Bước đầu nghiên cứu điều kiện sản xuất và xác định khả năng kháng bacillus cereus của muối chitosan acetate

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VÀ
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG BACILLUS CEREUS
CỦA MUỐI CHITOSAN ACETATE
Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Trang Sĩ Trung
Th.S Phạm Thị Đan Phượng
Sinh viên thực hiện:

Hoàng Thị Thùy Trang

Mã số sinh viên:

57130114

Khánh Hòa – 2019


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN SẢN XUẤT VÀ
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG KHÁNG BACILLUS CEREUS
CỦA MUỐI CHITOSAN ACETATE
GVHD: PGS.TS Trang Sĩ Trung
Th.S Phạm Thị Đan Phượng

SVTH: Hồng Thị Thùy Trang
MSSV: 57130114

Khánh Hịa – 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài “Bước đầu nghiên cứu điều kiện sản xuất
và xác định khả năng kháng Bacillus cereus của muối chitosan acetate” là cơng trình
nghiên cứu của cá nhân tơi và chưa từng được cơng bố trong bất cứ cơng trình khoa học
nào khác cho đến thời điểm này.
Khánh Hòa, tháng 7 năm 2019

iv


LỜI CẢM ƠN
Trải qua 4 năm dưới mái Trường Đại Học Nha Trang, đó là khoảng thời gian vơ
cùng ý nghĩa đối với mỗi sinh viên, tại đây em đã được học tập, nghiên cứu và tìm tịi những
kiến thức mới góp phần củng cố và nâng cao tầm hiểu biết của mình trong lĩnh vực chun
mơn. Trong 4 tháng với sự nổ lực của bản thân cùng với sự quan tâm từ nhiều phía, đến
nay em đã hồn thành đề tài tốt nghiệp. Qua đây cho phép em được bày tỏ lòng cảm ơn
đến:
Ban Lãnh Đạo Nhà Trường, Khoa Công Nghệ Thực Phẩm Trường Đại Học Nha
Trang và các thầy cơ đã tận tình giúp đỡ, giảng dạy và trang bị cho em những kiến thức quý
báu trong suốt thời gian học tập và rèn luyện tại Trường.
Đặc biệt em muốn bày tỏ lòng biết ơn đến PGS.TS Trang Sĩ Trung, Th.S Phạm Thị
Đan Phượng, Th.S Nguyễn Công Minh đã rất tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và động viên em
trong suốt quá trình em thực hiện đề tài.
Em muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cơ cán bộ phịng thí nghiệm Khu

Cơng Nghệ Cao đã tạo điều kiện thuận lợi cho em thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn gia đình, các anh chị và bạn bè đã động viên
và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian vừa qua.

Sinh viên thực hiện

Hoàng Thị Thùy Trang

v


TĨM TẮT ĐỒ ÁN
Sản xuất và xác định các tính chất của chitosan ban đầu.
Mục tiêu của đề tài là nhằm tạo ra sản phẩm muối chitosan có thể hịa tan trong nước
và không gây hại khi sử dụng để mở rộng phạm vi ứng dụng của nó. Mặt khác muối chitosan
có thể kháng lại một số vi khuẩn hay gặp trong thực phẩm.
Chitosan acetate có hoạt tính tương tự với chitosan hịa tan trong mơi trường acid
acetic nhưng hoạt tính kháng khuẩn trên đối tượng vi khuẩn có thể khác so với chitosan.
Việc tạo ra được sản phẩm chitosan hòa tan được trong nước ở trạng thái rắn với các
thông số như độ tan tốt và độ nhớt cao. Từ đó khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan
và muối chitosan đối với chủng vi khuẩn Gram + là Bacillus cereus.
Đề tài này nghiên cứu theo hướng sản xuất chitosan acetate ở trạng thái rắn bằng cách
cho chitosan dạng rắn tiếp xúc với dung dịch acid acetic, sản phẩm sau đó được rửa sạch
bằng ethanol để loại bỏ lượng acid dư và thu nhận muối chitosan acetate.
Sản phẩm sau đó được đem đi khảo sát hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn
Bacillus cereus để xác định khả năng kháng khuẩn so với chitosan.

