Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử Real time PCR định lượng HBV DNA trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm viêm gan B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR
ĐỊNH LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội, 2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

TRẦN THỊ NGUYÊN DUNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ REAL-TIME PCR ĐỊNH
LƯỢNG HBV DNA TRONG HUYẾT THANH
BỆNH NHÂN NHIỄM VIÊM GAN B

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN :
TS.NGUYỄN XUÂN THÀNH

Hà Nội, 2006

mục lục
Trang
Đặt vấn đề

1

Chương I: Tổng quan tài liệu

3

I. Bệnh viêm gan B virut.

3

I.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B.

3

I.2. Biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut.

4

II. Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và trên thế giới. 5
III. Virut viêm gan B (HBV).

7

III.1. Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B.

7

III.2. Sự mà hoá của các gen cho kháng nguyên của HBV và các phân
typ của HBV.

10

III.3. Các dấu ấn của virut viêm gan B.

16

III.4. Sức đề kháng của HBV.

18

III.5. Khả năng và cơ chế gây bệnh của HBV.

19

IV. Các kỹ thuật chẩn đoán HBV.

21

IV.1. Các kỹ thuật miễn dịch.

22

IV.2. Kỹ thuật PCR truyền thống.

26

IV.3. Kỹ thuật real time PCR định lượng HBV DNA.

27

V. Vai trò, ý nghĩa của định lượng HBV DNA trong chẩn đoán
và điều trị.

34

Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu

35

I. Đối tượng nghiên cứu.

35


II. Vật liệu nghiên cứu

35

III. Phương pháp nghiên cứu.

37

III.1.1. Kỹ thuật tách chiết DNA.

37

III.1.2. Kỹ thuật miễn dịch xác định các dấu ấn virút viêm gan B.

39

III.1.3. Kỹ thuật định lượng HBV DNA bằng kỹ thuật real time PCR. 42
Chương III: Kết quả và bàn luận

47

I. Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật real-time
PCR định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân. 47
I.1. Đánh giá độ nhạy của các cặp mồi thiết kế

47

I.2. Đánh giá độ đặc hiệu của các cặp mồi thiết kế.

49

II. Tìm hiểu mối tương quan của nồng độ HBV DNA với các dấu ấn
khác của HBV.
50
Kết luận

61

kiến nghị

62

Tài liƯu tham kh¶o

63


1

Đặt vấn đề
Viêm gan virut là một bệnh truyền nhiễm rất phổ biến và nguy hiểm. Bệnh
thường gặp với các tần xuất cao ở các nước đang phát triển và là một vấn đề
quan trọng của y tế cộng đồng.
Mc dù chương trình tiêm phịng vi rút viêm gan B (HBV) đã làm giảm đáng
kể tỷ lệ bệnh viêm gan do vi rút B, nhưng HBV vẫn còn là một mối hiểm hoạ
lớn của loài người vỡ ụi khi triu chứng của bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm
tưởng với một trường hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, và đa số trường hợp
khơng có triệu chứng lâm sàng ở những trường hợp viêm gan vi rút B mãn
tính mà chỉ có xét nghiệm máu chúng ta mới chẩn đốn được bệnh. Do đó,
vai trị của xét nghiệm trong chẩn đoán viêm gan do vi rút B giữ một vai trị
cực kỳ quan trọng. Có nhiều loại xét nghiệm khác nhau được sử dụng trong
chẩn đoán viêm gan vi rút B, mỗi loại có một ý nghĩa khác nhau tùy vào từng
giai đoạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lựa chọn xét nghiệm thích hợp. Có 5
xét nghiệm hay được dùng trong chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi
B trước đây là HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM và
AntiHBc IgG. Các xét nghiệm này là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương
pháp miễn dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế.
Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ
phát triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên
chúng ta đã có thể chẩn đốn được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử (Đó là

các xét nghiệm phân tích trên phân tử di truyền của HBV là DNA). Nhờ ứng
dụng các kỹ thuật về phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết
được các hạn chế của các kỹ thuật miễn dịch cị cũng như phân tích DNA
giúp chúng ta có những cơ sở đánh giá tình trạng bệnh, khả năng diễn tiến của


