Luận văn thạc sĩ Hóa sinh học, Đột biến gen, Bệnh cơ não, Người Việt Nam.

IH

QU

GI H N I

TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Trƣơng Thị Huệ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN
GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO
NGƢ I VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C

Hà Nội, 2013

IH

QU

GI H N I

TRƢ NG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN


Trƣơng Thị Huệ

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN MỘT SỐ ĐỘT BIẾN
GEN TY THỂ TRÊN BỆNH NHÂN CƠ NÃO

NGƢ I VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH H C

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA H C:
1. PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2013


I CAM ĐOAN
T i xin a

an

y

ng

nh nghi n ứ

i

hực hiện dưới sự

hướng dẫn của PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa v PGS.TS. Nguyễn Thị V n

ố iệ

ế

n

ng

ấ

ng

nh n

h

ận n

ng hự v

hưa

ng ư

ai

ng ố

NCS. Trương Thị Huệ

i

nh
ng


L I C M ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS.
Phan Tuấn Nghĩa, người thầy tâm huyết đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên
khích lệ, dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi trong quá trình thực
hiện luận án. Người thầy đã hết lịng giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất, luôn dành
cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt quá trình làm nghiên cứu khoa học. Tôi
xin gửi đến Thầy lời tri ân nhất về những điều mà Thầy đã dành cho tơi.
i in ày tỏ lịng c
ơn tới PGS.
Nguy n hị ân nh, đã ch ẫn và
giúp đỡ t i trong qu tr nh thực hiện luận án.
i in chân thành c
ơn đến GS.TS. Nguy n hanh Liê , Gi
đốc Bệnh
viện Nhi rung ương cùng c c B c sĩ Phạm Thị ân nh, B c sĩ rịnh Thúy Ngọc
đã nhiệt t nh giúp đỡ, cung cấp và chia sẽ thông tin về bệnh nhân trong quá trình
thu thập mẫu nghiên cứu.
Tơi xin chân thành c
ơn đến tồn thể q thầy, cơ trong Bộ mơn Sinh lý
thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, rường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền
đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành c
ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Ban
Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh –K NN, rường Đại học Quy Nhơn, c c

thầy, cô giáo, các anh chị bạn è đồng nghiệp trong Khoa Sinh học, các thành viên
trong nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp, Phịng Thí nghiệm trọng điể
ng nghệ n y và Prot in, rường Đại học Khoa học ự nhiên
i in gửi lời c
ơn đến Ban Giám hiệu, Phòng au Đại học, Ban hủ
nhiệm Khoa Sinh học và c c Phòng chức năng của rường Đại học Khoa học ự
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều iện cho t i học tập, hoàn thành c c
thủ t c cần thiết của một nghiên cứu sinh.
Luận n đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài NAFOSTED
106.06.123.09 và b n thân t i cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư
cách là một nghiên cứu sinh của đề tài.
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới c c ậc ố,
chồng con, gia đ nh,
những người đã lu n ên t i, cổ vũ, động viên và tạo điều iện thuận lợi nhất cho tơi
có thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận n
NCS. Trương Thị Huệ

ii


MỤC LỤC
Trang
LỜI

M O N

i

LỜI

M N

ii

M

L

iii

NH M

K HI U V

NH M

H

VIẾT TẮT

vi

NG

NH M

viii

H NH V

TH

ix

MỞ ẦU .................................................................................................................. 1
HƯ NG 1 TỔNG QUAN TÀI LI U ........................................................... 5
1.1. CẤU TRÚC VÀ CHỨ NĂNG ỦA TY THỂ NGƯỜI .......................................5

1.1.1. Cấu trúc của ty thể .....................................................................................5
1.1.2. Chứ năng ủa ty thể .................................................................................7
1.2. H GEN TY THỂ VÀ SỰ DI TRUYỀN CỦA CÁC GEN TY THỂ.....................12

1.2.1. Hệ gen ty thể ............................................................................................12
1.2.2. Sự di truyền theo mẹ và thuyế “nú ổ chai di truyền” ..........................16
1.2.3. Tính chấ
1.2.4. Tố
13

h ng ồng nhấ v ngưỡng biểu hiện của ột biến ................18

ộ ột biến của DNA ty thể ..............................................................20
T BIẾN TRONG H GEN TY THỂ NGƯỜI VÀ CÁC B NH LIÊN

QUAN ....................................................................................................................21

131

ột biến iểm DNA ty thể ....................................................................... 22

132

ột biến khác trên DNA ty thể ..........................................................29

1.3.3. Các bệnh i n
14

141

an ến rối loạn ty thể d

PHƯ NG PH P PH T HI N

ặ

ột biến gen nhân ..................33

T BIẾN GEN TY THỂ .........................35

iểm chung của bệnh d

ột biến gen ty thể..............................35

1 4 2 Ph n í h ột biến iểm DNA ty thể bằng PCR kết h p với RFLP ........38
1 4 3 Ph n í h ột biến iểm bằng x

ịnh trình tự gen ................................39

1 4 4 Ph n í h ột biến gen ty thể bằng một số phương ph p h
iii

................39


HƯ NG 2 NGUYÊN LI U V PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU .. 43
2.1. NGUYÊN LI U ................................................................................................43

2.1.1. Mẫu máu ..................................................................................................43
2.1.2. Các hoá chất, nguyên liệu khác ...............................................................43
2.2. MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT B ...................................................................43
2 3 PHƯ NG PH P NGHIÊN ỨU.......................................................................44

2 3 1 T h hiế

N

ổng số t mẫu máu ......................................................44

2.3.2. Tách chiết DNA plasmid .........................................................................44
av

2.3.3. Kiể

2.3.4. Nhân b n

ịnh ư ng DNA tách chiết ..................................................45
ạn gen ty thể chứa ột biến bằng kỹ thuật PCR ..................46