vi

MỤC LỤC
Đề mục

Trang

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................ iv
LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................................... v
TĨM TẮT ĐỒ ÁN .............................................................................................................. vi
MỤC LỤC ..........................................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................ ix
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................xii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1 Tìm hiểu về nguồn nguyên liệu .................................................................................... 3
1.2 Giới thiệu về chitin, chitosan ....................................................................................... 4
1.2.1. Sự tồn tại của chitin, chitosan trong tự nhiên ...................................................... 4
1.2.2. Cấu tạo và tính chất của chitosan ........................................................................ 5
1.2.3 Các phương pháp sản xuất chitin, chitosan ........................................................ 11
1.3 Muối chitosan ............................................................................................................. 14
1.3.1 Đặc tính của muối chitosan................................................................................. 15
1.3.2 Các phương pháp sản xuất muối chitosan .......................................................... 16
1.3.3 Tình hình nghiên cứu về muối chitosan ............................................................. 17
1.4 Chủng vi khuẩn .......................................................................................................... 19
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 20
2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................. 20
2.1.1 Chitin, chitosan ................................................................................................... 20
2.1.2 Chủng vi khuẩn ................................................................................................... 23
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 23
2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát ................................................................................ 23

2.2.2 Bố trí thí nghiệm chi tiết ..................................................................................... 25
2.2.3 Các phương pháp phân tích ................................................................................ 32
2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................. 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................................... 34
3.1 Tính chất của chitin, chitosan ban đầu ....................................................................... 34
vii


3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và ethanol đến độ tan, độ nhớt của muối chitosan
..................................................................................................................................... 34
3.1.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và acid acetic đến độ tan, độ nhớt của muối
chitosan ........................................................................................................................ 36
3.1.3 Ảnh hưởng của công đoạn xử lý ethanol đến độ tan, độ nhớt của muối chitosan
..................................................................................................................................... 39
3.2 Đề xuất quy trình tạo muối và đánh giá chất lượng của chitosan acetate .................. 41
3.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và muối chitosan acetate đối với chủng
vi khuẩn Bacillus cereus ................................................................................................. 42
3.3.1 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan đối với chủng vi khuẩn Bacillus
cereus ........................................................................................................................... 42
3.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan acetate đối với chủng vi khuẩn
Bacillus cereus ............................................................................................................. 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................................ 47
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 48
PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 52
PHỤ LỤC I: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ........................................................... 52
PHỤ LỤC II : KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ....................................................... 58
PHỤ LỤC III: HÌNH ẢNH MỘT SỐ THIẾT BỊ DÙNG TRONG ĐỀ TÀI ..................... 62

viii

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose [16]. ....................................... 4
Hình 1.2 Sơ đồ tổng quát quy trình sản xuất chitin, chitosan [3]. ...................................... 12
Hình 1.3 Quy trình sản xuất chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học và sinh học [22].
............................................................................................................................................ 13
Hình 1.4 Cơ chế tạo muối chitosan [25]. ............................................................................ 15
Hình 2.1 Quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học [31] ............................. 20
Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc Bacillus cereus khi ni cấy trong mơi trường thạch và nhuộm
Gram ................................................................................................................................... 23
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt ........................................................................ 24
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và ethanol đến
độ tan, độ nhớt của muối chitosan ...................................................................................... 26
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và acid acetic
đến độ tan, độ nhớt của muối chitosan ............................................................................... 28
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của công đoạn xử lý ethanol đến
độ tan, độ nhớt của muối chitosan ...................................................................................... 29
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn của chitosan acetate ... 30
Hình 3.1. Sản phẩm muối chitosan tạo thành từ các tỷ lệ chitosan và ethanol khác nhau. 35
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và ethanol đến độ tan, độ nhớt của chitosan acetate
............................................................................................................................................ 36
Hình 3.3. Sản phẩm muối chitosan tạo thành từ các tỷ lệ acid acetic và ethanol khác nhau.
............................................................................................................................................ 37
Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và acid acetic đến độ tan, độ nhớt của chitosan
acetate ................................................................................................................................. 38
Hình 3.5. Chitosan phản ứng trực tiếp với acid acetic ....................................................... 39
ix


Hình 3.6. Sản phẩm muối chitosan tạo thành khi thay đổi cơng đoạn xử lý ethanol ......... 40

Hình 3.7. Quy trình sản xuất muối chitosan acetate ........................................................... 42
Hình 3.8. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của chitosan. ................................................... 43
Hình 3.9. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của muối chitosan. ............................. 45

x


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng [14] ....................... 3
Bảng 1.2 Các dung mơi dùng để hịa tan chitosan [3] .......................................................... 7
Bảng 1.3 Tính chất của một số loại chitosan thương mại [3]............................................. 10
Bảng 1.4 Các thơng số hóa lý của muối chitosan [26]. ...................................................... 16
Bảng 3.1 Chỉ tiêu chất lượng của chitin đầu vào................................................................ 34
Bảng 3.2 Chỉ tiêu chất lượng của chitosan đầu vào ........................................................... 34
Bảng 3.3. Kết quả thực nghiệm cho thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và ethanol đến
độ tan, độ nhớt và pH của muối chitosan acetate ............................................................... 35
Bảng 3.4. Kết quả thực nghiệm cho thấy sự ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và acid acetic
đến độ tan, độ nhớt và pH của muối chitosan acetate ........................................................ 37
Bảng 3.5. Kết quả thực nghiệm cho thấy sự ảnh hưởng của công đoạn xử lý ethanol đến
độ tan, độ nhớt và pH của muối chitosan acetate ............................................................... 40
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các nồng độ chitosan (ppm) đến tỷ lệ chết (%) của vi khuẩn
Bacillus cereus .................................................................................................................... 43
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các nồng độ muối chitosan acetate (ppm) đến tỷ lệ chết (%) của
vi khuẩn Bacillus cereus ..................................................................................................... 45