2
bệnh, theo dõi điều trị bệnh và lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp. HiƯn
nay chúng ta có thể thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ë
HBV như: Xác định được tình trạng đang tăng sinh của vi rút trong những
trường hợp có đột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) để từ đó có quyết định
điều trị đặc trị khơng. Đó là xét nghiệm HBV DNA, và kỹ thuật thường dùng
để xác định HBV DNA là kỹ thuật PCR (Là một kỹ thuật khuếch đại DNA
đích, rất nhạy và đặc hiệu, được sử dụng phổ biến không chỉ ở Việt Nam mà
cả trên thế gii); Kỹ thuật định lng vi rỳt B trong mỏu để theo dõi trong
điều trị. Nhờ xác định được số lượng vi rút trước khi điều trị mà chúng ta có
thể theo dõi số lượng vi rút trong q trình điều trị: Tăng giảm như thế nào để
có sự thay đổi điều trị kịp thời và hiệu quả. Hai kỹ thuật thường dùng để định
lượng vi rút viêm gan B là Real Time PCR (Khuếch đại DNA đích với thời
gian thật) và bDNA (Khuếch đại tín hiệu). Trong ®ã, kü thuật real time cho
kết quả chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, thời gian thí nghiệm ngắn. Đây
là mét kü tht míi ë ViƯt Nam, viƯc øng dơng kỹ thuật này trong thực tế còn
chưa phổ biến. Nhằm mục đích đưa kỹ thuật này áp dụng một cách rộng rÃi
trong nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị, chúng tôi tiến hành đề tài:
ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử real time PCR định lượng Virut HBV
DNA trong huyết thanh bệnh nhân mắc viêm gan siêu vi B
Mục đích:
1. Đánh giá độ nhạy và đặc hiệu của quy trình kỹ thuật Real- time PCR
định lượng virút viêm gan B trong huyết thanh bệnh nhân.
2. Tìm hiểu mối tương quan của nồng độ HBV DNA với các dấu ấn kh¸c

cđa HBV.


3

Chương I
Tổng quan tài liệu
I. bệnh viêm gan b virut.
I.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan do virut viêm gan B.
Viêm gan virut là thuật ngữ chung chỉ những trường hợp gan bị nhiễm ít nhất
một trong các loại virut gây viêm gan khác nhau. Bệnh đà được mô tả từ thế
kỷ thứ năm trước công nguyên.
Năm 1963, Baruch Blumberg và cộng sự phát hiện thấy trong mẫu huyết thanh
người bản xứ Australia có một loại kháng nguyên phản ứng đặc hiệu với một
loại kháng thể của bệnh nhân bị Hemophilia người Mỹ, gọi là kháng nguyên
Au. Loại kháng nguyên này ít gặp ở người Băc Mỹ và Tây Âu nhưng thấy lưu
hành ở vài nước Châu Phi và Châu á và còn gặp ở bệnh nhân bị bạch cầu cấp,
bệnh nhân phong và hội chứng Down. Tuy nhiên mối liên quan giữa kháng
nguyên Au và viêm gan huyết thanh vẫn chưa biết đến một cách đầy đủ.
Năm 1968, Prince, Okochi và Murakami đà chứng minh rằng kháng nguyên
Au (mà ngày nay gọi là kháng nguyên bề mặt viêm gan B hay HBsAg) được
tìm thấy đặc hiệu ở huyết thanh bệnh nhân viêm gan B.
Năm 1970, Dane và cộng sự đà xác định được hạt virut viêm gan B hoàn chỉnh
(virion) gọi là tiểu thể Dane.
Năm 1972, Magnuis và Espmark tiếp tục nghiên cứu các thành phần kháng
nguyên của virut viêm gan B: HBcAg, HBeAg và các kháng thể t­¬ng øng.


4
I.2. Biểu hiện lâm sàng của bệnh viêm gan B virut.

I.2.1. Viêm gan B cấp.
Khoảng 70% các trường hợp VGSV B cấp không có triệu chứng lâm sàng.
Tuy nhiên, trong 30% trường hợp bệnh nhân có triệu chứng thì bệnh cảnh lâm
sàng thường diễn tiến qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn ủ bệnh: Có thể thay đổi từ 1-4 tháng. Trong giai đoạn này, khám
lâm sàng và các kết quả xét nghiệm đều âm tính.
Giai đoạn khởi phát: kéo dài từ 1-2 tuần, 10-20% số bệnh nhân có biểu hiện
có ban hồng, mày đay, đau khớp, đôi khi viêm khớp và sốt vài ngày trước khi
xuất hiện các biểu hiện lâm sàng: sốt nhẹ, mệt mỏi, tiểu vàng, chán ăn.
Giai đoạn toàn phát: kéo dài từ 2-6 tuần, mức độ nặng nhẹ rất thay đổi ở từng
cá thể. Các triệu chứng của viêm gan B cấp có thể nhẹ và không vàng da hoặc
nặng hơn kết hợp với vàng da. Trong trường hợp điển hình, gồm đau đầu, mệt
vmỏi, chán ăn, ngứa nhẹ, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ là những dấu hiệu sớm
xuất hiện 2-7 ngày trước khi vàng da trong các trường hợp có vàng da, đầy
bụng hoặc đau khu trú ở hạ sườn phải hay gặp. Nước tiểu trở nên sẫm màu và
phân nhạt màu hơn.
Kháng nguyên HBs xuất hiện vài tuần sau khi nhiễm virut viêm gan B. Một
thời gian ngắn sau xuất hiện kháng nguyên HBe. Kh¸ng thĨ HBc cịng xt
hiƯn sím trong khi kh¸ng thể kháng HBs xuất hiện muộn từ vài ngày đến vài
tuần trước khi HBsAg biến mất, bệnh khỏi, kháng thể antiPre S1 vµ anti Pre S2
xt hiƯn tr­íc khi cã anti HBs vµ lµ dÊu hiƯu tiÕn triĨn tèt cđa bệnh. Sự tồn
tại dai dẳng của kháng nguyên Pre S1 hoặc Pre S2 cho biết sự nhân lên của