2.3.5. Kỹ thuật PCR kết h p với kỹ thuậ

a h nh hiề d i

ạn cắt giới

hạn (PCR-RFLP) ..............................................................................................46
2.3.6. Nhân dòng trực tiếp
2 3 7 Gi i

nh ự

ạn gen chứa ột biến vào vector pGEM- T ........47

ạn g n hứa ột biến .................................................48

238

iện di DNA trên gel agarose .................................................................50

239

iện di DNA trên gel polyacrylamide .....................................................51

2 3 10

ịnh ư ng ột biến A3243G bằng kỹ thuật real-time PCR .................52

2 3 11

ịnh ư ng acid lactic trong máu ...............................................................56

HƯ NG 3 KẾT QU VÀ TH O LUẬN ................................................. 57

3.1. PHÂN TÍCH

Ặ TRƯNG ỦA B NH NHÂN CH N NGHIÊN CỨU

T BIẾN GEN TY THỂ .......................................................................................57

311

ặ

iểm về bệnh lý: .........................................................................57

312

ặ

iểm về tuổi và giới tính: ...........................................................59

3.2. XÂY DỰNG CÁCH THỨC PHÁT HI N M T S

T BIẾN IỂM TRONG

H GEN TY THỂ ....................................................................................................60

3.2.1. Tách chiết DNA t mẫ

v

nh gi

ộ tinh sạch ...........................60

3.2.2. Thiết kế các cặp mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme cắt cho kỹ thuật PCRRFLP dùng ể phát hiện
323 X

ột biến iểm trong hệ gen ty thể ........................61

ịnh iều kiện thích h p cho phân tích PCR-RFLP .........................66

iv


3 2 4 X y dựng
3.3. SÀNG L

ch thức phát hiện ột biến iểm trong DNA ty thể .............72

S

T BIẾN GEN TY THỂ Ở B NH NHÂN

NÃO .......................................................................................................................73
3.3.1. Sàng lọ

ột biến A3243G bằng PCR-RFLP ..........................................73

3.3.2. Sàng lọ

ột biến A8344G / mấ

3.3.3. Sàng lọ

ột biến T14728C bằng PCR-RFLP .........................................82

3.4. SỰ BIỂU HI N CỦ

3.4.1. Nghiên cứ

ạn 9 bp bằng PCR-RFLP ................77

T BIẾN GEN TY THỂ Ở MỨ

GI

NH ..........88

ột biến A3243G thuộc hội chứng MELAS ........................88

3.4.2. Sự di truyền phân tử của ột biến mấ

ạn 9 bp (nucleotide 8272-8280) ..101

3.4.3. Sự di truyền phân tử của ột biến T14727C thuộc hội chứng ơ n

...105

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH ......................................................................... 111
M TS

ÔNG TR NH Ã ÔNG

LIÊN QU N ẾN LUẬN

ÁN .......................................................................................................................... 112
TÀI LI U THAM KH O...........................................................................113

v


DANH MỤC C C

HIỆU V CHỮ VIẾT TẮT

APS

Ammonium persulfate

Amp

Ampicillin

ANT

Adenine nucleotide translocase

bp

Base pair (cặp azơ)

BFQ

Black fluorescence quencher (chất hấp phụ hu nh quang)

COII

Cyt c oxidase II

CoQ
CPEO

Coenzyme Q
Chronic progressive external ophthalmoplegia
(liệt mắ ơ ng i iến triển kinh niên)

Cyt c

Cytochrome c

Cyt b

Cytochrome b

D-loop

Vòng chuyển vị

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

ddNTP

Dideoxyribonucleoside triphosphate

ddH2O

Deionized distilled H2O (nước cất loại ion, khử trùng)

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

EtBr

Ethidium bromide

FAD+

Flavin adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

FADH2

Flavin adenine dinucleotide (dạng khử)

IPTG

Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

kb

Kilobase

KSS

Kearns-Sayre syndrome (hội chứng KSS)

LB

Luria Bertani

LHON

L

’ h

di a y p i n

pa hy

(liệt thần kinh thị giác di truyền theo Leber)
LNA

Locked nucleic acid (nucleotide dạng khóa)

MELAS

Mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, stroke-like episodes

vi

(não giậ ơ ăng a id a i
MERRF

v gi tai biến mạch)

Myoclonic epilepsy with ragged-red fibres
( ộng kinh giậ ơ với các s i ỏ xé rách)

MIDD

Maternally inherited diabetes and deafness
(bệnh tiể

MRI

ường v

iếc di truyền theo mẹ)

Magnetic resonance image
(hình nh chụp cộng hưởng t )

mtDNA

Mitochondrial DNA (DNA ty thể)

nDNA

Nuclear DNA (DNA nhân)

NAD+

Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng oxi hóa)

NADH

Nicotinamide adenine dinucleotide (dạng khử)

NARP

Neuropathy, ataxia and retinitis pigmentos
(hội chứng gây liệt, mất sự iều hòa và viêm võng mạc
ộ quang học)

OD

Optical density (mậ

PCR

Polymerase chain reaction (ph n ứng chuỗi polymerase)

PEO

Progressive external ophthalmoplegia (liệ ơ

RFLP

Restriction fragment length polymorphism
(sự a h nh

ắt ngoài tiến triển)

ạn phân cắt giới hạn)

ROS

Reactive oxygen species (dạng oxy ph n ứng)

SDS

Sodium dodecylsulphate

TAE

Tris -Acetate-EDTA

TBE

Tris -Borate-EDTA

TEMED

N N N’ N’- Tetramethyl-Ethylenediamine

Tm

Melting temperature (nhiệ

X-gal

5-Bromo-4 chloro-3-indolyl--D galactopyranoside

vii

ộ nóng ch y)


DANH MỤC CÁC B NG
B ng 1.1. Các gen trong hệ gen ty thể ..................................................................... 14
ng 2 1 Thành phần trong b n gel polyacrylamide ............................................... 51
B ng 2.2. Trình tự của mồi và mẫu dò dùng cho real-time PCR..............................54
B ng 3.1.

