Nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tổng hợp ISOFLAVONE ở giá đỗ đậu tương

bộ giáo dục và đào tạo
trường đại học bách khoa hà nội

------------------------------

luận văn thạc sỹ khoa học

Ngành : công nghệ sinh học

nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến
quá trình tổng hợp isoflavone
ở giá đỗ đậu tưƠng

DươnG TH Thanh Tịnh

hà nội 2006


bộ giáo dục và đào tạo
trường đại học bách khoa hà nội

----------------------------

luận văn thạc sỹ khoa học

nghiên cứu sự biểu hiện của các gen liên quan đến
quá trình tổng hợp isoflavone
ở giá đỗ đậu tưƠng
Ngành : công nghệ sinh học

Dương tHỊ Thanh TÞnh

Ng­êi h­íng dÉn khoa häc : TS. L£ QUANG HOµ

hµ néi 2006


-1-

Luận văn thạc sỹ

LỜI MỞ ĐẦU
Isoflavone là hợp chất chỉ được tìm thấy trong thực vật. Chúng
cũng là một loại phytoestrogen hay cịn gọi là hormon thực vật, có cấu trúc hoá
học tương tự estrogen ở người. Bằng việc bắt chước estrogen ở những vị trí xác
định trong cở thể người, isoflavone mang lại những lợi ích về sức khoẻ giúp con
người tránh được bệnh tật. Isoflavone được tìm thấy trong đậu tương, đậu xanh
và những loài họ đậu khác. Tuy nhiên đậu tương đáng được chú ý nhất vì chúng
có hàm lượng cao nhất, đặc biệt là genistein và daidzein [34].
Với mong muốn xác định được giai đoạn phát triển của cây đậu tương cho
hàm lượng isoflavone cao nhất, đồng thời xác định được sự biểu hiện của các
gen trong quá trình sinh tổng hợp isoflavone với hai hợp chất cụ thể là genistein
và daidzein từ đối tượng là giá đậu tương mới nảy mầm, chúng tôi tiến hành thí
nghiệm:
 Tách chiết và định lượng hỗn hợp isoflavone từ giá đậu
tương mới nảy mầm.
 Nghiên cứu sự biểu hiện của các gen mục tiêu trong con đường
sinh tổng hợp isoflavone ở giá đậu tương.
• Phenylalanine ammonia lyase
• Cinnamic acid 4 – hydroxylase
• 4 coumarate: CoA ligase

• Chalcone synthase
• Chalcone reductase
• Chalcone isomerase
• Isoflavone synthase

Dương Thị Thanh Tịnh


-2-

Luận văn thạc sỹ

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU
MỤC LỤC
Danh Mục Các Ký Hiệu Viết Tắt

