Nghiên cứu công nghệ sản xuất isomaltulose từ đường mía

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

ĐỖ THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ISOMALTULOSE
TỪ ĐƯỜNG MÍA
LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
Chun ngành : Cơng nghệ Thực phẩm

HÀ NỘI-2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
---------------------------------------

ĐỖ THỊ YẾN

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ISOMALTULOSE
TỪ ĐƯỜNG MÍA
Chun ngành : Cơng nghệ Thực phẩm

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
NGƯỜI HƯỚNG DẪN:
1. PGS. Vũ Nguyên Thành
2. PGS. Nguyễn Thanh Hằng

HÀ NỘI – 2019

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn tốt nghiệp đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất
isomaltulose từ đường mía” là cơng trình nghiên cứu của tơi. Tơi cũng xin cam đoan
rằng những phần sử dụng tài liệu tham khảo trong luận văn đã được nêu rõ trong
phần tài liệu tham khảo. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hoàn toàn
trung thực và chưa được các tác giả khác công bố.
Hà Nội, Ngày

tháng

Học viên

ĐỖ THỊ YẾN

i

năm 2019.


LỜI CÁM ƠN
Luận văn được tiến hành dưới sự hỗ trợ của đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản
xuất enzyme sucrose isomerase tái tổ hợp và ứng dụng trong công nghiệp chế biến
isomaltulose từ đường mía”, mã số: ĐT.04.2016/CNSHCB.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng cám ơn sâu sắc tới PGS. Vũ Nguyên Thành và
PGS. Nguyễn Thanh Hằng đã hướng dẫn, giúp đỡ, tạo điều kiện và dạy bảo tận tình
cho tơi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thiện luận văn.
Bên cạnh đó, tơi cũng đã nhận được sự ủng hộ nhiệt tình và các ý kiến đóng
góp của các thành viên tham gia thực hiện đề tài cũng như các cán bộ trong Trung
tâm Vi sinh vật Công nghiệp,Viện Công nghiệp Thực phẩm; các thầy cô, bạn bè ở

Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Trường ĐHBK Hà Nội trong quá trình học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cám ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ở bên cạnh chia sẻ, động viên giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tơi học tập,
nghiên cứu và hồn thiện luận văn của mình.
Mặc dù tơi đã có nhiều cố gắng hồn thiện luận văn bằng sự nhiệt tình và
năng lực của mình, tuy nhiên khơng thể tránh khỏi nhiều thiếu sót. Rất mong nhận
được những đóng góp của quý thầy cơ và các bạn để tơi có thể hồn thiện luận văn
được tốt hơn.
Tôi xin chân thành cám ơn!

ii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Các ký hiệu,
các chữ viết tắt

Diễn giải

ĐC

Đối chứng

OD

Mật độ quang

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

QCVN

Quy chuẩn Việt Nam

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TN

Thí nghiệm

Và cs.

Và cộng sự

WHO

Tổ chức y tế thế giới

iii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN .......................................................................................................... ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................... iii
MỤC LỤC ............................................................................................................... iv

DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH .............................................................................................. viii
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................1
Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
1.1. Đường Isomaltulose ...........................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm của đường isomaltulose ..................................................................3
1.1.2. Tính chất vật lí, hóa học. .................................................................................5
1.1.3. Công dụng của đường isomaltulose. ...............................................................7
1.2. Các phương pháp tổng hợp đường isomaltulose..............................................10
1.2.1. Đường isomaltulose trong tự nhiên ...............................................................10
1.2.2. Tổng hợp đường isolatulose bằng phương pháp hóa học .............................10
1.2.3. Chuyển gen isomaltulose synthase vào cây trồng (sử dụng cây trồng biến
đổi gen) ....................................................................................................................10
1.2.4. Tổng hợp đường isomaltulose từ đường mía ................................................11
1.3. Phương pháp thu hồi dịch chuyển hóa isomaltulose ........................................11
1.4. Tình hình sản xuất isomaltulose trên thế giới và ở Việt Nam .........................12
1.4.1. Xu thế phát triển trên thế giới .......................................................................12
1.4.2. Xu thế phát triển ở Việt Nam ........................................................................13
1.4.3. Sử dụng vi sinh vật để sản xuất isomaltulose tại Viện Công nghiệp Thực
phẩm ........................................................................................................................14
1.4.4. Chủng Pichia pastoris X33-SI36.15. .............................................................16
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................19
2.1. Vật liệu .............................................................................................................19
2.1.1. Chủng giống ..................................................................................................19
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................19

