Nghiên cứu tinh sạnh pectinase từ canh trường aspergillus ficuum và khảo sát một số đặc tính của chế phẩm thu được

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
---O0O---

NGUYỄN VÂN NGỌC PHƯNG

Đề tài

NGHIÊN CỨU TINH SẠCH
PECTINASE TỪ CANH TRƯỜNG
ASPERGILLUS FICUUM VÀ KHẢO
SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA CHẾ
PHẨM THU ĐƯC

CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
MÃ SỐ NGÀNH : 2.11.00

LUẬN VĂN THẠC SĨ
TP. HỒ CHÍ MINH, THÁNG 6 NAÊM 2002


CÔNG TRÌNH ĐƯC HOÀN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

Người chấm nhận xét 1 : TS. TRỊNH THỊ HỒNG
Người chấm nhận xét 2 : TS. NGUYỄN KÍNH

Luận văn thạc só được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN
THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ngày tháng naêm 2002


LỜI CẢM ƠN
Chân Thành Cám Ơn
Cô Đồng Thị Thanh Thu, thầy Lê Văn Việt Mẫn đã nhiệt tình hướng
dẫn và truyền đạt những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quý báu cho
tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Quý Thầy, Cô bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Bách
khoa TP. Hồ Chí Minh đã trang bị những kiến thức cũng như tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi học tập trong hơn 2 năm qua.
Thành thật cám ơn
Các anh, chị cán bộ phòng thí nghiệm đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt
cho tôi hoàn thành thí nghiệm.
Trường Cao Đẳng Cộng Đồng Tiền Giang đã tạo điều kiện thuận lợi
cho tôi học tập và thực hiện luận văn này.
Gửi lời chào thân ái đến các bạn học viên cao học khóa 10 đã thảo
luận, ủng hộ, động viên tôi trong thời gian thực hiện luận văn.


ABSTRACT
In this study, some technological parameters of the pectinase extraction and
precipetation from the Aspergillus ficuum surface culture were determined.
The enzyme extraction can be carried out by the culture/water ratio 1/3 in 60
minutes with continious agitation.
Absolute ethanol can precipitate 78% pectinase from the enzyme aqueous
solution and specific activity of the precipitated enzyme is about 0,22 units/mg
protein

The enzymes were then purified by gel filtration (Sephadex G-75), 4 peak
with hight pectinase activity were observed
The pH and temperature optimum of the produced pectinases were also
determined (pHopt =4,4, topt = 450C)
Pectinase application to fruit juice treatment in order to reduce the pectin
quanltily in juice gave the good effect


MỤC LỤC
Trang
Danh mục các bảng ----------------------------------------------------------------------- 1
Danh mục các hình------------------------------------------------------------------------ 2
Lời mở đầu --------------------------------------------------------------------------------- 4
PHẦN I: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
1 Khái niệm chung về enzym ---------------------------------------------------------- 5
1.1 Định nghóa --------------------------------------------------------------------- 5
1.2 Hoạt tính của enzym --------------------------------------------------------- 5
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym ------------------------- 6
2 Pectin------------------------------------------------------------------------------------- 7
2.1 Giới thiệu ---------------------------------------------------------------------- 7
2.2 Cấu tạo của pectin------------------------------------------------------------ 7
2.3 Tính chất của pectin---------------------------------------------------------- 8
3 Enzym pectinase ----------------------------------------------------------------------10
3.1 Phân loại enzym pectinase ----------------------------------------------------------10
3.2 Cơ chế tác dụng của enzym pectinase --------------------------------------------12
4 Pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật và các điều kiện sinh tổng hợp
enzym ----------------------------------------------------------------------------------17
4.1 Enzym pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật ----------------------------17
4.2 Điều kiện sinh tổng hợp các enzym pectinase ở vi sinh vật ------------19
5 Trích ly và làm sạch chế phẩm enzym -------------------------------------------21

5.1 Trích ly enzym từ môi trường rắn -----------------------------------------21
5.2 Kết tủa enzym ----------------------------------------------------------------22
5.3 Lọc gel ------------------------------------------------------------------------24
5.4 Các phương pháp khác ------------------------------------------------------27
6. Ứng dụng enzym pectinase ---------------------------------------------------------28
6.1 Ứng dụng trong sản xuất nước quả ------------------------------------------------28
6.2 Ứng dụng trong sản xuất rượu vang -----------------------------------------------29
6.3 Ứng dụng trong trích ly các dược liệu đông y ------------------------------------29