5
virut đang tiếp tục. Trong giai đoạn cấp, DNA của virut có thể phát hiện bằng
các kỹ thuật PCR hoặc kỹ thuật lai phân tử.
I.2.2. Viêm gan B mạn.
I.2.2.1. Viêm gan B mạn tồn tại.
Thường không có triệu chứng, có thể đi kèm với mệt mỏi, chán ăn, đau tức

nhẹ vùng hạ sườn phải.
Thăm khám lâm sàng bình thường hoặc có vẻ thấy gan to nhẹ. Những xét
nghiệm chức năng gan bình thường.
I.2.2.2. Viêm gan B mạn hoạt động.
Phần lớn bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi B mạn không có triệu chứng lâm
sàng, tuy nhiên một số ít có các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, đau hạ sườn
phải, vàng da và ngứa khi có tắc mật. Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa.
Khám thấy gan to vừa đôi khi đau, có thể thấy lách to.
Viêm gan virut B mạn được xác định bằng xét nghiệm sinh hoá khi men
Transaminase cao kéo dài trên 6 tháng sau giai đoạn cấp. Các kháng nguyên
tồn tại lâu trong máu như HBsAg, HBeAg và DNA virut cho thấy sự nhân lªn
cđa virut vÉn tiÕp tơc. Sau mét thêi gian nhÊt định (có thể từ vài tháng đến vài
năm) DNA virut gắn vào genom của tế bào gan, HBeAg có thể mất, xuất hiện
kháng thể kháng HBe, men transaminase trở lại bình thường.
II. Tình hình nhiễm viêm gan virut B ở Việt Nam và
trên thế giới.
II.1. Tình hình nhiễm virút viêm gan B trªn thÕ giíi.


6
Nhiễm vi rút gây viêm gan siêu vi B (HBV) hiện nay là một vấn đề sức khỏe
lớn của toàn cầu, đặc biệt tại các nước đang phát triển. Ng­êi là ổ chứa duy
nhất và không có nhiễm tự nhiên trên các động vật hoang dại, mặc dầu người
ta đà gây bệnh thực nghiệm trên loài chimpanzee và một số loài linh trưởng
khác, và mặc dù nhiễm HBV được phát hiện ở tất cả các dân tộc nhưng tần
xuất của bệnh và tỷ lệ mang virut trên người lành thay đổi tuỳ theo vùng địa lý
và chủng tộc.
Hiện nay, theo thèng kª cđa Tỉ chøc Y tÕ ThÕ giíi, ­íc tính có khoảng 2 tỷ
người đà bị nhiễm HBV, trong đó có khoảng 350 triệu người đang mang mầm
bệnh mạn tính, 3/4 trong số này là ở Châu á, 25% người nhiễm virut mÃn có

thể sẽ thành viêm gan mÃn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Hng nm
khong 1-2 triệu người tử vong do các bệnh có liên quan đến HBV như viêm
gan cấp, tối cấp; lâu dài như xơ gan và ung thư gan. Tû lƯ nhiƠm HBV thay
đổi theo từng khu vực địa lý dân cư cũng như ở các quần thể dân cư khác
nhau. Các nhóm nguy cơ cao (truyền máu, tiêm chích, quan hệ t×nh dơc, tiÕp
xóc trong nghỊ nghiƯp) cã tØ lƯ mang trùng 10 lần cao hơn so với quần thể dân
cư nói chung và khả năng trở thành mang trùng sau tiếp xúc tăng lên khi đáp
ứng miễn dịch suy giảm.
II.2. T×nh h×nh nhiƠm HBV ë ViƯt Nam.
Việt Nam là một quốc gia nằm trong vùng lưu hành viªm gan cao. Theo
TCYTTG cũng như một số cơng trình nghiên cứu trong nước, có khoảng 515% dân số Việt Nam đang mang HBV và hàng nǎm khoảng 35.000 người tử
vong vì những bệnh có liên quan đến HBV.