iv


2.1.3. Thành phần các môi trường dùng trong nghiên cứu .....................................19

2.1.4. Máy móc thiết bị ...........................................................................................20
2.2. Phương pháp.....................................................................................................21
2.2.1. Ni cấy vi sinh vật.......................................................................................21
2.2.2.1. Nhân giống .................................................................................................21
2.2.2.2. Chuyển hóa đường mía thành isomaltulose ...............................................21
2.2.2. Nghiên cứu thành phần môi trường chuyển hóa đường mía thành
isomaltulose.............................................................................................................21
2.2.3. Nghiên cứu điều kiện chuyển hóa đường mía thành isomaltulose ...............21
2.2.3.1. Nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau ..........................................................21
2.2.3.2. Nhiệt độ chuyển hóa khác nhau .................................................................22
2.2.3.3. pH chuyển hóa khác nhau ..........................................................................22
2.2.3.4. Thời gian chuyển hóa .................................................................................22
2.2.4. Điều kiện thu hồi và làm sạch dịch đường thô..............................................23
2.2.4.1. Thu dịch đường isomaltulose .....................................................................23
2.2.4.2. Làm sạch dung dịch đường isomaltulose ...................................................23
2.3. Các phương pháp phân tích ..............................................................................24
2.3.1. Phương pháp xác định đường khử bằng DNS ..............................................24
2.3.2. Phương pháp phân tích bằng hệ thống HPLC ...............................................27
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...............................................................29
3.1. Nghiên cứu thành phần mơi trường chuyển hóa đường mía thành isomaltulose
.................................................................................................................................29
3.2. Nghiên cứu các điều kiện chuyển hóa đường mía thành isomaltulose. ...........30
3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ đường ban đầu .......................................................30
3.2.2. Nhiệt độ chuyển hóa đường mía thành isomaltulose ....................................31
3.2.3. pH chuyển hóa đường mía thành isomaltulose .............................................32
3.2.4 Thời gian chuyển hóa đường mía thành isomaltulose ..................................33
3.3. Nghiên cứu điều kiện kết tinh và thu hồi sản phẩm .........................................34
3.4. Xây dựng quy trình cơng nghệ sản xuất isomaltulose trên thiết bị lên men 2 lít..35
Chương 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................39

v


4.1. Kết luận ............................................................................................................39
4.2. Kiến nghị ..........................................................................................................39
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................40
PHỤ LỤC 1 – HỆ THỐNG THIẾT BỊ ...................................................................44
PHỤ LỤC 2 – CHỦNG GIỐNG .............................................................................46
PHỤ LỤC 3 – QUY TRÌNH SẢN XUẤT ISMALTULOSE .................................47

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Các tính chất hóa lý và sinh học của isomaltulose (Wanmeng et al., 2014)
...................................................................................................................7
Bảng 2.1. Pha nồng độ đường chuẩn isomaltulose ...................................................26
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ các thành phần dinh dưỡng tới hiệu suất chuyển
hóa đường mía thành isomaltulose bởi chủng nấm men tái tổ hợp Pichia
pastoris X33-SI36.15. ..............................................................................29

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa của đường mía dưới tác dụng của đường mía
isomerase . .................................................................................................4
Hình 1.2. Phản ứng thủy phân và đồng phân hóa đường mía khi được xúc tác bởi
sucrose isomerase ......................................................................................5
Hình 2.1. Dịch đường trước xử lý và sau khi xử lý than hoạt tính. Hình A - Dịch

đường sau khi chuyển hóa. Hình B - Dịch đường được trộn với than hoạt
tính. Hình C - Dịch đường sau khi xử lý than và lọc trong. ....................24
Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới hiệu suất chuyển hóa đường mía
thành isomaltulose bởi chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33SI36.15. ....................................................................................................30
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất chuyển hóa đường mía thành
isomaltulose bởi chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33-SI36.15.
.................................................................................................................31
Hình 3.4. Đồ thị thời gian chuyển hóa đường mía thành isomaltulose bởi chủng
nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33-SI36.15 trên thiết bị lên men 2
Lít .............................................................................................................33
Hình 3.5. Khả năng kết tinh isomaltulose ở các nồng độ 40%, 50%, 60%, 70% (A:
thời điểm 0h, B: thời điểm sau 24h) ........................................................35
Hình 3.6. Các thơng số kỹ thuật ảnh hưởng tới hiệu suất chuyển hóa sản phẩm
đường isomaltulose trên thiết bị lên men 2 Lít ........................................36

viii


MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng đường mía bằng một loại đường
khác ngày càng gia tăng do những ảnh hưởng không tốt của nó tới sức khỏe con
người như: góp phần gây béo phì, sâu răng, tiểu đường và lỗng xương.
Isomaltulose là một đồng phân của đường mía và được sản xuất từ đường mía thơng
qua chuyển hóa enzyme trong đó liên kết 1,2-glycosid giữa glucose và fructose
được thay thế bằng liên kết 1,6-glycosid. Isomaltulose có tính chất vật lí và cảm
quan gần giống với đường mía và có giá trị năng lượng như đường mía.
Isomaltulose được đánh giá là một sự thay thế hợp lí cho đường mía bởi rất nhiều
ưu điểm [20]: (i) Không gây sâu răng do các liên cầu khuẩn trong răng miệng khơng
có khả năng sử dụng isomaltulose; (ii) Được cơ thể tiêu hoá và hấp thụ chậm hơn

rất nhiều so với đường mía, gây ra ảnh hưởng không đáng kể tới nồng độ đường và
insulin trong máu; (iii) Không bị lên men bởi phần lớn các vi khuẩn và nấm men,
bền trong acid và invertase, không hút ẩm, do vậy thực phẩm chứa isomaltulose bền
và ổn định hơn. Gần đây người ta đã chứng minh rằng isomaltulose còn tốt cho
chức năng của não, tăng bộ nhớ. Trong thiên nhiên, isomaltulose có lẽ đóng vai trị
giúp vật chủ cạnh tranh giành nguồn dinh dưỡng với các vi sinh vật khác trong môi
trường giàu sucrose bởi phần lớn vi sinh vật khơng có khả năng sử dụng
isomaltulose.
Hiện nay, isomaltulose đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm
và dược phẩm. Đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập đoàn Südzucker
của Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu. Ngoài ra, Cerestar
(thuộc tập đoàn Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công ty lớn sản xuất
isomaltulose. Isomaltulose công nghiệp được sản xuất từ đường mía qua phản ứng
đồng phân hố bởi enzyme sucrose isomerase . Cơng nghệ sản xuất isomaltulose
phổ biến nhất hiện nay trên thế giới là sử dụng tế bào cố định của Protaminobacter
rubrum.