xi


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT TẮT

DIỄN GIẢI

Cp

Centipoise

DD

Độ deacetyl

CTS

Chitosan

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu( Minimum
Inhibitory Concentration)

MW

Khối lượng phân tử (Molecular weight)

NA

Môi trường nutrient agar

NB

Môi trường nutrient broth

HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High performance liquid
chromatography)

ppm

parts per million

CFU

colony-forming unit

kDa

kiloDalton

xii


MỞ ĐẦU
Tính cấp thiết của vấn đề
Trong những năm gần đây, ngành đánh bắt và chế biến thủy sản ở nước ta đã đóng
góp một phần khơng nhỏ vào sự phát triển kinh tế đất nước. Tuy nhiên, tình trạng ô nhiễm
môi trường tại các cơ sở chế biến đang ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường, gây bức
xúc trong xã hội. Theo điều tra mới đây của Viện nghiên cứu hải sản (NCHS) cho thấy,
trong chế biến thủy sản đông lạnh, cứ sản xuất được 1 tấn thành phẩm tôm sẽ thải ra môi

trường 0,75 tấn phế thải [1]. Trước đây, nguồn phế liệu này chủ yếu được làm thức ăn gia
súc và một số nơi không thể sử dụng hết lượng phế liệu đã gây ra ô nhiễm môi trường. Hiện
nay, với sự phát triển khoa học công nghệ thì phần lớn lượng phế liệu này được sử dụng
làm ngun liệu cho q trình sản xuất bột tơm, protein, astaxanthin, chitin/chitosan và một
số sản phẩm có giá trị gia tăng khác vừa nâng cao hiệu quả kinh tế cho ngành thủy sản, vừa
giảm thiểu ô nhiễm môi trường.
Trong phế liệu vỏ tôm chứa hàm lượng lớn chitin, một polymer sinh học lớn thứ hai
trên trái đất chỉ sau cellulose [12]. Nghiên cứu thử nghiệm tách chiết chitin bằng phương
pháp hóa học. Kết quả cho thấy, lượng chitin trung bình thu được từ 100g nguyên liệu bột
đầu – vỏ tôm khô là 7,4-7,5 g. Hiệu suất thu hồi chitin phụ thuộc vào mẫu ngun liệu đó
chứa nhiều hay ít protein [2]. Chitin có đặc tính hịa tan cực kỳ kém, khiến chitin khó xử lý
và do đó hạn chế các ứng dụng tiềm năng của nó [12]. Chitosan là một dẫn xuất của chitin
được hình thành khi thay thế các nhóm acetyl bằng các nhóm amino. Chitosan tan tốt trong
các acid hữu cơ và vô cơ thông thường. Chitosan được sử dụng trong các lĩnh vực y học,
nông nghiệp, thực phẩm… Chitosan có phổ hoạt động kháng khuẩn rộng rãi và có tính diệt
khuẩn cao [13]. Tuy nhiên, độ hịa tan kém của chitosan tại pH trung tính và cao hơn giới
hạn các ứng dụng của nó. Để cải thiện khả năng hịa tan trong nước và hoạt tính sinh học
của chitosan thì muối chitosan được nghiên cứu để sản xuất. Vì vậy, đề tài “Bước đầu
nghiên cứu điều kiện sản xuất và xác định khả năng kháng Bacillus cereus của muối
chitosan acetate” nhằm tạo ra sản phẩm muối chitosan có thể hịa tan trong nước và khơng
gây hại khi sử dụng để mở rộng phạm vi ứng dụng của nó. Mặt khác muối chitosan có thể
1


kháng lại một số vi khuẩn hay gặp trong thực phẩm.
Mục tiêu
Tạo ra được sản phẩm muối chitosan hòa tan được trong nước để mở rộng phạm vi ứng
dụng, vừa là sản phẩm thân thiện với mơi trường và có các đặc tính tốt.
Xác định khả năng kháng lại vi khuẩn Bacillus cereus trong thực phẩm.
Ý nghĩa khoa học của đề tài