6.4 Ứng dụng trong sản xuất sợi đay, gay ---------------------------------------------30
PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu -----------------------------------------------------------------------------31
2 Phương pháp nuôi cấy chủng nấm mốc ---------------------------------------------32
3. Sơ đồ nghiên cứu ----------------------------------------------------------------------32
4 Phương pháp tách chiết và tinh sạch enzym ---------------------------------------34
4.1 Trích ly enzym ------------------------------------------------------------------------34
4.2 Kết tủa enzym ------------------------------------------------------------------------34
4.3 Phương pháp lọc gel Sephadex ----------------------------------------------------36
5 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của enzym pectinase38
6 Ứng dụng chế phẩm pectinase làm giảm hàm lượng pectin trong nước ép
trái cây -----------------------------------------------------------------------------------39
7 Phương pháp phân tích ----------------------------------------------------------------40
7.1 Xác định hoạt tính enzym pectinase bằng phương pháp so màu --------------40
7.2 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry -------------------------42
7.3 Xác định hoạt tính riêng ------------------------------------------------------------44
7.4 Xác định mức độ tinh sạch ----------------------------------------------------------44
7.5 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến -----------------44
7.6 Xác định hàm lượng pectin trong nguyên liệu -----------------------------------46
7.7 Xác định độ nhớt của nước ép trái cây --------------------------------------------47

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp hệ enzym pectinase theo thời gian -----------48
2 Trích ly enzym --------------------------------------------------------------------------49
2.1 Xác định tỷ lệ canh trường/dung môi (nước) và thời gian trích ly tối ưu -----49
2.2 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly enym ----------------------------------52
3 Kết tủa enzym --------------------------------------------------------------------------53
3.1 Bằng dung môi hữu cơ ---------------------------------------------------------------53
3.2 Kết tủa enzym bằng polyetylenglycol --------------------------------------------58
3.3 Kết tủa enzym bằng muối sulfat amon --------------------------------------------60
4 Phân đoạn chế phẩm enzym PC bằng phương pháp lọc gel Sephadex G-75 --65
5 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố đến hoạt tính của enzym pectinase 68


5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính và độ bền của enzym ------------------68
5.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính và độ bền của enzym ------------------------71
5 Ứng dụng enzym pectinase -----------------------------------------------------------74
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1 Kết luận ----------------------------------------------------------------------------------77
2 Đề nghị -----------------------------------------------------------------------------------78
Tài liệu tham khảo -----------------------------------------------------------------------79


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1 Tính chất của một vài enzym pectinase từ thực vật và vi sinh vật -------12
Bảng 2 Tính chất của enzym pectinesterase -----------------------------------------13
Bảng 3 Tính chất của enzym endopolygalacturonase-------------------------------15
Bảng 4 Tính chất của enzym polygalacturonatlyase --------------------------------17
Bảng 5 Khả năng sinh tổng hợp các loại enzym pectinase ở vi sinh vật ---------18
Bảng 6 Bản chất của lưới lọc gel ------------------------------------------------------25

Bảng 7 Pha dung dịch đệm phosphat -------------------------------------------------39
Bảng 8 Hàm lượng chất khô trong dung dịch theo thời gian trích ly -------------50
Bảng 9 Hoạt tính của enzym pectinase khi trích ly ở các tỷ lệ
canh trường/dung môi khác nhau --------------------------------------------- 51
Bảng 10 Hoạt tính và hàm lượng protein trong dung dịch khi trích ly ở các
giá trị pH khác nhau -----------------------------------------------------------52
Bảng 11 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng cồn tuyệt đối ----------------------54
Bảng 12 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng isopropanol ------------------------55
Bảng 13 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng aceton -----------------------------55
Bảng 14 Hàm lượng protein của các chế phẩm thu được khi kết tủa enzym
bằng các dung môi hữu cơ với các tỷ lệ khác nhau------------------------56
Bảng 15 Hoạt tính của chế phẩm sau khi kết tủa bằng PEG ------------------------58
Bảng 16 Hiệu suất thu hồi enzym khi tủa bằng muối sulfat amon -----------------61
Bảng 17 Độ tinh sạch của chế phẩm khi tủa bằng các tác nhân khác nhau-------62
Bảng 18 Hoạt tính riêng của enzym ở một số phân đoạn sau khi qua cột gel ----67
Bảng 19 Độ tinh sạch của pectinase qua các bước thí nghiệm ---------------------68
Bảng 20 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc hoạt tính enzym theo nhiệt độ ----------69
Bảng 21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền hoạt tính enzym --------------------70
Bảng 22 Kết quả khảo sát hoạt tính của enzym ở các giá trị pH khác nhau -----72
Bảng 23 Ảnh hưởng của pH đến độ bền hoạt tính enzym --------------------------73
Bảng 24 Sự thay đổi độ nhớt tương đối của nước ổi trong quá trình
xử lý enzym --------------------------------------------------------------------75
Bảng 25 Sự thay đổi hàm lượng pectin trong dịch quả sau 2 giờ xử lý enzym ---76

-1-


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1 Các đơn vị cấu tạo của hợp chất pectin --------------------------------------- 8

