Cố định acetobacter aceti bằng chất mang cellulose vi khuẩn để ứng dụng lên men acid acetic

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN

CỐ ĐỊNH ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT
MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG
LÊN MEN ACID ACETIC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH

: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày

tháng

năm 2009


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc

Tp. HCM, ngày

tháng

năm 2009

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: Lê Nguyễn Hồng Ân .

Giới tính: Nam.

Ngày, tháng, năm sinh: 21-04-1983.

Nơi sinh: TP. Hồ Chí Minh.

Chun ngành: Cơng nghệ sinh học.

MSHV: 03106662.

Khố (năm trúng tuyển): 2006.
I- TÊN ĐỀ TÀI
CỐ ĐỊNH TẾ BÀO ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG
CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Xác định một số điều kiện dinh dưỡng thích hợp của Acetobacter aceti trong
lên men acid acetic.

-

So sánh hiệu quả tạo acid acetic trong quá trình lên men theo mẻ ở chế độ lắc
và chế độ tĩnh.

-

Tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn ở
điều kiện cố định tối ưu.

-

Xác định chế độ tối ưu để bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên
chất mang cellulose vi khuẩn.

-

Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên chất mang cellulose vi

khuẩn trong hệ thống lên men acid acetic liên tục.

III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ:
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ:
V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG.
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng chun ngành thơng qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MƠN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

PGS. TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG


LỜI CÁM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG.
Cô luôn đồng hành cùng em trong thời gian thực hiện đề tài, những lúc em gặp khó
khăn nhất. Em vơ cùng q trọng sự nhiệt tình và hi sinh của Cơ đã dành cho em để
em có thể hồn thành luận văn.
Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Thầy PGS. TS NGUYỄN ĐỨC
LƯỢNG đã tạo điều kiện cho em thực hiện luận văn này.
Em xin chân thành cám ơn các Cô trong Bộ mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã
tận tình giúp đỡ, quan tâm chỉ dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong thời gian em
thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến tất cả các bạn học viên Cao học khóa 2006, khóa
2007, các bạn sinh viên trường Đại học Dân lập Kỹ thuật Công nghệ đã chia sẻ
buồn vui cùng tơi trong khóa học và thời gian làm luận văn. Đặc biệt cám ơn hai em
Minh và Mi đã chia sẽ cho anh những lời khuyên và kinh nghiệm quý báu.

Tôi xin cám ơn các bạn thân đồng nghiệp đã luôn bên cạnh tôi những lúc tơi
gặp khó khăn để động viên tinh thần cho tơi sớm hoàn thành luận văn.
Con xin cảm ơn Bố Mẹ và em Bi luôn là chỗ dựa vững chắc nhất để con có
thể an tâm làm việc và hồn thành luận văn. Gia đình mình ln là động lực lớn
nhất giúp con phấn đấu hơn trong cuộc sống.
Tp.HCM, ngày 01 tháng 8 năm 2009
LÊ NGUYỄN HỒNG ÂN


TĨM TẮT
Acid acetic là một loại hóa chất cơng nghiệp được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp thực phẩm, tổng hợp chất dẻo tơ sợi, chế biến mủ cao su, sản xuất chất
màu, dung môi hữu cơ…Để nâng cao nồng độ acid acetic, luận văn có sử dụng
phương pháp cố định Acetobacter aceti lên chất mang cellulose vi khuẩn và hệ
thống lên men liên tục. Các kết quả nghiên cứu đạt được như sau:
− Điều kiện dinh dưỡng thích hợp trong lên men acid acetic của Acetobacter
aceti: nồng độ sulfate amon 0.2%, nồng độ ethanol 0.3% và nồng độ acid acetic bổ
sung ban đầu 0.5%.
− Trong thí nghiệm khảo sát sự lên men theo mẻ, chế độ lắc tạo ra nồng độ
acid acetic cao hơn nồng độ acid acetic được tạo ra ở chế độ tĩnh. Thời gian lên men
để nồng độ acid acetic đạt giá trị cao (7.03%) là 6 ngày.
− Tạo ra được chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi khuẩn
trong điều kiện tối ưu lắc 250 vòng/phút ở 35oC. Chế phẩm Acetobacter aceti cố
định trên cellulose vi khuẩn bảo quản ở nhiệt độ mát (5 – 10oC) vẫn giữ được chất
lượng, mật độ tế bào còn sống đạt 94.6% so với ban đầu.
− Khi tiến hành ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi
khuẩn trong hệ thống lên men liên tục, đã xác định được tốc độ pha loãng tối ưu cho
hệ thống lên men liên tục là 0.008 (1/h); hệ thống lên men liên tục hoạt động ổn
định trong thời gian theo dõi, đạt nồng độ acid acetic là 7.5%; không phát hiện thấy
tế bào rửa trôi của chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên cellulose vi khuẩn trong

quá trình lên men liên tục.