Tạo ra được sản phẩm muối chitosan acetate với các tính chất khác nhau.
Xác định khả năng kháng lại vi khuẩn Bacillus cereus trong thực phẩm.
Tạo ra tài liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kĩ thuật trong ngành
công nghệ thực phẩm.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của đề tài giúp nâng cao giá trị cho phế liệu thủy sản.
Giải quyết vấn đề phế liệu thủy sản gây ô nhiễm môi trường.
Ứng dụng khả năng kháng khuẩn của muối chitosan acetate.
Nội dung nghiên cứu
Xác định tính chất của chitosan ban đầu.
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và ethanol đến độ tan, độ nhớt của chitosan
acetate.
Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan và acid acetic đến độ tan, độ nhớt của chitosan
acetate.
Nghiên cứu ảnh hưởng của công đoạn xử lý ethanol đến độ tan, độ nhớt của chitosan acetate.
Đánh giá hoạt tính kháng Bacillus cereus của chitosan acetate.

2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 Tìm hiểu về nguồn nguyên liệu
Chitin, chitosan có thể được thu nhận từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau như phế
liệu thủy sản, vi nấm, vi khuẩn. Tuy nhiên nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin,
chitosan thương mại là từ phế liệu thủy sản, chủ yếu là từ vỏ tôm, vỏ cua, mai mực. Hàm
lượng chitin biến đổi theo từng loại nguyên liệu [3].
Bảng 1.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tơm thẻ chân trắng [14]

STT

Chỉ tiêu phân tích

Kết quả

1

Độ ẩm (%)

77,5 ± 1,2

2

Hàm lượng tro tổng số (%)

24,6 ± 0,8

3

Hàm lượng chitin (%)

18,3 ± 0,9

4

Hàm lượng protein (%)

47,4 ± 1,8

5

Hàm lượng lipid (%)

4,7 ± 0,3

6

Hàm lượng astaxanthin (ppm)

± 13,9

Từ bảng thành phần trên cho thấy chitin chiếm một hàm lượng lớn trong vỏ tôm,
nhiều nhà khoa học đã tách chiết nhằm tạo ra sản phẩm có giá trị gia tăng. Nguồn nguyên
liệu khác nhau chứa thành phần các hợp chất với hàm lượng khơng giống nhau nên quy
trình thu nhận chitin cũng có khác nhau. Trong nguyên liệu vỏ giáp xác, chitin tồn tại dưới
dạng liên kết chặc chẽ với các hợp chất khác như protein, lipid, khống, carotenoid do đó
việc loại bỏ các hợp chất này khi sản xuất chitin là khá khó khăn. Trong vỏ tơm, các hợp
chất phi chitin như là protein, khoáng, astaxanthin, acid béo và các hợp chất khác liên kết
với nhau bằng các liên kết este và liên kết imin gây khó khăn cho quá trình tách chiết chitin
[15].

3


1.2 Giới thiệu về chitin, chitosan
1.2.1. Sự tồn tại của chitin, chitosan trong tự nhiên

Chitin-chitosan là polymer phổ biến trong tự nhiên, chúng có cấu trúc hóa học
giống cellulose và được xem là một dẫn xuất của cellulose [3].

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cellulose [16].

Trong tự nhiên thì chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong động vật chitin là
thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ một số động vật không xương sống như: côn trùng,
nhiễm thể, giáp xác và giun trịn. Trong thực vật thì chitin có mặt ở thành tế bào của nấm
và một số loại tảo.
Chitin được tách chiết lần đầu tiên vào năm 1811 bởi nhà dược hóa học người Pháp
Henri Braconnot từ nấm. Tuy nhiên, chitin ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết chặc chẽ
với protein, canxi cacbonat và nhiều hợp chất hữu cơ khác, do đó gây khó khăn cho việc
tách chiết thu nhận [15]. Chitin và các sản phẩm của chúng hiện nay được ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý mơi
trường.
Chitin-chitosan là một polysaccharide có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin
là một tập hợp các phân tử, liên kết với nhau bởi các cầu nối glucoside và hình thành một
mạng lưới sợi có tổ chức.
Chitosan là một sản phẩm được sản xuất bởi chitin, sau khi xử lý chitin trong mơi
trường kiềm. Chitosan có những tính chất đặc biệt hơn chitin nên khả năng ứng dụng của
chitosan rất rộng rãi.
4


1.2.2. Cấu tạo và tính chất của chitosan
1.2.2.1. Cấu tạo của chitosan
Chitosan là một sản phẩm deacetyl hóa chitin, là một polyme chứa các đơn vị là Dglucosamine và N-acetyl-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glycoside.
Chitosan biểu hiện hoạt tính sinh học nhờ ba nhóm chức năng N-acetyl, nhóm amino, nhóm
hydroxyl. Tuy nhiên chitosan chỉ hịa tan trong một số dung mơi acid yếu [3], do đó đã làm
hạn chế khả năng ứng dụng của chitosan.
Để khắc phục những hạn chế trên nhiều tác giả đã tập trung nghiên cứu sản xuất
chitosan hòa tan trong nước để cải thiện khả năng ứng dụng của chitosan. Chitosan hòa tan
trong nước có thể tồn tại dưới dạng chitosan oligosaccharide hoặc dạng muối chitosan [3].