5

Danh Mục Các Bảng và Biểu Đồ

6

Danh Mục Các Hình Vẽ Đồ Thị

7

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

8

1.1.Hợp chất flavonoid trong tự nhiên

8

1.2.Phân loại flavonoid

9

1.3. Hợp chất Isoflavone

10

1.4. Các isoflavone trong đậu tương:

13

1.5.Tính chất vật lý của isoflavone

15

1.6.Tính chất hố học của isoflavone

16

1.7. Những lợi ích sức khoẻ mà isoflavone mang lại

17

1.7.1. Hoạt tính chống ung thư

18

1.7.2. Hoạt tính sinh học

19

1.7.3. Các hoạt tính khác

21

1.8. Q trình tổng hợp isoflavone ở đậu tương

22

1.9. Các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp isoflavone

25

1.9.1. Chalcone synthase

26

1.9.2. Chalcone isomerase

26

1.9.3. Chalcone reductase

27

1.9.4. Enzym chủ chốt isoflavone synthase

28

1.9.4.1. Sự phát hiện ra isoflavone synthase (IFS)

28

1.9.4.2. Phương thức hoạt động của IFS

29

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

-3-

1.10. Kỹ thuật trao đổi chất cho sự tích luỹ isoflavone ở cây họ đậu

31

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

36

2.1. Đối tượng nghiên cứu

36

2.2. Nguyên liệu

36

2.3. Hoá chất và dụng cụ2.4. Phương pháp nghiên cứu

36

2.4.1. Xác định độ ẩm của nguyên liệu

36

2.4.2. Phương pháp tạo giá đỗ

37

2.4.3. Tách chiết hỗn hợp isoflavone

38

2.4.4. Định tính và định lượng hỗn hợp isoflavone

39

2.4.5. Xác định các gen biểu hiện chu trình tổng hợp isoflavone

40

2.4.5.1. Tách chiết RNA tổng số

40

2.4.5.2. Phương pháp định lượng RNA bằng quang phổ kế

41

2.4.5.3. Điện di kiểm tra sản phẩm

41

2.4.5.4. Tinh sạch RNA bằng kit của Promega

42

2.4.5.5. Xác định sự có mặt của các gen biểu hiện trong chu trình tổng

42

hợp isoflavone bằng phương pháp RT – PCR
2.4.5.6. Điện di sản phẩm kiểm tra sự biểu hiện của các gen

44

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

46

3.1 Hàm lượng isoflavone trong giá đậu tương ở các giai đoạn phát triển

46

khác nhau
3.2 Kết quả định lượng RNA

54

3.3. Xử lý Dnase

57

3.4. Nghiên cứu biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình tổng

57

hợp isoflavone trong thân giá đậu tương:
3.4.1. Sự biểu hiện của gen PEPC

58

3.4.2. Sự biểu hiện của gen PAL

59

Dương Thị Thanh Tịnh


-4-

Luận văn thạc sỹ

3.4.3. Sự biểu hiện của gen C4H

60

3.4.4. Sự biểu hiện của gen 4CL

61

3.4.5. Sự biểu hiện của gen CHS

62

3.4.6. Sự biểu hiện của gen CHR

63

3.4.7 Sự biểu hiện của gen CHI

65

3.4.8 Sự biểu hiện của gen IFS

67

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

70

DANH MỤC CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO

72

PHỤ LỤC

76

Dương Thị Thanh Tịnh


-5-

Luận văn thạc sỹ

DANH MỤC CÁC K Ý HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CHI: chalcone isomerase
CHR: chalcone reductase
CHS: chalcone synthase
C4H: cinnamic acid 4 – hydroxylase
dNTP: Deoxy Nucleotid Triphosphat
DFR: dihydroflavonol reductase
EDTA: Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid
EtBr: Ethidium Bromide
F3H: flavanone 3 – hydroxylase
HDL: height density lipid (lipid tốt)
IFS: isoflavone synthase
LDL: low density lipid (lipid xấu)
LDOX: leucoanthocyanidin dioxygenase
M MLV: Moloney Murine Leukemia Virus Rever Transcripetase.

PAL: phenylalanine ammonia lyase
RT PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
TAE: Tris – Acetate - EDTA
TE: Tris – EDTA
2- HIS: 2- hydroxyisoflavone synthase
4CL: 4 coumarate: CoA ligase

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

-6-

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ
• Bảng 1.1 Hàm lượng isoflavone trong những lồi họ đậu
• Bảng 3.1 Hàm lượng isoflavone trong thân giá và hạt giá của
giá đậu tương VX93 ủ ở 25 0 C. Xác định bằng HPLC.
P

P

• Bảng 3.2 Hàm lượng isoflavone trong thân giá và hạt giá của
giá đậu tương VX93 ủ ở 35 0 C. Xác định bằng HPLC.
P

P

• Bảng 3.3 Hàm lượng isoflavone trong thân giá và
hạt giá trong mẫu đã nghiền của giá đậu tương VX93 ủ ở 25 0 C

P

P

• Bảng 3.4 Hàm lượng isoflavone trong thân giá và
hạt giá trong mẫu đã nghiền của giá đậu tương VX93 ủ ở 35 0 C
P

P

• Bảng 3.5. Hàm lượng isoflavone trong thân giá
của giá đậu tương VX93 ủ ở 25 0 C và 35 0 C
P

