SEMINAR xác ĐỊNH các CHẤT CHUYỂN hóa BẰNG kỹ THUẬT UPLCQTOF MS TRONG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG 4 sản PHẨM CHẾ BIẾN từ NHÂN sâm sắc ký HIỆN đại

ỨNG DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆN ĐẠI
XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA BẰNG KỸ
THUẬT UPLC/QTOF-MS TRONG ĐÁNH GIÁ
CHẤT LƯỢNG 4 SẢN PHẨM CHẾ BIẾN TỪ
NHÂN SÂM


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việc đánh giá chất lượng sâm chế biến có vai trị rất quan trọng
(thực phẩm và dược phẩm)
Kỹ thuật đánh giá: UPLC/Đầu dò khối phổ (MS/MS)
(UPLC-QTOF/MS)

Phương pháp xác định chất chuyển hóa

Phương pháp phân tích
- PCA (Phân tích thành phần chính)
- S-plot

Đối tượng:
- Hồng sâm
- Bạch sâm
- Hắc sâm
- Sâm Taegeuk

3


01

Tổng quan

02

Trang thiết bị và phương pháp

03

Kết quả

04

Bàn luận

05

Kết luận

4


1. TỔNG QUAN
Các phương pháp chế biến sâm

01

02
03

Bạch sâm
Phơi nhân sâm tươi dưới

ánh sáng mặt trời.

Sâm Taegeuk

Đun nóng sâm tươi ở nhiệt
độ 80-95 oC trong 20−25
phút trước khi sấy khô.

03

04

Hồng sâm
Hấp ở 95−100 oC trong
2−3 h, sau đó là loại nước.

Hắc sâm
Hấp WG trong chín chu kỳ ở
95−100 oC, trong 2−3 h.

5


1. TỔNG QUAN
Các phương pháp chế biến sâm

6


1. TỔNG QUAN

Sau chế biến, thành phần chất chuyển hóa sẽ có sự thay đổi

Định tính, định lượng:
Có sự khác nhau

Tác động dược lý:
Khác nhau (BG > WG và RG)

Do đó, điều quan trọng là cần phải đánh giá mức độ
Ginsenosid để kiểm soát chất lượng.
7


1. TỔNG QUAN
Các phương pháp áp dụng trong phân tích

Đầu dò UV

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
NMR

HPLC

Đầu dò tán xạ bay hơi (ELSD)
Khối phổ (MS)

Hiện nay, UPLC/QTOF-MS: Chế độ quét tồn bộ => Hiệu quả để tìm kiếm
và hồ sơ hóa các Ginsenosid, các chất chuyển hóa khác nhau trong hỗn
hợp phức tạp.
8

1. TỔNG QUAN
Các phân tích đa biến được sử dụng

PCA

Cho biết bất kỳ sự khác biệt
nào tồn tại giữa các mẫu

OPLS-DA

Xác định hợp chất đã được
chuyển hóa

Cách tiếp cận các chất chuyển hóa được xây dựng tốt kết hợp với các phân tích
đa biến sẽ hữu ích cho việc đánh giá chất lượng của các chế phẩm nhân sâm
khác, chẳng hạn như TG và BG (trước đây ít được nghiên cứu).
9


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dung mơi hóa chất

Các chất chuẩn

Dùng cho HPLC

Ginsenosid

Nước
Acetonitril
Methanol
Acid Formic

Tự phân lập

Chế phẩm nhân sâm

WG
RG
TG
BG

10


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị mẫu: Rễ chính và rễ bên có đường kính tương đồng trung
bình lần lượt là 2,1- 2,5 cm và 0,6 -1,1 cm. Rễ con được loại bỏ.

Lọc (0,22 µm)

Rễ đã xử lý

Nghiền mẫu < 0,5 mm

Ly
MeOH 70%

(200mg/ 2ml)

Máy trộn
Đồng nhất hóa mẫu

Easy to change
colors, photos and
Text. You can simply
tâm(13500
rpm)
impress your
audience and add a
unique zing and
appeal to your
Presentations.