Chitosan hịa tan được trong nước có ưu điểm là dễ sử dụng, hoạt tính sinh học cao, đặc
biệt là hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa.
Cơng thức cấu tạo:

Tên danh pháp của chitosan là: poly β- (1,4)- 2- amino -2- deoxy- D-glucopyranose hoặc
poly – (1,4) – D- glucosamine.
Công thức phân tử: (C6H11O4N)n
Phân tử lượng: Mchitosan= (161,07)n
Trong mỗi mắc xích phân tử chitosan có chứa nhóm amin nên nó được gọi là
polyamin. Khả năng ứng dụng của chitosan phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đó thì độ
deacetyl và trọng lượng phân tử có ảnh hưởng nhiều. Thông thường chitosan thương mại
5


có DD từ 85-95% và phân tử lượng dao động từ 100.000-1.200.000 Da [10].
1.2.2.2. Đặc tính lý, hóa, sinh học của chitosan
-

Độ deacetyl:

Độ deacetyl của chitin và chitosan là thông số quan trọng. Độ deacetyl là tỷ số giữa số
nhóm –NH2 so với tổng số nhóm –NH2 và nhóm –NHCOCH3 trong phân tử chitin hoặc
chitosan. Ngồi ra độ deacetyl cịn là thông số để phân biệt chitin và chitosan. Chitin có độ
deacetyl thấp cịn chitosan thì có độ deacetyl cao, tức có chứa nhiều nhóm amino. Nếu độ
deacetyl nhỏ hơn 50% thì gọi là chitin, cịn lớn hơn 50% thì gọi là chitosan [14].
Độ deacetyl được xác định bằng nhiều kỷ thuật khác nhau như: phân tích nguyên tố,
chuẩn độ điện thế tuyến tính, chuẩn độ thế năng, quang phổ hồng ngoại, phổ UV, phương
pháp sắc ký lỏng và rắn…
Ngoài ra sự phân bố các nhóm glucosamin trong mạch phân tử polyme cũng ảnh hưởng đến
tính chất hịa tan của chitosan.

-

Độ nhớt, độ tan:
Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử, độ deacetyl, pH, nhiệt độ

[3]. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì độ nhớt càng cao.
Chitosan chỉ có khả năng tan trong dung dịch acid yếu như acid acetic, acid formic, acid
lactic… hoặc acid loãng có pH <6, acid vơ cơ như HCl 1% nhưng khơng hịa tan trong các
acid mạnh, đậm đặc như H2SO4, H3PO4. Độ tan của chitosan không chỉ phụ thuộc vào dung
mơi mà cịn phụ thuộc vào nồng độ của dung mơi [17].
Nhờ khả năng hịa tan trong các dung dịch acid yếu của chitosan, còn chitin chỉ tan
trong một số ít hệ dung môi nên chitosan được ứng dụng rộng rãi hơn.

6


Bảng 1.2 Các dung mơi dùng để hịa tan chitosan [3]

Nồng độ thường sử

Dung môi

-

dụng (%)

Acid acetic

1-2

Acid formic

1-2

Acid lactic

1-2

Acid propionic

1-2

Acid HCl

0,25-0,5

Acid citric

5-10

Acid glutamic

1-3%

Acid ascorbic

1-2%

Khối lượng phân tử:
Phân tử lượng của chitosan là thơng số quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của

chitosan như tính tan, khả năng tạo màng, hấp thụ màu, tạo gel, chống oxy hóa và ức chế
vi sinh vật.. [40]. Khối lượng phân tử phụ thuộc vào nguồn chitin và phương pháp sản xuất,
chitosan phân tử lượng cao có khả năng tạo màng tốt, chitosan phân tử lượng thấp thì thường
có hoạt tính sinh học cao hơn, được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm, y học,
công nghệ sinh học [42]. Khối lượng phân tử được xác định bằng các phương pháp như sắc
ký lỏng HPLC, phương pháp đo độ nhớt, phương pháp tán xạ ánh sáng.. [41].
-

Khả năng kháng khuẩn:

Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn Gram âm, vi khuẩn Gram
dương và vi nấm. Khả năng ức chế còn phụ thuộc vào độ deacetyl và phân tử lượng. So với
chitin thì chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan tích điện dương
ở carbon số 2 ở pH nhỏ hơn 6. Chitosan có độ deacetyl lớn hơn 85% thì có khả năng kháng
7


khuẩn, kháng nấm tốt [3].
Chitosan hòa tan trong các acid hữu cơ thường được sử dụng để kháng khuẩn và kháng
nấm. Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan mạnh hơn ở vi khuẩn Gram âm hơn là vi khuẩn
Gram dương. Nồng độ ức chế còn phụ thuộc vào loại chitosan và loài vi sinh vật, điều kiện
áp dụng và thường sử dụng trong khoảng 0,0075%- 1,5%. Ngoài ra dẫn xuất của chitosan
cũng có khả năng kháng khuẩn kháng nấm tốt [3].
Cơ chế kháng khuẩn của chitosan có thể được giải thích như sau [4]:
+ Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần polyanion vách tế bào
(lipopolysaccharide và glycoprotein) của vi sinh vật, kết quả là sự rò rỉ thành phần nội bào
do thay đổi tính thấm của màng sinh chất (barrier); ngăn cản chất dinh dưỡng đi vào tế bào;
ngăn cản sự nhập bào.
+ Chitosan có khả năng gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn (coagulation) và

dẫn đến giết chết tế bào.
-

Khả năng tạo màng:
Chitosan có khả năng tạo màng rất tốt. Tính chất cơ học của màng chitosan tương đối

tốt, màng dai, khó xé rách, độ bền tương đương với một số chất dẻo được dùng làm các loại
bao bì. Chitosan có độ deacetyl cao có ứng suất kéo và độ dãn dài giới hạn cao hơn màng
chitosan có độ deacetyl thấp [5]. Ngồi ra, tính chất của màng chitosan phụ thuộc rất nhiều
vào dung mơi sử dụng hịa tan chitosan để tạo màng. Độ rắn của màng chitosan cũng phụ
thuộc vào dung môi sử dụng [5]. Khi hòa tan chitosan vào acid hữu cơ thu được dung dịch
muối của chitosan, sau đó làm khô và xử lý nhiệt sẽ thu được màng chitosan. Màng này sẽ
tan chậm trong nước và các dung môi hữu cơ.
Màng chitosan thường được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như rau quả, thịt cá nhằm
hạn chế các tác nhân gây hư hỏng. Có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng màng chitosan có
khả năng kéo dài thời gian bảo quản, giảm sự thối hỏng và hao hụt khối lượng tự nhiên,
giảm sự hô hấp và sản sinh ethylene của quả nho, dâu tây, măng cụt…[6].
-

Khả năng chống oxy hóa:
8


Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng chitosan có khả năng kìm hảm các dạng chất oxy linh
động và ngăn cản sự oxy hóa lipid trong thực phẩm và các hệ sinh học [18]. Chitosan có
thể gắn kết tốt với lipid, protein và chất màu. Do chitosan không tan trong nước nên chitosan
ổn định hơn trong nước so với các polymer tan trong nước như alginat, agar. Chitosan có
thể làm giảm đáng kể nồng độ acid béo tự do và malondialdehyde, nâng cao hoạt tính
dismutases superoxide và hổ trợ hoạt động của catalase, glutathione peroxidase, là các
enzyme chống oxy hóa quan trọng trong cơ thể. Điều này cho thấy rằng chitosan có khả

năng điều hịa hoạt động của các enzyme chống oxy hóa và giảm peroxy lipid [19].
Chitosan có khả năng loại bỏ các gốc tự do vì chứa các nhóm –OH và –NH2 vẫn cịn
các electron tự do. Các nhóm này có thể tương tác với ion kim loại do sự hấp phụ, trao đổi
ion và trung hòa các gốc tự do [20]. Màng chitosan thể hiện tác dụng hạn chế oxy hóa lipid
do màng chitosan làm rào cản với oxy. Ngồi ra, khả năng chống oxy hóa của chitosan
cũng phụ thuộc vào độ deacetyl, phân tử lượng và độ nhớt của chitosan. Chitosan có độ
deacetyl cao, khối lượng phân tử thấp và độ nhớt thấp thì có khả năng chống oxy hóa cao.
-

Khả năng phân hủy sinh học:

Chitosan là một polymer sinh học nên chúng rất dễ bị phân hủy bởi các vi sinh vật trong
đất và trong nước. Chitosan cũng như các polymer khác như chitin, cellulose và các dẫn
xuất khác của chúng cũng được xem là thân thiện với mơi trường. Lysozyme có khả năng
làm giảm hoạt tính của chitosan như làm giảm 60% độ nhớt sau 4h, pH 5,5 [21].
Khả năng phân hủy còn phụ thuộc vào độ deacetyl, khi độ deacetyl cao thì tính phân
hủy càng nhanh.
-

Từ các đặc tính trên có thể rút ra được rằng:

Chitosan là một chất rắn xốp, nhẹ, ở dạng vảy có màu đục.
Chitosan có tính kiềm nhẹ, khơng hòa tan trong nước, trong dung dịch kiềm. Nhưng hòa
tan trong dung dịch acid loãng tạo thành dung dịch keo dương. Vì vậy mà chitosan khơng
bị kết tủa khi có mặt các kim loại nặng như Pb3+, Hg+…
Chitosan có tính chất cơ học tốt, khơng độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh
9


học, có tính hịa hợp sinh học cao với cơ thể [11].