ặ

iểm lâm sàng và tỷ lệ bệnh nhân bị

ộng .............................................57

B ng 3.2. Trình tự mồi và chế ộ nhiệt cho PCR ..................................................... 63
B ng 3.3. Enzyme giới hạn dùng

ng ph n í h ột biến ......................................69

B ng 3.4. Một số ột biến trong hệ gen ty thể ư c phát hiện ở bệnh nh n ơ n ............86
B ng 3.5. Tỷ lệ ột biến A3243G của bệnh nh n v người thân trong các gia
nh ........................................................................................................................... 94

B ng 3.6. Triệu chứng lâm sàng và tỷ lệ ột biến A3243G của
gia

người con trong

nh ..................................................................................................................... 98

viii


DANH MỤC C C H NH
Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể ...........................................................5
Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể......................................................................................6
Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể ..........................................................................7
Hình 1.4. Ty thể v
H nh 1 5

nh a

ổi năng ư ng trong tế bào..................................9

ơ hế của sự lão hố theo thuyết ty thể ..................................................10

Hình 1.6. Sự tổng h p và nh hưởng của ROS trong ty thể .....................................10
Hình 1.7. Hệ gen ty thể người ...................................................................................13
Hình 1.8. Thuyết nút cổ chai di truyền .....................................................................17
Hình 2.1. Cấu trúc của nucleotide c i biến dạng LNA .............................................53
Hình 2.2. Nguyên lý hoạ
Hình 2.3. Biểu ồ mộ

ộng của mẫu dò Taqman ...............................................54

ường biểu diễn khuế h ại (A) và biể

quan hệ giữa số b n N

í h ó

ng

ồ chuẩn về mối

ẫu chuẩn và chu k ngưỡng ương

ứng (B) ......................................................................................................................55
Hình 3.1.Tỷ lệ các nhóm tuổi của bệnh nhân ................................................................ 59
H nh 3 2

iện di s n phẩm DNA tổng số t mẫu máu của các bệnh nhân..............60

H nh 3 3

iện di s n phẩ

P R nh n

ạn gen chứa ột biến t mẫu máu của bệnh

nhân. ..........................................................................................................................67
H nh 3 4

iện di s n phẩm PCR - RFLP

ạn gen chứa ột biến của các bệnh nhân

...................................................................................................................................71
H nh 3 5

iện di s n phẩ

P R nh n

ạn gen 3134-3331 trong hệ gen ty thể của

các bệnh nhân. ...........................................................................................................73
H nh 3 6

iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) của một số bệnh nhân

nghi bị ột biến A3243G. ..........................................................................................73
H nh 3 7

iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/pUC19-Rv (A) và cặp mồi MAG (B) của ột biến A3243G .................75
H nh 3 8

iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII) kiểm tra s n phẩm ............

biến nạp chứa ột biến A3243G t khuẩn lạc trắng..................................................75

ix


Hình 3.9. So sánh trình tự n

id

ạn gen 3134-3331 của ty thể bệnh nhân ...76

Hình 3.10. Một phần trình tự nucleotide của

ạn DNA ty thể chứa ột biến

A3243G của ệnh nh n N4 ....................................................................................76
H nh 3 11

iện di s n phẩ

P R nh n

ạn gen 8155-8366 trong hệ gen ty thể của

các bệnh nhân ............................................................................................................77
H nh 3 12

iện di s n phẩ

P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ......78

Hình 3.13. iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi ...........
pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi MRAG (B).................................................79
Hình 3.14. So sánh trình tự n
(mẫu BN2, phụ lụ 2) nghi

id

ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân

ang ột biến mấ

Hình 3.15. Một phần trình tự nucleotide của
H nh 3 16

iện di s n phẩ

ạn với trình tự gen chuẩn ...........80
ạn DNA ty thể (8155-8366)...........80

P R ư c cắt bằng BanII của một số bệnh nhân ......81

Hình 3.17. So sánh trình tự n
(mẫu BN22, phụ lụ 2) nghi

id

ạn gen 8155-8366 của ty thể bệnh nhân .....

ang ột biến với trình tự gen chuẩn .........................82

Hình 3.18. Một phần trình tự nucleotide của

ạn DNA ty thể (8155-8366) chứa ột

biến G8251A .............................................................................................................82
H nh 3 19

iện di s n phẩm PCR nhân nh n

ạn gen 14601-14753 trong hệ gen

ty thể của các bệnh nh n
H nh 3 20

83

iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng DraI) của một số bệnh nhân

nghi bị ột biến T14728C .........................................................................................83
H nh 3 21

iện di s n phẩm PCR kiểm tra kết qu biến nạp sử dụng cặp mồi

pUC19-Fw/ pUC19-Rv (A) và cặp mồi ETC-Fw/ETC-Rv (B) ................................84
Hình 3.22. So sánh trình tự nucleotid
nhân (mẫu BN7, phụ lụ 2) nghi