Hình 2 Những phân đoạn của phân tử pectin và những điểm tấn công của enzym
pectinesterase --------------------------------------------------------------------13
Hình 3 Sự kết hợp của ion Ca++ với các acid pectic để tạo thành
kết tủa Ca-pectat ----------------------------------------------------------------14
Hình 4 Sự xúc tác quá trình thủy phân bởi enzym polygalacturonase trên
acid pectic-------------------------------------------------------------------------15
Hình 5 Sự phân hủy pectin bởi enzym pecticlyase ----------------------------------16
Hình 6 Sự phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel ----------------------24
Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu ----------------------------------------------------------------33
Hình 8 Quy trình kết tủa enzym bằng muối sulfat amon và thẩm tích -----------35
Hình 9 Sắc ký lọc gel--------------------------------------------------------------------37
Hình 10 Đồ thị biểu diễn quá trình sinh tổng hợp pectinase theo phương pháp
nuôi cấy bề mặt------------------------------------------------------------------48
Hình 11 Sự thay đổi hàm lượng protein của dung dịch trong quá trình trích ly --50
Hình 12 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ canh trường/ dung môi đến quá
trình trích ly enzym pectinase ------------------------------------------------51
Hình 13 Ảnh hưởng của pH đến quá trình trích ly enzym pectinase ---------------53
Hình 14 Hiệu suất thu hồi enzym pectinase trong quá trình tủa bằng các dung
môi hữu cơ -----------------------------------------------------------------------56
Hình 15 Hoạt tính riêng của các chế phẩm thu được khi kết tủa enzym bằng các
dung môi hữu cơ khác nhau ---------------------------------------------------57
Hình 16 Ảnh hưởng của nồng độ PEG đến hiệu suất thu hồi enzym và hoạt tính
riêng của chế phẩm ------------------------------------------------------------59
Hình 17 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi enzym cao nhất khi sử dụng các tác
nhân tủa khác nhau -------------------------------------------------------------62
Hình 18 Quy trình tách chieát enzym pectinase ---------------------------------------64

-2-

Hình 19 Chế phẩm enzym pectinase PC sau khi qua cột lọc
gel Sephadex - G75-------------------------------------------------------------66
Hình 20 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC)
vào nhiệt độ ----------------------------------------------------------------------69
Hình 21 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ổn định hoạt tính của
enzym pectinase (chế phẩm PC) --------------------------------------------- 71
Hình 22 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc hoạt tính enzym pectinase (chế phẩm PC)
vào pH ----------------------------------------------------------------------------72
Hình 23 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến sự ổn định hoạt tính của
enzym pectinase (chế phẩm PC)----------------------------------------------74
Hình 24 Đồ thị biểu diễn sự giảm độ nhớt của nước ổi trong quá trình xử lý
enzym ----------------------------------------------------------------------------75

-3-


LỜI MỞ ĐẦU
Trong 30 năm trở lại đây, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ
sinh học, các chế phẩm enzym được sản xuất ngày càng nhiều về số lượng, đa
dạng về chủng loại. Enzym không thể tổng hợp bằng con đường hóa học mà chỉ
tổng hợp bằng con đường sinh học. Do đó, muốn thu nhận enzym chỉ có con đường
duy nhất là thu nhận chúng từ cơ thể sinh vật hay nói cách khác bằng con đường
sinh tổng hợp. Ta có thể sinh tổng hợp enzym từ động vật, thực vật và vi sinh vật.
Tuy nhiên, con đường thu nhận enzym từ vi sinh vật được khai thác và sử dụng
nhiều nhất vì vi sinh vật có tốc độ sinh trưởng cực kỳ nhanh chóng, tạo ra được
những hệ enzym vô cùng phong phú, có hoạt lực xúc tác cực kỳ mạnh mẽ và hàm
lượng enzym khá cao. Nguyên liệu làm môi trường nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và
rẻ tiền.
Một trong các chế phẩm enzym vi sinh vật được ứng dụng nhiều nhất là pectinase,
enzym này đứng thứ ba về số lượng sản xuất sau protease và amilase. Enzym

pectinase được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y
dược…, đặc biệt trong công nghiệp thực phẩm: sản xuất nước quả, nước giải khát
không cồn, rượu vang…[14,24]. Trong chế biến thực phẩm, pectinase nếu dùng ở
dạng thô (như canh trường nuôi cấy bề mặt) sẽ cho sản phẩm có mùi vị lạ[16].
Thực tế ở nước ta hiện nay, các chế phẩm pectinase hầu hết phải nhập từ nước
ngoài và có giá thành khá cao nên việc ứng dụng chế phẩm này để làm giảm độ
nhớt của purê dịch quả, tăng hiệu suất thu hồi chất chiết trong các quy trình sản
xuất nước quả trong từ xoài, ổi, đu đủ… còn hạn chế. Trên cơ sở đó, chúng tôi bước
đầu khảo sát quá trình trích ly và kết tủa nhóm enzym pectinase từ canh trường
nuôi cấy bề mặt Asp. ficuum với mục đích tinh sạch sơ bộ chế phẩm enzym, sau đó
xác định nhiệt độ và pH tối ưu để ứng dụng enzym pectinase phục vụ cho ngành
sản xuất nước quả trong nước