P

P

P

• Bảng 3.6. Kiểm tra độ tinh sạch RNA

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

-7-

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Tên và cơng thức hố học của các isoflavone đậu tương
Hình 1.2. Con đường phelylpropanoid.
Hình 2.1. Hệ thống sắc ký lỏng cao áp
Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số
Hình 3.2. Sự biểu hiện gen của mẫu sau khi xử lý DNA
Hình 3.3. Sự biểu hiện của gen cấu trúc PEPC
Hình 3.4. Sự biểu hiện của gen PAL
Hình 3.5. Sự biểu hiện của gen C4H
Hình 3.6. Sự biểu hiện của gen 4CL1_2
Hình 3.7. Sự biểu hiện của gen 4CL 3_4
Hình 3.8. Sự biểu hiện của gen CHS
Hình 3.9. Sự biểu hiện của gen CHR NCBI
Hình 3.10.Sự biểu hiện của gen CHR TIGR
Hình 3.11. Sự biểu hiện của gen CHI 2
Hình 3.12. Sự biểu hiện của gen CHI1A
Hình 3.13. Sự biểu hiện của gen CHI1B2
Hình 3.14. Sự biểu hiện của gen IFS 1
Hình 3.15. Sự biểu hiện của gen IFS 2
Biểu đồ 3.1 Hàm lượng daizein và genistein trung bình của
các mẫu thân giá
Biểu đồ 3.2 Hàm lượng isoflavone tổng số trung bình của
các mẫu thân giá

Dương Thị Thanh Tịnh


-8-

Luận văn thạc sỹ

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 Hợp chất flavonoid trong tự nhiên
Flavonoid là những hợp chất phenol thực vật có chứa 15 nguyên tử cacbon
trong phân tử. Người ta cũng có thể coi flavonoid là dẫn xuất của croman và
cromon thuộc nhóm phenyl propan vì chúng có chứa khung cacbon C 6 - C 3
R

R

R

R

(trong đó, anthocyanin, leucoanthocyanin, catechin là dẫn xuất của croman, còn

các hợp chất còn lại trong đó có isoflavone đều là sản phẩm ngưng tụ của
cromon với một nhóm phenol ngoại) [12]:

Flavonoid là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên, tạo màu cho hoa, quả, cành và
lá cây. Flavon cho màu vàng, anthocyanin cho màu tím trong mơi trường trung
tính, màu đỏ trong mơi trường axit, hoặc màu xanh trong môi trường kiềm.
Các flavonoid thường tồn tại trong tự nhiên dưới dạng monome, rất ít khi gặp
các polyme của chúng. Hơn nữa, các monome này thường liên kết với các gốc
đường qua liên kết glucosit, phần lớn là các loại đường đơn giản như glucoza,
fructoza, đôi khi liên kết với cả các disaccarit và một số oligosaccarit. Khi
monome liên kết với đường thì ta gọi là glycosit flavonoid, cịn khi monome
đứng độc lập thì gọi là aglycon. Như vậy, sự đa dạng của flavonoid là do sự khác
nhau của các nhóm đường và khả năng liên kết của chúng vào các vị trí khác

Dương Thị Thanh Tịnh

-9-

Luận văn thạc sỹ

nhau của phân tử ban đầu. Đường có thể khác nhau do độ lớn của vịng oxy, cấu
hình các liên kết glycosit và thứ tự liên kết giữa chúng.
Trên thế giới, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 5000 loại flavonoid khác
nhau. Tuy nhiên, mới chỉ có khoảng 1000 chất được nghiên cứu một cách đầy
đủ. Ở Việt Nam đã phát hiện được trên 200 hợp chất flavonoid có trong gần 100
họ thực vật. Ví dụ: catechin và galocatechin có trong lá chè, rutin trong hoa hoè
(Styphnolobium japonicum L.Schott), puerarin trong sắn dây (Pueraria montana
(Lour.) Merr.), gencyanin trong quả mơ (Prunus armeniaca), crizin trong gỗ của
cây tùng hương (Pinus massoniana)…[6].
Flavonoid giữ nhiều vai trò quan trọng trong q trình sinh trưởng của thực
vật. Khơng đơn thuần là yếu tố tạo màu hấp dẫn cho hoa, quả, hợp chất này cịn
có tác dụng giúp các lồi thực vật bậc cao kháng lại sự tấn công của vi sinh vật,
tạo một hàng rào bảo vệ hữu hiệu cho cây cỏ. Đối với con người, flavonoid chứa
nhiều hợp chất có lợi cho việc tăng cường và bảo vệ sức khoẻ (tanin, isoflavone,
rutin…). Vì thế, tuy đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về flavonoid, nhóm hợp
chất này vẫn tiếp tục thu hút sự chú ý của các nhà khoa học.
1.2. Phân loại isoflavonoid