Chitosan là polymer mang điện tích dương nên được xem là polycationic pH< 6,5,
có khả năng bám dính trên bề mặt mang điện tích âm như protein, alginate, acid béo và
phospholipid nhờ có nhóm –NH2.
Dung dịch chitosan có tính kiềm nên có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn cao [3].
Do sự tương tác giữa các phân tử chitosan mang điện tích dương và màng tế bào vi sinh vật
mang điện tích âm dẫn đến biến tính màng tế bào và rò rỉ các thành phần trong tế bào,
chitosan sẽ thâm nhập vào nhân tế bào liên kết với DNA ức chế tổng hợp mRNA và protein.
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại chitosan với các tính chất và chất lượng
khác nhau, thể hiện rất rõ ở hàm lượng protein, khoáng, độ deacetyl và độ nhớt.
Bảng sau giới thiệu một số sản phẩm chitosan thông dụng trên thị trường:
Bảng 1.3 Tính chất của một số loại chitosan thương mại [3].

Hàm lượng nitơ Hàm lượng khoáng Ðộ deacetyl

Sản

Mật độ khối

Ðộ nhớt

phẩm

(%)

(%)

(%)

(g/ml)

(cps)

1

7,13 ± 0,00

0,3 ± 0,1

90,6 ± 0,0

0,26 ± 0,02

120 ± 3

2

7,16 ± 0,03

0,2 ± 0,1

89,9 ± 1,1

0,38 ± 0,01

444 ± 6

3

7,14 ± 0,08

1,0 ± 0,2

83,0 ± 0,0

0,28 ± 0,00

1928 ± 11

4

6,91 ± 0,28

0,2 ± 0,1

72,5 ± 0,0

0,38 ± 0,01

72 ± 3

5

7,00 ± 0,05

1,7 ± 0,3

86,9 ± 1,1

0,20 ± 0,01

768 ± 8

1.2.2.3 Ứng dụng của chitosan

Nhờ chitosan có các đặc tính đặc biệt mà chitosan được ứng dụng theo nhiều hướng
khác nhau. Chẳng hạn như trong thực phẩm, dược phẩm, nông nghiệp và bảo vệ môi trường.
Ý nghĩa đối với y sinh học và điều trị của các dẫn xuất chitin, chitosan là chủ đề đang được
10


quan tâm ở nhiều nơi trên thế giới. Tính kháng khuẩn, tính tạo màng, khả năng chống oxy
hóa làm cho chitosan trở thành một phụ gia phổ biến được ứng dụng trong công nghiệp
thực phẩm và bảo quản.
Màng được tạo từ chitosan có độ thấm khí oxy thấp do đó có thể làm rào cản đối với
khơng khí. Những màng này sử dụng đối với các loại thực phẩm như trái cây, rau quả để
kéo dài thời gian bảo quản. Với khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, tạo màng nên
chitosan trở thành lớp màng bọc thực phẩm hiệu quả và an toàn.
Hoạt động kháng khuẩn đối với một số loại vi khuẩn như : Bacillus cereus, Bacillus
subtilis, Lactobacillus spp, Listeria monocytogenes,…bao gồm cả nấm men và nấm mốc.
Chitosan là bazơ yếu nên khơng tan trong pH trung tính và kiềm. Vì vậy việc sản
xuất chitosan tan trong nước sẽ giúp mở rộng phạm vi ứng dụng của chitosan.
1.2.3 Các phương pháp sản xuất chitin, chitosan
Các phương pháp sử dụng phổ biến trong quá trình sản xuất chitin và chitosan có
thể chia thành 3 nhóm chính bao gồm phương pháp hóa học, phương pháp sinh học và
phương pháp kết hợp hóa học và sinh học.
Phương pháp hóa học có một số ưu điểm là đơn giản, khơng địi hỏi thiết bị máy
móc phức tạp và chi phí thấp. Do đó phương pháp rất dễ áp dụng để sản xuất quy mơ lớn.
Tuy nhiên phương pháp hóa học có một số nhược điểm là chitin, chitosan thu được có độ
nhớt, phân tử lượng thấp, protein và astaxanthin trong quy trình sản xuất chưa được thu hồi
và tận dụng, gây ô nhiễm mơi trường do lượng hóa chất thải ra.