ạn gen 14601-14753 của ty thể bệnh

ang ột biến T14728C với trình tự gen chuẩn ..85

Hình 3.23. Một phần trình tự nucleotide của

ạn DNA ty thể (14601-14753) chứa

ột biến T14727 ở ệnh nh n N7 ........................................................................85
Hình 3.24. Ph hệ các gia
H nh 3 25
A3243G của

nh

ang ột biến A3243G ...........................................89

iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng HaeIII)
h nh vi n

ng

gia

ạn g n

ang ột biến

nh ệnh nhân .......................................90

x

ạn gen chứa ột biến A3243G t các thành viên

Hình 3.26. So sánh trình tự
của gia

nh N42 ( ) v gia

Hình 3.27. Biể

ồ khuế h ại ằng

3243G ử dụng N
ang

ạn g n ở

H nh 3 28
mấ

h

a-i

P R

ạn gen ty thể

h nh vi n ủa 5 gia

nồng ộ h

nha

ạn của

h nh vi n

ng

ang ột biến

nh ệnh nh n v p a

id

................................................................95

iện di s n phẩm PCR-RFLP (cắt bằng BanII)

Hình 3.29. So sánh trình tự
gia

nh N58 ( ) ..........................................................91

gia

nh ệnh nh n

ạn gen chứa mất

ạn g n

ang ột biến

ang ột biến ............102

ạn 9 bp t các thành viên của

nh N15 .........................................................................................................102

Hình 3.30. Ph hệ của hai gia
H nh 3 31
h nh vi n

iện di s n phẩm PCR-RFLP
ng hai gia

ang ột biến T14727C ................105

ạn g n

ang ột biến T14727C của các

nh ệnh nhân .................................................................106

Hình 3.32. So sánh trình tự
của gia

nh ệnh nh n

nh N7 ( ) v gia

ạn gen chứa ột biến T14727C t các thành viên
nh N50 ( ) ..........................................................107

Hình 3.33. Cấu trúc bậc 2 của RNA vận chuyển acid glutamic ở ty thể người và vị
í ột biến T14727C . .............................................................................................108

xi


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ty hể

bào quan ó

ặ

ng hầu hết

ế

nhân chuẩn với chứ năng

chính là s n xuấ năng ư ng dưới dạng ATP cho tế bào. Ty thể tạo ra năng ư ng
bằng cách oxy hóa các acid hữ

ơ v a id é thông qua quá trình phosphoryl hóa

oxy hóa x y ra bên trong ty thể. ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất
nh a

c

ổi chất cần thiết bên trong tế bào.

Ty thể có hệ gen riêng, có cấu trúc s i

i, DNA mạch vịng với í h hước

16.569 bp, gồm 37 gen mã hóa cho 13 chuỗi polypeptide của chuỗi vận chuyển iện
tử, 22 RNA vận chuyển (tRNA) và 2 RNA ribosome (rRNA) khác nhau liên quan
ến hoạ

ộng chứ năng ủa y hể. So với DNA của nhân tế bào thì DNA của ty

thể dễ bị tổn hương d ty thể là một

i ường giàu chất oxy ph n ứng và do thiếu

ơ hế sửa chữa hiệu qu dẫn ến nhiề

ng ố ột biến iể

1988, Wallace và tập thể
gây bệnh i n

ột biến xuất hiện trong hệ gen ty thể. Nă
ầu tiên trên hệ gen ty thể người

an ến thần kinh thị giác di truyền theo Leber (L
ạn

optic neuropathy - LHON). Sự mấ
ơ

bệnh nhân liệ

N

’ h

ũng ư c tìm thấy ở

di a y
ơ ủa

ắt ngồi tiến triển mãn tính (chronic progressive external

ophthalmoplegia - CPEO) và hội chứng Kearns-Sayre (KSS) ũng ư c phát hiện
vào cùng nă

1988. h

người

x

ư

ến nay hơn 300 ột biến khác nhau trong hệ gen ty thể

ịnh, trong ó ó hơn 200 ột biến có kh năng g y ệnh và kèm

theo nhiều hội chứng khác nhau.
Gần như ất c các tế
cung cấp, d

ều dựa vào nguồn năng ư ng ổn ịnh do ty thể

ó những sai hỏng trong DNA của ty thể có thể gây ra sự rối loạn a

hệ thống nh hưởng ến nhiều loại tế bào, nhiều loại mô và tổ chức. Các bệnh do
ột biến gen ty thể có thể khởi phát ở mọi lứa tuổi với diễn biến khác nhau. Mứ
nghiêm trọng của bệnh ty thể ăng h
biến có mặt trong các mơ bị
ổi rất lớn, có thể i n

ộ

ộ tuổi và tỷ lệ DNA ty thể (mtDNA) ột

ộng. Biểu hiện lâm sàng do các rối loạn ty thể thay

an ến nhiề

ơ

an phức tạp hoặ

Các triệu chứng lâm sàng hay thấy ở n

ơ
1

ặ

ưng h

ng mơ.

ắt và giác quan. Các triệu chứng ó


có thể kết h p với nhau trong các hội chứng riêng biệ như hội chứng KSS, hội
chứng não giậ

ơ è

h

i ơ ỏ xé rách (myoclonic epilepsy with ragged-red

fibres – MERRF), hội chứng não giậ

ơ ăng a id a i

v gi tai biến mạch

(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes – MELAS)
hoặc viêm não tủy cấp di truyền theo Leigh (hội chứng Leigh). Tuy nhiên các triệu
chứng ó ũng ó hể không nằm trong một bệnh c nh cụ thể nào, mộ v i ột biến
thể hiện kiể h nh ương ự nhau làm cho việc chẩn
hó hăn. Vì vậy bệnh d

nên rấ

n ệnh dựa trên lâm sàng trở

ột biến gen ty thể hó ó ư c những chẩn

n

chính xác nếu chỉ dựa vào các triệu chứng lâm sàng và các chỉ tiêu cận lâm sàng.
Hiện nay, phân tích DNA là những phương ph p hiện ại nhất cho phép phát hiện
nhanh v

hính x

ột biến gen gây bệnh. Nghiên cứ

ột biến trong hệ

gen ty thể cho phép phát hiện ra ngun nhân của nhiều bệnh khác nhau.
ó nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh d

Hiện nay, trên thế giới

ng

biến gen ty thể. Tuy nhiên, do tính phức tạp

ột

ộng lâm sàng, mô bệnh học,

ơ hế phát sinh và biểu hiện bệnh nên sự sai sót trong hệ gen ty thể ở nhiều bệnh
nhân vẫn hưa ư c phát hiện v
Ở Việt Nam, bệnh d

h ng ó phương ph p iều trị hiệu qu .