Dương Thị Thanh Tịnh


- 10 -

Luận văn thạc sỹ

1.3. Hợp chất isoflavone
Isoflavone là một dưới nhóm của flavonoid, có cấu trúc cơ bản gồm gốc
phenol đính vào vị trí số 3 trên phân tử cromon . Riêng nhóm isoflavone đã gồm
hơn 600 hợp chất khác nhau [18]. Nhiều hợp chất trong số này đã được nghiên
cứu về tính chất cũng như tác dụng. Mỗi loại thực vật đặc trưng bởi một hoặc
một số isoflavon nhất định. Ví du: daidzein và puerarin trong sắn dây, rotenoid
trong hạt của loài Lonchocarpus salvadorensis, cristacarpin từ Erythrina
abyssinica,…

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

- 11 -

Isoflavone là nhóm trao đổi chất thứ cấp diphenolic được chiếc xuất từ một số
lượng hạn chế thực vật bậc cao. Mặc dầu có ít nhất 22 họ thực vật sản xuất và
tổng hợp isoflavone nhưng hầu hết là được tìm thấy ở họ Papilionoideae [23].
Trong hầu hết các loại họ đậu ăn được thì đậu tương chứa hàm lượng
isoflavone cao nhất (bảng 1.1), cao hơn 100 lần so với những loại họ đậu khác.
Bảng 1.1. Hàm lượng isoflavone trong những loài họ đậu [23]
Họ đậu

Đậu
Kidney

Isoflavone

TL tham

Họ

Isoflavone

TL tham

(mg/100 g)

khảo

đậu

(mg/100 g)

khảo

Mazur et
0.06

al
(1998)

Franke et al
Đậu
phộng

0.26

Đậu Pinto

0.21

0.27

Franke et al

al (1995),

Đậu Hà

Mazur et

lan

2.42

Franke et

Franke et al

al (1995),

Đậu

Mazur et

Pigeon

al
(1998)

Chickpeas

0.1

Mazur et al
(1998)

Mazur et
0.03

(1995),

al (1998)

0.56

al (1998)

Đậu Broad

Mazur et al
(1998)

Franke et
Đậu Navy

(1995),

Franke et

(1995),
Mazur et al
(1998)

Đậu
tương
Hàn

144.99

Quốc
Đậu

118.51

Franke et al

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

- 12 -

Cowpeas

0.03

al (1995),

tương

(1995), Wang

Mazur et

Nhật

& Murphy

al (1998)

Bản

(1994a)

Franke et

Đậu

al (1995),

tương

Mazur et

Đài

al (1998)

Loan

Franke et
Lentils

0.10

al (1995),
Mazur et
al (1998)

59.75

(1995)

Franke et al

Đậu

(1995),

tương
Mỹ

Franke et al

128.35

(thực

Mazur et al
(1998), Wang
& Murphy

phẩm)

(1994a,b)
Eldridge &

Franke et
Lima

0.03

al (1995),
Mazur et
al (1998)

Kwolek
Đậu
tương
Mỹ

(1983)
153.40

Franke et al

(1995), Wang
& Murphy
(1994a)

Franke et
Mung

0.19

al (1995),
Mazur et
al (1998)

Dương Thị Thanh Tịnh


- 13 -

Luận văn thạc sỹ

Genistein và daidzein là hai isoflavone phổ biến ở nhiều loài thực vật. Tuy
nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy rằng đậu tương và các sản phẩm từ đậu
tương là nguồn giàu hai hợp chất này nhất. Bên cạnh đó, đậu tương lại là loại
thực phẩm bổ dưỡng cho sức khoẻ con người. Do đó, isoflavone đậu tương đã
thu hút sự chú ý của các nhà khoa học trong mấy thập kỷ trở lại đây [33 ].
1.4. Các isoflavone trong đậu tương
Hình 1.1. Tên và cơng thức hố học của các isoflavone đậu tương [19].