7
III. Virut viêm gan B (HBV).
III.1. Hình thể và cấu trúc của virút viêm gan B.
HBV là một thành viên của họ Hepadnaviridae (có axit nhân là DNA). HBV
có trọng lượng phân tử khoảng 2.000.000 dalton.
Quan sát huyết thanh người bị nhiễm HBV bằng kính hiển vi điện tử, thấy có
3 loại hình thể:
- Những hạt to 42-45 nanomet.
- Những vi cầu đường kính 20-22 nanomet.
- Những ống nhỏ đường kính 20-22 nanomet dài 40-400 nanomet.
Các vi cầu và hình ống nhỏ là những bao ngoài rỗng của virut đứng lẻ hoặc
nối với nhau chính là phần kháng nguyên bề mặt HBsAg của siêu vi được sản
xuất thừa tại bào tương của tế bào gan trong quá trình nhân lên của virut. Các
hạt này có rất nhiều trong huyết thanh, nồng độ vào khoảng 10-100àg/ml, gấp
100-1000 lần so với lượng virion.
Những hạt to chính là những virut hoàn chỉnh (hạt Dane), bao gồm lớp vỏ bọc

bên ngoài là kháng nguyên bề mặt HBsAg, tiếp đến là vỏ capxit được cấu tạo
từ kháng nguyên lõi (HBcAg), bên trong lõi chứa bộ gen virut.


8

H×nh 1: Ba kiĨu cÊu tróc cđa HBV trong hut thanh
Bao ngoài của virut (envelope) được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptide:
+ Chuỗi có kích thước ngắn nhất (trọng lượng phân tử 25 kilo Dalton, kDa)
được gọi là polypeptide chính do có nhiều nhất trong thành phần bao ngoài.
Đây chính là kháng nguyên HBsAg với 5 quyết định kháng nguyên khác
nhau: a đặc hiệu chung cho nhóm, d/y và w/r đặc hiệu cho phụ typ (subtype).
+ Chuỗi polypeptide trung bình có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn (HBsAg)
cộng thêm một đoạn có 55 axit amin (KN Pre-S2), trọng lượng phân tử 29kDa.
+ Chuỗi polypeptide lớn có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi trung bình cộng thêm
một đoạn có từ 108-119 axit amin (KN Pre-S1 và Pre-S2), trọng lượng phân tử
33 kDa, có tính sinh miễn dịch cao hơn so với HBsAg. Chuỗi lớn là thành
phần quan trọng của hạt virut hoàn chỉnh
Vỏ capxit: được cấu thành bởi 2 loại chuỗi polypeptide, được gọi là
polypeptide lõi và tiền lõi. Chuỗi polypeptide ngắn (polypeptide lõi), trọng
lượng phân tử 22 kDa, chính là kháng nguyên lõi của virut, ký hiệu là HBcAg
(Hepatitis B core antigen). Chuỗi polypeptide dài (polypeptide tiền lõi), trọng


9
lượng phân tử 25 kDa, có cấu trúc gồm toàn bộ chuỗi ngắn cộng thêm một
peptide đơn có 29 axit amin. Kháng nguyên e của HBV (Hepatitis B e antigen,
HBeAg) chính là một sản phẩm chuyển hoá của lớp vỏ capxit.

Hìn 2: Mô hình virut VG B hoàn chỉnh

Bộ gen HBV:
HBV cú b gen l phõn t DNA vòng, mạch kép không hoàn chỉnh và có
chiu di khong 3200 bases. DNA này bao gồm hai chuỗi có chiều dài khác
nhau: Chuỗi dài nằm ngoài, có cực tính âm (-), tạo nên một vòng tròn liên tục
có chiều dài cố định là 3,2 kb và mà hoá cho các thông tin di truyền của siêu
vi. ARN thông tin và ARN tiền gen của virut được mà hoá từ mạch này. Chuỗi
ngắn nằm trong, có cực tính dương (+), chiều dài thay đổi từ 50-80% chiều dài
mạch âm.
Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo là sự ghép nối hai đầu 5 của hai sợi
DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide, được gọi là vùng liên kết.
Vùng này nằm giữa hai trình tự DR1 và DR2 gồm có 10-11 nucleotide, trong
đó DR1 nằm ở đầu 5 của sợi DNA (-) và cũng hiện diện ở đoạn dư của đầu
3, còn DR2 nằm ở đầu 5 của sợi DNA (+). Hai trình tự này có vai trò chủ
yếu trong việc khởi phát quá trình tổng hợp của các chuỗi DNA tương øng.


10
Thứ tự của các nucleotit được đánh số bắt đầu từ 1 tương ứng ở vị trí EcoRI.
Chiều dài bộ gen thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau.

