Nghiên cứu tận dụng phụ phế liệu lò mổ động vật để thu nhận một số chế phẩm enzyme có giá trị và các ứng dụng

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

--------------------

LÊ VĂN BÌNH

NGHIÊN CỨU TẬN DỤNG PHỤ PHẾ LIỆU
LỊ MỔ ĐỘNG VẬT ĐỂ THU NHẬN MỘT SỐ CHẾ
PHẨM ENZYM CĨ GIÁ TRỊ VÀ CÁC ỨNG DỤNG

Chun ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Mã số: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2008


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
------------------------------

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu

Cán bộ chấm nhận xét 1:

Cán bộ chấm nhận xét 2:

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:

HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày tháng 08 năm 2008


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC
Tp. HCM, ngày 30 tháng 06 năm 2008

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Lê Văn Bình

Phái: Nam

Ngày, tháng, năm sinh: 23/07/1982

Nơi sinh: Đồng Tháp

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 03106663

Khóa: 2006
I. TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU TẬN DỤNG PHỤ PHẾ LIỆU
LÒ MỔ ĐỘNG VẬT ĐỂ THU NHẬN MỘT SỐ CHẾ PHẨM ENZYM
CÓ GIÁ TRỊ VÀ CÁC ỨNG DỤNG

II. NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG:
-

Thu enzym pepsin từ niêm mạc dạ dày heo.

-

Thu hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo.

-

Thu hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non.

-

Thử nghiệm ứng dụng enzym trong sản xuất pepton.

-

Thử nghiệm ứng dụng enzym trong đông tụ sữa.

III. NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: Ngày 25 tháng 02 năm 2008
IV. NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: Ngày 30 tháng 06 năm 2008
V. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chun ngành thơng qua.
Ngày
TRƯỞNG PHỊNG ĐT – SĐH

tháng

năm 2008

TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin chân thành cảm ơn:
¾ Ban Giám Hiệu Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh.
¾ Phòng Đào tạo Sau đại học, Trường Đại học Bách khoa Tp. Hồ Chí Minh.
¾ Ban chủ nhiệm Khoa Cơng nghệ hóa học – Dầu khí, Trường Đại học Bách
khoa Tp. Hồ Chí Minh.
¾ Ban chủ nhiệm Bộ Mơn Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Bách khoa
Tp. Hồ Chí Minh, cùng tất cả q thầy cơ đã hết lịng truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
¾ PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn
thành tốt luận văn.
¾ Cuối cùng tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lịng giúp đỡ, động viên tơi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Tôi xin gửi lời chúc sức khỏe đến tất cả quý thầy cô và các anh chị.

Tp. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 06 năm 2008
Lê Văn Bình

TĨM TẮT
Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ
yếu trong phân tử protein và peptide. Protease thực hiện được nhiều chức năng đa
dạng và có những ứng dụng quan trọng trong cơng nghệ sinh học. Protease là một
trong ba nhóm enzym cơng nghiệp lớn, được ứng dụng trong sản xuất các chất tẩy
rửa, công nghiệp thuộc da, công nghiệp dược, công nghiệp thực phẩm,...
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu nhận enzym pepsin từ niêm mạc dạ dày
heo, hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo và thu hỗn hợp enzym protease từ
niêm mạc ruột non. Sau đó, chúng tơi thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzym trong
sản xuất pepton và đông tụ sữa.
Để thu nhận enzym pepsin, chúng tôi thực hiện quá trình tự phân bằng
HCl 0,5% và kết tủa bằng muối amôn sulfat 70%.
Để thu nhận enzym pancreatin và hỗn hợp protease từ niêm mạc ruột non,
chúng tôi tiến hành tự phân trong môi trường kiềm và kết tủa enzym bằng cồn 960.
Những kết quả đạt được:
¾ Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và protease từ
niêm mạc ruột non lần lượt là: 7,17%, 6,22% và 2,21%.
¾ Hoạt độ protease của chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và protease
từ niêm mạc ruột non lần lượt là: 16,670, 3,831 và 1,920 (UI/g CPE).
¾ Hoạt độ đơng tụ sữa của chế phẩm enzym pepsin, pancreatin và
protease từ niêm mạc ruột non đối với sữa không béo 10% lần lượt là:
344,400, 54,400 và 27,600 (x 103 UI/g CPE).
¾ Hiệu suất thủy phân của chế phẩm enzym pepsin 1% trên các dịch cơ
chất đậu nành 25%, tơm 25%, thịt bị 25% và albumin 2% lần lượt là:
9,245%, 14,171%, 11,215% và 21,977%.
¾ Hiệu suất thủy phân của chế phẩm enzym pancreatin 3% trên các dịch
cơ chất đậu nành 25%, tơm 25%, thịt bị 25% và casein 2% lần lượt
là: 14,668%, 31,993%, 30,452% và 46,444%. Tương tự, protease của
ruột non 3% là: 8,885%, 26,539%, 25,992% và 38,347%.