1


Lịch sử nghiên cứu
Luận văn được thực hiện do sự hỗ trợ của đề tài “Nghiên cứu công nghệ sản
xuất enzyme sucrose isomerase tái tổ hợp và ứng dụng trong cơng nghiệp chế biến
isomaltulose từ đường mía” Mã số đề tài (ĐT.04.2016/CNSHCB) trong thời gian từ
1.2016 đến 12.2018.
Mục đích:
Việc chuyển hóa đường mía thành isomaltulose với giá trị cao (gấp 10 lần so
với nguyên liệu ban đầu) sẽ tạo giá trị gia tăng cho sản xuất nông nghiệp, cung cấp
sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước và xuất khẩu. Xuất phát từ mục tiêu đó, đề
tài đã xác định các yếu tố công nghệ phù hợp cho việc chuyển hóa đường mía thành

isomaltulose và thu hồi, tinh chế sản phẩm isomaltulose tạo được.
Đối tượng:
Trong nghiên cứu này, chủng nấm men tái tổ hợp Pichia pastoris X33SI36.15 được chọn để lên men chuyển hóa đồng thời có hiệu suất chuyển hóa
đường mía thành isomaltulose đạt được trong khoảng 85 ÷ 95%.
Phạm vi nghiên cứu:
Quy trình sản xuất thử nghiệm trên qui mô pilot được nghiên cứu và xây
dựng dựa trên kết quả từ mơ hình thiết bị lên men 2 Lít.

2


Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đường Isomaltulose
1.1.1. Đặc điểm của đường isomaltulose
Đường mía thường được sử dụng để sản xuất bánh kẹo và đồ uống. Tuy
nhiên, loại chất ngọt này, nếu được ăn nhiều lại gây sâu răng, ảnh hưởng không tốt
tới sức đề kháng của cơ thể, làm tăng nguy cơ mắc bệnh béo phì, tiểu đường, loãng
xương và bệnh tim. Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng đường mía bằng một
loại đường khác ngày càng gia tăng do những ảnh hưởng không tốt của nó tới sức
khoẻ con người. Chính vì vậy mà nhiều nước trên thế giới chẳng hạn như Mỹ,
Trung Quốc, Nhật Bản... đã nghiên cứu và sản xuất các loại chất ngọt thế hệ mới,
khắc phục nhược điểm nói trên của đường mía. Đường chức năng là một bộ phận
quan trọng trong nhóm thực phẩm chức năng, được tập trung nghiên cứu nhiều
trong những năm gần đây do có nhiều đặc tính có lợi cho sức khỏe như chống sâu
răng, chống bệnh tiểu đường, khơng gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động
của hệ tiêu hóa v.v... Các loại đường chức năng mới xuất hiện là: đường palatinose,
maltitol, sorbitol, lactitol, fructo-oligosacarit, xylo-oligosacarit, galacto-oligosacarit
izomalto-oligosacarít, soybean-oligosacarit, v.v...
Isomaltulose (6-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructose), với các tên thương mại
là Palatinose, NRGylose hoặc Xtend là một đồng phân của đường mía và được sản

xuất từ đường mía thơng qua chuyển hóa sử dụng enzyme sucrose isomerase trong
đó liên kết 1,2-glycosid giữa glucose và fructose được thay thế bằng liên kết 1,6glycosid.

3


Sucrose (α1-β2) (khơng khử)

Isomaltulose (α1-6) (đường khử)

OH
HO

OH

HO

OH

1

O

OH

2

OH

O

Sucrose

6

O
OH

OH

isomerase

O
OH

[glucose]

[fructose]

O

1 6

HO

OH

[glucose]

O

HO

O
1

[fructose]

Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa của đường mía dưới tác dụng của sucrose isomerase .
Isomaltulose bị thủy phân thành glucose và fructose trong hệ tiêu hóa, kết
quả tạo thành glucose và fructose sau đó được hấp thụ và chuyển hóa cùng một cách
như glucose và fructose có nguồn gốc từ các nguồn khác như đường mía. Do đó,
isomaltulose khơng gây ra tác dụng phụ nào nguy hiểm đối với con người và động
vật. Isomaltose được ứng dụng, không chỉ trong ngành công nghiệp thực phẩm,
chẳng hạn như trong các loại thực phẩm bánh kẹo, cơng nghiệp chế biến trái cây,
rau quả đóng hộp, đồ uống mà còn là một thành phần trong mỹ phẩm, và thuốc
men. Isomaltulose được đánh giá là một sự thay thế hợp lí cho đường mía bởi rất
nhiều ưu điểm [20]:
- Không gây sâu răng do các liên cầu khuẩn trong răng miệng khơng có
khả năng sử dụng isomaltulose
- Được cơ thể tiêu hoá và hấp thụ chậm hơn rất nhiều so với đường
mía, gây ra ảnh hưởng không đáng kể tới nồng độ đường và insulin trong máu
- Không bị lên men bởi phần lớn các vi khuẩn và nấm men, bền trong
acid và invertase, tính chất này có lợi cho việc duy trì độ ngọt trong thực phẩm
lên men và đồ uống
- Không hút ẩm như đường mía và lactose, do vậy thực phẩm chứa
isomaltulose bền và ổn định hơn
- Kích thích sự phát triển của bifidobacteria có ích trong hệ vi thực vật
của ruột người
- Gần đây người ta đã chứng minh rằng isomaltulose còn tốt cho chức

năng của não, tăng bộ nhớ (sản phẩm sữa cho trẻ em có chứa isomaltulose đang
được Cơng ty Cơ gái Hà Lan quảng bá rộng rãi với tính năng này).

