân tử M= 108kDa. Trong bốn tiểu phần xác định này, có hai tiểu
phần nhỏ khối lượng 12kDa và 2 tiểu phần lớn khối lượng phân tử mỗi tiểu
phần là 42kDa. [38]
- Tyrosinase từ nấm mốc Aspergillus oryzae là một tetrameric, có khối
lượng phân tử M=280kDa, trong đó mỗi tiểu phần có khối lượng phân tử là
67kDa. Mỗi tiểu phần 67kDa này có chứa 2g Cu. Trung tâm hoạt động gồm 2
nguyên tử Cu, mỗi nguyên tử Cu liên kết bởi 3 His (His-63, His-84 , His-93
liên kết với nguyên tử Cu thứ nhất và His-290, His-294, His- 333 liên kết với
nguyên tử Cu thứ hai). Các nghiên cứu trình tự đầu “N” của enzym này cho
thấy rằng chuỗi nucleotide của gen mã hóa tyrosinase từ A.oryzae có 1671
cặp bazơ nitơ.
Các tài liệu về tyrosinase từ A.oryzae cho kết luận rằng: 7 histidine là
His-63, His-84, His-93, His-290, His-294, His-332, His-333 và một gốc
cysteine là Cys-82 tham gia vào hoạt lực xúc tác và tạo các liên kết với Cu
trong phân tử tyrosinase. [26]
- Tyrosinase từ Thermomicrobium roseum, có M = 43kDa, trình tự đầu
“N” là Asp-Lle-Gly-Gly-Gly-Ala-Thr-Leu-Pro-Gln-Lys-Leu-Tyr [6].
- Tyrosinase từ Streptomyces sp. REN 21 có M = 32kDa, đầu “N” AlaVal-Arg-Lys-Asn-Gln-Ala-Asn-Leu-Thr-Ala-Ser-Glu.[31].
19
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
1.1.3. Tính chất của tyrosinase.
Các tyrosinase có nguồn gốc khác nhau thì có các đặc tính khác nhau.
Tyrosinase từ vi sinh vật:
+ Tyrosinase từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermomicrobium roseum có tính chất [6]:
- pI = 4,9
- pH opt = 9,5, enzyme mất 50% hoạt tính khi 7
tính hồn tồn.
- Cơ chất đặc hiệu là catechol, L-DOPA và pyrogallol.
- Giá trị Km đối với cơ chất L-DOPA là 0.18 mM.
- Chất kìm hãm là β-mercaptoethanol và sodium diethyldthiocarbamat
- Hoạt tính của enzym tăng khi có mặt của ion Mg2+, K+ và Cu+ 1mM.
- Enzym này rất bền với nhiệt độ cao và với guanidine hydrochloride.
- Đầu N bao gồm chuỗi các axit amin sau: Asp-Lle-Asn-Gly-Gly-GlyAla-Thr-Leu-Pro-Gln-Lys-Leu-Tyr.
+ Đặc tính của tyrosinase sinh tổng hợp bởi Streptomyces sp. REN-21.[31]
- pH opt = 7.
- Enzyme bền ở pH=7-8, sau 16 giờ ủ ở 30 0C hoạt độ còn lại trên 72%.
- Nhiệt độ tối ưu 35 0C, enzym bền ở nhiệt độ dưới 55 0C
- Cơ chất đặc hiệu là L-3,4-dihydroxyphenyl alanine (L-DOPA).
- Ổn định được trong etanol 30% tại pH 7, 30 0C trong 20 giờ.
-Chất kìm hãm là axit kojic, L-cystein, DL- dithiothreitiol và N,Nđiethylithiocarbamate trihydrate (DDC). Khơng bị kìm hãm với arbutin,
sodiumazide, EDTA với nồng độ 1mM hoặc các ion kim loại Cu 2+, Fe 3+,
Zn 2+, Mg 2+, Mn2+ và Ca2+.
20
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
+ Tyrosinase từ Neurospora crassa :
- Nhiệt độ tối ưu : 25oC.
-
pI =6,0 -8,0.
-
pH = 5,0 -8,0.
- Cơ chất đặc hiệu là L-Dopa
Tyrosinase từ động vật:
+ Tyrosinase từ Illex argentius (sinh vật thân mềm). [30]
- pH tối ưu 8, hoạt tính cịn trên 90% ở dải pH 6,5- 11, nhiệt độ 40 C sau 24h.
- Ổn định hoạt tính ở 4- 40oC, trên 450C enzyme mất hồn tồn hoạt tính.
- Cơ chất tối ưu là L-DOPA
- Chất ức chế là phenylthiourea, tropolone, axit kojic và arbutin.
+ Tyrosinase từ loài chai biển Ruditapes philippinarum
- pH tối ưu 7
- Nhiệt độ tối ưu 40oC
- Đạt giá trị Km = 2,2 mM/l với cơ chất là L-DOPA
- Bị ức chế mạnh bởi benzoic acid, sodium sulfite, citrat acid, thiourea,
1-phenyl- thiourea và cysteine. Không bị ảnh hưởng bởi axit ascorbic.