ABSTRACT
A protease is any enzyme that conducts proteolysis, that is, begins protein
catabolism by hydrolysis of the peptide bonds that link amino acids together in the
polypeptide chain. Proteases execute a large variety of functions and have important
biotechnological applications. Proteases represent one of the three largest groups of
industrial enzymes and find application in detergents, leather industry,
pharmaceutical industry, food industry and so on.
In this study, we recover pepsin from pig stomach mucosae, pancreatin from
pig pancreases and proteases from pig small intestine mucosae. Then, we test
enzymes for hydrolysing protein in pepton production and curdling milk.
In order to recover pepsin, comminuted pig stomach mucosae were steeped
in 0.5% hydrochloric acid solution and 70% amonium sulfate was used for enzyme
precipitation.
In order to recover pancreatin and proteases from pig small intestine
mucosae, comminuted pig pancreases and small intestine mucosae were steeped in
base solution and 96% ethanol was used for enzyme precipitation.
Results:
¾ The recovery yields of pepsin, pancreatin and proteases from small
intestine mucosae were 7.17%, 6.22% and 2.21%, respectively.
¾ The activities of pepsin, pancreatin and proteases from small intestine
mucosae were 16.670, 3.831 and 1.920 (Units/g enzyme), respectively.
¾ The activities of curdling of pepsin, pancreatin and proteases from small
intestine mucosae on 10% fat-free milk were 344.400.103, 54.400.103
and 27.600.103 (Units/g enzyme), respectively.
¾ The hydrolysis yields of 1% pepsin on 25% soya-bean, 25% shelled
shrimp, 25% beef and 2% albumin solution were 9.245%, 14.171%,
11.215% and 21.977%, respectively.
¾ The hydrolysis yields of 3% pancreatin on 25% soya-bean, 25% shelled
shrimp, 25% beef and 2% casein solution were 14.668%, 31.993%,

30.452% and 46.444%, respectively. Similarly, 3% proteases from small
intestine mucosae were 8.885%, 26.539%, 25.992% and 38.347%.


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
Phần 1:TỔNG QUAN ...............................................................................................2
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NHÓM ENZYM PROTEASE............................2
1.1.1. Khái niệm chung ...............................................................................................2
1.1.2. Phân loại nhóm enzym protease........................................................................2
1.1.3. Các ứng dụng của protease ...............................................................................4
1.2. PEPSIN................................................................................................................5
1.2.1. Lịch sử của pepsin.............................................................................................5
1.2.2. Nguồn thu nhận .................................................................................................6
1.2.3. Thành phần và cấu tạo.......................................................................................7
1.2.4. Đặc tính ...........................................................................................................10
1.2.5. Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin .............................................................11
1.2.6. Tính chất đặc hiệu và khả năng thủy phân protein của pepsin .......................14
1.2.7. Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin.........................................15
1.2.8. Các phương pháp thu nhận pepsin ..................................................................17
1.2.9. Ứng dụng của pepsin.......................................................................................20
1.3. PANCREATIN .................................................................................................21
1.3.1. Nguồn thu nhận enzym từ tụy tạng .................................................................21
1.3.2. Thành phần và tính chất của pancreatin..........................................................22
1.3.3. Protease tuyến tụy ...........................................................................................22
1.3.4. Amylase tuyến tụy...........................................................................................27

1.3.5. Lipase tuyến tụy ..............................................................................................28
1.3.6. Các phương pháp thu nhận pancreatin............................................................29


1.4. PEPTON............................................................................................................30
1.4.1. Khái niệm pepton ............................................................................................30
1.4.2. Phân loại pepton..............................................................................................30
1.4.3. Tính chất của pepton .......................................................................................31
1.4.4. Các dẫn xuất của pepton .................................................................................31
1.4.5. Phương pháp thu nhận pepton.........................................................................32
1.4.6. Ứng dụng của pepton ......................................................................................32
1.5. ENZYM ĐƠNG TỤ SỮA ...............................................................................33
1.5.1. Tính chất của enzym đơng tụ sữa....................................................................33
1.5.2. Cơ chế đông tụ sữa..........................................................................................33
Phần 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............34
2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................34
2.1.1. Nguyên liệu để thu enzym...............................................................................34
2.1.2. Các nguyên liệu sử dụng trong phương pháp xác định hoạt độ enzym, sản
xuất pepton và đơng tụ sữa........................................................................................34
2.2. HĨA CHẤT ......................................................................................................34
2.3. THIẾT BỊ SỬ DỤNG.......................................................................................35
2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................35
2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu.............................................................................................35
2.4.2. Phương pháp thu nhận pepsin .........................................................................36
2.4.3. Phương pháp tách chiết pancreatin và kết tủa bằng cồn 960 ...........................38
2.4.4. Phương pháp thu hỗn hợp protease từ niêm mạc ruột non và kết tủa bằng
cồn 960 ......................................................................................................................39
2.4.5. Phương pháp xác định hoạt độ protease .........................................................39
2.4.6. Phương pháp định lượng protein theo Lowry .................................................41
2.4.7. Xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl .........................................43

2.4.8. Xác định nitơ formol theo phương pháp Sorensen .........................................45
2.4.9. Xác định hoạt tính enzym α-amylase theo phương pháp Smith và Roe.........47
2.4.10. Xác định hoạt tính enzym lipase theo phương pháp định lượng axít béo.....49