4


1.1.2. Tính chất vật lí, hóa học.
Isomaltulose
CAS: 13718-94-0
Cơng thức phân tử: C12H22O11·H2O
Khối lượng phân tử: 360.3
Nhiệt độ nóng chảy: 123÷124 °C
Biểu hiện bên ngồi: Tinh thể trắng

Tên hóa học của isomaltulose là 6-O-α-D-glucopyranosyl-D-fructofuranose
(CAS. No. 13718-94-0). Nó là một đồng phân của đường mía và bao gồm Dglucose và D-fructose được liên kết bởi liên kết glycosidic α-1,6, khác với liên kết
glycosid trong đường mía, liên kết α-1,2 (Hình 1.2).

Hình 1.2. Phản ứng thủy phân và đồng phân hóa đường mía khi được xúc tác bởi
sucrose isomerase

5


Các tính chất hóa lý và sinh học của isomaltulose được thể hiện trong bảng
1.1. Độ nhớt của dung dịch nước isomaltulose và đường mía là tương tự nhau. Khả
năng hòa tan của isomaltulose là 29% (20°C; dung dịch nước) và nhiệt độ nóng
chảy thấp (120÷128°C) so với đường mía (160÷185°C)[25].

6

Bảng 1.1.Các tính chất hóa lý và sinh học của isomaltulose (Wanmeng et al., 2014)
Đặc điểm

Giá trị

Chemical family

Carbohydrate, disaccharide, isomer of sucrose

CAS No.

13718-94-0

Cơng thức hóa học

C12H22O11

Khối lượng phân tử

342,30 g/mol

Dạng

chất rắn tinh thể màu trắng

Mùi

Khơng mùi

Nhiệt độ nóng chảy

123÷124oC

Nhiệt độ chuyển pha

62oC

Hoạt động quang học

[α]20/D=+85o (c=1.9, H2O)

Độ tan

20% w/w ở 20oC

Độ ngọt

50% so với đường mía ở nồng độ 10% (w/w)

Năng lượng riêng

4 kcal/g

Phản ứng Maillard

Có

Độc tố

Khơng
So với đường mía, isomaltulose ổn định hơn trong phản ứng thủy phân với
xúc tác của axit. Isomaltulose (dung dịch 10%) ổn định trong hơn 30 phút khi được
ủ tại pH 1.0 ở nhiệt độ 95°C, trong khi đường mía (dung dịch 10%) gần như bị thủy
phân hoàn toàn trong cùng điều kiện. Ngoài ra, isomaltulose cho thấy ít caramel hóa
trong q trình xử lý nhiệt hơn đường mía, vì nhiệt độ nóng chảy thấp hơn và độ ổn
định cao hơn của liên kết glycosid [25]. Do đặc tính của đường khử, isomaltulose
tham gia vào các phản ứng hóa nâu Maillard. Giống như đường mía, nó được tiêu
hóa hồn tồn và cung cấp cùng một giá trị calo khoảng 4 kcal/g.
1.1.3. Công dụng của đường isomaltulose.
Trong dinh dưỡng, isomaltulose là một nguồn thực phẩm cung cấp năng
lượng. Nó cung cấp một lượng năng lượng tương tự như đường mía. Năng lượng từ
isomaltulose và đường mía được sử dụng để thúc đẩy các hoạt động thể chất, tinh
thần, sinh lý và trao đổi chất. Bằng cách giải phóng nhiệt trong q trình cung cấp

7


nhiên liệu, đường mía và isomaltulose giúp giữ ấm cơ thể. Trong thực phẩm, cả
isomaltulose và đường mía đều là chất ngọt, tuy nhiên isomaltulose ít ngọt hơn
đường mía. Trong chế biến và công nghệ chế biến thực phẩm, cả isomaltulose và
đường mía đều có đặc điểm tương tự nhau cho phép các cơng thức sử dụng đường
mía có thể sử dụng isomaltulose thay thế hoặc có thể sử dụng cùng nhau [20].
Nguồn carbon cho cơ thể
Isomaltulose là một loại carbohydrate như đường mía và hầu hết các loại
đường khác hoặc maltodextrin. Khi có mặt trong thực phẩm và đồ uống, isomaltulose
được tiêu hóa và hấp thụ hồn tồn. Nó được tiêu hóa trên thành ruột liên quan đến
enzyme isomaltulose, nằm ở bề mặt của lớp mao mạch trên thành trong của ruột non.
Enzyme này có liên quan đến việc các liên kết α-1,6 có trong tinh bột. Các sản phẩm
của isomaltulose là glucose và fructose, được hấp thụ và đi vào máu. Sau khi được