Hình 3: Cấu tạo bộ gen HBV
III.2. Sự mà hoá của các gen cho kháng nguyên của HBV và các phân typ
của HBV.
Chỉ có sợi DNA (-) mới được mà hoá. Trên sợi DNA này có bốn đoạn gen
tương ứng với bốn khung đọc mở là các vùng mà hoá để tổng hợp các protein
của siêu vi. Quá trình đọc mà được bắt đầu từ bộ ba nucleotit AUG được gọi
là codon khởi đầu và chấm dứt bằng codon kết thúc TAG.
Gen S: bao gåm pre-S1, pre-S2 vµ vïng S m· hoá để tổng hợp các protein của
KN bề mặt (HBsAg). Vùng S và pre-S2 có chiều dài cố định trong khi đó vùng
pre-S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng phân týp khác nhau.

11
Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiỊu dµi 24kd gåm 226
axitamin (aa). Protein nµy gåm hai thành phần là p24 và gp27 (gp:
glycoprotein). Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số.
Đoạn gen S và pre-S2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài 33kd
gồm 281 aa. Protein này gồm hai loại glycoprotein gp33 và gp36. Vùng preS2 có vai trò giúp cho siêu vi bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ
nó liên kết với một loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh người đồng
thời trên tế bào gan cũng có các thụ thể để gắn với pHSA. Nếu trên tế bào gan
thiếu các thụ thể này thì có thể làm cho các tế bào gan có khả năng đề kháng
với sự nhiễm HBV.
Đoạn gen S, pre-S1 và pre-S2 tổng hợp nên Protein L, có chiều dài 39 kd gồm
hai loại p39 và gp42. Chuỗi protein pre-S1 có chiều dài thay đổi tuỳ theo từng
phân týp khác nhau. Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt của tế
bào gan sẽ liên kết với siêu vi, giúp siêu vi xâm nhập vào trong tế bào. Kháng
thể antipre-S1 có thể trung hoà và ức chế siêu vi kết dính vào tế bào gan.
Cả ba loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt cđa
virion, trong ®ã protein S chiÕm ®a sè, protein M chiếm khoảng 5-10% trong
các virion và các hạt có kích th­íc 22nm. Protein L chiÕm 20% trong vá bäc
cđa virion và các cấu trúc dạng ống nhưng chỉ chiếm 1-2% trong các protein
của hạt 22nm.


12

Hình 4: Ba vùng của gen S (S, pre-S1 và pre-S2).
Gen C: (pre-C và C) mà hoá để tổng hợp potein của KN lõi (HBcAg ). ở đầu
5 của gen C có hai codon khởi đầu cho quá trình đọc mÃ. Trình tự nucleotide
nằm giữa hai codon này được gọi là vùng pre-C. Nếu quá trình đọc mà được

bắt đầu từ codon AUG thứ nhất ở vị trí 1814 và dọc suốt chiều dài của đoạn
gen pre-C và C sẽ tổng hợp nên HBeAg. Các nucleotide đầu tiên của vùng preC sẽ mà hoá cho việc tạo nên một đoạn peptide gåm 19 aa gäi lµ peptide tÝn
hiƯu. Peptide nµy giúp cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào
tương của tế bào gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hoà tan
được trong huyết thanh. Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng nguyên hoà tan.
Đây là một loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng
của nó chưa được biết rõ. Tuy nhiên, sự hiện diện của HBeAg có liên quan
đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạng đang nhân đôi của siêu vi.
Nếu quá trình đọc mà bắt đầu từ codon AUG thứ nhì ở vị trí 1901 và đi suốt
đoạn gen C sẽ tổng hợp nên KN lõi hay HBcAg. Đây là KN cấu trúc của phần


13
nucleocapid. Vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không
được bài tiết ra khỏi tế bào gan. Vì vậy, HBcAg không bao giờ hiện diện trong
huyết thanh.
Một số trường hợp xảy ra đột biến ở đoạn pre-C tại vị trí 1896, guanosine
được thay thế bằng adenine, tạo nên một trình tự TAG là một codon kết thúc.
Chính codon kết thúc này đà chấm dứt quá trình giải mà của vùng pre-C, cho
nên sự tổng hợp của HBeAg không thực hiện được mặc dù quá trình nhân đôi
của siêu vi vẫn tiếp diễn.

Hình 5: Gen C gồm vùng pre-C và C.
Gen P: mà hoá tổng hợp enzyme polymerase. Gen P chiếm 80% chiều dài của
bộ gen. Sản phẩm của gen P không chỉ liên quan đến cơ chế sao chép ngược
mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capsid bao bọc bên ngoài cầu trúc RNA
tiền genome.


14

Hoạt động nhân đơi của HBV nhờ hoạt tính của men DNA polymerase (P
protein) nội sinh trong các viên kết siêu li tâm từ huyết thanh người chứa
HBV. Gen P (Polymerase) được chia làm 4 vùng, mỗi vùng có một chức năng
riêng: Terminal protein, Spacer, RT domains và RNAase H (Xem hình).
Trong đó, vùng sao mã ngược (RT domains: Reverse Transcription) chịu
trách nhiệm cho việc tổng hợp men RNA-dependent DNA và DNAdependent DNA được chia ra thành 7 vùng đặt tên từ A – G (Xem hình cấu
tạo RT). HBV DNA có tỉ lệ đột biến rất cao vì men này hay bị sai sót trong
khâu sao chép.