2.4.11. Phương pháp xác định hoạt độ đông tụ sữa ..................................................51
2.4.12. Phương pháp sản xuất pepton .......................................................................52
Phần 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN......................................................................53
3.1. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM PEPSIN ................................................53
3.1.1. Dịch chiết enzym pepsin từ màng nhầy dạ dày sau tự phân ...........................53
3.1.2. Thu chế phẩm enzym pepsin từ dịch lọc.........................................................54
3.1.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym pepsin ...........................58
3.1.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym pepsin trên các dịch cơ chất
khác nhau...................................................................................................................61
3.2. THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYM PANCREATIN....................................64
3.2.1. Dịch chiết enzym pancreatin từ tụy sau tự phân .............................................64
3.2.2. Thu chế phẩm enzym pancreatin từ dịch lọc ..................................................66
3.2.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym pancreatin .....................72
3.2.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym pancreatin trên các dịch cơ
chất khác nhau...........................................................................................................74
3.3. THU NHẬN HỖN HỢP ENZYM PROTEASE TỪ NIÊM MẠC RUỘT
NON ..........................................................................................................................77
3.3.1. Dịch chiết hỗn hợp enzym protease từ niêm mạc ruột non sau tự phân .........77
3.3.2. Thu chế phẩm enzym protease từ dịch lọc......................................................78
3.3.3. Xác định hoạt độ đông tụ sữa của chế phẩm enzym protease từ ruột non......81
3.3.4. So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzym protease từ ruột non trên
các dịch cơ chất khác nhau........................................................................................83
Phần 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.......................................................................86
4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................86
4.2. ĐỀ NGHỊ...........................................................................................................87

Phần 5: TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................88
Phần 6: PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần amino acid của pepsin.............................................................9
Bảng 1.2. Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin ...........................10
Bảng 1.3. Lượng enzym của tuyến tụy .....................................................................22
Bảng 3.1. Giá trị ΔOD theo hàm lượng tyrosin ........................................................53
Bảng 3.2. Hoạt độ protease của dịch lọc...................................................................54
Bảng 3.3. Hiệu suất thu chế phẩm enzym pepsin .....................................................54
Bảng 3.4. Hàm lượng muối (NH4)2SO4 trong chế phẩm enzym pepsin ...................55
Bảng 3.5. Hoạt độ của chế phẩm enzym pepsin .......................................................56
Bảng 3.6. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam ...........................56
Bảng 3.7. Giá trị ΔOD theo hàm lượng albumin ......................................................57
Bảng 3.8. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym pepsin......................................58
Bảng 3.9. Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym pepsin ..............................................58
Bảng 3.10. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym pepsin .59
Bảng 3.11. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym pepsin ............59
Bảng 3.12. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym pepsin ..........................59
Bảng 3.13. Hàm lượng Nitơ tổng của các dung dịch cơ chất thủy phân ..................61
Bảng 3.14. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy
phân ..........................................................................................................................62
Bảng 3.15. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......62
Bảng 3.16. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...62
Bảng 3.17. Hàm lượng Nitơ formol của dịch albumin 2% và hiệu suất thủy phân..62
Bảng 3.18. Hoạt độ protease của dịch lọc.................................................................64
Bảng 3.19. Hoạt độ enzym α-amylase của dịch lọc..................................................65
Bảng 3.20. Hoạt độ enzym lipase của dịch lọc .........................................................66
Bảng 3.21. Hiệu suất thu chế phẩm enzym pancreatin .............................................66

Bảng 3.22. Hoạt độ protease của chế phẩm enzym pancreatin.................................67
Bảng 3.23. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam .........................68
Bảng 3.24. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym pancreatin .............................69


Bảng 3.25. Hoạt độ riêng protease của chế phẩm enzym pancreatin .......................69
Bảng 3.26. Hoạt độ enzym α-amylase của chế phẩm enzym pancreatin..................70
Bảng 3.27. Hoạt độ riêng α-amylase chế phẩm enzym pancreatin...........................70
Bảng 3.28. Hoạt độ enzym lipase của chế phẩm enzym pancreatin .........................71
Bảng 3.29. Hoạt độ riêng lipase của chế phẩm enzym pancreatin ...........................72
Bảng 3.30. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym
pancreatin ..................................................................................................................72
Bảng 3.31. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym pancreatin ......73
Bảng 3.32. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym pancreatin....................73
Bảng 3.33. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy
phân ...........................................................................................................................74
Bảng 3.34. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......75
Bảng 3.35. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...75
Bảng 3.36. Hàm lượng Nitơ formol của dịch casein 2% và hiệu suất thủy phân .....75
Bảng 3.37. Hoạt độ protease của dịch lọc.................................................................77
Bảng 3.38. Hiệu suất thu chế phẩm enzym protease từ ruột non..............................78
Bảng 3.39. Hoạt độ của chế phẩm enzym protease từ ruột non................................79
Bảng 3.40. Thời gian thủy phân protein theo Dược điển Việt Nam .........................79
Bảng 3.41. Hàm lượng protein của chế phẩm enzym protease từ ruột non..............80
Bảng 3.42. Hoạt độ riêng của chế phẩm enzym protease từ ruột non ......................80
Bảng 3.43. Hoạt độ đông tụ sữa bột không béo 10% của chế phẩm enzym
protease từ ruột non...................................................................................................81
Bảng 3.44. Hoạt độ đông tụ sữa bột béo 10% của chế phẩm enzym protease từ ruột
non.............................................................................................................................81
Bảng 3.45. Hoạt độ đông tụ sữa tươi của chế phẩm enzym protease từ ruột non ....82