ABSTRACT
Acetic acid is an important industrial chemical. It is widely used in the
foodstuff industry, the synthesis of fibrous plastic and the manufacture of rubber
latex, colourant, organic solven… In this thesis, with the aim of increasing the
acetic acid concentration, the immobilization of Acetobacter aceti cells in the
bacterial cellulose and the continuous fermentation system are applied. The results
are given as following:
− The nutritional conditions suitable for Acetobacter aceti in the acetic acid
fermentation include: the sulfate amon concentration of 0.2 percent, the ethanol
concentration of 0.3 percent and the supplied acetic acid concentration of 0.5
percent.
− Each day of batch fermentation, the fermentation with shaking condition
makes the acetic acid concentration higher than the acetic acid concentration made
form the stable fermentation. The fermentation time to get high acetic acid
concentration (7.03%) is determined as 6 days.
− The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose
carrier is optimally created in the shaking condition of 250 rpm and at 35oC. Its
preservation at the cool temprature (5 – 10oC) still remains the quality, the density
of live cells is 94.6% in comparision with the initial product.
− The product of Acetobacter aceti cells immobilizated in bacterial cellulose
carrier is applied in the continuous fermentation system. The optimal speed of
dilution is determined as 0.008(1/h). The continuous fermentation system works
stably in observation time and gets the acetic acid concentration of 7.5 percent.
Acetobacter aceti cells in bacterial cellulose carrier may not be wash-out in the
continuous fermentation process.

i

MỤC LỤC
Trang
LỜI MỞ ĐẦU------------------------------------------------------------------------------- 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ----------------------------------------------- 3
1.1. Đặc điểm của acid acetic -------------------------------------------------------------- 4
1.2. Tác nhân vi sinh vật -------------------------------------------------------------------- 4
1.3. Bản chất sinh hóa của quá trình lên men acetic -----------------------------------10
1.4. Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men acetic --------------------------11
1.5. Các phương pháp sản xuất acid acetic ---------------------------------------------13
1.6. Cố định tế bào vi sinh vật ------------------------------------------------------------17
1.7. Hệ thống lên men----------------------------------------------------------------------28
1.8. Các nghiên cứu về tế bào vi sinh vật cố định trong sản xuất acid acetic ------33
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ----------------39
2.1. Vật liệu và hóa chất -------------------------------------------------------------------40
2.2. Phương pháp nghiên cứu ------------------------------------------------------------42
2.2.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của giống ----------------------------------42
2.2.2. Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic
của Acetobacter aceti ----------------------------------------------------------------------44
2.2.3. Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ ---------44
2.2.4. Khảo sát các điều kiện tối ưu để tạo chế phẩm Acetobacter aceti cố định lên
chất mang BC -------------------------------------------------------------------------------44
2.2.5. Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên BC ------------45
2.2.6. Ứng dụng chế phẩm A. aceti cố định trong hệ thống lên men liên tục ------45
2.2.7. Các phương pháp phân tích --------------------------------------------------------46
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN-------------------------------------------50
3.1. Khảo sát một số đặc điểm sinh học của Acetobacter aceti ----------------------51
3.2. Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic
của Acetobacter aceti ----------------------------------------------------------------------56

ii

3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon ---------------------------------56
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol----------------------------------------58
3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu--------------------------60
3.3. Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ -----------63
3.4. Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định chủng A. aceti lên chất mang BC --65
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của chế độ lắc đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang
BC theo thời gian --------------------------------------------------------------------------65
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến mật độ tế bào hấp phụ lên chất mang
BC theo thời gian --------------------------------------------------------------------------67
3.5. Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định ------------------------69
3.6. Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trên chất mang BC trong hệ
thống lên men liên tục----------------------------------------------------------------------71
3.6.1. Xác định tốc độ pha lỗng tối ưu cho q trình lên men-----------------------73
3.6.2. Kiểm tra tính ổn định của hệ thống lên men liên tục ---------------------------76
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ---------------------------------------------79
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Vi khuẩn Acetobacter aceti dưới kính hiển vi điện tử. .................................9
Hình 1.2. Q trình oxy hóa rượu thành acid acetic. ..................................................10
Hình 1.3. Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét của màng BC. ......................20

Hình 1.4. Các liên kết hydro trong cellulose. .......................................................20
Hình 1.5. Lớp màng BC được hình thành trong điều kiện ni cấy tĩnh...............21
Hình 1.6. Các hạt BC được hình thành trong điều kiện ni cấy lắc. ...................22
Hình 1.7. Phương pháp cố định vi sinh vật trên bề mặt chất mang. .....................25
Hình 1.8. Phương pháp cố định vi sinh vật trong lịng chất mang........................26
Hình 1.9. Fermenter làm việc liên tục. ................................................................29
Hình 3.1. Khuẩn lạc A. aceti sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa.............51
Hình 3.2. A. aceti sau 3 ngày ni cấy trong mơi trường thạch đứng...................51
Hình 3.3. Hình dạng và cách sắp xếp của tế bào A. aceti dưới kính hiển vi. ........52
Hình 3.4. Phản ứng dương tính khi thử với FeCl3................................................52
Hình 3.5. Bình nhân giống khảo sát đường cong sinh trưởng. .............................54
Hình 3.6. Đường cong sinh trưởng của chủng Acetobacter aceti. ........................55
Hình 3.7. Bình lên men tĩnh. ...............................................................................63
Hình 3.8. Bình ni cấy cho các thí nghiệm cố định tế bào. ................................65
Hình 3.9. Hệ thống lên men acid acetic liên tục. .................................................71
Hình 3.10. Cấu tạo của 1 bình lên men................................................................72