hấp thụ, glucose và fructose theo cùng một quá trình trao đổi chất qua cơ thể giống
như chúng có nguồn gốc từ đường mía [20]. Điều này dẫn đến việc cung cấp năng
lượng cân bằng và kéo dài hơn dưới dạng glucose.
Isomaltulose không gây ung thư và có chỉ số đường huyết thấp bằng cách
giảm tốc độ monosacarit và insulin được giải phóng trong máu, thúc đẩy sử dụng
cho bệnh nhân tiểu đường [20].
Cung cấp nguồn năng lượng
Dựa trên nhiệt tỏa ra khi đốt cháy hoàn toàn isomaltulose trong oxy thành
carbon dioxide và nước, và phân loại là nguồn carbohydrate [14], năng lượng thực
phẩm của isomaltulose giống hệt với đường mía.
Hạ đường huyết và đáp ứng insulin
Về lâu dài khi ăn chế độ ăn kiêng bao gồm carbohydrate, giảm nồng độ
glucose cao trong máu và nhu cầu insulin liên quan, hỗ trợ phòng ngừa và kiểm soát
bệnh đái tháo đường, bệnh tim mạch, thừa cân và béo phì. Theo dõi liên tục nồng độ
glucose trong máu 24 giờ sau chế độ ăn kiêng bao gồm isomaltulose thay vì đường
mía làm giảm chỉ số đường huyết trong ngày [32]. Vì cho thấy cung cấp glucose
trong máu ổn định ở mức đường huyết thấp và tương ứng với cấu hình insulin, việc

8


uống isomaltulose có liên quan đến sự oxy hóa chất béo được cải thiện so với
carbohydrate thực phẩm thông thường. Như vậy, isomaltulose có thể làm tăng
lượng chất béo được sử dụng như năng lượng và do đó giúp ngăn ngừa tăng cân và
sức đề kháng. Một số nghiên cứu cung cấp bằng chứng về sự cải thiện cả về kiểm
sốt đường huyết và chuyển hóa lipid ở cả bệnh nhân tiểu đường và người không
mắc bệnh tiểu đường khi tiêu thụ isomaltulose thường xuyên khi so sánh với các
carbohydrate khác như đường mía, maltodextrin hoặc glucose [11].
Ảnh hưởng đến q trình oxy hóa chất béo
Khi so sánh với các carbohydrate ăn vào khác, việc ăn isomaltulose liên quan

đến tốc độ oxy hóa chất béo cao hơn và tỷ lệ lưu trữ chất béo thấp hơn. Về mặt cơ
học, điều này liên quan đến nồng độ glucose trong máu thấp hơn, sau đó cung cấp
sự kích thích thấp hơn đến việc tiết insulin, từ đó cho phép nhiều axit béo được giải
phóng từ mơ mỡ để oxy hóa như một nguồn năng lượng. Nồng độ insulin thấp hơn
cũng làm giảm tốc độ tái chế axit béo tự do của gan thông qua triglyceride huyết
tương và làm giảm việc lưu trữ triglyceride trong mô mỡ. Ý nghĩa thực tế dường
như là một số, tỷ lệ oxy hóa chất béo xảy ra sau isomaltulose cao hơn so với sau khi
ăn carbohydrate đường huyết cao hơn trong nhiều nghiên cứu, tuy nhiên các nghiên
cứu có các tiêu điểm khác nhau [30].
Tăng hiệu suất nhận thức
Carbonhydrate bằng glucose mà isomaltulose cung cấp có thể cải thiện hiệu
suất nhận thức (tâm trạng và trí nhớ). Một số nghiên cứu so sánh isomaltulose với
carbohydrate glycemia cao hơn được thực hiện vào bữa sáng cho thấy sự cải thiện
về tâm trạng và trí nhớ ở trẻ em khỏe mạnh, người trung niên và người cao tuổi.
Sức khỏe răng miệng
Ngày nay, nhu cầu thay thế đường mía bằng một loại đường khác đang tăng
lên do những tác động tiêu cực của nó đối với sức khỏe con người như: góp phần
gây béo phì, sâu răng, tiểu đường và lỗng xương. Isomaltulose là một đồng phân
của đường mía và được sản xuất từ đường mía thơng qua sucrose isomerase trong
đó liên kết 1, 2-glycosid giữa glucose và fructose được thay thế bằng liên kết 1, 6-

9


glycosid. Isomaltulose được coi là một thay thế phù hợp cho đường mía vì nhiều lợi
ích của nó như: Khơng gây sâu răng do streptococci đường uống không thể sử dụng
isomaltulose; tiêu hóa và hấp thu chậm hơn nhiều so với đường mía; gây ra tác dụng
khơng đáng kể đối với lượng đường trong máu và insulin; không được lên men bởi
hầu hết các vi khuẩn và nấm men, kháng axit và invertase, khơng hút ẩm, do đó
thức ăn có isomaltulose ổn định hơn. Gần đây người ta đã chứng minh rằng