Bảng 3.46. Hàm lượng Nitơ formol của dịch đậu nành 25% và hiệu suất thủy
phân ...........................................................................................................................83
Bảng 3.47. Hàm lượng Nitơ formol của dịch tôm 25% và hiệu suất thủy phân.......83
Bảng 3.48. Hàm lượng Nitơ formol của dịch thịt bò 25% và hiệu suất thủy phân...84
Bảng 3.49. Hàm lượng Nitơ formol của dịch casein 2% và hiệu suất thủy phân .....84


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc của pepsin và pepsinogen .............................................................9
Hình 3.1. Đường chuẩn tyrosin.................................................................................53
Hình 3.2. Chế phẩm enzym pepsin ...........................................................................55
Hình 3.3. Dung dịch phản ứng ban đầu theo Dược điển Việt Nam..........................56
Hình 3.4. Dung dịch sau thủy phân theo Dược điển Việt Nam ................................56
Hình 3.5. Đường chuẩn albumin...............................................................................57
Hình 3.6. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm
enzym pepsin.............................................................................................................60
Hình 3.7. Sữa đơng tụ ...............................................................................................60
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy
phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym pepsin .........................................63
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian
bởi chế phẩm enzym pepsin ......................................................................................63
Hình 3.10. Chế phẩm enzym pancreatin ...................................................................67
Hình 3.11. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm
enzym pancreatin ......................................................................................................73
Hình 3.12. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy
phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym pancreatin...................................76
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian
bởi chế phẩm enzym pancreatin................................................................................76
Hình 3.14. Chế phẩm enzym protease ......................................................................78
Hình 3.15. Biểu đồ so sánh hoạt độ đông tụ các loại sữa khác nhau của chế phẩm

enzym protease từ ruột non .......................................................................................82
Hình 3.16. Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng Nitơ formol theo thời gian thủy
phân các protein khác nhau bởi chế phẩm enzym protease từ ruột non ...................84
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thủy phân các protein khác nhau theo thời gian
bởi chế phẩm enzym protease từ ruột non ................................................................85


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .....................................................................................35
Sơ đồ 2.2. Quy trình tách chiết enzym pepsin ..........................................................36
Sơ đồ 2.3. Quy trình tách chiết pancreatin và kết tủa bằng cồn 960 .........................38
Sơ đồ 2.4. Quy trình sản xuất pepton........................................................................52


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
- CPE: Chế phẩm enzym
- UI: Đơn vị hoạt độ enzym
- HĐĐT: Hoạt độ đông tụ sữa


1

MỞ ĐẦU
Một trong những thành tựu to lớn của khoa học và công nghệ trong nửa cuối
thế kỷ XX là những nghiên cứu về enzym, khám phá về cấu trúc hóa học, cơ chế
xúc tác, phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym để phục vụ cuộc sống con người.
Enzym là một chất xúc tác sinh học chỉ được tạo thành trong tế bào sinh vật, nó
đóng vai trị quan trọng và không thể thiếu được trong trao đổi chất.
Enzym là một trong những ngành khoa học mũi nhọn của công nghệ sinh học
và là lĩnh vực đã đạt được nhiều thành tựu trong cả nghiên cứu khoa học lẫn ứng

dụng trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp chế biến thực phẩm. Thực
tế ở nước ta, các chế phẩm enzym hầu hết phải nhập từ nước ngoài và có giá thành
rất cao nên việc ứng dụng chế phẩm enzym trong sản xuất chưa được rộng rãi. Do
đó căn cứ vào nguồn phế phụ liệu rẻ tiền, dồi dào từ lò mổ động vật chưa được tận
dụng một cách khoa học và hiệu quả. Chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu tận dụng
phụ phế liệu lò mổ động vật để thu nhận một số chế phẩm enzym có giá trị và
các ứng dụng”. Chế phẩm enzym thu nhận theo phương pháp này có giá thành rẻ
hơn nhiều so với giá enzym nhập ngoại. Quy trình sản xuất góp phần tận dụng phế
phụ liệu của công nghiệp và chống ô nhiễm môi trường.
Mục tiêu của đề tài là hoàn thiện quy trình thu nhận một số chế phẩm enzym
có giá trị và ứng dụng các enzym này để tạo một số sản phẩm.
Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm: Thu nhận enzym pepsin từ niêm
mạc dạ dày heo, hỗn hợp enzym pancreatin từ tụy tạng heo và thu hỗn hợp enzym
protease từ niêm mạc ruột non. Ứng dụng các enzym này để thủy phân một số protit
và đông tụ sữa.
Trong đề tài này, chúng tôi giới hạn phạm vi nghiên cứu như sau: Xây dựng
quy trình tách chiết enzym, xác định hoạt độ các chế phẩm enzym, ứng dụng chế
phẩm enzym để tạo sản phẩm pepton và ứng dụng đông tụ sữa.