Dương Thị Thanh Tịnh

- 14 -

Luận văn thạc sỹ

Dương Thị Thanh Tịnh


- 15 -

Luận văn thạc sỹ

Hàm lượng của mỗi loại isoflavone trong hạt đậu là rất khác nhau, với tỷ lệ
daidzein : genistein : glycitein là 4: 5: 1(Wang và Murphy, 1994). Hầu hết
isoflavone trong hạt đậu tương kết hợp với đường glucose hoặc đường malonyl ở
vị trí C7. Liên kết đường –acetyl được phát hiện nhưng hầu hết là trong quá trình
xử lý hoặc là lên men những sản phẩm đậu đưa ra giả thuyết chúng là những sản
phẩm phân rã của của những liên kết đường – malonyl (Reinli và Block, 1996).
Giống như nhiều hợp chất flavonoid, những flavones liên kết với nhau được lưu
giữ trong không bào và được cố định bằng enzyme.
1.5. Tính chất vật lý của isoflavone
Các isoflavone có độ hồ tan rất khác nhau. Do phân tử phân cực, nên các
glycosit flavonoid và sulfat flavonoid khơng tan hoặc ít tan trong dung mơi hữu
cơ, tan được trong nước. Ngược lại, các aglycon lại tan trong dung môi hữu cơ

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

- 16 -

mà không tan trong nước. Trong môi trường axit các gốc đường của glucosit
isoflavone sẽ bị phân cắt, cịn trong mơi trường kiềm các gốc acyl dễ bị phân cắt
[20].
Cấu trúc của các flavonoid thường được xác định dựa theo phương pháp
quang phổ tử ngoại. Phương pháp này dựa vào khả năng hấp thụ tia UV của các
hợp chất flavonoid do sự tồn tại của hệ thống nối đôi liên hợp trong phân tử tạo
ra bởi hai vòng benzen và vòng phụ phenol ngưng tụ. Các flavonoid tập trung ở
hai dải hấp thụ có bước sóng là: 320 ÷ 380 nm và 240 ÷ 280 nm [18].
1.6. Tính chất hố học của isoflavone
Nhóm phenol có tính axit, dễ tạo muối tan trong nước với hydroxyt kiềm. Khi
có nhiều nhóm OH trong phân tử và thêm nhóm cacbonyl thì tính axit lại càng
tăng; flavonoid khi đó dễ dàng tan trong các dung dịch bicacbonat natri. Nhóm
hydroxyl phản ứng với NaOH, KOH, NH 4 OH cho màu vàng đặc trưng. Do đó,
R

R

nếu đun flavonoid với dung dịch NaOH đậm đặc thì sẽ xuất hiện hiện tượng mở
vịng tạo dẫn xuất axit thơm [6].
Trong cấu trúc phân tử của một số flavonoid thường có các nhóm hydroxyl
nằm kề nhau, rất dễ dàng nhường hai H + để tạo thành các gốc tự do có ái lực cao
P

P

với các ion kim loại nặng có hố trị hai như Fe, Cu, Zn…
Tuỳ theo số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl, các flavonoid tạo phức
với các muối AlCl 3 , FeCl 3 cho màu lục hoặc màu xanh nâu. Phản ứng này thể

R

R

R

R

hiện rất rõ khi gia nhiệt rau quả trong các thiết bị bằng sắt.
Flavonoid cịn có phản ứng Shinoda đặc trưng của nhóm cacbonyl, phản ứng
diazo hố… cho phép xác định sự có mặt của các hợp chất này trong đối tượng
nghiên cứu.

Dương Thị Thanh Tịnh


- 17 -

Luận văn thạc sỹ

1.7. Những lợi ích sức khoẻ mà isoflavone mang lại
Đậu tương cùng với lúa mì và hai loại hạt kê được xem như là những mùa vụ
không thể thay thế ở Trung Quốc. Trong thế kỷ này ở Trung Quốc đậu tương là
nguồn cung cấp protein chính cho những người ăn kiêng, cùng với sự phát triển
nghành trồng trọt ở Trung Quốc thì đậu tương đã trở thành sản phẩm chủ yếu của
các nước Đông Nam Á. Ngày nay ở những nước này đậu tương được tiêu thụ
dưới những dạng truyền thống như phomat đậu, phomat đậu khô, sữa đậu, bánh
đậu lên men, patê đậu lên men. Mức độ tiêu thụ đậu tương ở Đông Nam Á
khoảng 12 – 16 gram người/ ngày tuỳ thuộc vào đối tượng nghiên cứu. Thậm chí
mức sống đã được cải thiện nhiều hơn trong năm mươi năm qua và protein động