Hình 6: Cấu tạo gen P và vùng RT.
Gen X: mà hoá tổng hợp protein có tác dụng chuyển hoạt hoá. Gen X mà hoá
cho một polypeptide có khoảng 145-154 aa tuỳ theo tong phân týp. Chức năng
của gen này vẫn chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó giữ vai trò chuyển
hoạt hoá trong quá trình nhân đôi của siêu vi. Protein X còn có liên quan đến
sự điều hoà quá trình tăng trưởng của tế bào, cho nên có thể nó có vai trò
trong cơ chế sin hung thư của tế bào gan bị nhiễm.
Các phân týp của HBV:


15
Trước đây, HBV được phân ra làm 4 kiểu huyết thanh (Serotypes) dựa trên
việc xác định các kiểu kháng nguyên ca khỏng nguyờn b mt vi rỳt B, mỗi
phân týp đều có chung phần quyết định kháng nguyên a và khác nhau tuỳ
theo sự ghép cặp của các quyết định kháng nguyên d hoặc y ghép với w
hoặc r để tạo nên các phân týp như adw, ayw, adr, ayr. Các kiểu huyết thanh
này có thể phân loại thêm ra 9 kiểu (Subtypes) là ayw1, ayw2, ayw3, ayw4,
ayr, adw2, adw4, adrq+, và adrq-. Nghiên cứu dịch tể cho thấy sự phân bố của
các serotypes khác nhau trên các vùng khác nhau trên thế giới. Tuy nhiên, cho
đến nay có rất ít dữ liệu về vai trò của HBV Serotypes.
Những tiến bộ của kỹ thuật sinh học phân tử vào những năm cuối thế kû 20

đã giúp khám phá ra sự đa dạng trong trình tự chuỗi của vi rút viêm gan B, và
từ đó một dấu ấn (marker) mới của HBV ra đời là HBV genotype. Tám kiểu
gen của HBV đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8%
của tồn bộ trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen
khác nhau ở các châu lục, các nước khác nhau.
Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotypes có thể chỉ cần dựa trên trình tự
chuỗi (sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình
tự chuỗi của gen pre-S; S. Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và
dùng trong việc xác định HBV genotypes như giải trình tự chuỗi
(sequencing), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), LiPA
(Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch men (Enzyme-linked Immunoassay).
Mỗi phương pháp có những ưu và nhược điểm khác nhau, tuy nhiên phương
pháp giải trình tự chuỗi có thể xem như có nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh
việc xác định được trình tự chuỗi các Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ
đó so sánh với thư viện gen và xác định được HBV genotypes mà còn dựa


16
vào kết quả giải trình tự này chúng ta có thể xác định được một số dạng đột
biến kháng thuốc của HBV để từ đó có phát đồ điều trị ti u.
III.3. Các dấu ấn của virut viêm gan B.
Virut viêm gan B có cấu tạo phức tạp, có nhiều kháng nguyên, các dấu ấn sau
đây đáng được chú ý ví nó có ý nghĩa trong chẩn đoán bệnh và trong nghiên
cứu dịch tễ:
III.3.1. Kháng nguyên bề mặt virut viêm gan B (HBsAg):
Kháng nguyên bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg), đây là maker (dấu ấn)
xuất hiện trước tiên sau khi bị lây nhiễm, có thể thấy trong huyết thanh ở giai
đoạn cuối của thời kỳ ủ bệnh thường nhiều ngày hoặc nhiều tuần trước khi có
triệu chứng lâm sàng rồi giảm dần và biến mất thường từ 4-8 tuần tiếp theo.
Nếu HBsAg tồn tại sau 6 tháng sau khi khỏi bệnh được gọi là nhiễm trùng

mạn tính (hay là mang HBsAg mạn tính) rất nguy hiểm cho người khác. Trong
viêm gan mạn HBsAg có thể tồn tại nhiều năm hoặc hết đời.
Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng cao: Nếu HBsAg không giảm xuống
đến mức 1/4 hiệu giá ban đầu trong 4-6 tuần đầu của bệnh thì bệnh nhân có
khả năng chuyển sang mạn tính. Khi thấy cã HBsAg trong m¸u chøng tá cã
ADN cđa virut trong gan, phản ánh tình trạng cấp hoặc mạn của bệnh viêm
gan và tất cả các trường hợp HBsAg dương tính đều được coi là có khả năng
truyền bệnh. Tuy nhiên vẫn có khoảng 5-10% bệnh nhân viêm gan xét nghiệm
không có HBsAg (có thể hàm lượng quá thấp hoặc bị kháng thể trung hoà).
III.3.2. Kháng thể Anti HBs:
Là dấu ấn phản ánh tình trạng viêm gan B đà khỏi bệnh và/hoặc đà được miễn
nhiễm đối với HBV.