isomaltulose cũng tốt cho chức năng não, tăng trí nhớ.
1.2. Các phương pháp tổng hợp đường isomaltulose
1.2.1. Đường isomaltulose trong tự nhiên
Isomaltulose tồn tại với số lượng cực nhỏ trong tự nhiên, chúng chủ yếu tồn
tại với một số lượng rất nhỏ trong mật ong và nước mía (D-glucopyranosyl-1, 6fructose) tuy nhiên chúng chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ rất khó để chiết tách [4] .
1.2.2. Tổng hợp đường isolatulose bằng phương pháp hóa học
Tổng hợp đường isomaltulose thơng thường bằng 2 cách là hóa học và sử
dụng các phương pháp bằng enzyme. Phương pháp hóa học ln đi kèm với sự hình
thành của một số sản phẩm phụ nhất định và có màu nâu, làm tăng khó khăn trong
việc cách ly và tinh chế sản phẩm; hơn nữa, những khó khăn này làm tăng chi phí
sản xuất và tiêu thụ năng lượng.
1.2.3. Chuyển gen isomaltulose synthase vào cây trồng (sử dụng cây trồng biến
đổi gen)
Việc phát triển mạnh mẽ của công nghệ chuyển gen đã mở ra hướng mới
trong việc sản xuất đường isomaltulose số lượng lớn với chi phí sản xuất rẻ hơn.
Trong nhưng năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu tách gen isomaltulose (IM)
synthase từ các vi sinh vật sau đó được chuyển vào cây trồng nhằm mục đích
chuyển hóa tạo ra đường isomaltulose. Nm 2002, Frederik Boărnke v cng s ó
tỏch c gene palI từ vi khuẩn Erwinia rhapontici, chuyển và biểu hiện thành
cơng trên cây khoai tây, nồng độ đường có trong khoai tây đạt 15 µmol/g trong
lượng tươi [4] . Năm 2012 Shiromani W và cộng sự đã công bố kết quả cho thấy,
trong cây mía chuyển gen tổng hợp đường gen isomaltulose tới 33% trong tổng số

10


lượng đường có trong cây mía chuyển gen. Các cây trồng được chuyển gen tổng
hợp isomaltulose (IM) đã tăng đáng kể lượng đường có trong cây, tuy nhiên hiện
nay cây trồng biến đổi gen vẫn còn nhiều tranh cãi về việc tác động của nó đến mơi
trường tự nhiên, và sức khỏe con người [24].

1.2.4. Tổng hợp đường isomaltulose từ đường mía
Sucrose isomerase (EC 5.4.99.11), cịn được biết đến như là isomaltulose
synthase, sucrose α-glucosyltransferase và trehalulose synthase, nó là xúc tác cho sự
sắp xếp lại liên kết α-1,2 giữa glucose và fructose (tạo ra isomaltulose) hoặc liên kết
α-1,4 (tạo ra trehalulose) (Hình 1.1). Ngồi ra, nó cũng thủy phân đường mía để tạo
ra một lượng nhỏ monosacarit glucose và fructose. Trehalulose cũng được khuyên
dùng như một loại thay thế đường mía, tự nhiên hiện diện với số lượng nhỏ trong
mật ong [19]. Đường này hòa tan rất tốt trong nước và có 70% độ ngọt của đường
mía; tuy nhiên, nó có đặc tính tương tự isomaltulose, khơng gây ung thư và cho thấy
tốc độ giải phóng monosacarit chậm vào máu [21], làm cho nó đặc biệt hữu ích
trong các thực phẩm có độ ngọt cao như thạch và mứt.
1.3. Phương pháp thu hồi dịch chuyển hóa isomaltulose
Phương pháp ly tâm dịch chuyển hóa
Tiến hành ly tâm ở 4000×g trong 30 phút, 4°C sử dụng thiết bị ly tâm
Avanti JE của Beckmancoulter – Mỹ hoặc hệ thống máy ly tâm liên tục Clara-20
của hãng sản xuất Thụy Điển tốc độ 9000 vòng/ phút để loại bỏ sinh khối và thu
dịch enzyme thô.
Dịch sau ly tâm nếu không được chuyển sang bước tiếp theo trong vòng lâu
hơn 8h cần được gia nhiệt 100℃ sau đó hạ lạnh và bảo quản ở 4-10℃. Trước khi
chuyển sang bước tiếp theo nâng nhiệt tới 25℃ hoặc nhiệt độ phòng.
Phương pháp xử lý bằng than hoạt tính
Dịch đường thu được sau q trình chuyển hóa ngồi thành phần chính là
isomaltulose cịn có chứa các thành phần phụ khác như lượng muối được cho vào
trong quá trình nuôi cấy, lượng nhỏ protein, cao nấm men, thành phần tạp nhiễm từ
xác tế bào vi khuẩn, chất mầu… Do đó, trước khi kết tinh, cần làm sạch dung dịch

11


đường thô. Để loại bỏ các thành phần protein, axit amin, màu của dịch đường và các

sản phẩm phụ được sinh ra trong q trình chuyển hóa
1.4. Tình hình sản xuất isomaltulose trên thế giới và ở Việt Nam
1.4.1. Xu thế phát triển trên thế giới
Hiện nay nhu cầu thay thế việc sử dụng đường mía bằng một loại đường
khác ngày càng gia tăng do những ảnh hưởng không tốt của nó tới sức khỏe con
người. Đường isomaltulose được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm và
dược phẩm. Nhu cầu sử dụng isomaltulose ước tính khoảng 3.000 tấn/năm. Đường
isomaltulose thay thế đường mía trong cơng nghiệp đã có từ lâu ở những nước như
Mỹ, Pháp, Nhật Bản... Isomaltulose được sử dụng trong nhiều sản phẩm khác nhau
như kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo cao su, các sản phẩm bọc đường, chocolate, bánh,
mứt, kem, các thức uống dạng bột... Công ty Südzucker đã thành công trong việc
tạo cây chuyển gen có khả năng sản xuất trực tiếp isomaltulose. Cơng nghệ này
được bảo hộ bởi patent WO/2002/027003 [17]. Tuy nhiên, hiện nay sản xuất
isomaltulose ứng dụng thực vật biến đổi gen vẫn chưa được thực hiện đại trà.
Isomaltulose cũng đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm và
dược phẩm. Đi đầu trong sản xuất những sản phẩm này là tập đoàn Südzucker của
Đức cũng là nhà sản xuất đường lớn nhất của châu Âu, thương hiệu Palatinit®, với 2
sản phẩm là Palatinose™ (kẹo cao su, nước tăng lực, bột dinh dưỡng, bánh quy,
chocolate, kem…)