vật đã được sử dụng nhiều hơn, đậu tương vẫn tiếp tục trở thành nguồn thực
phẩm quan trọng [23].
Ngược lại, tại Mỹ thì đậu tương khơng được trồng ở quy mô rộng cho đến
chiến tranh thế giới lần thứ hai, và sau đó chỉ là những kết quả nghiên cứu để
thay thế dầu thực vật. Đậu tương được con người sử dụng rất là hạn chế. Tuy
nhiên trong suốt mười năm qua sự tiêu thụ đậu tương như là một nguồn thức
phẩm đã tăng lên một cách cách đáng kể từ 900 nghìn $ vào đầu năm 1990 tăng
lên ba triêu một trăm nghìn $ vào năm 2100. Ở Bắc Mỹ và Đông Âu protein đậu
được tiêu thụ dưới dạng sữa đậu để thay thế thịt hoặc protein đậu được tách ra và
bổ sung vào các loại thực phẩm.
Trong số những nguyên nhân giải thích việc phát triển thị trường thực phẩm
đậu tương thì sự nhận thức được những lợi ích về sức khoẻ của những sản phẩm
từ đậu hoặc liên quan đến đậu là một trong những nhân tố quan trọng nhất.
Những nghiên cứu dịch tễ học đã phát hiện ra sự khác nhau trong nguyên nhân
gây ra ung thư liên quan đến hocmon giữa những người dân ở miền Đông Á và

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

- 18 -

miền Tây Âu. Ví dụ ung thư vú ở Đông Á thấp hơn gần sáu lần so với ở Mỹ và
ung thư tuyến tuyền liệt thấp hơn gấp mười hai lần, Sự khác biệt này phát sinh
do nhiều nhân tố như di truyền và phong cách sống [27]. Tuy nhiên nhiều nghiên
cứu đưa ra giả thuyết là do sự khác nhau về chế độ ăn uống, đặc biệt là mức độ
tiêu thụ đậu tương. Đặc biệt hơn, một trong những nhân tố duy nhất của đậu
tương mà đóng vai trị quan trọng trong việc mang lại lợi ích sức khoẻ cho con
người là Isoflavone.

1.7.1. Hoạt tính chống ung thư của isoflavone
Trong quy mơ phịng thí nghiệm những dữ liệu về dịch tễ học và động vật
đã thiết lập nên mối quan hệ giữa lượng isoflavone lấy vào và sự xảy ra ung thư
vú, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư ruột kết. Sự kìm hãm tyrosine kinase và
DNA topoisomerase bởi isoflavone đóng góp phần nào trong việc ngăn chặn ung
thư (Messina 1994).
Một thử nghiệm được tiến hành với 100 phụ nữ tình nguyện: lượng
isoflavone đưa vào cơ thể trung bình là 60 - 100 mg/ngày trong thời gian liên tục
6 tháng [12]. Thử nghiệm cho thấy những phụ nữ này có nguy cơ mắc các bệnh
ung thư, đặc biệt là ung thư dạ con thấp hơn hẳn so với đối chứng. Nhiều thử
nghiệm khác cũng đã được tiến hành với cả nam giới và nữ giới, đều khẳng định
vai trò của isoflavone trong việc phòng chống ung thư.
Cơ chế phòng chống bệnh ung thư của hốn hợp các chất này đã dần dần
được sáng tỏ. Cơ chế này dựa trên khả năng tạo gốc tự do của phân tử
isoflavone. Do sự tồn tại của hệ thống nối đôi liên hợp, các phân tử isoflavone dễ
dàng tạo gốc tự do. Các gốc tự do này tương đối bền vững, khi nó thay thế các
gốc tự do hoạt động được tạo ra trong quá trình bệnh lý: OH •, O •, O 2 • … sẽ có
P

P

P

P

R

RP

P

tác dụng làm đứt phản ứng chuỗi, ức chế sự tạo thành các chất độc trong cơ thể.
Quá trình này bắt đầu bằng phản ứng:

Dương Thị Thanh Tịnh


Luận văn thạc sỹ

- 19 -

RO 2 • + ArOH → RO 2 H + ArO •
R

RP

P

R

R

P

Vậy nguyên nhân cơ bản của sự ức chế là sự tạo ra các gốc tự do ArO • ít
P

P

hoạt động hơn, khơng có khả năng tiếp tục phản ứng chuỗi, ngăn cản các gốc tự

do gây bệnh trong các q trình chuyển hố tế bào bình thường thành tế bào ác
tính.
1.7.2 Hoạt tính sinh học của isoflavone
Thời kỳ mãn kinh bắt đầu vào khoảng tuổi 45 – 55, về sinh lý học trong giai
đoạn này cho đến cuối cuộc đời, phụ nữ phải sống trong tình trạng thiếu hụt
estrogen với những biểu hiện mà y học gọi là triệu chứng mãn kinh. Thật ra
estrogen vẫn còn trong cơ thể, nhưng ở mức rất thấp không đủ bảo vệ phụ nữ
khỏi một số bệnh [7].
Khi thiếu estrogen, lượng cholesterol sẽ tăng trong đó LDL(lipid xấu) tăng
nhiều hơn HDL(lipid tốt) và triglycerid tăng kèm theo tăng VLDL (lipid rất xấu)
nên thêm nhiều nguy cơ xơ vữa động mạch. Đối với hệ tim mạch: trong giai
đoạn hoạt động của buồng trứng cịn bình thường, estrogen có tác dụng bảo vệ
người phụ nữ đối với các bệnh mạch vành và mạch máu não, nhờ đó mà phụ nữ
ít bị thiếu máu cơ tim và đột quỵ hơn nam giới. Nguy cơ thuyên tắc mạch sẽ tăng
lên nếu có kèm theo các yếu tố nguy cơ như: nghiện thuốc lá, béo phì, cao huyết
áp. Do estrogen có tác dụng làm chậm sự tiêu xương và tăng tiết calcitonin, nên
thiếu estrogen ở thời mãn kinh, người phụ nữ sẽ bị loãng xương, xương dễ bị gãy
dù va chạm nhẹ, thường gặp nhất là đầu dưới xương cổ tay và đầu trên xương
đùi [23].
Isoflavone, cụ thể là daidzein và genistein, từ lâu đã được coi là
phytoestrogen, một hormon thực vật lý tưởng để thay thế hormon của người

Dương Thị Thanh Tịnh


- 20 -

Luận văn thạc sỹ

trong trường hợp bị thiếu. Sở dĩ hai isoflavone kể trên có tính chất này là do cấu

trúc tương tự giữa chúng với hormon estrogen [22].

Estrogen là loại hormon sinh dục nữ có bản chất steroid, được tổng hợp từ
cholesterol, qua nhiều phản ứng phức tạp, tạo thành dạng phổ biến là estradiol.
Estrogen có nhiều tác dụng sinh lý quan trọng trong cuộc sống của phụ nữ [11] :
- Kích thích phát triển nang buồng trứng.
- Tăng bài tiết dịch nhày ở cổ tử cung
- Kích thích sự tăng trưởng các tuyến của cổ tử cung.
- Tăng cường độ co bóp cần thiết
- Phát triển hệ thống ống dẫn sữa.
- Tăng cường phát triển xương.
Trước, trong và sau thời kỳ mãn kinh, lượng estrogen trong cơ thể biến đổi
bất thường dẫn đến nhiều bệnh nguy hiểm thường gặp trong thời kỳ mãn kinh:
nhức đầu, áp huyết cao, đau thắt ngực, ung thư dạ con, ung thư cổ tử cung, loãng
xương…

Dương Thị Thanh Tịnh


- 21 -

Luận văn thạc sỹ

Isoflavone đậu tương, do có thể kết hợp với các thụ thể của estrogen, có khả
năng thay thế estrogen khi cần, giảm bớt các nguy cơ gây ra do thiếu hụt
estrogen, đồng thời lại có hoạt tính estrogen yếu, giảm bớt lượng estrogen khi dư
thừa, tạo sự cân bằng hormon trong cơ thể.
Liệu pháp thay thế Estrogen bị giảm sút bằng Phytoestrogen là một đường
hướng tích cực, khơng dùng thuốc có hiệu quả cao. Hãy ăn các sản phẩm chế
biến từ đậu nành, mỗi ngày chỉ cần 2-3 cốc sữa đậu nành hoặc vài bìa đậu phụ