2

Phần 1
TỔNG QUAN
1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ NHÓM ENZYM PROTEASE
1.1.1. Khái niệm chung [5] [11] [28]
Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ
yếu trong phân tử protein và peptide. Cơ chế thủy phân như sau:
Endopeptidase

HO H

HO H
NH2 – CH – CO – NHCH....NHCHCO – NHCHCO – NHCHCO – NHCHCOOH
R1

R2

Amino peptidase

R3

R4
HO H

R5

R6

Carboxy peptidase

Exopeptidase

Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen)
và có thể chuyển thành dạng hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng
sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, giải phóng một số
peptide kìm hãm, khi đó sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt
động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động.
1.1.2. Phân loại nhóm enzym protease [4] [5] [11] [13]
Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử

protein, người ta chia protease ra làm hai nhóm:
9 Endopeptidase: Chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử
protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ
(polypeptide mạch ngắn, pepton,...). Nhóm các protease tiêu hóa chủ yếu ở


3

người và động vật gồm có: Pepsin và rennin có trong dịch dạ dày, trypsin và
chymotrypsin của tuyến tụy và niêm mạc ruột non đều thuộc nhóm enzym
này.
9 Exopeptidase: Chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở hai đầu mạch.
Ví dụ: Nhóm carboxypeptidase và aminopeptidase phân giải liên kết peptide
từ hai đầu mạch polypeptide có nhóm carboxyl và amin tự do. Ngồi ra cịn
có dipeptidase phân giải dipeptide thành các amino acid tự do.
Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia
protease thành các nhóm:
-

Protease acid: Pepsin, rennin,... hoạt động ở vùng pH acid.

-

Protease kiềm: Trypsin, chymotrypsin,... hoạt động ở vùng pH kiềm.

-

Protease trung tính: Amylase, papain,... hoạt động ở vùng pH trung tính.

Dựa vào cấu tạo của trung tâm hoạt động, người ta chia protease thành bốn nhóm:

9 Protease – serine
Ở trung tâm hoạt động của những enzym này có mặt của một gốc serine
và một gốc histidine. Các enzym này chủ yếu chỉ tấn công vào các liên kết
peptide giữa một số acid amin.
Những enzym thuộc nhóm này có khoảng pH hoạt động từ 7 – 10, hay
gọi là các protease kiềm. Những enzym điển hình có nguồn gốc động vật như
trypsin, chymotrypsin,...
Một số vi sinh vật cũng có thể sinh tổng hợp được các enzym protease
serine như: Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Bacillus subtilis,...
9 Protease – cysteine
Là các protease có nhóm –SH của gốc cysteine trong trung tâm hoạt
động, trực tiếp tham gia xúc tác thủy phân. Các enzym điển hình đại diện cho
nhóm này bao gồm bromelin, papain, ficin, enzym từ Streptococcus. Khoảng
pH hoạt động của chúng rất rộng từ 4,5 – 10, khoảng pH tối ưu là 6 – 7,5.
Các enzym này thể hiện tính đặc hiệu rộng.


4

9 Protease – metalo
Trung tâm hoạt động của các enzym này có chứa các ion kim loại
(Zn2+, Mn2+,...), trực tiếp tham gia xúc tác phản ứng. Nhóm này bao gồm các
exopeptidase như: carboxypeptidase, aminopeptidase, dipeptidase,...
Một số vi sinh vật cũng có thể sinh tổng hợp được các enzym này như:
Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis, Streptomyces griseus,...
9 Protease – aspartic
Cấu trúc của trung tâm hoạt động của các enzym này gồm hai nhóm
carboxyl của hai gốc aspartate. Nhóm này bao gồm các enzym điển hình như
pepsin, rennin, cathepsin D. pH hoạt động của các enzym này trong khoảng
2 – 5, nó tùy thuộc vào loại cơ chất và loại enzym.

1.1.3. Các ứng dụng của protease [1] [13] [15] [18]
1.1.3.1. Trong công nghiệp thịt
Trong cơng nghiệp chế biến thịt, có thể sử dụng các chế phẩm protease để làm
mềm thịt, các chế phẩm thường dùng là papain, bromelin, ficin và các chế phẩm
protease từ vi sinh vật như Aspergillus oryzae. Khi sử dụng các chế phẩm protease
thì chất lượng thịt được nâng lên, thời gian chín được giảm xuống rất nhiều.
1.1.3.2. Trong cơng nghiệp sữa
Protease cịn có khả năng làm đơng tụ sữa trong sản xuất pho mát. Các enzym
có hoạt tính đơng tụ sữa cao như rennin và pepsin. Ngày nay người ta đã có các chế
phẩm từ vi khuẩn (Bac. Mesentericus) hay từ nấm mốc (Asp. Candidus, Mucor) có
hoạt tính enzym tương tự rennin có thể thay thế một phần cho rennin (từ 25 – 50%).
1.1.3.3. Trong công nghiệp thuộc da
Dùng chế phẩm protease thơ từ vi sinh vật có thể dùng trong thuộc da, tách
lông, làm mềm da (chủ yếu phá bỏ collagen, protit trong da). Các loài vi sinh vật
sau đây có thể dùng tạo chế phẩm enzym cho thuộc da:
-

Nấm mốc: Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. parasitucus.