17
Xuất hiện muộn 2-16 tuần sau khi không phát hiện được HBsAg.
Kháng thể IgM anti HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp, còn kháng thể IgG anti
HBs xuất hiện muộn hơn và tồn tại lâu hơn.
Xuất hiện kháng thể anti HBs là dấu hiệu bệnh đà được cải thiện, nó cã t¸c
dơng chèng t¸i nhiƠm HBV. Kh¸ng thĨ anti HBs còn phát hiện được trong
máu ở những người có tiêm phòng vacxin viêm gan B.
III.3.3. Kháng nguyên HBeAg:
Kháng nguyên E (HBeAg) là kháng nguyên hoà tan, xuất hiện sớm sau
HBsAg nhưng tồn tại lâu trong các thể nhiễm trùng mÃn (đặc biệt là viêm gan
mÃn hoạt động) có liên quan đến sự có mặt của virut HBV nên nó phản ánh
mức độ lây nhiễm của người bệnh, đặc biệt ở phụ nữ mang thai có HBsAg
dương tính. Xét nghiệm phát hiện HBeAg và kháng thể kháng lại HBeAg (anti
HBe) thường chỉ nên chỉ định ở những bệnh nhân đà có xét nghiệm HBsAg
dương tính.
Sự biến mất của HBeAg và xuất hiện kháng thể anti HBe là dấu hiệu của bệnh

đang lui dần. Ngược lại, trong viêm gan mÃn tấn công th­êng thÊy HBeAg
(+).
III.3.4. Kh¸ng thĨ anti HBe:
Sù chun hut thanh antiHBe x¶y ra khi antiHBe tõ (-) chun sang (+) và
HBeAg từ (+) chuyển sang (-). Hiện tượng này phản ánh sự nhân đôi của siêu
vi đà giảm hoặc chấm døt. Sù chun hut thanh antiHBe cã thĨ x¶y ra một
cách tự nhiên hoặc được thúc đẩy nhanh chóng nhờ các phương pháp trị liệu
kháng siêu vi.


18
Tuy nhiªn, trong viªm gan B m·n tÝnh, sù hiƯn diện của antiHBe chứng tỏ
bệnh đà diễn tiến tương đối lâu, nhất là có thể đà chuyển sang giai đoạn xơ
gan hoặc ung thư gan nguyên phát.
IgM anti HBe xuất hiện sớm còn IgG anti HBe xuất hiện muộn hơn.
III.3.5. Kháng nguyên lõi HBcAg:
Kháng nguyên lõi (HBcAg) là thành phần bên trong lõi virut, được bao bọc
bởi bao ngoài nên không có trong máu dưới dạng tự do, nó chỉ xuất hiện ở
trong tế bào gan, vì vậy các kỹ thuật miễn dịch học thường không phát hiện
được. Bằng các kỹ thuật đặc biệt như miễn dịch huỳnh quang hoặc miễn dịch
enzyme có thể phát hiện chúng trong nhân tế bào gan trên các tiêu bản sinh
thiết hoặc tử thiết.
Khi trong mét tÕ bµo gan cã HBcAg bao giê cịng có HBsAg trên màng tế bào
và nồng độ DNA polymerase luôn luôn tăng cao.
III.3.6. Kháng thể anti HBc:
Là dấu ấn huyết thanh quan trọng nhất chứng minh bệnh nhân đà từng bị
nhiễm HBV; là dấu ấn quý giá giúp phân biệt VGSV B trong giai đoạn cấp
tính hay mÃn tính.
Kháng thể IgM anti HBc xuất hiện sớm trong những tuần đầu của bệnh, còn
kháng thể IgG anti HBc xuất hiện muộn nhưng tồn tại lâu hơn.

Sự có mặt của kháng thể anti HBc không có tác dụng bảo vệ chống tái nhiễm
HBV.
III.4. Sức đề kháng của HBV.