thêm vào chế độ ăn hằng ngày là được. Nếu có điều kiện ngâm đậu nành nảy
mầm mà ăn thì tốt hơn nhiều .
1.7.3. .Một số hoạt tính khác của isoflavone
Isoflavone có thể ngăn chặn chứng nghẽn mạch vành tim bằng việc giảm
lipid xấu (LDL) và tăng lipid tốt (HDL).
Năm 1999 cơ quan kiểm soát thực phẩm và thuốc FDA đã phê chuẩn yêu
sách về sức khoẻ như sau: “ Thực đơn hằng ngày phải giảm thấp hàm lượng chất
béo no và cholesterol bằng việc sử dụng 25 gam protein đậu một ngày để giảm
nguy cơ bệnh tim” Việc sử dụng 25 – 59 mg isoflavone / ngày có khả năng làm
giảm 8 % lượng cholesterol trong máu của người trưởng thành. Cung cấp 118
mg isoflavone / ngày, liên tục trong 3 tháng sẽ giảm nguy cơ tắc nghẽn động
mạch ở phụ nữ sau mãn kinh[27] .
Isoflavone có thể có tác động tích cực lên những q trình sinh lý khác
như những hoạt động của hệ thần kinh :
Với những hiểu biết quan trọng của estrogen trong những chức năng của thần
kinh và não, những nghiên cứu bắt đầu từ sự tác động vào cách cư xử ở động vật
và người liên quan đến lượng tiêu thụ isoflavon(Lephart et al ., 2002). Isoflavone
có khả năng kéo dài khả năng nhớ của người già tới 20 -25 năm nếu ở độ tuổi

Dương Thị Thanh Tịnh


- 22 -

Luận văn thạc sỹ

trưởng thành và trung niên trong bữa ăn hằng ngày sử dụng khoảng 70 mg hợp
chất này [27].
1.8. Qúa trình tổng hợp isoflavone ở đậu tương
Isoflavonoids được tổng hợp từ một nhánh của con đường phenylpropanoid.

Đường hướng phenylpropanoid bao gồm rất nhiều nhánh phổ biến với các lồi
thuộc hoặc khơng thuộc họ đậu, tạo ra hàng loạt các hợp chất khác nhau, như
lignan, lignin, flavone, flavonol, tannin (được biết đến như là proanthocyanidin),
và anthocyanin. Bởi vì màu sắc hoa có sức hấp dẫn đối với con người và những
thành phần tạo nên màu sắc đáp ứng được các phép phân tích, nên con đường
phenylpropanoid là con đường trao đổi chất thứ cấp được nghiên cứu nhiều nhất.
Ngày nay những nghiên cứu về sinh hoá và kỹ thuật gen đã phát hiện ra nhiều
bước và những enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp flavonoid [23].
Bắt đầu từ aminoaxit phenylalanine, enzyme phenylalanine ammonia lyase
(PAL) tách nhóm amine từ amino acid và sinh ra axit cinnamic. Bước đầu một
vài cytochrome P450 monooxygenases nằm trong con đường này, axit cinnamic
4- hyđroxylase (C4H) kết hợp với một nhóm hydroxyl tạo thành p- coumarate.
Enzyme 4- coumarate: coenzyme A ligase (4CL) hoạt hố tốt hơn p- coumarate
bởi có sự kết hợp của nhóm CoA ở vị trí cacbon thứ ba. Tiếp theo chacon
synthase (CHS) tiến hành đông tụ p- coumaroyl – CoA với ba phân tử malonyl –
CoA hình thành nên khung flavonoid C15. Trong hầu hết các loài hợp phần này
là naringenin – chalcone (4,2,4,6 ’ - tetrahydroxychalcone). Chalcone được tổng
P

P

hợp bởi CHS có thể được biến đổi thành flavone naringenin (5,7,4 ’ P

P

trihydroxyflavanone) bởi enzyme chalcone isomerase (CHI).
Naringenin là một trong những phần cơ chất giữa con đường flavonoid và
isoflavonoid. Xa hơn nữa sự biến đổi của naringenin đã dẫn đến việc sản xuất ra

Dương Thị Thanh Tịnh

- 23 -

Luận văn thạc sỹ

hàng loạt các hợp chất flavonoid. Những phản ứng phổ biến nhất sử dụng
naringenin như là một cơ chất là việc cộng thêm vào một nhóm hydroxyl ở vị trí
cacbon số 3 tạo thành dihydrokaempferol được xúc tác bởi flavanone 3 –
hydroxylase (F3H)
Hình 1.2. Con đường phenylpropanoid.

Sự thay đổi vị trí C3 là rất cần thiết cho việc sản xuất ra anthocyanins và
tannin, mà cần thiết phải có enzyme dihydroflavonol reductase (DFR),

Dương Thị Thanh Tịnh