-

Vi khuẩn: Bac. subtilis, Bac. mesentericus; Xạ khuẩn: Actinomyces fradiae.


5

1.1.3.4. Trong sản xuất tơ tằm
Dịch enzym protease từ nấm mốc, vi khuẩn có thể làm bóng và tách rời các
sợi tơ tằm, do thủy phân lớp xerixin (là 1 protit) làm dính bết các sợi tơ tự nhiên
(lượng xerixin khoảng 30%).

1.1.3.5. Trong sản xuất các chất tẩy rửa
Trong quá trình sản xuất bột giặt người ta có bổ sung các enzym có pH tối
thích nằm trong vùng kiềm, trong đó có enzym protease để tẩy các vết bẩn, đặc biệt
là các vết máu, sữa trên áo quần.
1.1.3.6. Trong mỹ phẩm
Hiện nay ở một số nước người ta đã sản xuất các loại kem có chứa protease
dùng để xoa mặt, xoa tay và cạo râu,... Dưới tác dụng của protease trong kem, các
biểu bì của da đã chết sẽ được tách ra, tạo sự phát triển cho lớp da non.
1.1.3.7. Trong y học
Chế phẩm protease để điều chế dịch thủy phân protein dùng làm mơi trường
ni vi sinh vật (ví dụ: pepton). Cô đặc tinh chế huyết thanh kháng độc (huyết thanh
miễn dịch).
1.1.3.8. Trong đời sống và công nghiệp thực phẩm
Từ xưa nhân dân ta dùng chế phẩm enzym vi sinh vật (như chế phẩm
amilase, protease,...) để chế biến các món ăn dân tộc như: làm chao, tương, nước
chấm, lên men rượu, bia. Ngày nay việc ứng dụng enzym này đã ở mức qui mô
công nghiệp như ở các nhà máy làm nước chấm, rượu bia,...
1.2. PEPSIN (EC.3.4.4.1)
1.2.1. Lịch sử của pepsin [11]
Vào năm 1713, Reaumur và Spallanzaai đã chứng minh bằng kết quả thí
nghiệm là có “sự tồn tại một nguyên lý tiêu hóa thịt trong dịch vị”. Sau này,
Braconnol và Paulo nghiên cứu về cơ chế tiết dịch vị ở dạ dày, nhưng mãi đến năm
1836 thì Schwann mới phát hiện ra là chất men phân giải protein của dịch vị.


6

Vào năm 1882, Langley đã thu được pepsinogen, là tiền pepsin bằng cách
trích dịch vị dạ dày heo với dung dịch kiềm, sau đó dùng acid để chuyển
pepsinogen thành pepsin. Đến năm 1930, Northrop đã thu nhận được pepsin dạng

tinh thể.
Pepsin là một enzym quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật thuộc nhóm
enzym thủy phân (hydrolase). Số phân loại: EC.3.4.4.1, pepsin có tên hệ thống là
peptide – peptidohydrolase.
1.2.2. Nguồn thu nhận [11]
1.2.2.1. Cấu trúc và chức năng của dạ dày
™ Cấu trúc: Dạ dày là một đoạn phình ra của ống tiêu hóa có tác dụng chứa
đựng thức ăn, nhào trộn thức ăn để thấm dịch vị. Thức ăn sẽ chịu sự tiêu
hóa của các enzym tiêu hóa chứa trong dịch vị, chuẩn bị cho giai đoạn
chính của việc tiêu hóa ở ruột non. Lúc đói dạ dày co bóp, khi thức ăn vào
cử động co bóp sẽ mạnh hơn và phức tạp hơn. Dạ dày co bóp là nhờ ba lớp
cơ khỏe: cơ dọc, cơ vòng và cơ chéo. Dạ dày chịu sự chi phối của hai tổ
chức thần kinh: một tổ chức nội tại có búi neissner nằm dưới niêm mạc và
búi auerbach nằm trong lớp cơ, hai là tổ chức thần kinh ngoại lai gồm
những sợi cảm giác và sợi vận động.
™ Chức năng cơ học của dạ dày bao gồm:
- Chức năng chứa thức ăn.
- Chức năng co bóp để trộn thức ăn với dịch vị, tạo ra dịch trấp.
- Đưa dịch trấp xuống ruột non với một tốc độ thích hợp cho sự hấp thụ và
tiêu hóa ở ruột non.
™ Các tuyến chính của dạ dày:
- Tế bào niêm dịch bài tiết chất nhầy.
- Tế bào chính bài tiết pepsinogen, rennin và gelatinase.
- Tế bào viền bài tiết HCl.
- Tế bào bài tiết gastrin.