Siêu âm 30 phút (50 oC)

11


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Điều kiện chạy UPLC

Máy: Waters ACQUITY H-Class UPLC
(Waters Corp, Milford, MA, USA)  

Tốc độ dòng: : 0,4 ml/phút

Nhiệt độ buồng cột, mẫu

Duy trì ở mức 40 và 4°C.

Cột: là ACQUITY BEH C18
(2,1 mm × 100 mm, 1,7 µm)

Pha động

Thể tích bơm mẫu: 2 µl

Dung mơi A: nước: acid formic (0,1% v/v)
Dung môi B: acetonitril: acid formic (0,1%, v/v)

12


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Chương trình rửa giải Gradient
Thời gian (phút)

Dung môi A (%)

Dung môi B (%)

0-0,5

85

15

1

80

20

6

80

20

13

70

30

23

65

35

24

62

38

27

40

60

31

10

90

32

85

15

35

85

15

13


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Mẫu sau khi được phân tách
bằng UPLC được dẫn qua

đầu dò quang phổ khối
Waters Xevo G2-S QTOF MS
(Waters Corp, Milford, MA,
USA). Dữ liệu MS có độ
chính xác cao được thu thập
từ m/z 100-2500 Da ở chế
độ ion âm.

Độ chính xác của LC / MS
được xác định bởi hệ số
biến thiên (CV) cho RT
(0,1%) và cường độ peak
(7,9%).

14


2.TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP

UNify 1.8
(Waters Corp Milford, MA, USA)
Cường độ của mỗi ion được
chuẩn hóa bằng các giá trị RT,
m/z và diện tích pic, các phần
tích điện, adduct ion và các mảnh
vỡ được tự động căn chỉnh
nhóm lại.

Dữ liệu được tập trung vào trung bình và áp
vào biểu đồ Pareto trước PCA, OPLS-DA

Dữ liệu ba chiều, bao gồm số cực đại
(cặp RT-m / z), diện tích pic đã chuẩn
hóa và tên mẫu, sau đó được xuất
sang phần mềm EZinfo 3.0.3
(UMETRICS) để phân tích đa biến
như PCA và OPLS-DA.

15


3. KẾT QUẢ
Hồ sơ hóa các chất chuyển hóa của các sản phẩm nhân sâm chế biến
bằng UPLC-QTOF / MS

WG,TG,
RG,BG

Methanol 70%

Dịch chiết chứa
Ginsenosid

UPLC-QTOF/MS
Chế độ: Quét ion âm

UPLC tách hiệu quả các chất chuyển hóa khác nhau trong 30 phút.
Các cường độ của một số đỉnh khác nhau tùy thuộc vào
các mẫu riêng biệt.
16

3. KẾT QUẢ
Hồ sơ hóa các chất chuyển hóa của các sản phẩm nhân sâm chế biến
bằng UPLC-QTOF / MS

Sắc kí đồ thể hiện
Cường độ đỉnh nền (BPI) trên sắc ký của các chất chuyển hóa khác nhau
(A) bạch sâm, (B) sâm Tae-geuk, (C) hồng sâm và (D) hắc sâm
17


3. KẾT QUẢ
Phân tích đa biến để phân biệt 4 chế phẩm nhân sâm

UPLC-QTOF/MS
Mỗi tập dữ liệu đã được xử lý với
phần mềm UNIFY.

Hồ sơ chuyển hóa
WG (n = 10)
TG (n = 10)
RG (n = 10)
BG (n = 10)

PCA

Trực quan hóa các xu
hướng phân cụm trong
cả bốn sản phẩm.

18


3. KẾT QUẢ
Phân tích đa biến để phân biệt bốn chế phẩm nhân sâm

Biểu đồ điểm phân tích thành phần chính (PCA) và (B) biểu đồ tải của tập dữ liệu
chuyển hóa của 4 chế phẩm từ nhâm sâm. Trong sơ đồ tải PCA, mỗi điểm được xác
định như sau: ginsenosid (a) Rg3, (b) Rg5, (c) Rk1, (d) Rd, (e) RC, (f) Rb2, (g) Rb1,
(h) Rg1, (i) Re, (j) M-RC, (k) M-Rb2, và (l) M-Rb1. R2X [1] = 0,9443 và
R2X [2] = 0,02803.
19


3. KẾT QUẢ
Phân tích đa biến để phân biệt bốn chế phẩm nhân sâm

OPLS-DA đã được thực hiện để phân biệt TG với RG, TG với BG
và RG với BG, theo thứ tự lần lượt.
Phân tích S-plot đã được thực hiện để chọn các biến quan trọng góp phần phân
biệt chúng. Trong S-plot, mỗi điểm cho thấy các cặp m/z-RT của mỗi phân tử.