iv

DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur. ..................................................6
Bảng 1.2. Các chủng vi sinh vật tổng hợp BC. ....................................................23
Bảng 3.1. Tương quan giữa mật độ tế bào (CFU/ml)và OD540.............................53
Bảng 3.2. Mật độ tế bào sau 5 ngày nhân giống. .................................................54
Bảng 3.3. Kết quả khảo ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon.............................56
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol. ...............................59
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu..............61
Bảng 3.6. Kết quả lên men theo mẻ ở 2 chế độ tĩnh và lắc..................................63

Bảng 3.7. Biến thiên mật độ tế bào ở 3 chế độ lắc theo thời gian.........................66
Bảng 3.8. Biến thiên mật độ tế bào ở 3 chế độ nhiệt độ theo thời gian.................67
Bảng 3.9. Chất lượng chế phẩm theo thời gian bảo quản. ...................................69
Bảng 3.10. Tỉ lệ % tế bào còn sống so với chế phẩm ban đầu theo thời gian bảo
quản. ...................................................................................................................69
Bảng 3.11. Các thông số lên men ban đầu. ..........................................................73
Bảng 3.12. Lượng chế phẩm cho vào mỗi bình lên men. .....................................75
Bảng 3.13. Biến động pH trong quá trình lên men...............................................75
Bảng 3.14. Biến động nồng độ acid acetic trong quá trình lên men. ....................76
Bảng 3.15. Nồng độ acid acetic và pH với tốc độ pha loãng 0.008(1/h)...............77
Bảng 3.16. Biến động của lượng acid acetic qua 5 bình của hệ thống ở tốc độ pha
loãng 0.008(1/h). .................................................................................................77
Bảng 3.17. Bảng so sánh hiệu quả lên men của thí nghiệm lên men theo mẻ và lên
men liên tục.........................................................................................................78


v

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Trang
Đồ thị 3.1. Đồ thị chuẩn mối tương quan giữa mật độ tế bào và OD. .......................53
Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng
tạo thành. ...........................................................................................................................57
Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ sulfate amon ban đầu đến mật độ tế bào. ............58
Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng tạo
thành. .................................................................................................................................59
Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu đến mật độ tế bào. ......................60
Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic bổ sung ban đầu đến nồng độ acid tổng
tạo thành. ...........................................................................................................................61
Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu đến mật độ tế bào..................62

Đồ thị 3.8. Giá trị pH ở 2 chế độ tĩnh và lắc theo từng ngày. .........................................64
Đồ thị 3.9. Nồng độ acid acetic ở 2 chế độ tĩnh và lắc theo từng ngày..........................64
Đồ thị 3.10. So sánh mật độ tế bào hấp phụ trên BC ở 3 chế độ lắc...........................66
Đồ thị 3.11. So sánh mật độ tế bào hấp phụ trên BC ở 3 chế độ nhiệt độ...................68
Đồ thị 3.12. Tỉ lệ tế bào còn sống ở 2 chế độ nhiệt độ bảo quản khác nhau...............70

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 1.1. Đường hướng tạo cellulose của vi khuẩn.............................................24
Sơ dồ 1.2. Phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật. ........................25
Sơ đồ 2.1. Nội dung nghiên cứu. .........................................................................42


1

LỜI MỞ ĐẦU
Acid acetic (hay còn gọi là ethanol acid) là một loại hóa chất có giá trị kinh
tế cao, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: sản xuất chất
dẻo, tơ sợi, chất màu, sợi tổng hợp, dung mơi hữu cơ, phim ảnh, thực phẩm, hóa
dược....
Ở Việt Nam nhu cầu sử dụng acid acetic trong đời sống và trong hoạt động
công nghiệp rất lớn. Acid acetic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến
mủ cao su, công nghiệp thực phẩm, sản xuất chất màu, dung môi hữu cơ, tổng hợp
các chất dẻo tơ sợi...[8].
Nhu cầu sử dụng acid acetic ngày càng nhiều, trong khi đó việc sản xuất acid
acetic trong nước khơng đủ đáp ứng những nhu cầu trên. Gần như toàn bộ nhu cầu
acid acetic ở nước ta đều phải đáp ứng bằng con đường nhập khẩu.
Việt Nam là một nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên nguồn ngun
liệu để sản xuất acid acetic trong nước khá dồi dào như: mật rỉ, hoa quả chín, tinh
bột, cồn...Với điều kiện như vậy rất thích hợp cho việc nghiên cứu sản xuất acid
acetic bằng cách ứng dụng công nghệ sinh học, nhằm đáp ứng nhu cầu về acid