-4-


1 KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM
1.1 Định nghóa [14]
Enzym (hay còn gọi là men) là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzym
có trong tế bào của mọi cơ thể sinh vật. Enzym không những làm nhiệm vụ xúc tác
đặc hiệu cho các phản ứng hoá học nhất định trong cơ thể sinh vật (Phản ứng của
các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống) gọi là “invivo” mà còn xúc
tác cho các phản ứng ngoài tế bào “ invitro”. Vì có nguồn gốc từ sinh vật nên
enzym được gọi là xúc tác sinh học nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học
khác
Rất nhiều phản ứng hoá học khó xảy ra trong điều kiện bình thường ở ngoài cơ thể,
để tiến hành cần có nhiệt độ cao, áp suất cao, với chất xúc tác là acid mạnh hay
base mạnh.. nhưng trong cơ thể, chính nhờ sự có mặt của enzym mà phản ứng xảy
ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng. Cơ thể thiếu enzym thì mọi quá
trình chuyển hóa sẽ đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản và phát triển bình

thường được, sự sống của sinh vật sẽ không tồn tại.
1.2 Hoạt tính của enzym [3]
Enzym có cường lực xúc tác rất lớn, ở điều kiện thích hợp hầu hết các phản ứng
enzym xảy ra với tốc độ nhanh gấp 10 8 đến 10 11 lần so với những phản ứng cùng
loại không có sự xúc tác của enzym, chỉ cần một lượng nhỏ enzym có thể xúc tác
chuyển hóa một lượng lớn cơ chất.
Hầu hết các phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao đối với bản chất hoá học của cơ
chất và kiểu phản ứng được xúc tác bởi enzym
Phạm vi hoạt động của enzym khá rộng, các phản ứng được enzym xúc tác gồm
nhiều loại như : các phản ứng oxy hoá khử , các phản ứng chuyển gốc hay nhóm,
các phản ứng thủy phân, các phản ứng đồng phân hóa, các phản ứng phân cắt và
tổng hợp.
Enzym do cơ thể sống tổng hợp và hoạt động trong môi trường của cơ thể sống cho

-5-


nên bản thân của enzym cũng như sự hoạt động của nó đều chịu sự kiểm tra, điều
khiển của tế bào về nhiều mặt . Cuối cùng cần lưu ý rằng sự tổng hợp của những
enzym và những chất có hoạt tính sinh học khác cũng đều do enzym xúc tác.
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym:
1.3.1nh hưởng của nhiệt độ [3]
Cũng giống như hầu hết các phản ứng hóa học , các phản ứng có enzym xúc tác
phụ thuộc vào nhiệt độ rất nhiều. Trong các phản ứng enzym, nhiệt độ có tác dụng
làm tăng tốc độ của phản ứng lên cực đại và cũng giống như những phản ứng hóa
học nói chung, chừng nào enzym chưa bị biến tính, thì mỗi khi tăng nhiệt lên 100C,
tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần . Khi tăng nhiệt độ đến khoảng 60-700C
thì phần lớn các enzym mất hẳn hoạt tính và nhiệt độ đó được gọi là nhiệt độ tới
hạn.
Mỗi enzym đều một có nhiệt độ thích hợp nhất cho các hoạt động xúc tác, ở nhiệt

độ đó phản ứng enzym đạt tới tốc độ cao nhất. Nói chung nhiệt độ thích hợp của
enzym thường gần với nhiệt độ của cơ thể. Tuy nhiên nhiệt độ thích hợp của một
enzym không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố, thời gian tác dụng càng dài
thì nhiệt độ thích hợp của enzym thấp dần. Ngoài ra, nồng độ enzym, nồng độ cơ
chất cũng có thể làm thay đổi tác dụng của nhiệt độ đối với enzym.
1.3.2 Ảnh hưởng của pH [3]
pH cũng là một yếu tố ảnh hưởng lên vận tốc phản ứng enzym xúc tác.
Tương tự nhiệt độ, mỗi enzym cũng có một giá trị pH mà tại đó vận tốc đạt Vmax ,
người ta gọi đó là pH tối ưu , kí hiệu là pHopt.
Mỗi enzym cũng có giá trị pHopt riêng , thông thường pHopt của enzym nằm ở vùng
acid yếu , kiềm yếu hay trung tính . Đặc biệt có một số enzym có pH tối ưu ở vùng
rất acid như Pepsin có pHopt = 1,5 – 2,5, hoặc rất kiềm như Trypsin có pHopt = 8-9.
pH tối ưu cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như bản chất hoá học , nồng độ cơ chất,
nhiệt độ của dung dịch phản ứng.