7

Pepsin phân bố trên các phần khác nhau của dạ dày và ở dạng tiền pepsin

(pepsinogen). Pepsinogen tập trung chủ yếu ở phần đáy mỏng của dạ dày. Ở đây
pepsinogen chiếm đến 75%. Phần cơ màu sẫm hơn là nơi tập trung thức ăn của dạ
dày.
1.2.2.2. Niêm mạc dạ dày – dịch vị dạ dày
™ Niêm mạc dạ dày: Niêm mạc dạ dày là lớp màng nhầy bên trong cùng của
dạ dày, bên dưới lớp này có lớp trung gian giữa niêm mạc và cơ, gọi là lớp
nhầy cơ, bề dày khoảng 0,5 – 2,5 mm, có nhiều nếp nhăn khi dạ dày lép và
sẽ mất nếp nhăn khi dạ dày chứa thức ăn. Trong niêm mạc có những ống
bài tiết những chất khác nhau, người ta chia dạ dày ra từng vùng:
- Vùng quanh tâm vị của niêm mạc bài tiết nhiều chất nhầy, ít pepsinogen.
- Vùng giữa đáy và thân dạ dày bài tiết thành phần chính dịch vị là HCl,
pepsinogen và các enzym tiêu hóa khác.
- Vùng dưới thân dạ dày là hang vị, bài tiết chính là vị tố gastrin và ít chất
nhầy.
™ Dịch vị dạ dày: Dịch vị do các tuyến ống ở dạ dày tiết ra. Đó là một dịch
khơng màu, trong và khơng mùi. Trong dịch vị có hai chất hoạt động chính
là HCl và pepsin, pH = 1,5 – 3. Mỗi ngày dạ dày bài tiết khoảng 1500 ml
dịch vị. Thành phần dịch vị bao gồm:
- Nước: 993 g/lít dịch vị.
- Chất vô cơ: Gồm HCl và các muối clorua (Na, K, Ca), các muối phosphat
(Mg, Ca, Fe).
- Chất hữu cơ, đặc biệt quan trọng là nhóm enzym tiêu hóa.
1.2.3. Thành phần và cấu tạo [11] [29] [30]
Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bị sát và cá. Ở heo
thì pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày. Pepsin thô là một hỗn hợp của
pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin
chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin.


8

™ Cấu trúc: Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại làm thành
hình cầu (từ kết quả phân tích cấu trúc tinh thể bằng tia X), tỷ lệ bán trục là
3 – 3,6, rất ít xoắn dạng cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc bốn cũng gồm có bốn
tiểu phần. Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro,
hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Chỉ có ba liên kết S-S trong phân tử
pepsin, người ta nhận xét ít nhất một trong những liên kết đó khơng cần
thiết cho hoạt động enzym. Liên kết hydro có thể đóng vai trị quan trọng
trong việc ổn định phân tử.
™ Cấu tạo: Pepsin gồm một mạch polypeptide hợp thành bởi 329 amino acid,
mà đầu C là alanin và đầu N là isoleucin. Theo Williamson và Dassmamn,
nhóm N cuối của pepsin là chuỗi liên kết peptide gồm sáu amino acid như
sau: Leu – Gly – Asp – Asp –His – Glu.
Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi Van Vunatcis,
Herriott (1966) và bởi Williamson, thứ tự là: Val – Leu – Ala.
Nói chung, việc nghiên cứu cấu trúc của pepsin cho đến nay vẫn còn
nhiều vấn đề cần giải quyết. Về cấu trúc bậc một, chỉ mới có phần đầu C và
N, cũng như phần của phân tử nằm kề các amino acid kiềm tính (Arg, Lys)
và gốc phosphoserin là được nghiên cứu chi tiết (theo Korka và cộng sự
1970) với cấu trúc như sau: Glu – Ala – Thr – SerP – Glu – Glu – Leu.
Thứ tự trong phần kề cận gốc phosphoserin của pepsin đã được xác
định bởi Flavin (1968) bằng phương pháp sắc ký, những phosphopeptide
sinh ra từ sự thủy phân acid, được biết là: Thr – Ser – Phos – Glu.
Trong phân tử pepsin có chứa S tạo thành ba cầu disulfua và một gốc
acid phosphoric kết hợp với nhóm hydroxyl của một trong các gốc serin
(Northrop 1930, Flavin 1954).
Sự hiểu biết về cấu trúc trung tâm hoạt động của pepsin cũng còn rất
hạn chế. Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carboxyl
của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin.