acetic ngày càng tăng của nước ta hiện nay và trong tương lai.
Sự cố định tế bào vi sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào vi
sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch, nhưng vẫn có khả
năng trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên. Người
ta cho rằng các tế bào vi sinh vật cố định sẽ giúp giải quyết nhiều q trình cơng
nghệ mới chưa có tiền lệ và rất có ý nghĩa về mặt kinh tế ở mức độ sản xuất công
nghiệp [40].
Được sự chấp thuận của trường Đại Học Bách Khoa và cán bộ hướng dẫn
khoa học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “CỐ ĐỊNH TẾ BÀO
ACETOBACTER ACETI BẰNG CHẤT MANG CELLULOSE VI KHUẨN ĐỂ
ỨNG DỤNG LÊN MEN ACID ACETIC” nhằm mục đích tạo chế phẩm vi khuẩn
cố định và ứng dụng lên men acid acetic trong hệ thống lên men liên tục.


2

Nội dung của đề tài bao gồm:
− Khảo sát một số điều kiện dinh dưỡng ảnh hưởng đến sự lên men acid acetic
của Acetobacter aceti.
− Khảo sát khả năng tạo acid acetic trong điều kiện lên men theo mẻ.
− Khảo sát các điều kiện tối ưu để cố định Acetobacter aceti lên chất mang BC.
− Theo dõi bảo quản chế phẩm Acetobacter aceti cố định.
− Ứng dụng chế phẩm Acetobacter aceti cố định trong hệ thống lên men acid
acetic liên tục.


3

CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của acid acetic
Acid acetic là hợp chất hóa học chủ yếu tạo nên mùi thơm và vị chua đặc trưng
của giấm, được xem như là thành phần chính của giấm. Giấm chứa khoảng 4 – 8 %
acid acetic. Acid acetic được sản xuất và sử dụng từ rất lâu đời. Tên gọi acid acetic
xuất phát từ tên Latinh của giấm – acetum [36].
Cơng thức hóa học của acid acetic là CH3COOH.
Khối lượng phân tử của acid acetic là 60,05.
Acid acetic hoàn toàn tan trong nước, cồn, ester, benzen, acetone và
chloroform; không tan trong CS2.
Acid acetic rất bền với các chất oxy hóa như acid chromic, permanganate.
Chúng có khả năng hịa tan cellulose, các hợp chất tương tự cellulose; có khả năng
phân hủy da, ăn mòn nhiều kim loại [7].
1.2. Tác nhân vi sinh vật
Nhiều lồi vi sinh vật có khả năng lên men để tạo ra acid acetic. Tất cả các vi
khuẩn có khả năng lên men tạo ra acid acetic được gọi chung là vi khuẩn acetic. Các
vi khuẩn acetic được xếp vào hai giống chính : Acetobacter, Gluconobacter. Trong
đó, Acetobacter là tác nhân chính của q trình lên men acetic, tạo acid acetic từ
ethanol. Đây là những vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên, có trên bề mặt lá, quả, hoa,
nước ép trái cây chua, giấm, thức uống có cồn [7, 8].
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn acetic là vi khuẩn Gram (-). Các tế bào trẻ thuộc Gram (-), các tế bào
già ở một số giống có đặc tính nhuộm Gram thay đổi.
Về hình dạng tế bào, vi khuẩn acetic là trực khuẩn hình que tới elip, kích thước
tế bào 0.6 - 0.8 µm / 1 - 3 µm. Các tế bào đứng tách riêng rẽ, một số xếp thành cặp,
một số khác xếp thành chuỗi dài. Một số lồi đặc biệt có tế bào hình cầu, hình kéo

dài, hình căng phồng, hình dùi cui, hình cong, hình phân nhánh, hình sợi. Tùy điều