-6-


pH có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng là do khi pH thay đổi sẽ có ảnh hưởng đến
trạng thái ion hoá của các nhóm chức có khả năng ion hoá tham gia trong trung
tâm hoạt động của enzym như nhóm α-COOH ,ω - COOH , -NH2, -OH, vòng
imidazol . . . cũng như trạng thái ion hoá của cơ chất và phức chất trung gian ES.
Tại pHopt , phân tử E, S, ES chắc chắn có một trạng thái ion hoá thích hợp nhất cho
hoạt động xúc tác của enzym nhờ đó mà vận tốc đạt cực đại.
2 PECTIN:
2.1 Giới thiệu[15]
Pectin là polysacharide có nhiều ở quả, củ, thân cây. Trong thực vật pectin tồn tại
dưới hai dạng:
i)Dạng protopectin không tan, tồn tại chủ yếu ở thành tế bào kết hợp với
polysacharide khác như galactan hoặc tinh bột.

ii) Dạng pectin hòa tan tồn tại chủ yếu ở dịch tế bào (có thể làm đục nước
quả)
II.2 Cấu tạo của pectin:[22]
Pectin là hợp chất cao phân tử của acid galacturonic và các ester methoxyl hoặc
acetyl của nó. Hầu hết pectin trong vách tế bào có hình thức liên hợp như là một
chuỗi phân tử với khung hình chính là các vùng rhamno-galacturonan. Mạch chính
này bao gồm các vùng “phẳng “, chủ yếu là polymer mạch thẳng của các acid
galacturonic liên kết với nhau bằng liên kết α-D -1,4 và rhamnose liên kết với
nhau bằng liên kết α-L -1,4. Mức độ ester hóa của các acid galacturonic với các
nhóm methoxyl và acetyl rất khác nhau.
Vùng “phân nhánh” của pectin là phần rhamnogalacturonan, chúng là các mạch
bên có chứa các gốc đường trung tính như galactose, arabinose, xylose, gắn với
mạch chính tại các nguyên tử C số 3 và số 4 trong vòng rhamnose và nguyên tử C
số 2 hoặc số 3 của oligogalacturonic hoặc polymergalacturonic bằng liên kết
glycosidic.

-7-


Hình1 : Các đơn vị cấu tạo của hợp chất pectin
2.3 Tính chất của pectin:[15,16, 17]
Khối lượng phân tử của pectin thường xê dịch từ 20.000 đến 200.000 tuỳ thuộc vào
nguồn pectin. Ví dụ từ táo, mận thu được pectin có phân tử lượng khoảng 25.000 –
35.000, trong khi đó pectin lấy từ cam có phân tử lượng tới 50.000
Pectin không hòa tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác. Pectin hòa tan trong
nước, kiềm, cacbonatnatri, etylendiamin và trong glycerin nóng.
Pectin dễ dàng bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, sulfat amon, clorua nhôm, muối
đồng, muối canxi và bởi acid.
Pectin hòa tan khi bị tác dụng của các chất kiềm loãng hoặc enzym pectinase sẽ
giải phóng nhóm metoxy dưới dạng rượu metylic và acid pectic tự do

Acid pectic + Ca2+ ---> pectat-Ca kết tủa. Tính chất này được ứng dụng để định
lượng pectin

-8-


Khi tăng mức độ ester hóa bằng methanol cũng như khi giảm khối lượng phân tử
thì độ hòa tan của pectin ở trong nước tăng lên, khi đó độ nhớt của dung dịch pectin
sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ.
Đặc tính quan trọng của pectin là khi có mặt của acid và đường nó tạo thành chất
gel. Vì vậy pectin được ứng dụng trong sản xuất mức kẹo. Để tạo thành keo pectin
có thể thêm đường saccharose với tỷ lệ 65-73% (đường bảo hòa) và tạo môi trường
pH = 3,1-3,5 nhờ các acid hữu cơ như acid citric. Riêng acid pectic tự do không có
khả năng tạo gel kể cả khi có đường. Vì vậy, tránh dùng môi trường kiềm hay có
mặt của enzym pectinase. Độ bền vững của pectin trước các enzym có thể tăng lên
khi có mặt các cation, đặc biệt là Al3+ và Fe3+
Chất pectin giữ vai trò quan trọng trong quá trình chín của quả. Khi quả còn xanh
và đang phát triển, protopectin phân tán ở thành tế bào và chiếm tỉ lệ khá cao làm
cho quả cứng. Khi quả bắt đầu chín, protopectin chuyển dần sang dạng pectin hòa
tan dưới tác dụng của các acid hữu cơ và enzym pectinase trong quả. Quả càng
chín càng mềm, pectin hòa tan tăng cao, ngược lại protopectin không tan sẽ giảm
dần
Đối với việc sản xuất nước quả, sự có mặt pectin là điều không mong muốn và
không có lợi. Do có tính chất keo nên khi ép quả, chất pectin đã làm cản trở đến
quá trình trích ly, quá trình làm trong và quá trình lọc dịch quả [17]
Đối với việc trích ly dược liệu đông y có nguồn gốc thực vật thường là lá, hoa, quả,
thân cây, rễ, củ sẽ phải gặp khó khăn khi có mặt của pectin vì làm cho hiệu suất
trích ly thaáp [9]