Việc hạn chế sử dụng hóa chất, cải tiến cơng nghệ theo hướng thân thiện với môi
trường, ứng dụng công nghệ sinh học trong sản xuất chitin, chitosan, tận thu các thành phần
có giá trị phi chitin, giảm thiểu chất thải hóa học, góp phần phát triển bền vững ngành cơng
nghệ chế biến chitin, chitosan. Vì vậy phương pháp sinh học đang dần phổ biến.

11


Phế liệu thủy sản

Nghiền

Thủy phân bằng hóa
chất hoặc enzyme

Lọc tách lấy bã rắn

Khử khống bằng acid
vơ cơ hoặc hữu cơ

Khử protein bằng hóa
chất hoặc enzyme

Khử màu bằng dùng
hóa chất hoặc phơi

Chitin

Khử acetyl bằng hóa
chất hoặc enzyme

Chitosan
Hình 1.2 Sơ đồ tổng quát quy trình sản xuất chitin, chitosan [3].

12


Vỏ tôm

Rửa sạch, loại bỏ tạp chất

Xử lý với flavourzym: tỷ lệ
enzym/phế liệu 0,2%(w/w),
nhiệt độ phòng, 24h

Xử lý NaOH 0,5%, tỷ lệ
1:5(w/v), nhiệt độ phịng, 24h

Rửa trung tính

Xử lý HCl 4%, thời gian 12h, tỷ
lệ 1:5(w/v), nhiệt độ phòng

Rửa trung tính

Phơi khơ

Chitin

Chuyển chitin thành chitosan: ngâm trong NaOH 60% tỷ

lệ 1:5(w/v) nhiệt độ 65oC , thời gian 20h

Rửa trung tính

Phơi khơ

Chitosan
Hình 1.3 Quy trình sản xuất chitin, chitosan bằng phương pháp hóa học và sinh học [22].
13


Phương pháp hóa học: quy trình hóa học sản xuất chitin, chitosan thường gồm các
cơng đoạn tách protein, tách khống, tẩy màu sử dụng các loại hóa chất khác nhau. Tuy
nhiên công đoạn tẩy màu ở các nước nhiệt đới như Việt Nam thường thực hiện kết hợp với
quá trình phơi khô sản phẩm chitin. Chitosan được sản xuất từ chitin qua q trình tách
nhóm acetyl sử dụng dung dịch kiềm. Tùy theo loại nguyên liệu, công nghệ và yêu cầu về
chất lượng sản phẩm chitin và chitosan mà các điều kiện xử lý sẽ khác nhau.
Trong thực tế các quy trình sản xuất ở quy mơ lớn sử dụng phương pháp hóa học.
Với ưu điểm như thời gian xử lý nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô lớn. Tuy nhiên
phương pháp này cũng có nhiều nhược điểm như không thân thiện với môi trường, giá
thành cao do chi phí xử lý chất thải chứa acid và kiềm và gây ăn mịn thiết bị. Hơn nửa, q
trình thu nhận sử dụng acid và kiềm mạnh dẫn đến sự cắt mạch polyme nên sản phẩm chitin,
chitosan có phân tử lượng thấp, độ nhớt thấp, chất lượng sản phẩm không đồng đều.
Phương pháp sinh học: mặc dù phương pháp hóa học với nhiều ưu điểm như đơn
giản, hiệu quả, dễ triển khai ở quy mơ lớn nhưng lại có các nhược điểm như ảnh hưởng đến
chất lượng sản phẩm, gây ô nhiễm môi trường, chưa tận dụng được các thành phần có giá
trị cao. Vì vậy, việc hạn chế sử dụng hóa chất, cải tiến cơng nghệ theo hướng thân thiện với
môi trường, ứng dụng công nghệ sinh học trong việc chế biến chitin, chitosan là xu hướng
hiện nay nhằm nâng cao chất lượng chitin, chitosan, tận thu các thành phần khác có giá trị
phi chitin, giảm thiểu chất thải hóa học, góp phần phát triển bền vững ngành cơng nghệ chế

biến chitin- chitosan.
Nhìn chung thì các phương pháp đều phải đi theo trình tự các phương bao gồm: quá
trình khử khống và q trình tách protein để tạo thành chitin. Sau đó từ chitin thực hiện
q trình deacetyl hóa để tạo thành sản phẩm chitosan.
1.3 Muối chitosan
Độ hòa tan là một đặc điểm rất quan trọng với chitosan. Cải thiện khả năng hòa tan
sẽ tạo điều kiện cho các ứng dụng của chitosan trong các lĩnh vực như thực phẩm và y học.
Trọng lượng phân tử cao thì khả năng hịa tan trong nước thấp, do đó có thể cải thiện khả
năng hòa tan trong nước bằng cách giảm trọng lượng phân tử [43] hoặc tạo muối chitosan
14