5

kiện pH môi trường, nhiệt độ nuôi cấy mà một số lồi có thể có hình dạng bán
nguyệt. Nhiều lồi vi khuẩn acetic khi phát triển trên môi trường thiếu dinh dưỡng
hay môi trường đã nuôi cấy lâu (môi trường già) dễ sinh ra hình thái đặc biệt (tế bào
phình to hay kéo dài ra) có thể phân nhánh.
Vi khuẩn acetic có khả năng tạo màng nhày, khơng có khả năng tạo nội bào tử,
một số có khả năng di động nhờ tiên mao ở cực hoặc xung quang cơ thể.
Nhìn chung, vi khuẩn acetic khơng có khả năng tạo sắc tố, nhưng các khối tế
bào có thể nhuộm màu hồng bởi porphirin. Một số giống vi khuẩn acetic tạo sắc tố
màu nâu tan trong nước.
Trên môi trường đặc, vi khuẩn acetic phát triển thành những khuẩn lạc tròn,
đều đặn, đường kính trung bình 1 – 3 mm. Trên mơi trường lỏng, chúng chỉ phát triển
trên bề mặt môi trường tạo thành những lớp màng dày mỏng khác nhau. Một số loài vi
khuẩn acetic tạo thành màng dày như sứa (0,5 mm), nhẵn trơn, khi lắc chúng chìm
xuống đáy bình và thay vào đó một lớp màng mỏng mới lại tiếp tục phát triển [7, 35].
1.2.2. Đặc điểm sinh trưởng
Vi khuẩn acetic có khả năng sinh trưởng trên mơi trường đơn giản đến phức
tạp (hầu hết không cần các vitamin); có khả năng phát triển tốt trên mơi trường
nước bia, các mơi trường có chứa cao nấm men, glucose, ethanol hay manitol.
Vi khuẩn acetic là loài vi sinh vật hiếu khí bắt buộc. Trong điều kiện mơi
trường đầy đủ và lượng oxy được cung cấp liên tục, chúng có thể tăng sinh khối sau
12 giờ gấp 17 triệu lần so với sinh khối ban đầu.
Vi khuẩn acetic có thể sinh trưởng ở pH 4.0 - 4.5; đôi khi ở pH 7 - 8; phát triển
tốt trong điều kiện hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ 25 - 30oC, pH 5.4 - 5.8.
Tính chất đặc trưng của vi khuẩn acetic là khả năng oxy hóa ethanol thành acid
acetic ở pH trung tính và pH acid (pH 4.5).

Ngồi ra, vi khuẩn acetic cịn thực hiện q trình oxy hóa acetate, oxy hóa
lactate thành CO2 và H2O, chuyển hóa glucose thành gluconate, oxy hóa không


6

hoàn toàn các hợp chất hữu cơ khác (các loại đường và dẫn xuất của chúng) để tạo
thành các hợp chất ketone hay các acid hữu cơ tương ứng.
Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn acetic đối với nguồn C, N và chất sinh
trưởng cũng rất đa dạng. Vi khuẩn acetic sử dụng đường, ethanol và các acid hữu cơ
làm nguồn C. Hexose và glycerol được sử dụng như nguồn C bởi hầu hết các giống;
manitol và glutamate ít được sử dụng hoặc không sử dụng. Vi khuẩn acetic không
thủy phân lactose, dextrin, tinh bột và sử dụng muối amon làm nguồn N.
Trong quá trình phát triển, vi khuẩn acetic có nhu cầu đối với một số acid amin
như valin, alanin, prolin.
Một số chất kích thích sinh trưởng như acid nicotine, acid amin, acid folic và
biotin… có vai trị quan trọng trong sinh trưởng của vi khuẩn acetic.
Một số vi khuẩn acetic có khả năng tổng hợp polysaccharide như cellulose,
tinh bột, dextran…Người ta ứng dụng khả năng này trong sản xuất cơng nghiệp.
Một số lồi tổng hợp được những sợi cellulose giống như bông là: A. xylinum, A.
acetigenum, A. viizingianum [7, 8, 35].
1.2.3. Phân loại
Năm 1950, Frateur chia vi khuẩn acetic làm 4 nhóm.
Bảng 1.1. Phân loại vi khuẩn acetic theo Frateur
Tên nhóm
Subosydans
Mezoxydans

Oxydans

Peroxydans

Vi khuẩn đại diện

Đặc điểm

Acetobacter subosydaz
Acetobacter melanogennum
Acetobacter aceti, Acetobacter
xylinum, Acetobacter mezoxydans
Acetobacter ascendans
Acetobacter ransens
Actobacter lovaniens
Acetobacter peroxydans
Acetobacter paradoxum

Khơng có khả năng oxy hóa
acid acetic thành CO2 và H2O
Có đầy đủ các đặc điểm trên
Khơng có khả năng tạo các
hợp chất ketose
Khơng chứa catalase, khơng
oxy hóa glucose
[9].


7

Trong số 20 loài vi khuẩn Acetobacter hiện đã được nghiên cứu kỹ, khả năng
áp dụng vào thực tế sản xuất của các giống vi khuẩn sau đây được xem như có