ột biến gen ty thể ịn í

ư c nghiên cứu, h

ến

nay chỉ mới có một vài cơng trình mang tính chất khởi ầu trong phát hiện bệnh ty
thể ở mứ
mứ

ộ gen và protein.

ặc biệ

hưa ó

ng

nh n

i

nghi n ứu

ộ h ng ồng nhất (heteroplasmy) của ột biến gen ty thể ũng như ự liên

quan giữa mứ

ộ h ng ồng nhất với triệu chứng lâm sàng của bệnh.

ề tài luận án của húng

i ư

ặt ra với mục tiêu áp dụng và thiết lập

phương ph p phân tích chính xác v x

ịnh mứ

ộ h ng ồng nhất một số ột

biến gen ty thể ở các bệnh nh n người Việt Nam nhằm góp phần vào cơng tác khám
và iều trị các bệnh do rối loạn hệ gen ty thể.
2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Xây dựng ư c cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và
sàng lọc

ột biến gen ty thể này ở bệnh nh n ơ n

2

(encephalomyopathy).


- Thiết lập ư c phương ph p x

ịnh mứ

loại ột biến gen ty thể (MELAS) ể ướ

ộ h ng ồng nhấ của một

ầu tìm hiểu mối liên quan giữa

ứ

ộ

h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý.
3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài
Đối tượng nghiên cứu của đề tài:
Các bệnh nhân nghi bị bệnh do rối loạn ty thể ến h

v

iều trị tại Bệnh

viện Nhi T ng ương
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
- Thu thập mẫu bệnh phẩm và tách chiết DNA tổng số t các bệnh nhân nghi
bị bệnh do rối loạn ty thể ến h

v

iều trị tại Bệnh viện Nhi T ng ương

- Thiết kế mồi ặc hiệu và lựa chọn enzyme giới hạn phù h p cho việc sàng
lọc phát hiện ột biến gen ty thể bằng kỹ thuật PCR-RFLP.
- Xây dựng cách thức phát hiện một số ột biến gen ty thể phổ biến và áp
dụng cách thức thiết lập ư c ể sàng lọ
ột biến gen ty thể ở mứ

nghiên cứ
-

ịnh ư ng số b n a

ộ gia

ột biến này ở người Việt Nam,
nh

ang ột biến bằng phương ph p

dụng mẫu dị hu nh quang c i tiến, tìm hiểu sự liên quan giữa mứ

a -time PCR sử
ộ h ng ồng

nhất và tình trạng bệnh lý của một loại ột biến gen ty thể.
4. Địa điểm thực hiện đề tài
Các nghiên cứu của luận n ư c thực hiện tại Phịng Thí nghiệm trọng iểm
Cơng nghệ Enzy

v P

in T ường

ại học Khoa học Tự nhi n

ại học Quốc

gia Hà Nội.
5. Đóng góp mới của đề tài

- ã thiết lập ư c cách thức phát hiện 15 loại ột biến iểm trong hệ gen ty
thể ở người Việt Nam bao gồm: các ột biến T3271C và T3291C (hội chứng
MELAS); A8344G và T8356C (hội chứng MERRF); G11778A, G3460A và
T14484C (hội chứng LHON); T8993G/C và T9176G (hội chứng Leigh), A1555G
(hội chứng

iếc) v

T14709C (hội chứng ơ n

ột biến G4298A, T10010C, T14727C, T14728C và

nói h ng).
3


- Thiế ập ư
nhấ

ủa ộ

quan giữa mứ
- L

iến

phương ph p ph

hiện v

ịnh ư ng

3243G h ộ hội hứng MEL S v

ướ

ứ
ầ

ộ h ng ồng
h

hấy

ối liên

ộ h ng ồng nhấ và tình trạng bệnh lý.
ng

nh ầu tiên phát hiện thấy ột biến mới T14727C trên gen

MTTE mã hóa cho tRNAGlu ở bệnh nh n ơ n .
6. Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Cách thức phát hiện các ột biến gen ty thể
này có thể dễ dàng phát triển h nh

y

bệnh do rối loạn ty thể ở các bệnh viện.

4

ư c tạo ra trong nghiên cứu

nh ể áp dụng vào việc xét nghiệm


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CẤU TRÚC V CHỨC NĂNG CỦA TY THỂ NGƢ I

1.1.1. Cấu trúc của ty thể
Ty thể là bào quan có ở hầu hết các tế bào nhân thật, bắ

cứu t giữa thế kỷ XIX Nă

ư c nghiên

1857, nhà gi i phẫu họ người Thụy Sĩ K

ầu tiên tìm thấy bào quan này trong tế
mơ họ người

ầ

ơ Hơn a

ươi nă

Hình dạng ặ

h

ần

a (1890), nhà

ức, Richard Altmann, bằng phương ph p nh ộm fuchsine

sát ư c ty thể ở nhiều tế

i

an

nha dưới kính hiển vi quang học.