9

(a)

(b)

Hình 1.1: (a) Cấu trúc của pepsin; (b) Cấu trúc của pepsinogen
™ Thành phần hóa học: Hàm lượng N trong phân tử pepsin là 14,7%
(Rajagopalan và cộng sự, 1966).
™ Thành phần amino acid: Pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính
acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh. Phân tử pepsin của heo chứa
khoảng 36 nhóm carboxyl tự do, trong khi đó chỉ chứa hai gốc arginin, một
gốc lysin và một gốc histidin. Pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước
(theo Perlman, 1959). Số lượng các amino acid có mạch nhánh không phân
cực là lớn, làm cho enzym dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các
hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực.
Bảng 1.1. Thành phần amino acid của pepsin [11]
Tên amino acid

A

B

Tên amino acid

A

B

Cystin

1,64

4

Glycin

6,40

20

Cystein

0,50

2

Valin

7,10

21

Methionin

0,70

4

Leucin

10,40

27

Arginin

1,00

2

Prolin

5,00

15

Histidin

0,90

2

Phenylalanin

6,40

13

Lysin

0,90

2

Isoleucin

10,80

28

Acid aspartic

16,00

41

Tyrosin

8,50

16

Acid glutamic

11,90

28

Tryptophan

2,40

4

Serin

12,20

40

Amide N

1,32

32

Threonin

9,60

28


10

Ghi chú: A – Số gam amino acid trong 100 g pepsin; B – Số gốc amino acid trong
một phân tử pepsin.
Do đặc điểm về thành phần amino acid, pepsin tinh khiết mang điện tích âm

ngay cả trong mơi trường HCl 0,1N (theo Herriot, 1940).
Pepsin được tạo thành từ màng nhầy và ở các phần khác nhau của dạ dày thì
tạo các dạng pepsin khác nhau. Ngồi pepsin A (được tách trước tiên) với các tính
chất cơ bản như trên, còn tách được pepsin B, C, D và các pepsinogen tương ứng.
Pepsin được tách từ các nguồn động vật khác nhau (heo, bò) và các pepsin
khác của cùng một nguồn (A, B, C và D) thì có đơi chút khác nhau về tính chất và
thành phần hóa học. Pepsinogen có ba loại A và hai loại C gọi là pepsinogen A-1,
A-2, A-3, C-1 và C-2, được kết tinh từ dạ múi khế dê trưởng thành.
Trọng lượng phân tử của pepsin là 34.500 Dalton. Pepsin của heo lớn hơn
khoảng 35.000 Dalton.
Bảng 1.2. Khối lượng phân tử của các loại pepsinogen và pepsin [11]
Loại

Trọng lượng phân tử (Dalton)

Amino acid ở đầu N

Pepsinogen A

40.400 ± 1600

Leu

Pepsin A

32.700 ± 1200

Ile

Pepsinogen B

39.000

Met, His

Pepsin B

38.600

Ala

Pepsinogen C

41.400

Ser

Pepsin C

36.000

Ser và Leu hoặc Ile

Pepsinogen D

41.000

Leu

Pepsin D

35.000

Ile

Khối lượng phân tử của pepsinogen A-1, A-2, A-3, C-1 và C-2 được xác định
tương ứng là 41, 40, 40, 39 và 39 kDa, xác định bằng phương pháp SDS-PAGE.
1.2.4. Đặc tính [11]
Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay
vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi


11

chua, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt (Dược điển Việt
Nam).
Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục, không tan trong
cồn 95oC, ester, chloroform. Pepsin ở cả hai dạng: kết tinh và thô (pepsin thô là một
hỗn hợp của pepsin, gelatin, cathepsin và Brucke pepsin).
Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1. Sở dĩ điểm đẳng điện (pI) của
pepsin thấp như vậy có thể do sự có mặt của gốc phosphoric acid trong phân tử
enzym vì sau khi loại bỏ gốc này pH đẳng điện của pepsin là 1,7 (Perlman, 1955).
Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1 – 4. pH hoạt động tối
ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường pH trong
khoảng từ 1,8 – 2,2. Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác
của pepsin hơi chuyển về vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể. Điều đó có
thể do sự biến tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân
(theo Northrop, 1922).
Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4 – 5, nhưng trong vùng pH này hoạt
lực của enzym có phần thay đổi giảm đi. Từ pH = 5,5 trở lên, pepsin không hoạt

động.
Khả năng hòa tan pepsin phụ thuộc vào độ tinh khiết. Những pepsin thu nhận
từ các nguồn nguyên liệu có những đặc tính khác nhau. Pepsin heo và pepsin bị có
những điểm khác nhau. Pepsin bị khơng khác những pepsin khác về mặt hoạt động
xúc tác.
Quá trình dự trữ pepsin: Pepsinogen ổn định 12 – 18 tháng ở 2 – 8oC, pepsin
ổn định 1 – 2 năm ở 2 – 8oC, chế phẩm pepsin thơ có thể giữ hoạt tính được trong
nhiều năm ở nhiệt độ 0 – 4oC.
1.2.5. Sự hoạt hóa pepsinogen thành pepsin [11] [23]
Enzym là chất xúc tác hữu hiệu nhất của cơ thể sống, về bản chất enzym
cũng là các protein. Enzym được tổng hợp ở dạng bất hoạt phù hợp để dự trữ hoặc
để vận chuyển từ vị trí tổng hợp đến vị trí hoạt động mong muốn như trường hợp
pepsin, trypsin, chymotrypsin và carboxypeptidase. Sự hoạt động của những enzym