và

galenIQ™ (dược). Ngoài ra Cerestar (thuộc tập đoàn

Cargill) và Shin Mitsui (Nhật) cũng là các công ty lớn sản xuất các chế phẩm của
isomaltulose. Isomaltulose cơng nghiệp được sản xuất từ đường mía qua phản ứng
đồng phân hố bởi enzyme sucrose isomerase. Cơng nghệ sản xuất isomaltulose phổ
biến nhất hiện nay mà các công ty trên cũng như thế giới đang sử dụng là cố định tế
bào hoặc enzyme vi sinh vật.
Trong quy trình của cơng ty Cerestar, để sản xuất isomaltulose, ngun liệu

đường mía (chất lượng thực phẩm) được hòa trong nước và xử lý bằng xúc tác sinh
học thu nhận từ tế bào bất hoạt của P.rubrum. Trước phản ứng, tế bào của chủng
P.rubrum được bất hoạt (giết) bởi formaldehyde. Lượng enzyme cần thiết cho phản

12


ứng là 4,500 IU/kg đường mía, tương đương với khoảng 4.1012 tế bào/kg đường
mía. Sau khi chuyển hóa hồn tất, sinh khối P. rubrum được loại bỏ bằng phương
pháp lọc. Dịch isomaltulose thơ sau đó được tinh chế qua các bước loại muối, kết
tinh và rửa. Sản phẩm sau khi sấy khơ và làm nguội có độ tinh khiết trên 99%.
1.4.2. Xu thế phát triển ở Việt Nam
Xu thế về nhu cầu thực phẩm ở Việt Nam đang hòa nhập vào trào lưu chung
của thế giới. Hiện nay trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại sản phẩm ứng dụng
đường chức năng nhằm giảm béo phì, chống sâu răng, thực phẩm ăn kiêng cho
người mắc bệnh tiểu đường… Phần lớn những sản phẩm này được nhập từ Thái
Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc… Tuy nhiên, một số sản phẩm nghiên cứu
phát triển bởi các cơ sở nghiên cứu trong nước cũng bắt đầu xuất hiện trên thị
trường. Công ty sữa Cô gái Hà Lan đã cho ra mắt dạng sữa cho trẻ em có bổ trợ
đường isomaltulose. Là một sản phẩm thay thế hợp lý cho đường mía, thị trường
isomaltulose dự kiến sẽ phát triển mạnh trong thời gian tới. Hiện tại chưa có một
nhà máy đường nào tại Việt Nam có cơng nghệ sản xuất isomaltulose và tồn bộ
lượng isomaltulose tiêu thụ trong thị trường là sản phẩm nhập khẩu.
Việt Nam là một trong những quốc gia có nguồn ngun liệu đường mía dồi
dào. Việc chuyển hóa đường mía thành isomaltulose với giá trị cao (gấp 10 lần so
với nguyên liệu ban đầu) sẽ tạo giá trị gia tăng cho sản xuất nông nghiệp, cung cấp
sản phẩm phục vụ tiêu dùng trong nước và xuất khẩu.
Trong các năm 2010-2011, nhóm nghiên cứu tại Viện Cơng nghiệp Thực
phẩm đã tiến hành phân loại dựa trên giải trình tự 16S rADN cho thấy các chủng có
khả năng sinh tổng hợp isomaltulose thuộc các loài Klebsiella variicola,

Enterobacter cloacae, Klebsiella sp., Enterobacter sp. Trong đó, Klebsiella
variicola và Enterobacter cloacae cho tới nay chưa được công bố và các chủng sinh
tổng hợp isomaltuloza phân lập được tại Việt Nam là mới về khả năng sinh tổng
hợp isomaltuloza [1].
Công nghệ sản xuất isomaltulose phổ biến nhất hiện nay mà các công ty trên
cũng như thế giới đang sử dụng là cố định tế bào hoặc enzym vi sinh vật. Trong đó,