ưng ủa ty thể là thon dài với ường kính 0,5-2 µm và chiều

dài 7-10 µm (hình 1.1 A). Phụ thuộc vào trạng thái tế bào hay loại tế bào, ty thể có
hình dạng v

í h hước khác nhau (hình 1.1 B, C). Ty thể có kh năng hay ổi

í h hước, hình dạng, có thể liên kết với nhau tạo ra những cấ

ú d i hơn h ặc

phân ra thành những cấu trúc ngắn hơn Ng i a, ty thể có kh năng di h yển ể
ph n ứng với những hay ổi sinh lý trong tế bào [30].

Hình 1. 1. Các hình dạng khác nhau của ty thể [30]
A: Dạng thon dài, B và C: Dạng biến ổi

Trong tế bào, ty thể nằm r i rác ở nguyên sinh chấ nhưng ũng ó hể nằm
tập trung ở khu vực cần nhiề năng ư ng như
thể ở một tế

i ủa tinh trùng. Số ư ng của ty

ũng phụ thuộc vào nhu cầu sử dụng năng ư ng của tế

thể t vài ty thể ở tế

da h

ến vài nghìn ty thể ở tế

5

ơ [30].

ó ó


Ty thể có cấu trúc gồm hai lớp màng lipoprotein, màng ngoài và màng trong,
ương ự như màng sinh chất. Hai lớp màng này bao lấy chất nền ở phía trong,
khoang giữa hai

ng ư c gọi là xoang gian màng. Màng trong ty thể ăn

v

ăng ư c [16, 38].

chất nền tạo thành các

Hình 1. 2. Cấu trúc của ty thể
[ />
Màng ngồi ty thể ó ộ d y 6 n

ng ó p

in hiếm kho ng 60% và

lipid chiếm kho ng 40%. Màng có nhiều protein lỗ (porin), kênh ion cho phép các
chất với khối ư ng phân tử lớn ến 10 kDa và các ion di chuyển tự do t ngoài
nguyên sinh chấ v

x ang gian

ng v ngư c lại. Màng ngồi ty thể cịn chứa

nhiều enzyme quan trọng như các transferase, các kinase, cytochrome-reductase,
acyl CoA synthetase [16]. Màng trong của ty thể ũng

ng ip p

in

ó ộ

dày 6 nm, protein chiếm 80%, lipid chiếm 20%, và mộ ư ng nhỏ cholesterol. Tỷ lệ
giữa cholesterol/phospholipid là 1/53. Màng trong ăn
ăng ư c. Cấ

ú “

”

so với màng ngoài và iề n y i n

v

hất nền tạo nên các

ăng diện tích bề mặt của màng trong gấp ba lần
an ến chứ năng của nó là ăng ường vận

chuyển iện tử và tổng h p ATP. Màng trong chứa nhiều protein vận chuyển chủ
ộng ATP, ADP, acid béo và các protein kênh vận chuyển các ion Na+, K+, Ca2+ và
H+. M ng

ng

nơi

ủa 5 phức h p thuộc chuỗi hô hấp bao gồm chuỗi vận

chuyển iện tử (phức h p I-IV), ATP synthase (phức h p V, còn gọi là F1F0ATPase) và adenine nucleotide translocase (ANT) [16, 38].

6


Hình 1.3. Cấu trúc màng trong ty thể [73]

Xoang gian màng (khoang hẹp giữa màng ngoài và màng trong ty thể)

nơi

trung chuyển các chất giữa hai màng. Xoang gian màng chứa nhiều ion H+ t chất
nền i a d h ạ
chấ

ộng của chuỗi vận chuyển iện tử, chứa cytochrome c (Cyt c) là

ang iện tử ơ ộng cho chuỗi hô hấp, gi i phóng Cyt c v

ương sẽ

hoạt hóa enzyme caspase có vai trị trong q trình tự chết của tế bào (apoptosis).
Chất nền (matrix) của ty thể chứa các enzyme của chu trình Krebs, các
enzyme của quá trình oxy hóa acid béo, acid amin và bộ máy di truyền riêng của ty
thể Như vậy, ở tế bào ộng vật, thực vậ v người ngồi hệ gen nhân, cịn có hệ gen
tế bào chất nằm trong ty thể [16, 38].
Khi ạ

í h hước lớn tối a y hể tiến h nh ph n

i tạo ra hai ty thể mới.

T ước tiên, hệ gen ty thể ư c sao chép ể ăng ố ư ng b n a

Sa

ó

ng

trong thắt lại rồi ến màng ngoài và hai ty thể con tách nhau ra. Tuy nhiên, nhiều ty
thể h ng ph n

iv

ị phân hủy

ng yz

ơ hế này giúp duy trì số ư ng ty thể ặ

ưng

h

ơ hế tự tiêu (autophagy).

ng

ột tế bào [30].

1.1.2. Chức năng của ty thể
1.1.2.1. y thể và qu tr nh trao đổi năng lượng trong tế ào
Ty thể là bào quan s n xuấ năng ư ng cho tế bào bằng cách oxy hóa các
h p chất hữ

ơ tạo ra CO2, H2O và gi i phóng tồn bộ năng ư ng (hình 1.4). Các

ph n ứng n y ư c xúc tác bởi các phức h p của chuỗi hô hấp I, II, III và IV nằm ở
màng trong của ty thể [36, 61]. Nguồn tạ
7

a năng ư ng trong ty thể là

ư c lấy t

carbohydrate, chất béo và protein

thứ

ăn

ng

ó hủ yếu là

carbohydrate. Các h p chấ n y ư c oxy hóa ể tạo ra các chất khử gi
ư ng a

ó

liên kế ph pha

năng

ương ư ng khử ư c chuyển h nh năng ư ng dự trữ ở dạng
a năng

ạn tạo ra ATP ở ty thể

ng

ó

TP thơng qua

h

nh K

n ường hóa thẩm. Có hai giai

diễn ra trong chất nền và quá trình

phosphoryl hóa oxy hóa ở chuỗi vận chuyển iện tử nằm ở màng trong ty thể với sự
xúc tác của các phức hệ enzyme.
Các h p chất carbohydrate, chủ yếu là glucose ư c phân cắt và biến ổi qua
nh ường phân (glycolysis) tạo thành s n phẩm cuối cùng là pyruvate, một ít
năng ư ng ATP và chất khử NADH. Pyruvate sau khi ư