-9-

3 ENZYM PECTINASE:
Enzym pectinase là nhóm enzym thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành là acid
galacturonic, glucose, galactose, arabinose, metanol…….. [11]
Năm 1840, E. Fremi phát hiện ra enzym pectase ở trong nước ép cà rốt, sau đó ít
lâu A. Mallevre lại tìm được trong nước ép cà chua. Còn E.Bourquelot và H.
Herissey vào khoảng năm 1898 phát hiện được pectinase trong đại mạch nảy mầm
[17,24].
3.1 Phân loại enzym pectinase:
Có nhiều enzym phân giải pectin với các cơ chế phân giải khác nhau. Các nhà
nghiên cứu không thống nhất khi phân loại các enzym này.
• 1957 A.L Demain và H.J Phaff phân loại các enzym này căn cứ theo tính đặc
hiệu (enzym phân giải pectin, enzym phân giải acid pectic và acid pectinic);
căn cứ vào cơ chế tác dụng (enzym phân giải liên kết đầu mạch và cuối mạch);
căn cứ vào pH tác dụng tối ưu của enzym (enzym tác dụng ở pH acid và enzym
phân giải ở pH kiềm).
• Năm 1966 Koller và Neukom đã dựa vào kiểu phản ứng xúc tác của enzym đã
phân chia pectinase thành hai nhóm chính:

- 10 -


Nhóm I : Hydrolase:Xúc tác cho quá trình thủy phân
™ Pectinesterase (PE): có tên hệ thống là pectinpectilhydrolase và có mã số
(E.C.3.1.1.11).
™ Polygalacturonase (PG): Có tên hệ thống là poly-α-1,4 galacturonidglucanohydrolase có mã số (E.C.3.2.1.15 và EC 3.2.1.67),
♦ Polymetylgalacturonase (PMG): có tên hệ thống là poly-α-1,4
galacturonid- metylesteglucanohydrolase. PMG tác dụng lên acid
polymetylgalacturonic đã được metoxil hóa ( tức pectin), PMG

được phân thành hai kiểu:
+ Endo glucosidase-polymetylgalacturonase (Endo- PMG):
+ Exo glucosidase-polymetylgalacturonase (Exo- PMG):
♦ Polygalacturonase (PG) tác dụng lên acid pectic hoặc pectinic,
gồm hai kiểu:
+ Endo glucosidase-polygalacturonase (Endo- PG)
+ Exo glucosidase-polygalacturonase (Exo- PG)
Nhóm II: Transeliminase:
¾ Pectin- transeliminase (PTE): Có tên hệ thống là poly-α-1,4
galacturonid -metylesteglucanoliase và có mã số (E.C.4.2.99.3). Chỉ tìm
thấy ở dạng Endo-pectin transeliminase (Endo-pectinlyase) (Endo-PTE)
¾ Polygalacturonat- transeliminase (PGTE): Có tên hệ thống poly α-1,4D galacturonid-glucanolyase, mã số (E.C.4.22.99.3), PGTE lại được chia
thành:
+ Endo- Polygalacturonat- transeliminase (Endo-pectatlyase) (EndoPGTE):
+ Exo- Polygalacturonat- transeliminase (Exo-pectatlyase) (ExoPGTE)
Ngoài ra, trong phức hệ enzym pectinase còn có enzym protopectinase, enzym này
tách araban và galactan khỏi protopectin để tạo thành dẫn xuất metyl của acid
galacturonic (tức pectin hoøa tan)

- 11 -


Bảng 1:Tính chất của một vài enzym pectinase từ thực vật và vi sinh vật [22]

Loại enzym/
nguồn gốc
PE
Cam I
Cam II
Cam III

A. Niger sp
A. Niger I
A. Niger II
PG
Khoai taây I
Khoai taây II
Kluyveromyces
fragilis
A. Aculeatus
A. Niger

Khối lượng
phân tử

PI

Hoạt tính riêng
(U/mg protein
enzym)

pHopt

Km
(mg/ml)

36.000
36.200
54.000
39.000
35.400

33.100

10,0
11,0
10,2
3,9
3,65
3,75

694
762
≥ 180
406
17
44

7,6
8,8
8,0
4,5
6,0
6,0

0,083
0,0046
0,041
3
5,0
0,9

100.000
44.000
46.000 – 48.000
47.000
42.000 – 49.000

8,6
9,4
6,1

89

4,5
4,5
4,0

4,7- 4,8
6,0- 6,4

67
275

4,0- 5,0
4,0

3.2 Cơ chế tác dụng của enzym pectinase: [24]
Tác dụng của các enzym pectinase tới pectin khác nhau về cách phá vỡ liên kết
(thủy phân hoặc lyase) và về đặc điểm của sự phá vỡ (hai đầu mút hoặc bên trong
mạch). Cơ chế tác dụng của pectinesterase và polygalacturonase lên pectin đã
được nghiên cứu khá nhiều