nhiều ưu điểm hơn cả:
Acetobacter pasteurianum:
Acetobacter pasteurianum là trực khuẩn ngắn, có hình thái gần giống
Acetobacter aceti. Nhưng khi ta nhuộm chúng với iod, tế bào sẽ có màu xanh thẫm.
Acetobacter pasteurianum tạo hình nhăn nheo khi phát triển trên môi trường đặc.
Khả năng chịu ethanol của Acetobacter pasteurianum kém hơn của
Acetobacter aceti. Trong điều kiện môi trường phát triển thuận lợi, chúng có khả
năng tạo được 5 – 6 % acid acetic.
Acetobacter orleaneuse:
Acetobacter orleaneuse là trực khuẩn hình que, kích thước nhỏ hơn vi khuẩn
Acetobacter pasteurianum và Acetobacter aceti, không chuyển động. Hai đầu của tế
bào thường nhỏ lại. Acetobacter orleaneuse thuờng hay bị nhầm lẫn với vi khuẩn kỵ
khí Clostridium. Khi tăng nhiệt độ, tế bào Acetobacter orleaneuse tạo thành hình
dài hoặc hình sợi. Acetobacter orleaneuse thường phát triển trong dịch nho lỗng.
Trong dịch ni cấy, Acetobacter orleaneuse thường tạo một lớp váng rất mỏng
trên bề mặt. Lớp váng vi khuẩn này thường rất chắc. Khi nhuộm với iod, tế bào
Acetobacter orleaneuse sẽ chuyển sang màu vàng. Vi khuẩn này chịu đựng được
lượng ethanol đến 12 % thể tích và trong điều kiện lên men thích hợp, chúng có thể
tạo ra được 9,5 % acid acetic.
Acetobacter xylinum:
Acetobacter xylinum là trực khuẩn dạng hình que, kích thước 2 µm, đứng
riêng rẽ hay xếp thành chuỗi, không di động. Các tế bào được bao bọc bởi chất
nhầy, tạo váng nhẵn khá dày, bắt màu xanh với thuốc nhuộm iod và H2SO4 (phản
ứng của hemicellulose) vì váng có chứa hemicellulose.
Vi khuẩn này khi phát triển trong môi trường thuận lợi, Acetobacter xylinum có thể
oxy hóa ethanol tạo 4,5 % acid acetic trong môi trường và tạo ra một màng xốp có khi rất


8

dày trên bề mặt mơi trường. Ngồi ra, Acetobacter xylinum cịn có khả năng oxy hóa tiếp
acid acetic thành CO2 và H2O.
Ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản, người ta thường sử dụng vi
khuẩn này cùng với nấm men để sản xuất ra loại nước uống rất đặc biệt gọi là “cvas”.
Acetobacter schiitzenbachii:
Acetobacter schiitzenbachii thuộc vi khuẩn hình que, nhưng kích thước của
chúng dài hơn các giống đã trình bày ở trên. A. schiitzenbachii khơng tạo bào tử,
khơng có khả năng di động và thuộc vi khuẩn Gram (-).
Khi phát triển ở môi trường lỏng, A. schiitzenbachii tạo ra lớp màng dày
nhưng không chắc. Ở các nước trên thế giới, người ta thường sử dụng A.
schiitzenbachii để sản xuất giấm theo phương pháp chìm. Trong điều kiện mơi
trường thuận lợi, A. schiitzenbachii có khả năng tạo được 11 – 12 % acid acetic.
Acetobacter curvum:
Về cơ bản vi khuẩn này giống Acetobacter schiitzenbachii. Trong môi
trường lên men thuận lợi, vi khuẩn này có thể tạo ra được 10 – 11 % acid acetic.
Acetobacter curvum tạo váng rất chắc trên bề mặt môi trường. Nhiệt độ lên men tối
ưu của vi khuẩn này là 35 – 37oC.
Acetobacter suboxydans:
Acetobacter suboxydans phát triển trên bề mặt cơ chất tạo thành màng nhẹ,
mỏng. Khi phát triển, chúng cần vitamin như acid paraaminonezoic, acid pantonic,
acid nicotinic.
A. suboxydans được sử dụng nhiều trong cơng nghệ sản xuất vitamin C.
Chúng có khả năng chịu đựng được nồng độ ethanol rất cao. Nếu ta cho thêm một
lượng nhỏ các chất dinh dưỡng cần thiết trong mơi trường (ví dụ như glucose), vi
khuẩn này có thể chuyển hóa hồn tồn ethanol thành acid acetic. Lượng acid acetic
tạo được từ q trình lên men có thể lên đến 13 %.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn này tiến hành lên men là 28 – 30oC. Thời gian
lên men xảy ra rất nhanh, chỉ cần 48 giờ lượng acid acetic có thể đạt được đến 13 %.

9

Trong q trình lên men cần thơng khí liên tục, vì vi khuẩn này cần lượng oxy rất
nhiều cho quá trình chuyển hóa ethanol thành acid acetic và cho q trình phát triển.
Acetobacter aceti - Tác nhân vi sinh vật sử dụng trong đề tài :
Acetobacter aceti là trực khuẩn ngắn có dạng hình que, kích thước rất ngắn
0,4 – 0,8 và 1 – 1,2 µm; thuộc tế bào Gram (-); khơng có khả năng di động; khơng
tạo bào tử. Các tế bào thường tạo hình chuỗi có kích thước rất dài. Khi nhuộm với
iod, tế bào chuyển thành màu vàng.