ưa v

y hể thì bị

oxy hóa decarboxyl hóa ể tạo thành acetyl-CoA (acetyl-CoA có thể t q trình
oxy hóa acid béo) và tiếp tụ

ư c oxy hóa hồn tồn trong chu trình Krebs ể tạo

thành CO2, H2O và năng ư ng gi i phóng chủ yếu ư c tích trữ dưới dạng ATP.
Trong q trình oxy hóa các h p chất thơng qua h

nh K

iện tử và proton

H+ ư c tách ra và chuyển ến các phân tử nhận iện tử là NAD+ và FAD trong
chuỗi vận chuyển iện tử ể tạo thành NADH và FADH2. Chuỗi vận chuyển iện tử
gồm 4 phức h p bao gồm nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase
(NADH-CoQ reductase) (phức hệ I), succinate CoQ reductase (phức hệ II),
ubiquinol cytochrome b reductase (phức hệ III), cytochrome c oxidase (phức hệ IV)
và hai phân tử vận chuyển iện tử giữa các phức hệ là coenzyme ubiquinone (CoQ)
và Cyt c. Phức hệ I và II xúc tác cho sự nhận iện tử của CoQ t NADH và
succinate. Phức hệ III xúc tác cho quá trình chuyển iện tử t

Q ến Cyt c. Cuối

cùng phức hệ IV xúc tác sự vận chuyển iện tử t Cyt c tới chất nhận cuối cùng là
oxy phân tử. Ở mỗi ước, iện tử i
ra kèm theo việc ơ

a

phức hệ năng ư ng ư c gi i phóng

+

các proton (H ) t chất nền qua màng trong ra xoang gian

màng và làm xuất hiện iện thế màng. Nhờ thế, hệ thống ATP synthase hoạ
và tổng h p ATP t ADP và ph pha v

ộng

ơ (Pi).

ATP là nguồn năng ư ng lớn ư c sử dụng cho tất c

nh a

ổi

ó khi ty thể bị tổn hương quá trình

chất cần thiết bên trong tế bào [37, 73]
s n inh a năng ư ng ể cung cấp cho tế
ng ng lại hoàn tồn.

8

v

ơ hể bị chậm lại, thậm chí bị


Hình 1.4. Ty thể và quá trình trao đổi năng lƣợng trong tế bào [100]

Gần như ấ
ng ấp d

ề dựa v

ng ồn năng ư ng ổn ịnh d

ó ự ổn hương ủa y hể ó hể g y a ự ối

hưởng ến nhiề
h ng giống nha
y hể ộ

ế

ại ế

nhiề

ại

v

ơ

ởi v người ệnh ó hể ó

iến với ự ph n ố i ng

ể ù ắp h những y hể ị ộ

an T iệ

y hể

ạn a hệ hống, nh
hứng ủa ệnh y hể

ộ hỗn h p y hể

nh hường ẫn

i hi ố y hể

nh hường ủ

ng ơ hể

iến [38].

1.1.2.2. Ty thể và q trình lão hóa
ng ơ hể sinh

Lão hóa là một quá trình sinh học phức tạp, x y ra tất yế
vậ v

h ng i n

an ến ơ hế tế bào chết h

Thuyết gốc tự d
v

nă

i n

hương

an ến lão hoá lần ầu tiên ư

nh (apoptosis).
ề xuất bởi Harman

1956. Thuyết này cho rằng ty thể là nguồn gốc của phần lớn các dạng oxy

ph n ứng ROS (reactive oxygen species,hình 1.5). Theo thuyết này, những tổn
hương í h

ỹ theo tuổi

ng

N

ng y n nh n i è

với những rối

loạn chứ năng y hể, dẫn tới việc s n xuất nhiều ROS và phá huỷ mtDNA. Kh
năng ạ năng ư ng ATP của ty thể gi

v

thành tế bào [38, 63, 84].

9

ăng

nh xy h

hư hại cấu


Hình 1.5. Cơ chế của sự lão hố theo thuyết ty thể [54]

Hô hấp tế bào là nguyên nhân sinh ra các gốc tự do gắn liền với b n chất của
sự sống. Sự hô hấp tế bào về b n chất là sự chuyển iện tử t chấ dinh dưỡng ến
oxy phân tử thông qua phức hệ các enzyme vận chuyển iện tử trong ty thể. Hơn 95%
O2 ư c tiêu thụ bởi ty thể và biến ổi ể tạo thành H2O ở cytochrome oxidase
(phức hệ IV của chuỗi hô hấp). Kho ng 2-4% O2 nhận iện tử ở các mức khác nhau
và trực tiếp tạo ra các gốc tự do oxy ph n ứng (gốc superoxide – O.-2, peroxide
hydro – H2O2 và gốc hydroxyl ph n ứng – OH-,hình 1.6). Các gốc tự do có hại khi
có mặt mộ ư ng lớn v

h ng ư c trung hòa bởi các chất chống oxy hóa. Các

gốc tự do này có thể làm tổn hương màng tế bào, DNA và các enzyme của q
trình phosphoryl hóa oxy hóa [38].