3.2.1 Enzym pectinestease (PE) (E.C.3.1.1.11) [16,23]
Enzym này xúc tác thủy phân liên kết ester phức tạp của pectin, sản phẩm tạo
thành là rượu methylic và acid pectinic hay acid polygalacturonic
Pectin + H2O ---> metanol + Acid pectinic (acid polygalacturonic)

- 12 -


Hình2: Những phân đoạn của phân tử pectin và những điểm tấn công của
enzym pectinesterase
Hoạt độ của enzym pectinesterase phụ thuộc nhiều vào mức độ ester hoá pectin và
tỷ lệ thuận với mức độ ester hóa
Người ta nhận thấy rằng enzym pectinase của nấm mốc thủy phân pectin và các
ester của acid galacturonic sâu sắc hơn pectinesterase của thực vật. Pectineterase
của nấm mốc có nhiệt độ tối ưu ở 40 – 450C và bị vô hoạt ở 55 – 620C . Các ion
Na+, Ca2, K+ hoạt hoá enzym pectinesterase còn các ion dưới dạng muối
(Hg(NO3)2, Pb(NO3)2, FeCl3) sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase [16]
Bảng 2: Tính chất của enzym pectinesterase[18]

Vi sinh vật

Khối
lượng

Acrocylindrium sp
Coniothyrium diplodiella I
Coniothyrium diplodiella II
Corticium solfsii
Fusarium oxysporum
Clostridium multifermentans

37000
35000
400000
- 13 -

Hoạt tính
riêng U/mg
protein
203
48

pHopt

7.5
4.8
408
305
7.0
9.0

Km theo
pectin
(mg/ml)
0.7
0.74


Pectinesterase tách gốc metyl khỏi phân tử pectin làm lộ ra các nhóm cacboxyl rất
hoạt động, dễ kết hợp với các ion kim loại (thí dụ Ca++) để tạo thành các muối

không hoà tan, kết lắng lại và có thể tách ra dễ dàng [11]

Hình 3 : Sự kết hợp của ion Ca++ với các acid pectic để tạo thành
kết tủa Ca-pectat
3.2.2 Enzym polygalacturonase (PE) (E.C.3.2.1.15)
Tham gia quá trình thủy phân liên kết α-1,4 - D galactozit giữa các gốc acid
galacturonic trong pectin và trong các acid polygalacturonic khác, tách các gốc
acid D -galacturonic thành các phân tử D –galacturonic tự do
™ Enzym endo-polygalacturonase: thủy phân phân tử pectin (endo- PMG)
hoặc phân tử acid pectic (endo –PG) thành các mạch ngắn hơn galacturonan
hoặc oligogalacturonic, làm cho độ nhớt dung dịch pectin giảm đi nhiều
™ Enzym exo-polygalacturonase: có khả năng phân cắt dần dần từng gốc acid
galacturonic một, bắt đầu từ đầu không khử của mạch. Enzym này không làm
giảm rỏ rệt độ nhớt của dung dịch pectin khi xúc tác nhưng làm tăng năng lực
khử của nó.

- 14 -


Bảng 3:Tính chất của endopolygalacturonase [19]

Vi sinh vật
Asp. niger 1
Asp. niger 11
Asp. Faponicus
F. oxysporum 1
F. oxysporum 11
Newrospora sitophilia
Rhizoctonia fragariae 1
Rhizoctonia fragariae 11

Kluveromyces fragilis 1
Kluveromyces fragilis 11
Kluveromyces fragilis 111

Khối lượng
phântử
35.000
85.000
35.000
37.000
37.000
13.000
36.000
36.000
46.000
50.000
30.000

PH opt

pI

4,1
3,8
4,5
5,0
5,0
5,5
5,0
5,0

4,0 – 5,0
4,0 – 5,0
4,0 – 5,0

7,0
7,0
6,8
7,1
6,1
6,1
5,8

Ngoài ra, một số endo và exo-polygalacturonase còn thể hiện tính đặc hiệu cao,
chúng có thể tác dụng được trên pectin đã metyl hóa, do đó có tên là endo và exopolymetylgalacturonase.
Endo-polygalacturonase còn gọi là polygalacturonase “dịch hóa”, còn exopolygalacturonase còn gọi là polygalacturonase “đường hóa”
Hoạt độ của enzym này tăng lên khi cơ chất được xử lý sơ bộ bằng enzym
pectinesterase [17]

Hình 4 : Sự xúc tác quá trình thủy phân bởi enzym polygalacturose
trên acid pectic

- 15 -


pH tối ưu của các polygalacturonase cũng khác nhau tùy thuộc vào nguồn thu nhận
và cơ chất. Polygalacturonase chủ yếu bền vững ở pH từ 4,0 – 6,0, nhiệt độ tối ưu ở
40 – 450C và bị vô hoạt ở 55 – 650C. Các polygalacturonase cũng giống như
pectinesterase được hoạt hóa bởi các cation của kim loại kiềm [16]
3.2.3 Transeliminase:[24]
Các công trình nghiên cứu trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng sự phá vỡ mối

liên kết α-1,4 của pectin có thể tiến hành bằng con đường phi thủy phân. Kết quả
sự phá vỡ này là tạo thành các acid galacturonic monomer không no (acid 4-dioxi5xetongalacturonic). Các enzym xúc tác phản ứng này được gọi

tên là

transeliminase (lyase)