Hình 1.1. Vi khuẩn Acetobacter aceti dưới kính hiển vi điện tử [42, 43].
A. aceti tạo thành khuẩn lạc to, sáng trên gelatin với dịch lên men chứa 10 %
đường saccharose, tạo thành màng dày nhẵn.
A. aceti sinh trưởng được trên môi trường thạch chứa dịch chiết nấm men và 2 %
canxi acetate hoặc canxi lactate. Trên môi trường thạch chứa dịch chiết nấm men, 10 %
glucose và 3 % CaCO3, A. aceti có khả sinh trưởng tốt, tạo ra nhiều acid gluconic, các
tinh thể canxi 5-ketogluconate. Nếu bổ sung 10 % fructose, đơi khi chúng cịn tạo thành
canxi oxalate.
A. aceti có khả năng phát triển trên mơi trường có nồng độ ethanol khá cao
(11 %), có khả năng tích lũy 6 % acid acetic. Nhiệt độ thích hợp nhất để A. aceti
phát triển là 30oC. Nếu nhiệt độ cao quá 43oC sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tế
bào có hình dạng quả lê. A. aceti thường phát triển trong môi trường bia [9].


10

1.3. Bản chất sinh hóa của q trình lên men acid acetic
Lên men acid acetic là q trình oxy hóa ethanol thành acid acetic nhờ vi
khuẩn acetic trong điều kiện hiếu khí.
Phương trình tổng qt của q trình lên men là:

C2H5OH + O2

Vi khuẩn Acetic

CH3COOH + H2O +117 KCal

Phản ứng này xảy ra trong tế bào của vi khuẩn. Muốn phản ứng được xảy ra,
C2H5OH và O2 phải được thẩm thấu vào trong tế bào. Khi đó các enzyme oxy hóa có
trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa ethanol tạo thành acid acetic. Acid acetic
được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan trong dung dịch mơi trường.

O2
CH3COOH

CH3COOH

C2H5OH

Môi trường

Tế bào

Môi trường

Hình 1.2. Q trình oxy hóa ethanol thành acid acetic [8].
Trong q trình lên men, ethanol được oxy hóa thành acid acetic. Ở đây, sự
chuyển hydro được thực hiện nhờ sự xuất hiện của NADP (Nicotiamide adenine
dinucleotide phosphate) dạng oxy hóa. Hydro được NADP nhận trở thành NADPH2
được chuyển qua chuỗi hô hấp để thu nhận năng lượng xuất hiện được chuyển qua chuỗi

hô hấp để thu nhận năng lượng, song cơ chất không bị phân giải hồn tồn, do vậy q
trình chuyển hóa trên cịn được gọi là sự oxy hóa khơng hồn tồn.


11

Cơ chế chuyển hóa ethanol thành acid acetic theo các phản ứng sau:
2H
CH3CH2OH + ½ O2 −
→ CH3CHO

CH3CHO + H2O 
→ CH3CH(OH)2
2H
CH3CH(OH)2 + ½ O2 −
→ CH3COOH + H2O

Acid acetic tạo thành sẽ thoát khỏi tế bào vi khuẩn và đi vào môi trường. Khi
môi trường hết ethanol, vi khuẩn sẽ oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O theo
phương trình sau:
CH3COOH + 2O2 
→ CO2 + H2O
Đây chính là sự “q oxy hóa” rất có hại cho q trình lên men giấm. Vì vậy,
trong dung dịch lên men phải có dư một lượng ethanol khoảng 0.3 – 0.5% để đảm
bảo không bao giờ hết ethanol [1, 7].
1.4. Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men acetic
1.4.1. Ảnh hưởng của oxy
Sự chuyển hóa ethanol thành acid acetic do phản ứng oxy hóa trong đó oxy
của khí quyển là chất tiếp nhận hydro. Do vậy trong sản xuất, sự oxy hóa ethanol
thành acid acetic chỉ xảy ra trong trường hợp vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy của

không khí. Trong điều kiện yếm khí thì vi khuẩn actic sẽ sử dụng cơ chất dinh
dưỡng mà không tạo thành acid acetic. Như vậy chế độ cung cấp oxy là nhân tố
điều chỉnh quá trình lên men. Lượng oxy cần thiết lớn gấp 2 lần lượng oxy lý
thuyết, càng thoáng khí thì năng suất càng lên men cao.
1.4.2. Ảnh hưởng nhiệt độ
Nhiệt độ mơi trường có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động sinh lý của vi sinh
vật, do đó sẽ ảnh hưởng đến quá trình lên men.
Vi khuẩn acetic thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25 –
o

32 C. Ở nhiệt độ thấp, quá trình lên men sẽ xảy ra chậm. Nhiệt độ cao sẽ ức chế
hoạt động của vi khuẩn và nhiệt độ tăng đến mức độ nào đó sẽ làm cho tế bào