19
HBV có sức đễ kháng cao và cao hơn cả HAV, virut có thể tồn tại ở nhiệt độ
buồng trong 6 th¸ng, ë 100oC trong 20 phót, ë 58oC trong 24 giờ; không bị
huỷ bởi ete. HBsAg rất bền vững, vẫn tồn tại sau 20 năm ở -20oC, dưới tác
dụng nhiều enzyme và dung môi hữu cơ. HBV bị bất ho¹t bëi formalin 5%/12
giê, Cloramin 3%/ 2 giê.
Mn hủ virut hoặc HBsAg phải khử trùng rất kỹ (đun sôi 30 phút hoặc sấy
khô, hấp ướt).
III.5. Khả năng và cơ chế g©y bƯnh cđa HBV.
HBV cã tÝnh l©y nhiƠm cao, 0,01-0,001 ml huyết thanh nhiễm HBV đà có thể
lây được bệnh.
Virut lây bệnh chủ yếu qua đường máu: tiêm truyền, truyền máu, tiêm chủng,
châm, tiếp xúc với máu có virut (mổ, chữa răng, lấy máu xét nghiệm máu, làm
việc ở các trung tâm máu, thận nhân tạo). Virut có thể lây qua đường sinh
dục và mẹ truyền sang con.
HBV là tác nhân gây viêm gan virut quan trọng nhất trong các virut viêm gan.
Bà mẹ nhiễm HBV trong những tháng đầu mang thai không làm cho thai nhi
bị dị tật, nếu bà mẹ nhiễm HBV ở 3 tháng cuối thời kỳ mang thai thì có 60%
có nguy cơ lây bệnh cho con. Mức độ lây bệnh cho con càng cao nếu người
mẹ mang đồng thời HBsAg và HBeAg (có thể lây tíi 100%). NhiƠm virut ë
løa ti nhá th­êng dƠ tiÕn triển thành các dạng mÃn tính nghiêm trọng. Tần
suất tiến triển thành dạng mÃn tính ở trẻ em nhiễm virut từ mẹ rất cao 40-80%
trong khi đó tỷ lệ này ở người trưởng thành là 5-10%.
Virut có thể thải ra ngoài theo dịch tiết của các niêm mạc và sữa nhưng không
thải theo phân. Thực tế cho thấy HBsAg có ở hầu hết các dịch sinh học: nước

20
bọt, dịch mật, dịch nÃo tuỷ, dịch màng phổi, tinh dịch, dịch âm đạo, nước ối,
mồ hôi và nước tiểu.
Quá trình nhân lên của virut viêm gan B:

Hình 7: Quá trình nhân lên của HBV trong tế bào gan
HBV có ái lực đặc biệt với tế bào gan. Sau khi bám vào tế bào gan, virut cởi
vỏ, chỉ có DNA xâm nhập vào nhân tế bào gan ở dạng siêu xoắn. RNApolymerase phụ thuộc DNA của tế bào chủ sẽ phiên mà sợi DNA (-) thành các
bản sao RNA hoàn chỉnh, trong đó có RNA tiền genome, để ra bào tương tế
bào gan tổng hợp các protein cho virut. Dưới tác dụng của DNA-polymerase,
RNA tiền genome thực hiện phiên mà ngược tổng hợp DNA sơi âm. Khi DNA
của virut được tổng hợp xong, RNA tiền genome bị giáng hoá trừ một đoạn
nhỏ khoảng 20 đôi baze từ đầu 5 sẽ hoạt động như một primer để tổng hợp
DNA sợi dương từ sợi âm mẫu, tuỳ thuộc vào mức độ hoạt động của DNA
polymerase mà DNA sợi dương có độ dài thay đổi, các thành phần khác được
tổng hợp từ các RNA thông tin cùng lúc với sự tổng hợp DNA sợi dương. Các


21
thành phần vừa được tổng hợp lắp ghép lại với nhau tạo hạt virut và giải phóng
khỏi tế bào gan. Trong quá trình nhân lên của virut luôn có sự tổng hợp thừa
thành phần vỏ virut vì vậy trong huyết thanh người nhiễm HBV có cả 3 loại
hạt: hạt vi rut hoàn chỉnh, hạt hình cầu và hạt hình ống.
Iv. Một số thử nghiệm cần thiết đối với bệnh nhân
mắc viêm gan siêu vi B:
Để tầm soát xem một bệnh nhân có bị nhiễm HBV hay không, người ta không
cần phải làm tất cả các dấu ấn huyết thanh gồm HBsAg, antiHBs, HBeAg,
antiHBe và antiHBc mà chúng ta chỉ cần tìm HBsAg và antiHBc.

HBsAg (+) là tiêu chuẩn chính yếu để chẩn đoán nhưng nếu HBsAg (-) thì
antiHBc (+) cũng ®đ chøng minh bƯnh nh©n ®· tong nhiƠm HBV. Do đó, khi
cả HBsAg và antiHBc đều (-), chúng ta có thể ít nghĩ đến VGSV B.
Sau khi đà xác định bị nhiễm HBV, nếu muốn biết bệnh nhân đang ở giai
đoạn nào của bệnh thì mới cần kết hợp thêm các dấu ấn còn lại.
HBsAg (+)
Viêm gan (cấp hoặc mÃn)

IgM antiHBc
âm tính
Viêm gan mÃn

dương tính
Viêm gan cấp

HBeAg và anti HBe
HBeAg (+)
L©y nhiƠm cao

antiHBe (+)
L©y nhiƠm thÊp