20


3. KẾT QUẢ
Phân tích đa biến để phân biệt bốn chế phẩm nhân sâm

S-plot của (A) bạch sâm (WG) với sâm Tae-geuk (TG) (R2:96%, Q2:92%)
(B) WG với hồng sâm (RG) (R2:95%, Q2:92%)

(C) WG với hắc sâm (BG) (R2:94%, Q2:91%)
21


3. KẾT QUẢ
Định lượng Ginsenosid khác nhau từ 4 chế phẩm nhân sâm

Hàm lượng của 39 ginsenosid từ 4 sản
phẩm chế biến từ P. ginseng: bạch sâm,
sâm Tae-geuk, hồng sâm, và hắc sâm.
Đơn vị mg/g.

22


4. BÀN LUẬN
PP sử dụng: pp chuyển hóa (metabolomics) dựa trên UPLC-QTOF/MS
Phân tích dữ liệu: PCA và OPLS-DA

PCA: dùng để tách nhóm (vd
trong bài này là tách mẫu
khác hồn tồn các mẫu cịn
lại), các mẫu có thành phần
chất chuyển hóa tương tự
được phân tán gần nhau,
trong khi những mẫu có chất
chuyển hóa khác nhau được
tách ra.

OPLS-DA: khi khơng tách mẫu bằng PCA

được, so sánh 2 mẫu không quá khác biệt.
Trong S-plot, các điểm của các chất chuyển
hóa đóng góp rất lớn đến phương sai giữa
2 nhóm, được vẽ ở xa hơn dọc theo trục x
và trục y.

23


4.BÀN LUẬN

1

2

Nghiên cứu đã
chứng minh được:
Thành phần và
hàm lượng chất
chuyển hóa trong
các loại nhân sâm
khác nhau do q
trình chế biến.

Dựa vào S-plot, đã xác định các
thành phần đặc trưng, thường có mặt
trong bốn sản phẩm nhân sâm, như
sau:
WG (M-Rb1, M-Rb2, M-Rc, Re, Rg1),
TG (Rb2, Rc, Rd, Re,Rg1, các hợp

chất chưa biết), RG (Rb1, Rb2, Rc,
Rd, Re, Rg1) và BG (Rd, Rk1, Rg5,
Rg3).

24


5. KẾT LUẬN
1
Nghiên cứu này đã
chứng minh sự tiện ích của
phương pháp chuyển hóa
cho đánh giá chất lượng
và kiểm sốt các sản phẩm
nhân sâm chế biến.

2
Trong tương lai, phương pháp này
có thể dùng để đánh giá các sản
phẩm nhân sâm chế biến được sản
xuất khơng chỉ từ rễ, mà cịn các bộ
phận khác chẳng hạn như lá, thân và
quả.

25


TÀI LIỆU THAM KHẢO
• Lee, J.W.; Ji, S.-H.; Choi, B.-R.; Choi, D.J.; Lee, Y.-G.; Kim, H.-G.; Kim, G.-S.;
Kim, K.; Lee, Y.-H.; Baek, N.-I.; Lee, D.Y. (2018), “UPLC-QTOF/MS-Based

Metabolomics Applied for the Quality Evaluation of Four Processed Panax
. ginseng Products”, Molecules, 23, 2062.
• Wiklund, S. (2008), “Multivariate Data Analysis for Omics”.
• Moco, S., Bino, R. J., Vos, R. C. H. De, & Vervoort, J. (2007), “Metabolomics
technologies and metabolite identification”, TrAC Trends in Analytical
Chemistry, 26(9).

26