12

ngừng sinh sản; hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic
và ethanol. Thường nhiệt độ lên men trong sản xuất được khống chế từ 30 – 34oC.
1.4.3. Ảnh hưởng của các nguồn C, N, P và các nguyên tố vi lượng
1.4.3.1. Sự acid hóa của dịch lên men
Trong lên men acid acetic, người ta thường cho vào cơ chất ban đầu một
lượng acid acetic nhất định để acid hóa mơi trường nhằm: ngăn chặn sự phát triển
của vi sinh vật tạp, tạo pH thích hợp cho vi khuẩn acetic phát triển. Mơi trường acid
(pH 3) là điều kiện thuận lợi đối với vi khuẩn acetic.
Độ acid ban đầu 0.2 – 0.5 %, nếu cao hơn sẽ hạn chế sự sinh trưởng của vi
khuẩn và giảm khả năng lên men. Nồng độ acid acetic 8 % sẽ ức chế hoạt động của
vi khuẩn rất lớn và bị ngừng hoạt động hoàn toàn khi lượng acid đạt 12 – 14 %.
1.4.3.2. Hàm lượng ethanol trong dịch lên men
Ethanol là chất sát khuẩn đối với vi khuẩn acetic và được sử dụng như cơ
chất. Nồng độ ethanol thường sử dụng là 6 – 14 % thể tích. Khi thiếu ethanol trong

mơi trường lên men thì vi khuẩn sẽ bắt đầu sử dụng acid acetic và acid acetic sẽ bị
mất đi theo phản ứng:
CH3COOH + 2O2 → 2CO2 + H2O
Do vậy, phải luôn luôn để thừa lại một lượng ethanol khoảng 0,3 – 0,5 %.
Lượng ethanol sót có tác dụng ức chế sự tổng hợp enzyme oxy hóa acid acetic.
1.4.3.3. Hàm lượng các chất dinh dưỡng
Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men, ta cần bổ sung một số
muối khoáng (NH4)2SO4, KH2PO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu cụ thể từng lồi.
Ngồi ra, mơi trường dinh dưỡng cịn được bổ sung vitamin, chất kích thích
sinh trưởng như pepton, cao nấm men…
Thơng thường tổng hàm lượng chất khoáng trong vi sinh vật chiếm 5 – 8%
trọng lượng chất khô [8].


13

1.5. Các phương pháp sản xuất acid acetic
1.5.1. Phương pháp hóa gỗ
Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp nhiều
chất khác nhau, trong đó có acid acetic với hàm lượng rất lớn. Hiện nay phương
pháp này khơng cịn sử dụng [8].
1.5.2. Phương pháp hóa học
Phương pháp này dựa trên q trình oxy hóa acetaldehyde thành acid acetic,
có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50 – 80oC.
Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau:
CH≡CH + H2O
CH2=CH2 + O2

→ CH3CHO

+ O2

CH3COOH

Hiện nay, người ta tổng hợp acid acetic từ methanol và CO bằng phản ứng
carbonyl hóa.
CH3OH + CO → CH3COOH [8].
1.5.3. Phương pháp hỗn hợp
Trước tiên, người ta tiến hành q trình oxy hóa hydrate carbon có mạch
carbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acid acetaldehyde, formaldehyde
methanol và acetone. Sau đó acetaldehyde được oxy hóa để tạo thành acid acetic.
Phương pháp hỗn hợp được sử dụng nhiều hơn cả là phương pháp thủy phân bột gỗ
bằng acid (phương pháp hóa học). Sau đó, người ta trung hòa khối thủy phân này và
tiến hành lên men để thu nhận được dung dịch chứa acid acetic [8].
1.5.4. Phương pháp sinh học
Hiện nay, người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng phương pháp lên men.
So với những phương pháp khác, phương pháp lên men có nhiều ưu điểm.
Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm. Có
thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước trái dừa, nước ép mía…),
có thể sử dụng ngun liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn cơng nghiệp.


14

Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua ba giai đoạn chuyển hóa:
− Giai đoạn chuyển tinh bột thành đường.
− Giai đoạn chuyển đường thành cồn.
− Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic.
Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì qua hai giai đoạn:
− Giai đoạn chuyển đường thành cồn.

− Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic.
Nếu sản xuất từ nguyên liệu đã chứa cồn thì ta cần tạo điều kiện thuận lợi để
vi khuẩn acetic chuyển cồn thành acid acetic.
Q trình chuyển hóa (hay q trình lên men) được thực hiện ở điều kiện rất
ơn hịa; khơng cần nhiệt độ cao, áp suất hay máy móc, thiết bị phức tạp.
Bản chất của q trình lên men là lên men hiếu khí, vì thế phải tạo điều kiện
tối đa để vi khuẩn tiếp xúc được với oxy và ethanol.
Để giải quyết tốt vấn đề này có 4 phương pháp khác nhau:
1.5.4.1. Phương pháp lên men chậm
Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là
phương pháp truyền thống của người Pháp. Phương pháp này được thực hiện như sau:
Người ta đóng các thùng lên men bằng gỗ có dung tích khoảng 250 – 300 lít
bằng gỗ sồi hình tang trống (giống các thùng sản xuất bia và rượu vang).
Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho.
Giống vi khuẩn acetic được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter
orleaneuse.
Người ta thường cho vào thùng gỗ 1/5 thể tích lượng giấm và sau đó cho vào
thùng dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt 1/2 thể tích thùng lên
men (hoặc 2/3 thể tích thùng lên men). Sở dĩ người ta cho acid acetic trước là để tạo
điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát
triển, không bị nhiễm.