13


cố định tế bào vi sinh vật trong chất mang được sử dụng trực tiếp. Công nghệ này
đã được triển khai trong sản xuất công nghiệp tại nhiều nước trên thế giới. Tuy
nhiên, hướng đi này có một số khó khăn là hiệu suất chuyển hóa chưa cao, khó cải
thiện và vi sinh vật sử dụng là vi sinh vật đường ruột không thân thiện với môi
trường, sản phẩm cần phải tinh chế kỹ lưỡng để loại bỏ tạp chất do vi sinh vật
đường ruột sinh ra. Do vậy, trong thời gian gần đây xu hướng sản xuất isomaltulose
ứng dụng enzym tái tổ hợp được quan tâm nhiều hơn. Năm 2011, Lee và CS đã biểu
hiện thành công gen mã hóa sucroza isomerase từ chủng vi khuẩn Enterobacter sp.
FMB-1 trên nấm men Saccharomyces cerevisiae [18]. Tuy nhiên hệ biểu hiện này
đồng thời có khả năng sinh tổng hợp invertase là enzym thủy phân đường mía thành
glucose và fructose, các loại đường mà nấm men có thể sử dụng dễ dàng. Quá trình
này sẽ làm giảm đáng kể hiệu suất chuyển hóa đường mía thành isomaltulose.
Do đó, các nghiên cứu tìm kiếm hệ biểu hiện gen mã hóa sucrose isomerase
tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn khác có khả năng chuyển hóa tốt đường mía
thành isomaltulose và hạn chế được việc sinh tổng hợp các enzym thủy phân đường
mía làm ảnh hưởng đến hiệu suất chuyển hóa này vẫn đang thu hút sự quan tâm của
các nhà khoa học trên thế giới.
1.4.3. Sử dụng vi sinh vật để sản xuất isomaltulose tại Viện Cơng nghiệp Thực
phẩm
Hiện nay có hai hướng công nghệ sản xuất isomaltulose theo phương pháp vi

sinh. Với hướng thứ nhất, tế bào vi sinh vật cố định trong chất mang được sử dụng
trực tiếp. Công nghệ này đã được triển khai trong sản xuất công nghiệp tại nhiều
nước trên thế giới. Tuy nhiên, hướng đi này có một số khó khăn là hiệu suất chuyển
hóa chưa cao, khó cải thiện và vi sinh vật sử dụng là vi sinh vật đường ruột không
thân thiện với môi trường, sản phẩm cần phải tinh chế kỹ lưỡng để loại bỏ tạp chất
do vi sinh vật đường ruột sinh ra. Do vậy, trong thời gian gần đây xu hướng sản
xuất isomaltulose ứng dụng enzyme tái tổ hợp được quan tâm nhiều hơn. Công
nghệ cho phép sản xuất enzyme trên vật chủ an tồn và hiệu quả hơn. Đặc tính của

14


enzyme cũng có thể được cải thiện nhờ thay đổi cấu trúc. Enzyme tái tổ hợp có thể
hiện nội bào, ngoại bào hoặc cố định trên thành tế bào tùy theo lựa chọn công nghệ.
Dựa trên những kết quả nghiên cứu thăm dị nhóm đề tài lựa chọn việc phát
triển công nghệ theo hướng tạo chủng tái tổ hợp bởi enzyme tái tổ hợp dễ tinh chế
hơn. So với công nghệ cố định tế bào, sản phẩm sau chuyển hóa khơng địi hỏi
nhiều cơng đoạn làm sạch và điều này cũng phù hợp hơn với khả năng công nghệ
của các nhà máy đường tại Việt Nam. Ứng dụng enzyme tái tổ hợp trong sản xuất
isomaltulose sẽ làm giảm giá thành sản xuất và đảm bảo khả năng cạnh tranh của
sản phẩm trong nước. Pichia pastoris là chủng nấm men được sử dụng phổ biến
trong lên men sản xuất enzyme tái tổ hợp. Trước đây, nhóm nghiên cứu chúng tơi đã
thành công với những đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme phytase tái tổ
hợp nấm men”, mã số ĐT.05.10/CNSHCB và “Nghiên cứu công nghệ sản xuất
xylanase tái tổ hợp và ứng dụng để sản xuất thức ăn chăn nuôi”, mã số
ĐT.03.14/CNSHCB. Kết quả cho thấy chủng Pichia pastoris có khả năng lên men tốt
nhất trong điều kiện nhiệt độ 28°C, nồng độ oxy hòa tan trên 10%, cấp giống ban đầu
10%. Trong quá trình lên men cần khuấy trộn và sục khí để đảm bảo duy trì đủ nồng
độ oxy hịa tan. Q trình tăng sinh khối và phát triển mạnh nhất sau 8h cấp giống.
Tuy nhiên công nghệ sản xuất isomaltulose bằng enzyme tái tổ hợp cũng có

một số điểm khơng mong muốn như: cần có phương án bảo quản, lưu trữ enzyme
để duy trì hoạt tính khi chưa chuyển sang quy trình chuyển hóa đường mía; thời
gian sản xuất rất dài do quá trình lên men biểu hiện enzyme tái tổ hợp thường cần
khoảng 7÷10 ngày; hệ thống promoter AOX1 được sử dụng để biểu hiện enzyme tái
tổ hợp trên nấm men Pichia pastoris tiềm ẩn nguy cơ nhiễm sản phẩm phụ
formaldehyde – chất gây độc cho sức khỏe con người. Do vậy, hướng nghiên cứu
mới cũng được tiến hành song song để khắc phục các yếu điểm này đó là sử dụng
hệ thống promoter GAP để biểu hiện enzyme sucrose isomerase trên nấm men
Pichia pastoris. Ưu điểm của công nghệ này là sử dụng trực tiếp tế bào nấm men
Pichia pastoris tái tổ hợp làm tác nhân chuyển hóa đường mía, hoạt tính enzyme sẽ
khơng bị ảnh hưởng do q trình biểu hiện và chuyển hóa diễn ra đồng thời, thời
gian sản xuất cũng được rút ngắn rất nhiều chỉ cịn 1÷2 ngày, chất cảm ứng của quá

15