Hình 1.6. Sự tổng hợp và ảnh hƣởng của ROS trong ty thể [15]

10


Trong số

có kh năng h ạ

ộc hại nhất là gốc HO*, vì nó là gốc tự d

ROS h

iển hình

ộng khá mạnh. ROS có thể tác dụng lên các chất có khối ư ng

phân tử lớn theo cách liên ứng, chúng lần ư t tạo ra các gốc tự do t các phân tử bị
tấn công nối tiếp nhau, gốc tự d
khuế h ại tác dụng tấn

a

ư c tạo thành t các phân tử

ước và

ng an ầu.

Gốc tự do có thể phá rách màng tế bào khiến chấ dinh dưỡng thất thoát, tế
h ng ăng ưởng

h ng ư c sửa chữa và chết. ROS phá hủy hoặ ngăn

sự tổng h p p

in ipid

elastin mấ ính

n hồi khiến da nhăn nh

n

ường, tinh bột, enzyme trong tế bào, làm cho collagen,

ROS và các gốc tự do g y a

ơ hớp cứng nhắc.
ột biến gen, ăng ự h nh h nh v í h ũy

ột biến DNA ty thể ở các mô trong quá trình lão hóa.

ồng thời các gốc tự do

oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại việc loại th i chất bã và tiếp nhận chất dinh
dưỡng; ROS tấn công ty thể, lạp thể khác và phá vỡ nguồn cung cấp năng ư ng,
các gốc tự do làm gi m kh năng iều hịa và hoạt tính xúc tác của enzyme dẫn ến
ơ hể h ng ăng ưởng ư

Gốc tự do là nguyên nhân của sự tự huỷ hoại, sự

lão hoá ở cấp ộ tế bào [38, 42, 63].
mtDNA ịnh vị ở màng trong ty thể ư c xem là thuận l i cho q trình hơ
hấp nhưng ại rất gần với bộ phận s n sinh ra ROS. Gốc tự do superoxide tấn công
trực tiếp vào DNA của tế bào hoặc làm xuất hiện các gốc tự do thứ phát có kh
năng ấn cơng DNA và protein. Theo thuyết ty thể về lão hố, việc tích luỹ những

tổn hương ở các thành phần bên trong ty thể bao gồm mtDNA, protein, lipid làm
nh hưởng ến chứ năng của ty thể. Nói chung, những tổn hương của mtDNA
trong phạm vi rộng với thời gian dài dẫn ến ty thể bị rối loạn, thậm chí ng ng hoạt
ộng là nguyên nhân làm cho tế bào chế v

ơ hể bị lão hoá.

1.2.2.3. Ty thể và quá trình tự chết của tế bào (apoptosis)
Ty thể óng vai ị h n hốt trong q trình tự chết của tế bào.
quá trình quan trọng trong sự phát triển v
Chết tế

h

hương

iều hành mơ của sinh vậ

nh ó i n

a

an ến 1.500 gen phân bố trong

nhân và ty thể [76, 103]. Tuy nhiên, vai trò của ty thể

11

y là một

ng “ hế h

hương

nh”


rất phức tạp và hưa ư c biế
thể có liên quan tới “ hế h

ến ầy ủ; có thể quá trình tạ năng ư ng của ty
hương

nh”; có thể do chuỗi hô hấp của ty thể tạo

ra s n phẩm phụ là các dạng ROS và d

ơ hế sửa chữa của hệ gen ty thể kém nên

ng

ăng

nh này.

Ty hể òn ó h năng í h ũy v giữ ư ng i n anxi
ọng

ng việ

iề hòa a

ổi hấ

dị h. Ng i a y hể ịn óng

ộ vai ị

hóa khác như làm ổn hương ế
g

a a

ăng inh ế

ổng h p

TP v

an ọng

hần

iề n y ấ

iề hòa hần inh hể

ng nhiề

inh d

an

nh h yển

h

hấ

iề hịa ạng h i xy hóa- hử ủa ế

ng gian
ổng h p

nhân heme, steroid [69].
1.2. HỆ GEN TY THỂ V SỰ DI TRUYỀN CỦA C C GEN TY THỂ

1.2.1. Hệ gen ty thể
Ty hể

an hiế

h i

ng ế

với hệ g n nh n Hệ g n ủa y hể người ư
1967

ến nă

1981

nd

n

ng ố

ó hệ g n i ng nh n
ay n

ần ầ

nh ự v

ấ

ú

n ộ
i nv

ập
nă

ủa hệ g n y hể

người [9, 16].
mtDNA người tồn tại ở dạng mạch vòng, s i

i

ó í h hước 16.569 bp,

bao gồm 37 gen (b ng 1.1) mã hóa cho 2 phân tử rRNA, 22 phân tử tRNA và 13
phân tử protein là thành phần cần thiết trong các phức h p của chuỗi hơ hấp. ND1ND6 và ND4L mã hóa 7 tiểu

ơn vị của phức hệ I (NADH–ubiquinone

oxidoreductase), cytochrome b (Cyt b) là tiể

ơn vị của phức hệ III chỉ ư c mã

hóa bởi mtDNA (ubiquinol cytochrome c oxidase reductase), COX1-3 (COI-COIII)
mã hóa cho 3 tiể

ơn vị của phức hệ IV (cytochrome c oxidase-COX), các gen

ATP 6 và ATP 8 mã hóa cho 2 tiể

ơn vị của phức hệ V, chính làATP synthase

(hình 1.7). Các phân tử protein cịn lại của chuỗi hơ hấp ư c mã hóa bởi gen nhân,
ư c dịch mã trong tế bào chất a

ó ư c vận chuyển vào bên trong ty thể [56].

ặc biệt, hệ gen ty thể chứa ít trình tự khơng mã hóa xen kẽ giữa các vùng mã hóa.
D-loop nằm giữa gen tRNAPhe (MTTF) và tRNAPro (MTTP), dài kho ng 1,1 kb là

vùng không mã hóa lớn nhất và có vai trị quan trọng

12

iều hịa q trình sao chép