+ Tyrosinase từ người:
- Enzyme thu được bởi quá trình tái tổ hợp ADN trong vi khuẩn E.coli
trực khuẩn ruột già, tyrosinase được tách, làm sạch qua cột sắc kí DEAE –
Sephacel, tyrosinase tái tổ hợp người xuất hiện như một băng core Protein
đơn, trọng lượng phân tử 66 kDa trên bảng điện di SDS –PAGE.
- Nhiệt độ tối ưu oxi hoá L-DOPA là 50o C
- Hoạt độ enzyme giảm nhanh chóng khi nhiệt độ trên 55o C
- pH tối ưu là 7,5, hoạt lực enzyme giảm 30% khi pH dưới 6,5
- Cơ chất đặc hiệu là L-DOPA
- Giá trị Km là 0,31 mM
21
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
- Chất ức chế là arbutin và ethyl ascorbyl.
Tyrosinase từ thực vật:
+ Tyrosinase từ nấm quả thể (mushroom) Amanita muscaria. [8]
- pH tối ưu 6, khơng có hoạt tính khi ở pH dưới 3, nhưng ở pH 8
enzyme vẫn cịn 75% hoạt tính.
- Chất kìm hãm là β-mercaptobenzothiazola (2-MBT), tropolone. Với
axit benzoic 1mM ức chế enzyme ở pH 5 nhưng với pH 8 thì axit này
khơng cịn khả năng ức chế.
- Cơ chất đặc hiệu: các monophenol như phenol, tyramine và axit 3(4-hydroxyphenyl)propionic, các diphenol như L-DOPA, D-DOPA, 3hydroxytyramine và axit 3-hydroxy-caffeic. Trong đó, L-tyrosine có hằng
số Km cao nhất trong các cơ chất trên, và có giá trị Vmax thấp nhất.
- Chất ức chế: enzym này bị ức chế mạnh mẽ bởi các chất ức chế điển
hình như 2-mercaptobenzothiazole (2-MBT) và tropolone. Axit benzoic
với nồng độ 1mM ức chế hoạt tính tyrosinase trên 95% tại pH=5, nhưng
khơng có khả năng ức chế tyrosinase tại pH=7.
+ Tyrosinase từ cây thuốc lá Nicotiana tabacum. [32]
- pH tối ưu 7
- Nhiệt độ tối ưu là 40o C.
- Km = 6,8 mM với cơ chất là catechol ở pH = 6,5 trong đệm H 3 PO 4 NaOH 0,05M
- Sử dụng phương pháp đo quang phổ UV/VIS EPR xác định được
Tyrosinase từ cây rhuốc lá có cấu trúc chứa 3 nguyên tử đồng.
+ Tyrosinase từ Agaricus bisporus.[25]
- pI=5,1-5,2.
- Nhiệt độ tối ưu 300C
- K m = 0,44 mM (L-DOPA), V max = 24,5 μmol/phút (L-DOPA).
22
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
Bảng 1.1: Một vài tính chất chính của tyrosinase từ một số loại nấm [25].
Các loại
nấm
Khối
lượng
phân tử
(kDa)
A.bisporus
47
pH
optimum
pI
Km
(mM)
Vm
kxđ
5,15,2
0,44 (LDOPA)
0,76
(catechol)
kxđ
kxđ
24,5
μM/min
(LDOPA)
288,0
μM/min
(catechol)
kxđ
kxđ
A. oryzae
L. edodes
67
70-105
5,0-6,0
6-6,5
N. crassa
46(TS*)
kxđ
kxđ
4,34,7
8,3
N. crassa
46(TL*)
kxđ
8,5
45
6,5-7,0
4,55,0
P.
sanguineus
0,88
(LDOPA)
0,95
(LDOPA)
1,0 (Ltyrosine)
0,9 (LDOPA)
kxđ
kxđ
54 (U/mg
protein)
(Ltyrosine)
112
(U/mg
protein)
(LDOPA)
Hoạt độ
riiêng
(U/mg
protein)
kxđ
kxđ
kxđ
1340
(LDOPA)
1330
(LDOPA)
30 (Ltyrosine)
84 (LDOPA)
TL: thermolabile isozyme: đồng phân không bền nhiệt.
23
Luận văn thạc sỹ khoa học
Đỗ Minh Trung
1.1.4. Cơ chế xúc tác phản ứng của Tyrosinase
Tyrosinase có cả hoạt tính cresolase và catecholoxidase, vì vậy cơ chất
đặc hiệu của tyrosinase bao gồm monophenol ( thể hiện hoạt tính cresolase)
và o- diphenol (thể hiện hoạt tính catecholoxidase).
Hình1.6: Tyrosinase xúc tác chuyển hố cả hai dạng mono và di-phenol
Phản ứng Hydroxyl hoá các monophenol tạo thành o-dipheno
Phản ứng oxihóa o- diphenol thành o-quinon
Cả hai phản ứng trên đều có sự tham gia của phân tử O 2 . Và nếu có mặt
axit ascorbic thì sẽ xảy ra sự chuyển hóa ngược từ o-quinone thành o-
24
Luận văn thạc sỹ khoa học