Hình 5: Sự phân hủy pectin bởi enzym pecticlyase
Enzym pectintranseliminase phá vỡ liên kết không no của acid digalacturonic, bắt
đầu từ đầu khử của mạch acid polygalacturonic. Khi ấy xảy ra quá trình thủy phân
pectin nhưng không thủy phân tới cùng. Enzym không thủy phân pectin kết hợp mà
trực tiếp xúc tác làm đứt mạch các cơ chất pectin bằng cơ chế transeliminase hóa
tạo pectin hòa tan trong nước
a. Pectintranseliminase (PTE): Là những enzym tác dụng trên pectin và acid
pectinic. Các enzym này có tên hệ thống là poly α-1,4 galacturonicmethylesteglucanolyase.

- 16 -


Endopectintranseliminase : Làm đứt mạch không trật tự liên kết α-1,4 D
galacturonit trong pectin, với sự tạo thành nối đôi
b. Polygalacturonatranseliminase (PGTE): Là những enzym tác dụng trên acid
pectinic và acid pectic. Các enzym này có tên hệ thống là poly α-1,4 D
galacturonicglucanolyase. Các enzym này chia thành hai nhóm:
* Endoenzym: với cơ chế tác dụng không theo trật tự, làm đứt mạch phân tử
polygalacturonic ở các vị trí khác nhau trong nội mạch với sự tạo thành
galacturonic không no và oligogalacturonic
* Exoenzym : làm đứt mạch không trật tự liên kết α-1,4 - D galacturonit trong
pectat, trong galacturonit với sự tạo thành Δ -4,5 degalacturonic acid.
Bảng 4 :Tính chất của enzym polygalacturonatlyase [19]

Vi sinh vật
B. circulans I
B. circulans II
B. subtilis I
B. subtilis II
Bacillus sp.RK9
B.stearothermophilus
Erwinia aroideae
Erwinia carotovora
Pseudomonas fluorescens
Streptomyces nitrosporeus

Khối lượng phân
tử
70.000
18.000
33.000
49.000
24.000
37.000
42.300
41.000

PH opt

PI

10
9,5

8,5
8,0
10
9,0
9,1
8,5
9,4
10

9,85
10,3
4,6

4 PECTINASE CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI SINH VẬT VÀ CÁC ĐIỀU KIỆN
SINH TỔNG HP ENZYM
4.1 Enzym pectinase có nguồn gốc từ vi sinh vật:[17]
Nấm mốc, vi khuẩn, nấm men đều có khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase
4.1.1 Nấm mốc: Các loài nấm mốc sau đây tổng hợp pectinase với hàm lượng cao
Pen. glaucum, Pen. chrlichi, Asp. awamori, Asp. foetidus, Asp. niger, Asp. Terrus

- 17 -


, Asp. saitoi... Các loài nấm mốc khác nhau thường sinh tổng hợp các kiểu enzym
pectinase không giống nhau như Asp. niger thường chủ yếu tạo ra enzym
pectinesterase, ngược lại Pen. Citrimim và Asp. cangestris lại không tạo ra được
enzym này. Asp.fonseanes tạo ra enzym pectintranseliminase. Pen. Citrimim
thường tạo ra enzym polygalacturonase.
4.1.2 Vi khuẩn: Các loài vi khuẩn sau đây sinh tổng hợp nhiều enzym pectinase:
Erwinia caralovora, Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Bacillus

felseneus. Các vi khuẩn Erwinia carotovora, Bacillus polymyxa, Flavobacterium
pectinovorum thường tạo ra enzym pectinhydrolase.
4.1.3 Nấm men: Sacharomyces fragilis chỉ tạo ra được một enzym phân giải duy
nhất là enzym endopolygalacturonase.
Hầu hết các vi sinh vật sinh tổng hợp enzym pectinase thuộc các loài hiếu khí song
gần đây, người ta đã tìm ra được một số vi sinh vật vốn là yếm khí nghiêm ngặt
nhưng lại có khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase
Bảng 5: Khả năng sinh tổng hợp các loại enzym pectinase ở vi sinh vật
(Rombouts & pilnik)[21]
Vi sinh vật
Nấm mốc
Aspergilius niger
Penicillium
Fusarium
Rhizopus
Sclerotinia
Collecotrichum
Nấm men
Kluyverromyces
Vi khuẩn
Bacillus polymyxa
Clostridium
Erwinia
Pseudomonas

PE

++
+
+

+
+

PG
Endo
Exo
++
+
+
++
+
+

PAL
Endo
Exo

++

PL
Endo
+
+

+

+
+

++

+++
+
+

- 18 -

+

+++
+++

+
+

+